專利名稱：：體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開涉及用于擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法，具體來說涉及利用免疫缺陷小鼠擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：肝臟是異生化合物、包括醫(yī)用藥物代謝的重要位點(diǎn)。因?yàn)樵S多肝酶是種屬特異性的，因此必需使用培養(yǎng)的初級人類肝細(xì)胞或它們的微粒體級份，來評估候選藥物的代謝(Brandon等，Toxicol.Appl.Pharmacol.189:233_246,2003；Gomez-Lechon等，Curr.DrugMetab.4:292_312，2003)。盡管微粒體肝細(xì)胞級份可用于闡釋某些代謝功能，但其它的測試依賴于活的肝細(xì)胞。例如，某些化合物誘導(dǎo)肝酶，因此它們的代謝隨著時(shí)間而變化。為了分析酶的誘導(dǎo)，肝細(xì)胞不僅必須是活的，而且是完全分化和有功能的。對于藥物代謝和其它研究來說，典型情況下肝細(xì)胞從器官供體的遺體分離，并運(yùn)送到要進(jìn)行測試的場所。遺體來源的肝細(xì)胞的狀態(tài)(存活性和分化狀態(tài))是高度不同的，許多細(xì)胞制備物的質(zhì)量勉強(qiáng)合格。高質(zhì)量人類肝細(xì)胞的可獲得性受到了下述事實(shí)的進(jìn)一步妨礙，即它們不能在組織培養(yǎng)中大量擴(kuò)增(Runge等，Biochem.Biophys.Res.Commun.2741-3,2000；CascioS.Μ.,Artif.Organs25:529_538，2001)。在鋪板后，細(xì)胞存活，但是不分裂。來自容易獲得的哺乳動(dòng)物物種、例如小鼠的肝細(xì)胞，不適合于藥物測試，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌某商状x酶，并在誘導(dǎo)研究中響應(yīng)不同。永生的人類肝臟細(xì)胞(肝細(xì)胞瘤)或胚胎成肝細(xì)胞也不足以代替完全分化的成年細(xì)胞。在微生物學(xué)領(lǐng)域也需要對人類肝細(xì)胞進(jìn)行研究。許多人類病毒，例如引起肝炎的病毒，不能在任何其它細(xì)胞類型中復(fù)制。由于這些限制，擴(kuò)增初級人類肝細(xì)胞的方法是高度需要的。因此，本文提供了用于擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的強(qiáng)有力的系統(tǒng)。發(fā)明概要本文提供了體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法。方法包括將分離的人類肝細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠中，允許肝細(xì)胞擴(kuò)增，以及收集人類肝細(xì)胞。在幾個(gè)實(shí)施方案中，將人類肝細(xì)胞施用于免疫缺陷接受體小鼠，其中小鼠還缺陷延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)。在某些實(shí)施方案中，小鼠是Fah+/Rag2+/I12rg+(FRG)小鼠。在其它實(shí)施方案中，小鼠是FahP7Rag2+/I12rg+(FpmRG)小鼠。在本方法的某些實(shí)施方案中，在注射人類肝細(xì)胞之前，將編碼人類尿激酶的載體施用于小鼠。在其它實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前，從小鼠消除了巨噬細(xì)胞。在某些實(shí)例中，人類肝細(xì)胞在接受體小鼠、例如FRG小鼠或FpmRG小鼠中擴(kuò)增至少大約2周。從接受體小鼠收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將分離的人類肝細(xì)胞注射到接受體小鼠的脾臟中，并從小鼠的肝臟收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞。收集的肝細(xì)胞可以被導(dǎo)入另一個(gè)接受體小鼠，例如FRG小鼠或FpmRG小鼠，用于進(jìn)一步擴(kuò)增。因此，方法可以重復(fù)使用，以進(jìn)一步擴(kuò)增人類肝細(xì)胞。在本文提供的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射之前，對Fah缺陷的小鼠施用抑制、阻止或延遲肝臟疾病發(fā)生的藥劑。一種這樣的藥劑是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?_1，3環(huán)己二酮(NTBC)。NTBC或其它適合的藥劑，可以通過任何適合的手段施用，包括但不限于在飲用水中，在食物中，或通過注射。任選，在肝細(xì)胞注射后，NTBC還施用至少大約3天到至少大約6天。在幾個(gè)實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞從器官供體或從肝臟外科切除術(shù)獲得。在某些實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞源自于干細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞在注射前超低溫保藏。在其它實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞來自于肝細(xì)胞的細(xì)胞系。本文還提供了遺傳修飾的小鼠，其基因組對于Fah、Rag2和I12rg基因中的缺失或點(diǎn)突變來說是純合的，使得缺失或點(diǎn)突變導(dǎo)致了功能性FAH、RAG-2和IL_2Ry蛋白的表達(dá)的喪失，其中小鼠是免疫缺陷的，并表現(xiàn)出降低的肝功能，并且其中人類肝細(xì)胞可以在小鼠中擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，缺失導(dǎo)致了B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的完全喪失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小鼠表達(dá)人類尿激酶。從下面的幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)描述中，并參考隨附的圖，上述的以及其它的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加明顯。圖la是顯示了在用人類肝細(xì)胞移入和再增殖后，三重突變FRG小鼠(#471)和兩只雜合子同窩仔畜(#469，#470)的相對重量的圖。FRG小鼠在移植后6周維持了其體重；但是，I12rg基因雜合子同窩仔畜持續(xù)地減重。NTBC只在第一和第四周施用，這用陰影指示。圖lb是凝膠的數(shù)字照片，顯示了來自肝細(xì)胞-接受體肝臟的基因組DNA上人類Alu序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。只有FRG小鼠是陽性的。圖lc-e是顯示了野生型(圖lc)、Fah(-/-)(圖Id)和人源化小鼠肝臟(圖le)中的FAH酶活性的圖片。FAH底物濃度在野生型小鼠肝臟中下降了，但是使用Fah+小鼠肝臟時(shí)沒有變化。人源化小鼠肝臟顯示出充足的酶活性。圖If是再增殖的小鼠肝臟中FAH免疫染色的數(shù)字照片，顯示出超過80%的肝細(xì)胞是FAH陽性的(由暗染色和大的箭頭指示)。小箭頭區(qū)別指示了FAH陰性細(xì)胞。圖lg是同樣的肝臟切片的H&E染色的數(shù)字照片，顯示了人類肝細(xì)胞嗜曙紅性低(由箭頭指示)。原始放大倍數(shù)x200。圖2a_h是來自嵌合小鼠的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)組織切片的數(shù)字照片。圖2a是數(shù)字照片，顯示了FAH陽性人類肝細(xì)胞整合到小鼠肝臟組織中，并且不擾亂接受體肝臟的微觀結(jié)構(gòu)。圖2b是數(shù)字照片，顯示了高度再增殖的嵌合肝臟也保留了正常的結(jié)構(gòu)。圖2c和2d是H&E染色的數(shù)字照片，顯示了人類肝細(xì)胞簇嗜曙紅性低。圖2e是數(shù)字照片，顯示了對FAH染色的連續(xù)切片。圖2f是數(shù)字照片，顯示了對H印Par染色的連續(xù)切片。圖2g是來自高度再增殖小鼠的腎臟切片的數(shù)字照片，顯示出即使在移植后4個(gè)月，也沒有腎小管或腎小球破壞。圖2h是數(shù)字照片，顯示了脾臟中FAH陽性的人類肝細(xì)胞。原始放大倍數(shù)xl00(圖2c)，x200(圖la、2b、2e、2f■和2g)，x400(圖2d和2h)。圖3a是一系列凝膠切片，顯示了來自嵌合小鼠肝臟的RT-PCR產(chǎn)物。人類ALB、FAH、TAT、TF、TTR禾口UGT1A1基因在嵌合小鼠肝臟(#697和#785)中表達(dá)。人類肝細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞被分別用作陽性和陰性對照。圖3b(正常作圖)和圖3c(對數(shù)作圖)是顯示了使用ELISA測定的初級肝細(xì)胞接受體的人類血白蛋白濃度的圖。系統(tǒng)的閾值濃度為大約0.005ug/mlo圖3d(正常作圖)和圖3e(對數(shù)作圖)是顯示了次級接受體的人類白蛋白濃度的圖。對數(shù)作圖顯示了白蛋白濃度的倍增時(shí)間是大約一周。圖4a是示意圖，顯示了從初級細(xì)胞開始(在最左側(cè)的深色框中)的連續(xù)的移植流程。深色框指示了再增殖的連續(xù)接受體，白色框指示了移入的小鼠。只有1/4的初級接受體再增殖，但是所有的6個(gè)次級接受體都移入了。圖4b是凝膠的數(shù)字照片，顯示了來自連續(xù)移植的接受體肝臟的Alu序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4c-e是通過FAH免疫細(xì)胞化學(xué)分析的肝細(xì)胞的數(shù)字照片，證明了來自第三級小鼠的培養(yǎng)的肝細(xì)胞超過70%對FAH是陽性的。圖4f-h是組織切片的數(shù)字照片，顯示了連續(xù)移植的小鼠肝臟的FAH免疫組織化學(xué)。初級(圖4f)、次級(圖4g)和第三級(圖4h)接受體肝臟通過人類肝細(xì)胞進(jìn)行了再增殖。圖5a_c是嵌合小鼠肝細(xì)胞的抗小鼠白蛋白抗體和抗FAH抗體免疫細(xì)胞化學(xué)的數(shù)字照片。大多數(shù)來自嵌合肝臟的肝細(xì)胞是小鼠白蛋白或FAH單一陽性的。圖5d-f是嵌合小鼠肝細(xì)胞的抗人類白蛋白抗體和抗FAH抗體免疫細(xì)胞化學(xué)的數(shù)字照片。大多數(shù)肝細(xì)胞是人類白蛋白和FAH雙重陽性的。原始放大倍數(shù)xlOO。圖5g-l是顯示了嵌合小鼠肝細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析的圖。使用了FITC結(jié)合的抗HLAA、B、C抗體和PE結(jié)合的抗H-2Kb抗體。顯示了針對HLA-A、B、C的對照人類肝細(xì)胞(圖5g)；針對HLA-A、B、C的對照小鼠肝細(xì)胞(圖5i)；針對H-2Kb的對照人類肝細(xì)胞(圖5h)；針對H-2Kb的對照小鼠肝細(xì)胞(圖5j)；以及來自兩個(gè)高度嵌合小鼠的肝細(xì)胞(圖5k和圖51)，它們對于HLA或H-2Kb各是陽性的。圖6a和6b是顯示了乙氧基9-羥基_3_異吩唑酮_0_脫乙基酶(CYP1A1依賴性)的代謝(圖6a)，以及睪酮向6-0-羥基睪酮的轉(zhuǎn)化(CYP3A4介導(dǎo)的)(圖6b)的圖。分析了來自三只具有不同的人類肝細(xì)胞再增殖水平(M79010%；M69730%；M78560%)的小鼠的培養(yǎng)肝細(xì)胞。圖6c是描繪了通過定量RT-PCR測定的與藥物代謝、運(yùn)輸和結(jié)合相關(guān)的人類特異性基因的mRNA水平圖。人類藥物代謝基因的比例是成年人類肝細(xì)胞典型的。圖7a_h是描繪了在來自三只具有不同的人類肝細(xì)胞再增殖水平(M79010%；M69730%;M78560%)的小鼠的肝細(xì)胞中，肝臟特異性基因和參與藥物代謝的基因的基礎(chǔ)基因表達(dá)水平的圖。圖7a是三個(gè)樣品中肝臟特異性基因的基礎(chǔ)表達(dá)的條形圖，針對小鼠肌動(dòng)蛋白mRNA進(jìn)行歸一化。圖7b-h是對0-萘黃銅(BNF)、苯巴比妥(PB)和利福平(Rif)作出響應(yīng)，對參與藥物代謝的mRNAs的誘導(dǎo)的條形圖，相對于在未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中的誘導(dǎo)。顯示的是CYP3A4(圖7b)，CYP2B6(圖7c)，CAR(核激素受體)(圖7d)，MDR1(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)(圖7e)，MRP(圖7f)，BSEP(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)(圖7g)，以及PXR(核激素受體)(圖7h)。CYP3A4被苯巴比妥的誘導(dǎo)甚至比在酶的水平上更顯著。序列列表在隨附的序列列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用了核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的三字母編碼，正如在37C.F.R.1.822中定義的。每個(gè)核酸序列只顯示了一條鏈，但是應(yīng)該理解對顯示的鏈的任何引用也包含了互補(bǔ)鏈。在隨附的序列列表中SEQIDNOs:1和2是用于擴(kuò)增人類Alu序列的PCR引物的核酉SEQIDNO3是人類ALB的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDNO4是人類ALB的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDNO5是小鼠Alb的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN06是小鼠Alb的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN07是人類TAT的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN08是人類TAT的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN09是人類TF的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN010是人類TF的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN0:11是人類FAH的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN012是人類FAH的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN013是人類TTR的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN014是人類TTR的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN015是人類UGT1A1的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQIDN016是人類UGT1A1的反向RT-PCR引物的核酸序列。詳細(xì)描沭I.締旨寫AAV腺相關(guān)病毒ALB白蛋白ALT丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶BNF萘黃酮DAB二氨基聯(lián)苯胺ELISA酶聯(lián)免疫吸附分析EROD乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮-0-脫乙基酶FACS熒光激活細(xì)胞分揀FAH延胡索酰乙酰乙酸水解酶FISH熒光原位雜交FITC熒光素異硫氰酸酯FRGFah"7Rag2+/I12rg+三重突變小鼠HLA人類白細(xì)胞抗原IL-2Ry白介素-2受體、MHC主要組織相容性復(fù)合物NTBC2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?-1，3環(huán)己二酮PB苯巴比妥PBS磷酸鹽緩沖鹽水PCR聚合酶鏈反應(yīng)PE藻紅蛋白PFU噬斑形成單位RAG重組酶活化基因Rif利福平RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)TAT酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶TF轉(zhuǎn)鐵蛋白TTR運(yùn)甲狀腺素蛋白UGT1A1UDP葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1家族，多肽A1uPA尿激酶纖溶酶原激活物II.術(shù)語除非特別指明，技術(shù)術(shù)語按照常規(guī)用法使用。分在BenjaminLewin的《基因V))(GenesV,由OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9))，Kendrew等主編的《分子生物學(xué)百科全書》(TheEncyclopediaofMolecularBiology，由BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9))，以及RobertA.Meyers主編的《分子生物學(xué)和生物技術(shù)綜合桌面參考》(MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,由VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8))中發(fā)現(xiàn)。為了便于瀏覽本發(fā)明的各種不同實(shí)施方案，提供了下面對具體術(shù)語的解釋抑制或阻止肝臟疾病發(fā)生的藥劑當(dāng)施用于FRG小鼠、FpmRG小鼠或其它類型的Fah缺陷小鼠時(shí)，在小鼠中阻止、延遲或抑制肝臟疾病發(fā)生的化合物或組合物。肝臟疾病或肝功能障礙的特征為多種征兆或癥狀中的任何一種，包括但不限于肝臟組織學(xué)的改變(例如壞死、炎癥、發(fā)育異?；蚋伟?，肝臟特異性酶和其它蛋白(例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白)的水平的改變，或肝臟總體衰竭。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制肝臟疾病的藥劑是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?_1，3環(huán)己二酮(NTBC)。羊水細(xì)胞在胚胎周圍的羊水中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞?？贵w包含一種或多種基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽的蛋白(或蛋白復(fù)合物)。已識(shí)別到的免疫球蛋白基因包括k、X、a、Y、S、￡禾口y恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為k或X。重鏈被分類為Y、P、a、S或e，它們相應(yīng)地分別定義了免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。基本的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位一般是四聚體。每個(gè)四聚體由兩對同樣的多肽鏈構(gòu)成，每對具有一條“輕鏈”(大約25kDa)和一條“重鏈”(大約50-70kDa)。每條鏈的的N-末端定義了大約100到110個(gè)或以上氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語“可變輕鏈”和“可變重鏈”(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈。本文中使用的術(shù)語“抗體”包括完整的免疫球蛋白以及許多已充分定性的片段。例如，與靶蛋白(或蛋白或融合蛋白中的表位)結(jié)合的FabS、FvS以及單鏈Fvs(SCFvs)，也是該蛋白(或表位)的特異性結(jié)合劑。這些抗體片段定義如下(l)Fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體而得到完整的輕鏈和一條重鏈的一部分而產(chǎn)生；(2)Fab'，通過用胃蛋白酶處理完整抗體，然后通過還原產(chǎn)生完整的輕鏈和一部分重鏈而獲得的抗體分子的片段；每個(gè)抗體分子獲得兩個(gè)Fab'片段；(3)(Fab')2，通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，隨后不進(jìn)行還原而獲得的抗體的片段；(4)F(ab')2，兩個(gè)Fab'片段通過兩個(gè)二硫鍵連接在一起的二聚體；(5)Fv，遺傳工程的片段，含有表達(dá)為兩條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)；以及(6)單鏈抗體，遺傳工程分子，含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，通過適合的肽接頭連接成遺傳融合的單鏈分子。制造這些片段的方法是常規(guī)的(參見，例如Harlow和Lane，《抗體使用實(shí)驗(yàn)指南》(UsingAntibodies=ALaboratoryManual)，CSHL,NewYork,1999)。用于本公開的方法的抗體可以是單克隆的或多克隆的。僅僅是舉例，單克隆抗體可以從鼠類雜交瘤、按照Kohler和Milstein的經(jīng)典方法(Nature256=495-97,1975)或其衍生方法制備。單克隆抗體生產(chǎn)的詳細(xì)步驟描述在Harlow和Lane，《抗體使用實(shí)驗(yàn)指南》(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1999中。B細(xì)胞一種類型的淋巴細(xì)胞，在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞的基本功能是制造針對可溶性抗原的抗體。B細(xì)胞是獲得性免疫系統(tǒng)的必要組分。收集本文中使用的“收集”擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞，是指從已經(jīng)注射過分離的人類肝細(xì)胞的小鼠(也被稱為接受體小鼠)取出擴(kuò)增的肝細(xì)胞的過程。收集任選包括將肝細(xì)胞與其它細(xì)胞類型分離開。在一個(gè)實(shí)施方案中，從Fah缺陷小鼠的肝臟收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，從FRG小鼠或FpmRG小鼠的肝臟收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞。白介素受體的共同Y鏈(I12rg)編碼白介素受體的共同Y鏈的基因。I12rg是許多白介素的受體成分，包括IL-2、IL-4、IL-7和IL-15(DiSanto等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.92=377-381,1995)。I12rg缺陷的動(dòng)物表現(xiàn)出B細(xì)胞和T細(xì)胞減少，并缺乏自然殺傷細(xì)胞。超低溫保藏的本文使用的“超低溫保藏的”是指通過冷卻到低零下溫度，例如77K或-196°C(液氮的沸點(diǎn))，來保存或維持的細(xì)胞或組織。在這些低溫下，任何生物活性、包括導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生物化學(xué)反應(yīng)，都被有效終止。降低的肝臟功能用于度量肝臟的健康或功能的許多參數(shù)中任何一個(gè)的異常變化。降低的肝臟功能在本文中也被稱為“肝臟功能障礙”。肝臟功能可以通過本
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熟知的許多手段中的任何一種進(jìn)行評價(jià)，例如但不限于檢查肝臟組織學(xué)和測量肝臟酶或其它蛋白。例如，肝臟功能障礙可以由肝臟的壞死、炎癥、氧化損傷或發(fā)育異常所指示。在某些情況下，肝臟功能障礙由肝癌指示，例如肝細(xì)胞癌。可以被測試以評估肝臟功能障礙的肝臟酶和蛋白的例子，包括但不限于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白。肝臟功能障礙也可以導(dǎo)致肝臟總體衰竭。用于測試肝臟功能的方法在本
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中是眾所周知的，例如由Grompe等(GenesDev.7=2298-2307,1993)和Manning等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.9611928-11933，1999)講述的，它們在本文中弓I為參考。缺陷本文中使用的“Fah缺陷”或“Fah中的缺陷”是指動(dòng)物例如小鼠，在Fah中含有突變，導(dǎo)致了FahmRNA表達(dá)和/或功能性FAH蛋白的顯著減少或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ah缺陷的動(dòng)物在Fah基因中含有純合的的缺失。作為一個(gè)例子，純合的缺失是在Fah的外顯子5中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ah缺陷的動(dòng)物在Fah基因中含有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。適合的Fah點(diǎn)突變的例子在本
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中是已知的(參見例如Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.950:641_645，2001，在此引為參考)。消除減少或除去。本文中使用的“巨噬細(xì)胞消除”是指清除、除去、減少或殺死動(dòng)物中的巨噬細(xì)胞的過程。已經(jīng)被消除巨噬細(xì)胞的動(dòng)物，不一定完全不含巨噬細(xì)胞，但是至少表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少或活性的降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，巨噬細(xì)胞消除導(dǎo)致有功能的巨噬細(xì)胞減少了至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少90%或100%。移入將細(xì)胞或組織植入到動(dòng)物中。本文中使用的人類肝細(xì)胞在接受體小鼠中的移入，是指人類肝細(xì)胞在注射后變得植入到接受體小鼠中的過程。移入的人類肝細(xì)胞能夠在接受體小鼠中擴(kuò)增。正如本文所述，“顯著移入”是指在接受體小鼠中，肝臟中至少大約的肝細(xì)胞是人類的?！案叨纫迫氲摹毙∈?，是其肝臟中至少大約30%的肝細(xì)胞是人類的小鼠。但是，移入效率可以更高，例如小鼠肝臟中至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%的肝細(xì)胞是人類肝細(xì)胞。胚胎干(ES)細(xì)胞從發(fā)育中的囊胚的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)分離的多能細(xì)胞。ES細(xì)胞是多能細(xì)胞，意味著它們可以產(chǎn)生身體中存在的所有細(xì)胞(骨骼、肌肉、腦細(xì)胞等)。用于產(chǎn)生鼠類ES細(xì)胞的方法可以在美國專利No.5，670，372中發(fā)現(xiàn)，在此引為參考。用于產(chǎn)生人類ES細(xì)胞的方法可以在美國專利No.6，090,622,PCT公布No.WO00/70021和PCT公布No.WO00/27995中發(fā)現(xiàn)，每個(gè)都在此引為參考。擴(kuò)增增加數(shù)量。本文中使用的“擴(kuò)增”人類肝細(xì)胞，是指允許細(xì)胞分裂發(fā)生，使得人類肝細(xì)胞的數(shù)量增加的過程。正如本文所述，使人類肝細(xì)胞在接受體小鼠中擴(kuò)增至少大約4周、至少大約6周、至少大約8周、至少大約12周、至少大約16周、至少大約20周、至少大約20周或至少大約28周。在一個(gè)實(shí)施方案中，使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增多達(dá)大約6個(gè)月。從擴(kuò)增產(chǎn)生的人類肝細(xì)胞的數(shù)量可以是不同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)生了至少1千萬、至少2千萬、至少3千萬、至少4千萬或至少5千萬個(gè)肝細(xì)胞。假設(shè)最初注射了1百萬個(gè)肝細(xì)胞，并且有大約10%移入，則肝細(xì)胞擴(kuò)增可以在大約10倍到大約500倍的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞在接受體小鼠中的擴(kuò)增，導(dǎo)致增加了至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍或至少1000倍。FRG小鼠在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、重組酶活化基因2(Rag2)和白介素接受體的共同、鏈(I12rg)基因中具有純合缺失的突變小鼠。在本文中也被稱為Fah+/Rag2+/I12rg+。本文中使用的Fah、Rag2和I12rg基因中的純合缺失，是指在含有突變的小鼠中不表達(dá)有功能的FAH、RAG-2和IL-2RY蛋白。FpmRG小鼠在重組酶活化基因2(Rag2)、和白介素受體的共同、鏈(I12rg)基因中具有純合缺失，以及在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)中具有純合點(diǎn)突變的突變小鼠。在FpmRG小鼠的Fah基因中的點(diǎn)突變，導(dǎo)致了mRNA中的錯(cuò)誤拼接和外顯子7的丟失(Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:641_645，2001)。在本文中也稱為Fahpm/Rag2"7ll2rg+。本文中使用的Rag2和I12rg基因中的純合缺失，是指在含有突變的小鼠中不表達(dá)有功能的RAG-2和IL-2RY蛋白。此外，在Fah基因中具有純合點(diǎn)突變的小鼠，不表達(dá)有功能的FAH蛋白。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)催化酪氨酸分解代謝最后一步的代謝酶。具有純合的Fah基因缺失的小鼠表現(xiàn)出改變的肝臟mRNA表達(dá)和嚴(yán)重的肝臟功能障礙(Grompe等，GenesDev.7:2298_2307，1993，在此引為參考)。Fah基因中的點(diǎn)突變已經(jīng)被顯示引起肝臟衰竭和產(chǎn)后致死(Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.98(2):641_645，2001，在此引為參考)。逐漸降低本文中使用的“逐漸降低”NTBC的劑量，是指隨著時(shí)間、例如經(jīng)過幾天時(shí)間減少施用于Fah缺陷小鼠的NTBC劑量的過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，NTBC劑量經(jīng)過大約6天時(shí)間逐漸降低，其中劑量以大約1或2天的間隔降低，使得在大約1周后，不再施用NTBC。NTBC的逐漸降低可以在更短或更長的時(shí)間過程中進(jìn)行，劑量減少之間的時(shí)間間隔也可以更短或更長。肝細(xì)胞一種類型的細(xì)胞，占肝臟細(xì)胞質(zhì)質(zhì)量的70-80%。肝細(xì)胞參與蛋白合成，蛋白儲(chǔ)存和碳水化合物轉(zhuǎn)化，膽固醇、膽鹽和磷脂的合成，以及外源和內(nèi)源物質(zhì)的解毒、修飾和排泄。肝細(xì)胞也引發(fā)膽汁的形成和分泌。肝細(xì)胞制造血清白蛋白、纖維蛋白原和凝血酶原類型的凝血因子，是脂蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體和糖蛋白合成的主要位點(diǎn)。此外，肝細(xì)胞具有代謝、解毒和失活外源化合物例如藥物和殺蟲劑以及內(nèi)源化合物類如類固醇的能力。純合的在一個(gè)或多個(gè)基因座處具有同樣的等位基因。本文中使用的“對于缺失純合”，是指生物體基因的兩個(gè)等位基因具有同樣的缺失。免疫缺陷缺乏免疫系統(tǒng)的至少一種必需功能。本文中使用的“免疫缺陷”小鼠是缺乏免疫系統(tǒng)的特定組分或缺乏免疫系統(tǒng)的特定組分的功能的小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫缺陷小鼠缺乏有功能的B細(xì)胞、T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫缺陷小鼠還缺乏巨噬細(xì)胞。分離的“分離的”肝細(xì)胞是指從具體的來源、例如器官供體獲得的，隨后與其它細(xì)胞類型基本上分離開或從中純化出來的肝細(xì)胞。巨噬細(xì)胞組織中源自于被稱為單核細(xì)胞的特定白細(xì)胞的一種細(xì)胞。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都是吞噬細(xì)胞，在脊椎動(dòng)物的非特異性防御(或先天免疫)以及特異性防御(或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)中都發(fā)揮作用。它們的功能是作為靜止或運(yùn)動(dòng)細(xì)胞吞噬(吞沒然后消化)細(xì)胞碎片和病原體，并刺激淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞對病原體作出響應(yīng)。自然殺傷(NK)細(xì)胞一種形式的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，構(gòu)成了先天免疫系統(tǒng)的主要成分。NK細(xì)胞在腫瘤和病毒感染的細(xì)胞的宿主排斥中，發(fā)揮了主要作用。接受體本文使用的“接受體小鼠”是用本文描述的分離的人類肝細(xì)胞注射的小鼠。典型情況下，一部分(百分率可以不同)人類肝細(xì)胞移入到接受體小鼠中。在一個(gè)實(shí)施方案中，接受體小鼠是免疫缺陷小鼠，它進(jìn)一步缺陷Fah。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接受體小鼠是Rag2+/I12rg+小鼠，它進(jìn)一步缺陷Fah。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接受體小鼠是FRG小鼠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接受體小鼠是FpmRG小鼠。重組酶活化基因2(Rag2)參與免疫球蛋白與T細(xì)胞受體位點(diǎn)的重組的基因。Rag2基因缺陷的動(dòng)物不能經(jīng)歷V(D)J重組，導(dǎo)致完全失去有功能的T細(xì)胞和B細(xì)胞(Shinkai等，Cell65:855-867，1992)。連續(xù)移植用于體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的過程，其中收集在第一只小鼠中擴(kuò)增的肝細(xì)胞，并例如通過注射，移植到第二只小鼠中進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。連續(xù)移植可以進(jìn)一步包括第三級、第四級或更多級的小鼠。干細(xì)胞具有產(chǎn)生未改變的子細(xì)胞(自身更新；細(xì)胞分裂產(chǎn)生了至少一個(gè)與親代細(xì)胞完全相同的子代細(xì)胞)和產(chǎn)生特化的細(xì)胞類型(潛能)的獨(dú)特能力的細(xì)胞。干細(xì)胞包括但不限于胚胎干(ES)細(xì)胞、胚胎生殖(EG)細(xì)胞、生殖干(GS)細(xì)胞(GS)、人類間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)、脂肪組織衍生的干細(xì)胞(ADSCs)多能成人祖細(xì)胞(MAPCs)、多能成人生殖干細(xì)胞(maGSCs)和不受限制的身體干細(xì)胞(USSCs)。干細(xì)胞在體內(nèi)的功能是替換在動(dòng)物的正常生命期間破壞的細(xì)胞。一般來說，干細(xì)胞可以不受限制地分裂。在分裂后，干細(xì)胞可以保持為干細(xì)胞、變成前體細(xì)胞或進(jìn)入終末分化。前體細(xì)胞是可以產(chǎn)生至少一種給定細(xì)胞類型的完全分化的有功能細(xì)胞的細(xì)胞。一般來說，前體細(xì)胞可以分裂。分裂后，前體細(xì)胞可以保持為前體細(xì)胞，或可以進(jìn)入終末分化。在一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞。T細(xì)胞一種類型的白細(xì)胞、或淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮中心作用。T細(xì)胞與其它類型的淋巴細(xì)胞、例如B細(xì)胞和NK細(xì)胞的差別在于，在它們的細(xì)胞表面上存在被稱為T細(xì)胞受體(TCR)的特異性受體。一般來說，據(jù)信胸腺是T細(xì)胞發(fā)生的主要器官。轉(zhuǎn)入基因被導(dǎo)入到生物體的細(xì)胞或基因組中的外源核酸序列。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物非人類動(dòng)物、通常為哺乳動(dòng)物，具有非內(nèi)源的(異源的)核酸序列作為染色體外元件存在于其一部分細(xì)胞中，或穩(wěn)定地整合在其種系DNA中(即在其大多數(shù)或所有細(xì)胞的基因組序列中)。異源核酸通過例如按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的方法對宿主動(dòng)物的胚胎或胚胎干細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，導(dǎo)入到這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的種系中?！稗D(zhuǎn)基因”意指這樣的異源核酸，例如表達(dá)構(gòu)建物形式的異源核酸(例如用于產(chǎn)生“敲入”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)，或者在插入到靶基因中或附近后導(dǎo)致靶基因的表達(dá)降低的異源核酸(例如用于產(chǎn)生“敲除”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)。“敲除”基因意味著改變基因的序列，導(dǎo)致靶基因的功能降低，優(yōu)選使得靶基因的表達(dá)不能檢測到或不顯著。轉(zhuǎn)基因敲除動(dòng)物可以包含靶基因的雜合敲除或靶基因的純合敲除?！扒贸币舶l件性敲除，其中靶基因的改變，可以在例如將該動(dòng)物暴露于促進(jìn)靶基因改變的物質(zhì)后、導(dǎo)入促進(jìn)靶基因位點(diǎn)處的重組的酶(例如Cre-Iox系統(tǒng)中的Cre)后、或使用其它在出生后引導(dǎo)靶基因改變的方法后，才發(fā)生。載體允許插入外源核酸而不破壞載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和/或整合能力的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制原點(diǎn)。載體也可以包含一種或多種選擇性標(biāo)記基因或其它遺傳元件。整合載體能夠?qū)⑵渥陨碚系剿拗骱怂嶂小１磉_(dá)載體是含有必要的調(diào)控序列而允許插入的基因轉(zhuǎn)錄和反義的載體。在本文描述的一個(gè)實(shí)施方案中，載體含有編碼尿激酶、例如人類尿激酶的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是質(zhì)粒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是病毒載體，例如腺病毒載體或腺相關(guān)病毒(AAV)載體。尿激酶也被稱為尿激酶型纖溶酶原激活物(UPA)，尿激酶是一種絲氨酸蛋白酶。尿激酶最初從人類尿液中分離，但是存在于幾種生理位置中，例如血流和細(xì)胞外基質(zhì)中。主要的生理學(xué)底物是纖溶酶原，它是絲氨酸蛋白酶纖溶酶的無活性的酶原形式。纖溶酶的活化觸發(fā)了蛋白水解級聯(lián)，它根據(jù)生理環(huán)境參與血栓溶解或細(xì)胞外基質(zhì)降解。在本文提供的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射之前將尿激酶施用于接受體小鼠。在某些實(shí)施方案中，尿激酶是人類尿激酶。在某些實(shí)施方案中，人類尿激酶是分泌形式的尿激酶。在某些實(shí)施方案中，人類尿激酶是修飾的、非分泌形式的尿激酶(參見美國專利No.5，980，886，在此引為參考)。除非另有解釋，否則在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，都與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的普通專業(yè)人員所通常理解的具有同樣的意義。沒有數(shù)量指示的名詞形式包含了其復(fù)數(shù)的指稱物，除非上下文明確表明不是這樣。同樣地，單詞“或”意在包括“和”，除非上下文明確表明不是這樣。因此，“包含A或B”意味著包括A、或B、或A和B。此外，應(yīng)該理解，對于核酸或多肽給出的所有的堿基尺寸或氨基酸尺寸，以及所有的分子量或分子質(zhì)量值，都是近似值，僅供描述。盡管與本文描述的相似的或等價(jià)的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但下面描述了適合的方法和材料。所有在本文中提到的的出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)，在此以其全文引為參考。在有沖突的情況下，以本發(fā)明的說明、包括術(shù)語的解釋為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅僅是說明性的，不打算進(jìn)行限制。III.幾個(gè)實(shí)施方案的概述本文提供了強(qiáng)有力的體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的系統(tǒng)。方法包括將分離的人類肝細(xì)胞移植到酪氨酸分解代謝酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的免疫缺陷小鼠中。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫缺陷小鼠是Rag2+/I12rg+小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ah缺陷小鼠包含F(xiàn)ah的純合缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ah缺陷小鼠在Fah中含有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，使得蛋白的功能和/或生產(chǎn)顯著降低。正如本文所述，F(xiàn)ah、重組酶活化基因2(Rag2)和白介素受體的共同Y鏈(I12rg)缺陷的三重突變小鼠，提供了用于體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的有效的體內(nèi)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，小鼠是Fah+/Rag2+/I12rg+(FRG)小鼠。在某些實(shí)施方案中，小鼠是FahP7Rag2"7ll2rg+(FpmRG)小鼠。本文公開了體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法，包括通過例如注射，將分離的人類肝細(xì)胞移植到免疫缺陷和Fah缺陷小鼠中(也被稱為接受體小鼠)，使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增至少大約2周，并從小鼠收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞。肝細(xì)胞可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何適合的手段進(jìn)行移植。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過例如注射，將分離的人類肝細(xì)胞移植到接受體小鼠的脾臟中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從接受體小鼠的肝臟收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞。使人類肝細(xì)胞在接受體小鼠中擴(kuò)增一段時(shí)間，該時(shí)間足以使人類肝細(xì)胞能夠擴(kuò)增。擴(kuò)增的準(zhǔn)確時(shí)間長度可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)憑經(jīng)驗(yàn)確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增多達(dá)6個(gè)月。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增至少大約4周，至少大約6周，至少大約8周，至少大約12周，至少大約16周，至少大約20周，至少大約24周或至少大約28周。肝細(xì)胞擴(kuò)增的程度可以各不相同。在某些實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞在接受體小鼠中的擴(kuò)增，導(dǎo)致增加了至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約250倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍或至少約1000倍。還提供了體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法，其中在注射人類肝細(xì)胞之前，向接受體小鼠施用編碼尿激酶基因的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶基因是人類尿激酶。野生型的尿激酶是分泌蛋白。因此，在某些實(shí)施方案中，人類尿激酶是分泌形式的尿激酶(Nagai等，Gene36183-188，1985，在此引為參考)。人類尿激酶(分泌形式)的序列在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的，例如但不限于GenBank登記號NoS.AH007073(1993年8月3日交存)、D11143(1996年5月9日交存)、A18397(1994年7月21日交存)、BC002788(2003年8月19日交存)、X02760(1993年4月21日交存)、BT007391(2003年5月13日交存)、匪002658(2004年10月1日交存)和X74039(1994年2月20日交存)，在此引為參考。在某些實(shí)施方案中，人類尿激酶是修飾的、非分泌形式的尿激酶。例如，Lieber等(Proc.Natl.Acad.Sci.92:6210_6214，1995，在此引為參考)描述了通過在尿激酶的羧基末端插入編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號的序列，或通過用氨基末端RR滯留信號(Strubin等，Cell47:619-625，1986;Schutze等，EMBOJ.13:1696_1705，1994，二者在此引為參考)禾口通過間隔肽與膜II型蛋白Iip33分離的跨膜錨(Strubin等，Cell47=619-625,1986)代替pre-uPA信號肽，產(chǎn)生了非分泌形式的尿激酶。非分泌形式的尿激酶也描述在美國專利No.5，980，886中，在此引為參考。編碼尿激酶的載體，可以是任何類型的適合于投送到小鼠中并能夠表達(dá)尿激酶基因的載體。這樣的載體包括病毒載體或質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是腺病毒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是AAV載體。編碼尿激酶的載體可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何適合的手段施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體通過靜脈內(nèi)施用。在一種情況下，載體通過眼球后注射施用。編碼尿激酶的載體可以在注射人類肝細(xì)胞之前的任何時(shí)間施用。典型情況下，載體被施用至允許有足夠的時(shí)間使尿激酶表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體在肝細(xì)胞注射Itr24到48小時(shí)施用。本文還提供了體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法，其中在注射人類肝細(xì)胞之前，對接受體小鼠進(jìn)行了巨噬細(xì)胞消除。在一個(gè)實(shí)施方案中，在巨噬細(xì)胞消除之前，向接受體小鼠施用編碼尿激酶的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在巨噬細(xì)胞消除后，向接受體小鼠施用編碼尿激酶的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，沒有向巨噬細(xì)胞消除的接受體小鼠施用編碼尿激酶的載體。可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的許多方法中的任何一種從接受體小鼠消除巨噬細(xì)胞，例如通過使用化學(xué)物質(zhì)或抗體。例如，可以通過施用拮抗劑，例如有毒物質(zhì)、包括C12MDP，或改變巨噬細(xì)胞發(fā)生、功能和/或存活性的抗體，來除去巨噬細(xì)胞。拮抗劑的施用通過熟知的技術(shù)來進(jìn)行，包括使用脂質(zhì)體，例如在歐洲專利No.1552740中描述的，在此引為參考。含有氯屈膦鹽的脂質(zhì)體也可以用于消除巨噬細(xì)胞，正如由vanRijn等(Blood702:2522-2531，2003)描述的，在此引為參考。在本文描述的方法的實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射之前，向Fah缺陷小鼠施用抑制、延遲或阻止小鼠中肝臟疾病發(fā)生的藥劑。藥劑可以是本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的抑制肝臟疾病的任何化合物或組合物。一種這樣的藥劑是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3環(huán)己二酮(NTBC)。NTBC的施用用于調(diào)控Fah缺陷小鼠中肝臟疾病的發(fā)生。劑量、用藥時(shí)間表以及施用方法，可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，以阻止Fah缺陷小鼠中的肝臟功能障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，NTBC施用的劑量為大約0.01mg/kg/天到大約0.50mg/kg/天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NTBC施用的劑量為大約0.05mg/kg/天到大約0.10mg/kg/天，例如大約0.05mg/kg/天，大約0.06mg/kg/天，大約0.07mg/kg/天，大約0.08mg/kg/天，大約0.09mg/kg/天或大約0.10mg/kg/天。NTBC可以在注射人類肝細(xì)胞之前和/或肝細(xì)胞注射后選定的時(shí)間施用。根據(jù)需要，在肝細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)間期間，NTBC可以撤銷或重新施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前和肝細(xì)胞注射后至少大約3天，向Fah缺陷小鼠施用NTBC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前和肝細(xì)胞注射后至少大約6天，向Fah缺陷小鼠施用NTBC。在一種情況下，NTBC的劑量在干細(xì)胞注射后經(jīng)6天的時(shí)間過程逐漸降低。NTBC可以通過任何適合的手段施用，例如但不限于在引用水中、在食物中或通過注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前在引用水中施用的NTBC的濃度是大約1到大約8mg/L，例如大約lmg/L，大約2mg/L，大約3mg/L，大約4mg/L，大約5mg/L，大約6mg/L，大約7mg/L或大約8mg/L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前在引用水中施用的NTBC的濃度是大約1到大約2mg/L，例如大約1.Omg/L，大約1.2mg/L,大約1.4mg/L,大約1.6mg/L,大約1.8mg/L或大約2.Omg/L。分離的人類肝細(xì)胞可以從許多不同來源的任何一個(gè)中獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞從器官供體的肝臟分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞從外科切除術(shù)分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞從干細(xì)胞衍生，例如胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)衍生的干細(xì)胞、脂肪組織衍生的干細(xì)胞、多能成人祖細(xì)胞或不受限制的身體干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞衍生自單核細(xì)胞或羊水細(xì)胞，因此在體外獲得了干細(xì)胞或祖細(xì)胞，以產(chǎn)生肝細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人類肝細(xì)胞在注射前超低溫保藏。本文還提供了在Fah缺陷的接受體小鼠中連續(xù)移植人類肝細(xì)胞的方法。方法包括從第一只接受體小鼠收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞，并進(jìn)一步在第二、第三、第四只或更多級的接受體小鼠中擴(kuò)增肝細(xì)胞。可以使用許多技術(shù)中的任何一種從小鼠收集人類肝細(xì)胞。例如，可以按照下面實(shí)施例中的描述，通過灌注小鼠肝臟，然后溫和切碎，來收集肝細(xì)胞。此外，可以使用眾所周知的方法，例如通過使用特異性識(shí)別人類細(xì)胞或人類肝細(xì)胞的抗體，將肝細(xì)胞與其它細(xì)胞類型、組織和/或碎片分離開。這樣的抗體包括但不限于與I類主要組織相容性抗原特異性結(jié)合的抗體，例如抗人類HLA-A、B、C抗體(Markus等，CellTransplantation6:455-462,1997)。然后可以通過淘選(利用了與固體基質(zhì)結(jié)合的單克隆抗體)、熒光激活的細(xì)胞分揀(FACS)、磁珠分離等，來分離與肝細(xì)胞結(jié)合的抗體。可選的收集肝細(xì)胞的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是熟知的。本文還提供了遺傳修飾的小鼠，其基因組對于Fah、Rag2和I12rg基因中的缺失或點(diǎn)突變來說是純合的，使得缺失或點(diǎn)突變導(dǎo)致了功能性FAH、RAG-2和IL_2Ry蛋白的表達(dá)的喪失，其中小鼠是免疫缺陷的，并表現(xiàn)出降低的肝功能，并且其中人類肝細(xì)胞可以在小鼠中擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，缺失導(dǎo)致了B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的完全喪失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小鼠表達(dá)尿激酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶是人類尿激酶。在一種情況下，尿激酶的表達(dá)是由于并入了編碼尿激酶的轉(zhuǎn)基因。另一種情況下，尿激酶的表達(dá)是由于施用了編碼尿激酶、例如分泌或非分泌形式的尿激酶的載體。編碼尿激酶的載體可以是任何類型的適合于投送到小鼠并能夠表達(dá)尿激酶基因的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是腺病毒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是AAV載體。在某些實(shí)施方案中，小鼠是FRG小鼠。在某些實(shí)施方案中，小鼠是FpmRG小鼠。IV.用于擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的遺傳修飾的小鼠株幾個(gè)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)嘗試了在嚙齒動(dòng)物中移入和擴(kuò)增初級人類肝細(xì)胞(美國專利No.6，509,514；PCT公布No.WO01/07338；美國公布No.2005-0255591)。Dandri等(Hepatology33:981-988,2001)首先報(bào)道了帶有人類肝細(xì)胞的小鼠肝臟的成功再增殖。從那以后，其它團(tuán)隊(duì)報(bào)道了將人類肝細(xì)胞成功地移入小鼠。在所有這些研究中，使用的動(dòng)物是在白蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Sandgren等，Cell66:245_256，1991)。uPA的過表達(dá)引起了代謝破壞，導(dǎo)致了小鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡，而不影響不表達(dá)轉(zhuǎn)基因的移植的人類肝細(xì)胞。alb-uPA轉(zhuǎn)基因在各種不同免疫缺陷背景上的雜交，防止了人類細(xì)胞的排斥(Tateno等，Am.J.Pathol.165=901-912,2004；Katoh等，J.Pharm.Sci.96:428_437，2007；Turrini等，Transplant.Proc.381181-1184，2006)。盡管在這些模型中已經(jīng)報(bào)道了高達(dá)70%的移入水平，但系統(tǒng)有幾個(gè)主要的缺點(diǎn)，阻止了其廣泛使用。首先，alb-uPA轉(zhuǎn)基因在生命的早期階段變得失活或丟失。因此，必需在非常早(14日齡)移植人類細(xì)胞并使用對轉(zhuǎn)基因純合的小鼠。這種狹窄的移植時(shí)間窗口嚴(yán)重限制了模型的靈活性。其次，轉(zhuǎn)基因的自發(fā)失活產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因陰性的、健康的小鼠肝細(xì)胞的集合。這些回復(fù)體鼠類肝細(xì)胞，在再增殖過程中與人類細(xì)胞有效地競爭。因此，不可能在人類細(xì)胞連續(xù)移植后再增殖次級接受體。第三，在該模型中，肝臟疾病發(fā)作非常早，從而降低了轉(zhuǎn)基因小鼠的生存力。因此，難以培育出足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠具有出血的傾向，增加了手術(shù)中的死亡率。最后，alb-uPA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，一旦再增殖到人類細(xì)胞超過50%后，將發(fā)生腎臟疾病。據(jù)認(rèn)為，這是由于人類補(bǔ)體對腎上皮的作用而引起的。為了獲得非常高的人類移入水平，必需用抗補(bǔ)體蛋白酶抑制劑處理移植小鼠(Tateno等，Am.J.Pathol.165=901-912,2004)。因?yàn)檫@些許多限制，更強(qiáng)有力的用于擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的系統(tǒng)是高度需要的。本文描述了高度有效的體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法，使用了具有獨(dú)特的基因缺失組合的遺傳修飾的小鼠。人類肝細(xì)胞在小鼠肝臟中的成功移入和擴(kuò)增，需要具有某種程度的肝臟功能障礙的免疫缺陷小鼠。已經(jīng)在多種不同類型的免疫缺陷小鼠、包括RAG-2敲除或SCID小鼠中，用人類肝細(xì)胞再增殖了小鼠肝臟，這兩種小鼠都缺乏B細(xì)胞和T細(xì)胞(美國專利No.6，509,514；PCT公布No.WO01/07338；美國公布No.2005-0255591)。為了獲得肝臟功能障礙，將免疫缺陷小鼠與尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。uPA在小鼠肝臟中的表達(dá)，對于小鼠肝細(xì)胞產(chǎn)生了生長劣勢，促進(jìn)了移植的人類肝細(xì)胞的擴(kuò)增(PCT公布No.WO01/07338)。為了避免uPA轉(zhuǎn)基因的限制，對Fah缺陷小鼠分析了它們使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增的能力。FAH是催化酪氨酸分解代謝的最后一步的代謝酶。具有Fah基因的純合缺失的小鼠，表現(xiàn)出改變的肝臟mRNA表達(dá)和嚴(yán)重的肝臟功能障礙(Grompe等，GenesDev.72298-2307，1993)。當(dāng)Fah突變雜交到裸鼠或RagI+(Mombaerts等，Cell68=869-877,1992)背景上時(shí)，用人類肝細(xì)胞再增殖小鼠肝臟沒有成功，這最可能是由于免疫排斥引起的。Fah缺陷小鼠與N0D/SCID小鼠的雜交(Dick等，StemCell15199-203，1997)，產(chǎn)生的小鼠中觀察到偶爾的人類肝細(xì)胞移入；但是，這些動(dòng)物發(fā)生快速肝衰竭，可能是由于SCID小鼠中存在的雙鏈斷裂DNA修復(fù)缺陷所致。本文公開了缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的Fah+/Rag2v7I12rg+(FRG)三重突變小鼠。Rag2+/I12rg+小鼠在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的(Traggiai等，Science304104-107，2004；GorantIa等，J.Virol.57:2700_2712，2007)。正如在下面的實(shí)施例中描述的，人類肝細(xì)胞在FRG小鼠中的移入和擴(kuò)增令人吃驚地高效。例如，F(xiàn)RG小鼠可以用1百萬個(gè)分離的人類肝細(xì)胞進(jìn)行注射。假設(shè)效率為10%，十萬個(gè)人類肝細(xì)胞移入到接受體小鼠中。那么，擴(kuò)增后從FRG小鼠的平均產(chǎn)量是大約3千萬到大約4千5百萬個(gè)人類肝細(xì)胞，這相當(dāng)于人類肝細(xì)胞增加300到450倍。FRG小鼠也可以用于人類肝細(xì)胞的連續(xù)移植。連續(xù)移植可以包括多只小鼠，每只小鼠可以產(chǎn)生人類肝細(xì)胞的至少大約150倍的擴(kuò)增。含有Fah缺陷的任何免疫缺陷小鼠都適合于本文描述的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，小鼠是在Fah中也有缺陷的Rag2+/I12rg+小鼠。Fah缺陷小鼠可以含有例如Fah的純合缺失，或Fah的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。Fah缺陷(例如通過點(diǎn)突變或純合缺失)導(dǎo)致了FahmRNA表達(dá)和/或有功能的FAH蛋白的顯著降低，或不存在。除了FRG小鼠之外，本文描述了對Fah基因中的點(diǎn)突變純合的免疫缺陷小鼠(Rag2+/I12rg+)(在本文中稱為FpmRG小鼠)，也是用于人類肝細(xì)胞體內(nèi)移入和擴(kuò)增的適合小鼠。V.人類肝細(xì)胞的分離和投送使用Fah缺陷小鼠用于人類肝細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增的顯著優(yōu)點(diǎn)，是使用源自于各種不同來源的人類肝細(xì)胞移入小鼠的能力。正如在下面的實(shí)施例中描述的，人類肝細(xì)胞可以源自于遺體捐獻(xiàn)者或肝臟切除術(shù)，或者可以從商業(yè)來源獲得。此外，正如本文顯示，F(xiàn)RG小鼠可以使用來自于所有年齡的供體的人類肝細(xì)胞，或使用超低溫保藏的肝細(xì)胞，成功地移植。在人類肝細(xì)胞的分離和移植之間通常存在延遲(典型為1到2天)，這可能導(dǎo)致肝細(xì)胞的存活力不佳。但是，即使當(dāng)用存活力有限的肝細(xì)胞移入時(shí)，F(xiàn)RG小鼠系統(tǒng)也能夠擴(kuò)增人類肝細(xì)胞。分離人類肝細(xì)胞的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的。例如，從器官供體或肝臟切除術(shù)分離人類肝細(xì)胞的方法，描述在PCT公布Nos.WO2004/009766和WO2005/028640，以及美國專利Nos.6，995，299和6，509，514中，它們都在此引為參考。肝細(xì)胞可以從經(jīng)皮獲取的或通過腹部外科手術(shù)獲取的肝臟活體組織獲得。用于移植到接受體小鼠、例如FRG小鼠中的人類肝細(xì)胞，通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
任何已知的便利方法從人類肝臟組織分離?？梢詫⒏闻K組織機(jī)械或酶法分散，以提供單細(xì)胞懸液，或可以使用完整人類肝組織的片段。例如，通過常規(guī)的膠原酶灌注(Ryan等，Meth.CellBiol.73:29，1976)，然后進(jìn)行低速離心，將肝細(xì)胞從供體組織分離。然后可以通過不銹鋼篩網(wǎng)過濾，隨后進(jìn)行密度梯度離心，來純化肝細(xì)胞?？蛇x地，其它的用于富集肝細(xì)胞的方法也可以使用，例如熒光激活的細(xì)胞分揀、淘選、磁珠分離、在離心場中淘洗，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的任何其它方法。可以使用類似的肝細(xì)胞分離方法，從接受體小鼠肝臟收集被擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞?？蛇x地，可以使用Guguen-Guillouzo等描述的技術(shù)來制備人類肝細(xì)胞(CellBiol.1壯.1印.6:625-628，1982)，該文獻(xiàn)在此引為參考。簡單來說，分離肝臟或其一部分，并將套管導(dǎo)入門靜脈或門脈分支。然后經(jīng)套管對肝組織進(jìn)行灌注，使用無鈣緩沖液，然后使用在HEPES緩沖液中在氯化鈣溶液(例如大約0.075%氯化鈣)中含有膠原酶(例如大約0.025%膠原酶)的酶溶液，以每分鐘30到70毫升的流速在37°C進(jìn)行灌注。將灌注過的肝組織切碎成小片(例如大約1立方毫米)。在與上述相同的緩沖液中37°C下酶法消化大約10-20分鐘，同時(shí)輕輕攪拌，以產(chǎn)生細(xì)胞懸液。通過將細(xì)胞懸液通過60-80微米的尼龍篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集釋放的肝細(xì)胞。然后將收集到的肝細(xì)胞在PH7.0的冷HEPES緩沖液中使用緩慢離心洗滌，以除去膠原酶和細(xì)胞碎片。非實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以通過三碘苯甲酰氨基葡萄糖梯度離心(參見美國專利No.6，995，299)來除去。人類肝細(xì)胞可以從新鮮組織(例如在死亡后數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得的組織)或新鮮冷凍的組織(例如冷凍和維持在或低于o°c的新鮮組織)獲得。優(yōu)選情況下，人類組織沒有可檢測的病原體，在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方面正常，基本無疾病。用于植入的肝細(xì)胞可以是最近分離的，例如在幾小時(shí)內(nèi)，或者如果細(xì)胞維持在適合的儲(chǔ)存介質(zhì)中，可以在較長的時(shí)期后進(jìn)行移植。在下面實(shí)施例中描述的一種這樣的介質(zhì)是VIASPAN(用于保存腹內(nèi)器官的通用主動(dòng)脈沖洗液和冷藏溶液；也被稱為威斯康辛大學(xué)溶液(UniversityofWisconsinsolution)或UW)。在移植之前，肝細(xì)胞也可以被超低溫保藏。超低溫保藏肝細(xì)胞的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是熟知的，描述在美國專利No.6，136，525中，在此引為參考。除了從器官供體或肝臟切除術(shù)獲得人類肝細(xì)胞之外，用于植入的細(xì)胞也可以是在移植到接受體動(dòng)物中后，發(fā)育或分化成能夠擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞的人類干細(xì)胞或肝細(xì)胞前體細(xì)胞。具有ES細(xì)胞性質(zhì)的人類細(xì)胞從內(nèi)囊胚細(xì)胞團(tuán)(Thomson等，Science282:1145_1147，1998)和發(fā)育的生殖細(xì)胞(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726-13731，1998)分離，并且已經(jīng)產(chǎn)生人類胚胎干細(xì)胞(參見美國專利No.6，200,806，在此引為參考)。正如在美國專利No.6，200,806中公開的，ES細(xì)胞可以從人類或非人類靈長動(dòng)物產(chǎn)生。一般來說，靈長類ES細(xì)胞在存在ES細(xì)胞培養(yǎng)基的情況下，在鼠類胚胎成纖維細(xì)胞的匯合層上分離。ES培養(yǎng)基一般由80%的Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；無丙酮酸，高糖配方，GibcoBRL)，以及20%的胎牛血清(FBS；Hyclone),0.ΙπιΜβ-巰基乙醇(Sigma)，非必需氨基酸儲(chǔ)液(GibcoBRL)構(gòu)成。ES細(xì)胞與成年人中存在的定向“專能”干細(xì)胞相比，區(qū)別性的特點(diǎn)包括ES細(xì)胞在培養(yǎng)中無限期地維持未分化狀態(tài)的能力，以及ES具有發(fā)育成每種不同細(xì)胞類型的潛力。人類ES(hES)表達(dá)SSEA-4，這是被特異性單克隆抗體識(shí)別的糖脂細(xì)胞表面抗原(參見例如Amit等，Devel.Biol.227:271_278，2000)。源自于人類間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的人類肝細(xì)胞也可用于本文描述的方法中。將骨髓衍生的hMSCs連續(xù)暴露于肝源性因子，導(dǎo)致干細(xì)胞分化成具有肝細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞(參見Snykers等，BMCDevBiol.724,2007；Aurich等，Gut.56(3)405-15，2007，每個(gè)文獻(xiàn)在此引為參考)。骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪組織衍生的干細(xì)胞(ADSCs)的肝源性分化也已被描述(參見Talens-Visconti等，WorldJGastroenterol.12(36):5834_45，2006，在此引為參考)。人類肝細(xì)胞也可以從單核細(xì)胞產(chǎn)生。Ruhnke等(Transplantation79(9):1097-103，2005，在此引為參考)描述了從終末分化的外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生類肝細(xì)胞(NeoH印)的細(xì)胞。NeoH印細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)、各種分泌和代謝功能，以及藥物解毒活性方面，與初級人類肝細(xì)胞類似。此外，源自于羊水細(xì)胞的人類肝細(xì)胞，也可以使用在本文描述的方法中。人類ES細(xì)胞系已有，并可用于本文公開的方法中。人類ES細(xì)胞也可以源自于體外受精(IVF)胚胎的植入前胚胎。對未使用過的人類IVF產(chǎn)生的胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果胚胎小于14日齡，在許多國家是允許的，例如新加坡和英國。只有高質(zhì)量的胚胎適合于ES分離。用于將單細(xì)胞人類胚胎培養(yǎng)成擴(kuò)增的囊胚的目前確定的培養(yǎng)條件，已經(jīng)被描述(參見Bongso等，HumR印rod.4:706_713，1989)。人類胚胎與人類輸卵管細(xì)胞的共培養(yǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)生了高的囊胚質(zhì)量。在細(xì)胞共培養(yǎng)或在改進(jìn)的確定培養(yǎng)基中生長的源自于IVF的擴(kuò)增的人類囊胚，允許分離人類ES細(xì)胞(參見美國專利No.6，200,806)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過移植例如通過注射到脾臟中，將人類肝細(xì)胞投送到接受體小鼠。肝細(xì)胞可以通過其它手段投送，例如通過注射到肝實(shí)質(zhì)或門靜脈中。注射到接受體小鼠中的人類肝細(xì)胞的數(shù)量可以是不同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，注射了大約IO5到大約IO7個(gè)人類肝細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，注射了大約5x10s到大約5xl06個(gè)人類肝細(xì)胞。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，注射了大約IO6個(gè)人類肝細(xì)胞。VI.在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞的應(yīng)用可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的許多技術(shù)中的任何一種，從接受體小鼠收集人類肝細(xì)胞。例如，可以將小鼠麻醉，使用導(dǎo)管插管于門靜脈或下腔靜脈。然后可以用適合的緩沖液(例如無鈣和無鎂的EBSS，添加有0.5mMEGTA和IOmMHEPES)對肝臟進(jìn)行灌注，然后進(jìn)行膠原酶處理(例如使用EBSS添加有0.lmg/ml膠原酶XI和0.05mg/mlDNaseI的溶液)。可以將肝臟輕柔地切碎，通過尼龍篩網(wǎng)(例如連續(xù)通過70μm和40μm的尼龍篩網(wǎng))進(jìn)行過濾，然后離心并清洗細(xì)胞?？梢允褂帽?br>技術(shù)領(lǐng)域：
任何熟知的技術(shù)，將從接受體小鼠收集的人類肝細(xì)胞與非人類細(xì)胞或其它污染物(例如組織或細(xì)胞碎片)分離開。例如，這樣的方法包括使用與人類肝細(xì)胞選擇性結(jié)合的抗體。這樣的抗體包括但不限于特異性結(jié)合I類主要組織相容性抗原的抗體，例如抗人類HLA-A、B、C抗體(Markus等，CellTransplantation6:455-462,1997)。特異性針對人類細(xì)胞或人類肝細(xì)胞的抗體，可以用于各種不同的技術(shù)中，包括FACS、淘選或磁珠分離。FACS使用了多種顏色通道、低角度和鈍角光散射檢測通道和阻抗通道，以及其它更復(fù)雜水平的檢測，來分離或分揀抗體結(jié)合的細(xì)胞(參見美國專利No.5，061，620)。磁性分離涉及了使用順磁性顆粒，它們1)與人類特異性抗體結(jié)合；2)與能夠結(jié)合人類特異性抗體的檢測抗體結(jié)合；或3)與能夠結(jié)合生物素化的抗體的親和素結(jié)合。淘選涉及與固相基質(zhì)、例如瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纖維膜或塑料培養(yǎng)皿結(jié)合的單克隆抗體。被抗體結(jié)合的細(xì)胞，可以通過簡單地將固相支持物與樣品物理分離，從樣品中分離出來。正如在下面的實(shí)施例中描述的，在從接受體小鼠收集的擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞中，檢測了參與藥物結(jié)合和解毒的、包括幾種肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)。最近的研究顯示了這些結(jié)合途徑(Kostrubsky等，Drug.Metab.Dispos.281192-1197，2000)和肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Kostrubsky等，Toxicol.Sci.90=451-459,2006)在預(yù)測藥物毒性中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。與對外源藥物例如利福平或PB、或BNF的CYP誘導(dǎo)的正常人類應(yīng)答一樣，在FRG小鼠中擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞對核激素受體轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)合途徑和主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，也允許對這些基因產(chǎn)物在人類藥物代謝和毒性中的作用，進(jìn)行體內(nèi)評估。測試分離的肝細(xì)胞中化合物毒性的方法，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是熟知的，描述在例如PCT公布No.WO2007/022419中，在此引為參考。本公開還考慮到了在接受體小鼠中擴(kuò)增并從其中收集的人類肝細(xì)胞，作為人類肝細(xì)胞的來源，用于在需要這樣的治療的對象中進(jìn)行肝臟重建。通過導(dǎo)入肝細(xì)胞在患者中重建肝組織，是對急性肝衰竭患者的潛在的治療性選擇，也可以在肝臟移植前作為暫時(shí)處理，或?qū)加泄铝⑿源x缺陷的患者用作確定性治療(Bumgardner等，Transplantation6553-61，1998)。肝細(xì)胞重建可以用于例如為基因療法導(dǎo)入遺傳修飾的肝細(xì)胞，或用于替換由于疾病、物理或化學(xué)損傷或腫瘤而引起的肝細(xì)胞損失(美國專利No.6，995，299，在此引為參考)。例如，已經(jīng)報(bào)道了在患有家族性高膽固醇血癥的患者的基因療法中，使用轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞(Grossman等，Nat.Genet.6:335，1994)。此外，擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞可用于放置在人造肝輔助裝置中。在FRG小鼠中擴(kuò)增的并從其中收集的人類肝細(xì)胞，也可用于各種不同的微生物學(xué)研究。許多病原性病毒，包括丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒，只能夠在人類宿主或初級人類肝細(xì)胞中復(fù)制。因此，具有足夠的初級人類肝細(xì)胞來源，對于這些病原體的研究來說是關(guān)鍵的。擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞可用于病毒感染或復(fù)制的研究，或用于研究以鑒定緩和肝病毒感染的化合物。使用初級人類肝細(xì)胞研究肝病毒的方法，描述在歐洲專利No.1552740、美國專利No.6，509,514和PCT公布No.W000/17338,每個(gè)專利在此引為參考。VII.使用Fah缺陷小鼠作為人類肝臟疾病的模型系統(tǒng)免疫缺陷的、Fah缺陷的小鼠也可用作人類肝臟疾病的模型系統(tǒng)。這些用人類肝細(xì)胞移入的的小鼠，包括還包含F(xiàn)ah缺陷的Rag2+/I12rg+小鼠(例如FRG小鼠或FpmRG小鼠)，可用于產(chǎn)生各種不同病因造成的肝臟疾病的模型，這些病因包括但不限于暴露于毒素、傳染病、遺傳病或惡性腫瘤。用人類肝細(xì)胞移入和重建的Fah缺陷小鼠，可用于獲得對這些疾病的更好的了解，以及用于鑒定可以阻止、阻礙或逆轉(zhuǎn)疾病過程的藥劑。例如，F(xiàn)ah缺陷的小鼠可用于測試基因療法載體?；蛑委煹哪康妮d體可以施用于Fah缺陷小鼠，并可以評估載體對植入的人類肝細(xì)胞的影響。同樣地，含有人類肝細(xì)胞的Fah缺陷小鼠可用于篩選化合物，例如毒素或藥劑，在體內(nèi)情況下對人類肝細(xì)胞的影響。懷疑引起或有助于肝臟疾病的藥劑，可以通過將有效量的藥劑施用于Fah缺陷小鼠，并評估藥劑對移入的人類細(xì)胞的功能的影響，來進(jìn)行篩選。例如，F(xiàn)ah缺陷小鼠可用于鑒定能夠抑制或防止由嗜肝性病原體引起的感染的藥劑。為了鑒定例如藥劑，可以將Fah缺陷小鼠暴露于病原體或用病原體接種，在之后或事先施用試驗(yàn)藥劑。然后對小鼠的感染征兆進(jìn)行評估，并任選與沒有用藥劑處理的和/或沒有用病原體感染的對照小鼠進(jìn)行比較。當(dāng)Fah缺陷小鼠被用作由毒素引起的肝臟疾病的模型時(shí)，被注射的人類肝細(xì)胞在暴露于毒劑之前，必須移入并允許擴(kuò)增適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長度。肝細(xì)胞擴(kuò)增所需的時(shí)間量，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，這在本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員的能力范圍內(nèi)。產(chǎn)生最近似模擬相應(yīng)的人類病癥的結(jié)果所需的毒劑的量，可以通過使用多只暴露于漸增劑量的毒劑的Fah缺陷小鼠來確定。毒劑的例子包括但不限于乙醇、對乙酰氨基酚、苯妥英、甲基多巴、異煙胼、四氯化碳、黃磷和鬼筆環(huán)肽。在Fah缺陷小鼠被用作惡性腫瘤肝臟疾病的模型的實(shí)施方案中，惡性腫瘤可以通過暴露于轉(zhuǎn)化劑或通過導(dǎo)入惡性腫瘤細(xì)胞來產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化劑或惡性腫瘤細(xì)胞的導(dǎo)入，可以與人類肝細(xì)胞的最初定殖導(dǎo)入同時(shí)進(jìn)行，或優(yōu)選在人類肝細(xì)胞已經(jīng)開始在宿主動(dòng)物中增殖后進(jìn)行。在轉(zhuǎn)化劑的情況下，優(yōu)選在人類肝細(xì)胞活躍增殖的時(shí)候施用轉(zhuǎn)化劑。這樣的轉(zhuǎn)化劑可以全身性施用于動(dòng)物，或局部施用到肝臟本身中。惡性腫瘤細(xì)胞可以直接接種到肝臟中。例如，對Fah缺陷小鼠使用人類肝細(xì)胞進(jìn)行移植。在人類肝細(xì)胞植入后，對小鼠施用轉(zhuǎn)化劑，或用惡性腫瘤細(xì)胞接種?？蛇x地，轉(zhuǎn)化劑或惡性腫瘤細(xì)胞可以與人類肝細(xì)胞結(jié)合施用。在惡性腫瘤在小鼠中發(fā)生后，這可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的許多方法中的任何一種來確定，F(xiàn)ah缺陷小鼠可以用作人類肝癌的模型。VIII.編碼尿激酶的載體在本文描述的方法的一些實(shí)施方案中，在人類肝細(xì)胞移植之前，向Fah缺陷小鼠施用編碼尿激酶的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶(也被稱為尿激酶纖溶酶原激活物(uPA))是分泌形式的人類尿激酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶是修飾的、非分泌形式的尿激酶(參見美國專利No.5，980，886，在此引為參考)。任何類型的適合于在小鼠中表達(dá)尿激酶的載體都可以考慮。這樣的載體包括質(zhì)粒載體或病毒載體。適合的載體包括但不限于DNA載體、腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體、AAV載體、長臂猿白血病病毒載體、VSV-G、VL30載體、脂質(zhì)體介導(dǎo)的載體，等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體是腺病毒載體。腺病毒載體可以源自于任何適合的腺病毒，包括任何腺病毒血清型(例如但不限于Ad2和Ad5)。腺病毒載體可以是第一、第二、第三和/或第四代腺病毒載體或無腸腺病毒載體(gutlessadenoviralvector)。非病毒載體可以由不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒、磷脂、脂質(zhì)體(陽離子或陰離子)構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體是AAV載體。AAV載體可以是本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何適合的AAV載體。編碼尿激酶的病毒和非病毒載體在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的。例如，編碼人類尿激酶的腺病毒載體描述在美國專利No.5，980,886以及Lieber等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.92(13):6210_4，1995)中。美國專利申請公布No.2005-176129和美國專利No.5，585，362描述了重組腺病毒載體，美國專利No.6，025，195公開了用于肝臟特異性表達(dá)的腺病毒載體。美國專利申請公布No.2003-0166284描述了用于目標(biāo)基因、包括尿激酶的肝臟特異性表達(dá)的腺相關(guān)病毒(AAV)載體。美國專禾IjNos.6，521，225和5，589，377描述了重組AAV載體。PCT公布No.W00244393描述了含有人類尿激酶纖溶酶原激活物基因的病毒和非病毒載體。能夠高水平表達(dá)人類尿激酶基因的表達(dá)載體公開在PCT公布No.WO03087393中。每個(gè)上述專利和出版物在此引為參考。編碼尿激酶的載體可以任選包含表達(dá)控制序列，包括適合的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白編碼基因前的起始密碼子(即ATG)、用于內(nèi)含子以及維持該基因的正確閱讀框以允許mRNA正確翻譯的拼接信號，以及終止密碼子。一般來說，表達(dá)控制序列包括啟動(dòng)子，足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。表達(dá)載體可以包含復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子，以及允許對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行表型篩選的特定基因(例如抗生素抗性盒式元件)。一般來說，表達(dá)載體將包含啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的。啟動(dòng)子可以是組織特異性的。適合的啟動(dòng)子包括胸苷激酶啟動(dòng)子(TK)、金屬硫蛋白I、多角體、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、酪氨酸羥化酶、β-肌動(dòng)蛋白或其它啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼尿激酶的序列位于所需啟動(dòng)子的下游。任選還包含增強(qiáng)子元件，它一般可以位于載體上任何位置而仍然具有增強(qiáng)效應(yīng)。但是，活性增加的量，一般將隨著距離而減小。編碼尿激酶的載體可以通過各種不同的途徑施用，包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或經(jīng)門靜脈進(jìn)行血管內(nèi)灌注。施用的載體的量是變化的，可以使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，以大約IxlO8到大約IxIOki噬斑形成單位的劑量向FRG小鼠施用編碼尿激酶的腺病毒載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，劑量是大約5χ109噬斑形成單位。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，向FRG小鼠施用編碼人類尿激酶的腺病毒載體。與其它類型的病毒載體相比，腺病毒載體具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如它們可以被生產(chǎn)成具有非常高的感染性顆粒滴度；它們感染大量種類的細(xì)胞；它們將基因有效地轉(zhuǎn)移到?jīng)]有正在分裂的細(xì)胞中；以及它們很少整合到客體基因組中，這避免了由于插入性誘變導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)(Douglas和Curiel，ScienceandMedicine,1997年3月/4月，44-53頁；Zern和Kresinam,Hepatology25(2)，484-491，1997)。可用于編碼尿激酶的代表性的腺病毒載體由Stratford-Perricaudet等(J.Clin.Invest.90:626_630，1992)，Graham禾口Prevec(在《分子生物學(xué)方法基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方法7》中(InMethodsinMolecularBiology:GeneTransferandExpressionProtocols7109-128,1991)),以及Barr等(GeneTherapy,2151-155,1995)進(jìn)行了描述，這些文獻(xiàn)在此引為參考。提供了下面的實(shí)施例以說明某些具體特點(diǎn)和/或?qū)嵤┓桨浮＿@些實(shí)施例不應(yīng)該被解釋為將本發(fā)明局限于所描述的具體特點(diǎn)或?qū)嵤┓桨?。?shí)施例正如在下面的實(shí)施例中所描述的，人類肝細(xì)胞的移入和擴(kuò)增在FRG小鼠中高度有效。從宏觀上來說，F(xiàn)RG肝臟在尺寸和形狀上是正常的，組織學(xué)檢查沒有發(fā)現(xiàn)與具有免疫能力的Fah+小鼠有顯著差異。此外，F(xiàn)RG小鼠在施用NTBC時(shí)生長良好，完全可育。在一個(gè)實(shí)施方案中，在FRG小鼠中，肝臟疾病的程度和選擇性壓力可以通過施用和撤銷NTBC進(jìn)行控制(Grompe等，Nat.Genet.70=453-460,1995)。撤銷NTBC為移植的人類肝細(xì)胞提供了選擇優(yōu)勢。能夠容易地控制肝臟疾病的程度，使動(dòng)物的管理和外科手術(shù)更加容易。此外，F(xiàn)ah缺陷突變是缺失，不能通過轉(zhuǎn)基因失活而回復(fù)到野生型。因此，在Fah敲除肝臟中不存在來自內(nèi)源回復(fù)體小鼠細(xì)胞的競爭。這意味著FRG小鼠可以在任何年齡時(shí)用人類肝細(xì)胞移入，并且連續(xù)移植是可行的。此外重要的是，F(xiàn)RG小鼠不需要施用補(bǔ)體抑制劑就可以高度再增殖，而以前的研究顯示，當(dāng)使用人類細(xì)胞再增殖超過50%時(shí)，為了防止腎衰竭，需要使用補(bǔ)體抑制劑(Tateno等，Am.J.Pathol.165=901-912,2004)。這不僅在動(dòng)物管理中具有實(shí)踐重要性，而且也除去了潛在的藥理學(xué)干擾源。人類肝細(xì)胞在FRG小鼠中的再增殖效率可以超過大約70%(小鼠肝臟中70%或以上的肝細(xì)胞是人類的)。來自單只再增殖FRG小鼠的平均產(chǎn)量是大約30-45百萬個(gè)人類肝細(xì)胞。然后可以在被稱為連續(xù)移植的過程中，使用從單只FRG小鼠擴(kuò)增的肝細(xì)胞來再增殖多達(dá)100只次級FRG接受體小鼠。在本文描述的新系統(tǒng)中，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)移植。連續(xù)移植不僅允許使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)大，而且提供了通過幾代接受體小鼠擴(kuò)增具有相同基因型的人類細(xì)胞的手段。它也意味著用于進(jìn)一步移植的高質(zhì)量的人類肝細(xì)胞來源總是在掌握中。在本文中，證實(shí)了至少四輪肝細(xì)胞移植是可行的。此外，從連續(xù)移植分離的人類肝細(xì)胞的存活性可以超過大約80%，肝細(xì)胞容易帖附到膠原蛋白包被的平板上。根據(jù)估計(jì)的10%的移入效率(100，000個(gè)細(xì)胞)和再增殖后最終收獲大約15百萬個(gè)擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞，在每一輪中可以實(shí)現(xiàn)至少150倍的體內(nèi)擴(kuò)增。因此，人類肝細(xì)胞在FRG小鼠中的總擴(kuò)增可以超過500百萬倍。使用來自各種不同來源和不同品類的分離的人類肝細(xì)胞，在FRG小鼠中進(jìn)行人類肝細(xì)胞的移入和擴(kuò)增是可能的。人類肝細(xì)胞的來源包括但不限于遺體捐獻(xiàn)者、肝臟切除術(shù)和可商購來源。正如本文顯示的，使用任何年齡的供體，人類肝細(xì)胞移入和擴(kuò)增都是成功的。此外，在本文中證明，即使在肝細(xì)胞以前被超低溫保藏的情況下，人類肝細(xì)胞也能在FRG小鼠中成功地?cái)U(kuò)增。與需要在肝細(xì)胞分離后立即移植的系統(tǒng)相比，這是明顯的優(yōu)勢。實(shí)施例1:Fah+/Rag2+/I12rg+(FRG)小鼠的產(chǎn)生產(chǎn)生了幾個(gè)品系的免疫缺陷Fah敲除小鼠。在裸鼠、nod/scid或RagI+背景上雜交Fah突變是不成功的。為了產(chǎn)生完全缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞、但是沒有DNA修復(fù)缺陷的免疫缺陷的Fah+小鼠品系，產(chǎn)生了Fah+/Rag2+/I12rg+(FRG)小鼠。將雄性Fah+129S4小鼠(Grompe等，GenesDev.7:2298_2307，1993)與雌性Rag2+/I12rg+小鼠(Taconic)進(jìn)行雜交。所有動(dòng)物都用含有濃度為1.6mg/L的2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)_1，3環(huán)己二酮(NTBC)的飲用水維持(Grompe等，Nat.Genet.70=453-460,1995)。為了證實(shí)每只動(dòng)物的基因型，在從腳趾組織分離的200ng基因組DNA上進(jìn)行了基于PCR的基因分型(Grompe等，GenesDev.7:2298_2307，1993；Traggiai等，Science304:104_107，2004)。FRG小鼠，如果在它們的飲用水中持續(xù)提供NTBC，能夠生長良好并完全可育。從宏觀上來說，F(xiàn)RG小鼠的肝臟在尺寸和形狀上是正常的，組織學(xué)檢查顯示出常規(guī)的Fah+小鼠與FRG小鼠之間沒有差異。與常規(guī)Fah+小鼠相同，NTBC撤銷在FRG小鼠中導(dǎo)致了逐漸的肝細(xì)胞損傷，并最終在4-8周后死亡(Overturf等，Nat.Genet.12=266-273,1996)。實(shí)施例2組織學(xué)和移入檢測分析組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)FAH免疫組織化學(xué)按照以前的描述進(jìn)行(Wang等，Am.J.Pathol.161=565-574,2002)。簡單來說，將固定在pH7.4的10%磷酸鹽緩沖的福爾馬林中的肝臟和腎臟組織，在100%乙醇中脫水，并在58°C下包埋在石蠟中。將去石蠟的4μm切片用蘇木精和曙紅染色。對于免疫組織化學(xué)來說，將切片用3%H2O2的甲醇溶液進(jìn)行處理，用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。在與第一抗體溫育之前，也進(jìn)行了親和素和生物素阻斷。將切片與抗FAH兔抗體或H印Par抗體(DAKO)在室溫溫育2小時(shí)。然后與HRP結(jié)合的第二抗體溫育。信號通過二氨基聯(lián)苯胺(DAB)檢測。FAH酶分析將延胡索酰乙酰乙酸與來自接受體肝臟的胞質(zhì)酶肝臟級份溫育，消失速度在330nm處通過分光光度法測量。野生型和Fah+肝臟被分別用作陽性和陰性對照。延胡索酰乙酰乙酸從尿黑酸通過酶法制備(Knox等，MethodsEnzymo1.2=287-300,1955)。Alu序列的基因組PCR基因組DNA使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen)從肝臟分離。人類Alu序列按照標(biāo)準(zhǔn)程序，使用下列引物通過PCR擴(kuò)增5'-GGCGCGGTGGCTCACG-3‘(SEQIDNO:1)和5'-TTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTC-3‘(SEQIDNO:2)。肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)的RT-PCR總RNA使用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)從肝臟分離?；パa(bǔ)DNA通過反轉(zhuǎn)錄酶，使用oligo-dT引物合成。表1中顯示的引物用于人類或小鼠特異性cDNA擴(kuò)增。表1用于擴(kuò)增肝細(xì)胞特異性基因的RT-PCR引物___引物序列引物描述SEQIDNOATGGATGATTTCGCAGCTTT人類ALB正向3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>人類白蛋白測量每星期一次，從左隱靜脈使用肝素處理過的取血毛細(xì)管收集少量血液。在用Tris緩沖的鹽水稀釋1，000或10，OOOx后，使用人類白蛋白ELISA定量試劑盒(Bethyl)，按照制造商的規(guī)程測量人類白蛋白濃度。熒光免疫細(xì)胞化學(xué)將來自人源化小鼠肝臟的肝細(xì)胞懸浮在Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，在1型膠原蛋白包被的6孔板上鋪板。將貼附的細(xì)胞用4%聚甲醛固定15分鐘，用5%脫脂乳阻斷。兔抗FAH抗體、山羊抗人類白蛋白抗體(Bethyl)、山羊抗小鼠白蛋白抗體(Bethyl)1/200稀釋后用作第一抗體。ALEXAFluoro488抗山羊IgG抗體(Invitrogen)或ALEXAFluoro555抗兔IgG抗體(Invitrogen)被用作第二抗體。照片用AXI0VERT200顯微鏡，使用Nikon數(shù)字相機(jī)捕獲。FACS分析在將接受體的肝臟離散后，將實(shí)質(zhì)細(xì)胞在4°C下與熒光素異硫氰酸酯(FITC)結(jié)合的抗人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A、B、C抗體(BDPharmingen)和藻紅蛋白(PE)結(jié)合的抗小鼠H2-K(b)抗體(BDPharmingen)溫育30分鐘。然后將它們用PBS清洗兩次，使用FACSCALIBUR(BectonDickinson)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。FITC結(jié)合的和PE結(jié)合的IgG被用作陰性對照。熒光原位雜交總基因組DNA探針通過總小鼠和人類基因組DNA的缺口翻譯產(chǎn)生。Cy3_dUTP的摻入按照制造商的推薦(Irwitrogen)進(jìn)行。最終的探針濃度是200ng/yl。將帶有附著的細(xì)胞的載片用100mg/ml的RNase在37°C處理1小時(shí)，并用2XSSC沖洗3次，每次3分鐘。在洗滌步驟后，將載片在70%、90%和100%乙醇中脫水，每種溶液中3分鐘。將染色體在70%甲酰胺/2XSSC中，在75°C變性3分鐘，然后在冰冷的70%、90%和100%乙醇中脫水，每種溶液中3分鐘。將探針混合物在75°C變性10分鐘，在37°C預(yù)雜交30分鐘。將探針涂敷到載片上，在37°C下、在加濕箱中溫育過夜。雜交后的洗滌由三次在50%甲酰胺/2XSSC中的3分鐘沖洗，以及三次在PN緩沖液(0.IMNa2HP04,0.IMNaH2P04,pH8.0,2.5%NONIDETP-40)中的3分鐘沖洗組成，都在45°C下進(jìn)行。然后將載片用Hoechst(0.2μg/ml)復(fù)染，蓋上蓋玻片，在UV熒光(Zeiss)下觀察。實(shí)施例3人類肝細(xì)胞的分離和超低溫保藏按照以前描述的程序，從不用于肝臟移植的供體肝臟分離了人類肝細(xì)胞(Strom等，CellTransplant.15=S105-110，2006)。簡單來說，將肝組織用添加有0.5mMEGTA(Sigma)和HEPES(Cellgro)的不含鈣和鎂的Hanks平衡鹽溶液(Cambrex)灌注，然后用含有100mg/L膠原酶XI(Sigma)和50mg/L脫氧核糖核酸酶I(Sigma)的Eagle's最低基本培養(yǎng)基(Cambrex)通過現(xiàn)有的血管系統(tǒng)進(jìn)行消化。將細(xì)胞用添加有7%牛血清(Hyclone)的Eagle's最低基本培養(yǎng)基以50xg洗滌3次，每次2分鐘。將沉淀的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移到冷的VIASPAN中(用于保存腹內(nèi)器官的通用主動(dòng)脈沖洗液和冷藏溶液；也被稱為威斯康辛大學(xué)溶液(UniversityofWisconsinsolution)或UW)。將運(yùn)輸?shù)母渭?xì)胞以每毫升5xl06個(gè)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移到添加有10%胎牛血清和10%二甲亞砜的VIASPAN中。將超低溫管用紙巾厚厚包裹，在-80°C儲(chǔ)存1天，最后轉(zhuǎn)移到液氮中。對于融化來說，將細(xì)胞在37°C水浴中快速預(yù)熱，并逐漸加入DMEM，以最小化DMSO濃度變化的速度。實(shí)施例4=FRG小鼠肝臟用人類肝細(xì)胞的再增殖尿激酶的過表達(dá)已被顯示在幾種系統(tǒng)中增加了肝細(xì)胞的移入(Lieber等，Hum.GeneTher.61029-1037，1995)。因此，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定在人類肝細(xì)胞移植之前施用表達(dá)尿激酶的腺病毒是否是有益的。表達(dá)分泌形式的人類尿激酶(尿激酶纖溶酶原激活物；uPA)的腺病毒載體，以前已經(jīng)描述過(Lieber等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.926210-6214，1995和美國專利No.5，980，886，在此引為參考)。分離供體肝細(xì)胞，并在分離后24-36小時(shí)進(jìn)行移植。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞在運(yùn)輸過程中保存在VIASPAN溶液中，保持在4°C下。但是，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，移植了超低溫保藏的肝細(xì)胞。供體肝細(xì)胞的存活性和質(zhì)量是高度可變的，鋪板效率在10%到60%的范圍內(nèi)。對于移植來說，使用了下面的通用步驟。在移植前24-48小時(shí)，對成年(6到15周齡的)雄性和雌性FRG小鼠靜脈內(nèi)(眼球后)注射uPA腺病毒(每只小鼠5xl09噬斑形成單位(PFU))。通過27號針，脾內(nèi)注射含有1百萬個(gè)活的人類肝細(xì)胞(通過錐蟲藍(lán)排斥確定)的100μ1Dulbecco's修改的基本培養(yǎng)基。在接下來的6天內(nèi)逐漸撤銷NTBC(第0_2天1.6mg/L；第3-4天0.8mg/L；第5-6天0.4mg/L)，并在移植一周后完全撤銷。停止NTBC兩周后，對動(dòng)物重新使用藥物5天，然后再次撤銷。在三個(gè)獨(dú)立的移植中，在首先接受UPA腺病毒的接受體中觀察到了人類肝細(xì)胞在FRG小鼠中的大量移入。因此，在大多數(shù)隨后的移植實(shí)驗(yàn)中，使用了uPA預(yù)處理的方案?？偟膩碚f，在導(dǎo)入uPA腺病毒方案后，來自9個(gè)不同供體的人類肝細(xì)胞被成功地使用，沒有發(fā)生移入失敗的情況。其中，7個(gè)分離自腦死亡器官供體的肝臟，兩個(gè)分離自外科肝臟切除術(shù)。供體年齡的范圍在1.2到64歲之間(表2)。表2每個(gè)肝細(xì)胞供體的移入結(jié)果的概述移植的小鼠人類白蛋白陽性供體來源年齡(歲)的數(shù)量(%)~WWO6nTA~切除術(shù)5593(33)~~C切除術(shù)5051(20)~WWL221(50)~遺體(超低溫保藏)~~5552(40)~商購(超低溫保藏)ΝΑ8Π3)~~GWW6462(33)~WW5953(60)~MWO64(60)在所有實(shí)驗(yàn)中，使用該方案，至少一個(gè)接受體變得明顯被人類肝細(xì)胞移入(>人類細(xì)胞)，無論使用哪個(gè)細(xì)胞批次。移入通過不同的方法得到了證明，包括組織學(xué)、DNA分析、酶分析以及在后面實(shí)驗(yàn)中的人類血清白蛋白。在由白蛋白水平監(jiān)測的移植中，43個(gè)初級接受體中的17個(gè)(39.5%;范圍為12到67%)變得再增殖(表2和圖3)。其中，7個(gè)高度再增殖(30-90%)，并獲得了>lmg/ml的白蛋白水平。不僅來自遺體肝臟的肝細(xì)胞，而且來自肝臟切除術(shù)的肝細(xì)胞，也移入了。此外，超低溫保藏的細(xì)胞也成功地移入。在高度移入的小鼠(>30%再增殖)中，被移植的FRG小鼠的重量在第二次NTBC撤銷期間穩(wěn)定，但是對I12rg雜合的較少免疫缺陷的同胎仔畜(Fah+/Rag2+/I12rg+)植入同樣細(xì)胞后持續(xù)地?fù)p失體重(圖la)。在三重突變小鼠中這種體重的穩(wěn)定，表明植入的人類肝細(xì)胞代替了患病的Fah+接受體肝細(xì)胞的功能。在體重完全穩(wěn)定后(在最初移植后2-3個(gè)月)，收獲接受體肝臟。從宏觀來說，F(xiàn)RG肝臟在形狀和重量上正常，沒有肉眼可見的結(jié)節(jié)。對人類特異性AluDNA序列進(jìn)行的基因組PCR，在FRG接受體肝臟中是陽性的，而I12rg雜合子都是陰性的(圖lb)。為了直接證實(shí)再增殖細(xì)胞的肝細(xì)胞功能，分析了FAH酶活性(Knox等，MethodsEnzymo1.2:287_300，1955)。接受體小鼠肝臟具有相當(dāng)量的FAH酶活性，等于或超過正常小鼠肝臟(圖lc-e)。因?yàn)镕AH專門表達(dá)在完全分化的肝細(xì)胞中，這表明植入的人類肝細(xì)胞，當(dāng)移入到小鼠肝臟時(shí)，不是去分化的或異常的。FAH的免疫染色證實(shí)，超過70%的肝臟實(shí)質(zhì)被FAH陽性人類肝細(xì)胞再增殖(圖If和圖Ig)。使用另外的接受體肝臟進(jìn)行了組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查(圖2a和圖2b)。FAH陽性人類肝細(xì)胞顯示出完全整合到接受體肝臟的結(jié)構(gòu)中。在幾個(gè)接受體中，移入的肝細(xì)胞占據(jù)了超過80%的實(shí)質(zhì)，而不擾亂接受體肝臟的組織(圖2b、2e和2f)。無性系擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞，可以在形態(tài)學(xué)上，通過尺寸、以及它們的蒼白的細(xì)胞質(zhì)，與小鼠肝細(xì)胞清楚地區(qū)分(圖2c和圖2d)。人類肝細(xì)胞的尺寸相對較大，它們的細(xì)胞質(zhì)看起來明亮，可能是因?yàn)槿缫郧皥?bào)道的糖原積累(Meuleman等，!fepatology41:847_856，2005)。FAH陽性的肝細(xì)胞對于H印Par抗體也是陽性的，該抗體特異性標(biāo)記人類肝細(xì)胞，但是不標(biāo)記小鼠對應(yīng)物(圖2e和圖2f)。相反，F(xiàn)AH陰性區(qū)域顯示出壞死性炎癥，并包含發(fā)育異常的肝細(xì)胞，與在撤銷NTBC后在常規(guī)Fah+小鼠中的發(fā)現(xiàn)一致。為了檢查再增殖的人類肝細(xì)胞是否表達(dá)成熟的肝細(xì)胞特異性基因，在從接受體肝臟提取的信使RNA上進(jìn)行了RT-PCR。人類白蛋白(ALB)、FAH、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)和UGTlAl基因在接受體肝臟中豐富表達(dá)(圖3a、圖6c和圖7)。通過測量血液人類白蛋白濃度，也評估了肝細(xì)胞的功能性。使用了對人類白蛋白特異性的ELISA試劑盒，檢測閾值是0.05yg/ml，使用1100稀釋的樣品。人類白蛋白首次在移植到初級接受體中后4到10周時(shí)檢測到。盡管最初在水平上存在某些波動(dòng)，但然后濃度相對穩(wěn)定地持續(xù)增加幾周(圖3b和圖3c)。為了保持高度再增殖的小鼠長期存活，可能需要藥理學(xué)蛋白酶抑制劑；由供體肝細(xì)胞產(chǎn)生的人類補(bǔ)體可能損傷接受體腎臟(參見Tateno等，Am.J.Pathol.165=901-912,2004)。因此，對幾只(η=3)高度再增殖的小鼠進(jìn)行了長期的觀察。這些小鼠在撤銷NTBC4個(gè)月時(shí)沒有損失體重，它們的人類白蛋白濃度保持穩(wěn)定。此外，它們的腎臟在收獲時(shí)在宏觀和組織學(xué)上是正常的(圖2g)。實(shí)施例5人類肝細(xì)胞的連續(xù)移植以前描述的肝臟異體再增殖模型的一個(gè)限制是不能進(jìn)一步擴(kuò)增移入的人類肝細(xì)胞。為了測試在FRG小鼠系統(tǒng)中連續(xù)移植的可行性，對高度再增殖的初級接受體的肝臟(大約70%人類細(xì)胞)進(jìn)行灌注，使用標(biāo)準(zhǔn)的膠原酶消化步驟收集實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞。將用人類細(xì)胞再增殖的小鼠麻醉，用24號導(dǎo)管對門靜脈或下腔靜脈進(jìn)行插管。使用添加有0.5mMEGTA和IOmMHEPES的不含鈣和鎂的EBSS，對肝臟灌注5分鐘。將溶液替換為添加有0.lmg/ml膠原酶XI(sigma)和0.05mg/mlDNaseI(sigma)的EBSS,灌注10分鐘。將肝臟在第二種溶液中輕輕切碎，連續(xù)地通過70μm和40μm的尼龍篩網(wǎng)進(jìn)行過濾。在150xg離心5分鐘后，將沉淀進(jìn)一步以50xg清洗兩次，每次2分鐘。通過錐蟲藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞的數(shù)量和存活性。將懸浮在100μ1DMEM中的1百萬個(gè)活細(xì)胞，通過27號針注射到接受體脾臟中。將肝細(xì)胞移植到次級FRG接受體中，而不分離Fah陽性人類和Fah陰性小鼠肝細(xì)胞。與用于初級移入的細(xì)胞相反，通過該方式收獲的人類肝細(xì)胞的存活性>80%，它們可以容易地粘附在膠原蛋白包被的培養(yǎng)板上(圖4c_e)。在移入次級接受體后，連續(xù)移植以同樣的方式繼續(xù)進(jìn)行，植入到第三級和第四級接受體中。在每一代中，某些但不是所有接受體小鼠的血液人類白蛋白，變得高度陽性(圖4a)。在連續(xù)移植接受體中高度再增殖小鼠的百分率較高(17/28，與7/43相比)，白蛋白增加的速度也更一致(圖3e)。這可能表明肝細(xì)胞的連續(xù)傳代富集了最可移植的人類肝細(xì)胞，或者它可能僅僅簡單地反映了從供體小鼠新鮮收獲的細(xì)胞的較高的質(zhì)量和存活性。來自白蛋白陽性小鼠的肝臟樣品的基因組PCR，顯示出在每一代中存在人類DNA(圖4b)。由人類肝細(xì)胞進(jìn)行的肝臟再增殖也由針對FAH的熒光免疫染色所證實(shí)(圖4c-e)。組織學(xué)檢測顯示出移入的人類肝細(xì)胞在每一代中形態(tài)學(xué)相似，是明顯的FAH陽性(圖4f-h)。實(shí)施例6肝細(xì)胞再增殖不是細(xì)胞融合的結(jié)果最近在尿激酶轉(zhuǎn)基因小鼠中用靈長類細(xì)胞進(jìn)行的肝臟再增殖的報(bào)道，證明了細(xì)胞融合可能潛在地造成了表觀上的“肝細(xì)胞再增殖”(Okamura等，Histochem.CellBiol.125247-257,2006)。因?yàn)樵谠撗芯恐惺褂昧藆PA轉(zhuǎn)基因小鼠，這些發(fā)現(xiàn)提出了在其它小鼠肝臟人源化的報(bào)道中，也是細(xì)胞融合也可能是其機(jī)理。造血細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的細(xì)胞融合，也已經(jīng)在Fah缺陷小鼠中觀察到(Wang等，Nature422:897_901，2003)。小鼠和人類細(xì)胞之間的細(xì)胞融合將極大地降低人源化小鼠肝臟對藥物應(yīng)用的價(jià)值。為了證實(shí)再增殖的肝細(xì)胞在起源上是真正人類的，進(jìn)行了針對人類或小鼠特異性白蛋白和FAH的雙重免疫染色。大多數(shù)(>95%)的小鼠白蛋白陽性肝細(xì)胞事實(shí)上對FAH是陰性的，大多數(shù)FAH陽性肝細(xì)胞對小鼠白蛋白是陰性的(圖5a-c)。另一方面，幾乎所有(>90%)的人類白蛋白陽性的肝細(xì)胞也是FAH陽性的，而剩余的肝細(xì)胞是雙重陰性的(圖5d-f)。白蛋白是分泌的蛋白，因此通過從其它細(xì)胞攝取異源白蛋白，細(xì)胞可以顯示出抗體陽性。為了進(jìn)一步證實(shí)沒有細(xì)胞融合，將人類和小鼠抗主要組織相容性復(fù)合物(MHC)抗體用于流式細(xì)胞術(shù)。每種抗體被證實(shí)是種屬特異性的(圖5g-j)。在高度再增殖的肝臟中，沒有發(fā)現(xiàn)對這兩個(gè)物種的表面標(biāo)志物陽性的肝細(xì)胞(圖5k和圖51)。最后，使用人類和小鼠全基因組探針在來自高度再增殖的移植接受體上進(jìn)行了熒光原位雜交(FISH)。來自高度再增殖的初級(嵌合小鼠#531)和第四級(嵌合小鼠#631)小鼠的肝細(xì)胞，與人類或小鼠總基因組DNA進(jìn)行雜交。記錄了對人類探針或鼠類探針陽性的細(xì)胞的百分率(表3)。對照是純的人類和小鼠肝細(xì)胞，或人類和小鼠肝細(xì)胞的等量混合物。如果在嵌合肝臟中發(fā)現(xiàn)的人類細(xì)胞是細(xì)胞融合的產(chǎn)物，許多肝細(xì)胞將對人類和小鼠探針是雙重陽性的，因此對小鼠和人類DNA陽性的細(xì)胞的百分率將超過100%。反之，則百分率的總和很近似于100%，與在人類和鼠類肝細(xì)胞的混合物中進(jìn)行時(shí)一樣。此外，在高度再增殖小鼠的脾臟中檢測到了人類肝細(xì)胞(圖2h)，盡管事實(shí)上脾臟不含能夠用作人類細(xì)胞的融合配偶體的鼠類肝細(xì)胞。因此，雙重陽性細(xì)胞(融合產(chǎn)物)不占人類細(xì)胞的主要部分。表3在再增殖肝細(xì)胞中檢測人類和小鼠DNA小鼠探針陽性(％)|人類探針陽性(％)|百分率總和<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>合在一起，這些結(jié)果表明融合事件如果發(fā)生的話，是罕見的，即使在進(jìn)行連續(xù)移植時(shí)，絕大多數(shù)的再增殖細(xì)胞也是純粹人類來源的。因此，在FRG小鼠中擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞只具有人類遺傳和生物化學(xué)性質(zhì)。實(shí)施例7人源化小鼠中藥物代謝的功能定性檢測了嵌合小鼠中人類肝臟特異性基因的基本表達(dá)和誘導(dǎo)。按照Kostrubsky等(DrugMetab.Dispos.27887-894，I"9)和Wen等(DrugMetab.Dispos.3O977-984，2002)的描述，分別進(jìn)行了培養(yǎng)的肝細(xì)胞的睪酮代謝和乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮-0-脫乙基酶(EROD)活性的評估。RNA分離、cDNA合成和實(shí)時(shí)PCR按照Komoroski等(DrugMetab.Dispos.32:512-518，2004)的描述進(jìn)行。引物從AppliedBiosystems獲得，特異性針對人類CYPlAl(Hs00153120_ml)、CYP1A2(Hs00167927_ml)、CYP3A4(Hs00430021_ml)、CYP3A7(Hs00426361_al)、CYP2B6(Hs00167937_gl)、CYP2D6(Hs00164385_al)、多藥抗性相關(guān)蛋白MRP2(Hs00166123_ml)、膽鹽輸出泵BSEP(Hs00184829_ml)、CAR(Hs00231959_ml)、白蛋白(Hs00609411_ml)、HNF4a(Hs00230853_ml)、親環(huán)蛋白(Hs99999904_ml)和小鼠肌動(dòng)蛋白(Ma00607939_sl)。建立了分離的肝細(xì)胞培養(yǎng)物，并暴露于細(xì)胞色素P450基因的原型誘導(dǎo)物。結(jié)果證明，細(xì)胞色素(CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A7)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BSEP、MRPT)和藥物結(jié)合酶(UGTlAl)的基本基因表達(dá)水平，與在培養(yǎng)的正常成年人類肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的完全一樣(圖6c，圖7)。此外，由化合物例如β-萘黃酮(BNF)、苯巴比妥(PB)和利福平(Rif)誘導(dǎo)的基因樣式，與從正常人類細(xì)胞所預(yù)計(jì)的相同。除了人類藥物代謝基因的mRNA表達(dá)水平之夕卜，還測量了人類CYPlA和3A家族成員的酶活性。已知在人類肝臟中，乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮-0-脫乙基酶(EROD)活性由CYPlAl和1A2介導(dǎo)。結(jié)果顯示，在人源化小鼠肝臟細(xì)胞中，EROD活性通過先前暴露于BNF而特異性、強(qiáng)有力地誘導(dǎo)(圖6a)。相反，先前暴露于PB或利福平，特異性誘導(dǎo)了睪酮轉(zhuǎn)化成6-β-羥基睪酮，這是CYP3A4介導(dǎo)的代謝的特異性度量(圖6b)。因此，在這些標(biāo)準(zhǔn)藥物代謝分析中，來自再增殖FRG肝臟的肝細(xì)胞與正常的人類成年肝細(xì)胞不能區(qū)分開。實(shí)施例8在肝細(xì)胞再增殖之前消除巨噬細(xì)胞初級移入沒有在100%的FRG接受體小鼠中發(fā)生，即使預(yù)先施用尿激酶腺病毒。有可能在FRG小鼠中存在的正常數(shù)量肝臟巨噬細(xì)胞，通過促進(jìn)先天免疫應(yīng)答，限制了人類細(xì)胞移入。為了消除可能的巨噬細(xì)胞引發(fā)的免疫應(yīng)答，在人類肝細(xì)胞移植之前對FRG小鼠進(jìn)行了巨噬細(xì)胞消除。巨噬細(xì)胞消除可以使用多種本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的方法中的任何一種來實(shí)現(xiàn)，包括化學(xué)消除(Schiedner等，Mol.Ther.7=35-43,2003)或通過使用抗體(McKenzie等，Blood106:1259-1261,2005)。巨噬細(xì)胞也可以使用含有氯膦酯的脂質(zhì)體(vanRijn等，Blood102=2522-2531,2003)進(jìn)行刪除。其它用于消除巨噬細(xì)胞的化合物和組合物，描述在美國專利公布No.2004-0141967和PCT公布No.WO02/087424中，它們在此引為參考。在消除巨噬細(xì)胞后，使用人類肝細(xì)胞，按照在本文前面的實(shí)施例中描述的方法，對FRG小鼠進(jìn)行移植或連續(xù)移植。實(shí)施例9在FpmRG小鼠中人類肝細(xì)胞的移入FRG小鼠在Fah基因的外顯子5中含有缺失(Fah"。為了證實(shí)人類肝細(xì)胞可以被移入其它Fah缺陷的模型中，并在其中擴(kuò)增，產(chǎn)生了在Fah中含有點(diǎn)突變的小鼠品系。這些小鼠被稱為Fah點(diǎn)突變(Fahpm)小鼠，在Fah基因中具有點(diǎn)突變，導(dǎo)致了在FahmRNA中的錯(cuò)誤拼接并失去外顯子7(Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:641_645，2001，在此引為參考)。在Fahpm小鼠和Fah"^5小鼠之間沒有檢測到表型的差異。將Fahpm小鼠與Rag2+/I12rg+小鼠雜交(如在實(shí)施例1中所述)，產(chǎn)生了純合的FahP7Rag2+/I12rg+(FpmRG)三重突變小鼠。按照在實(shí)施例4中描述的方法，用人類肝細(xì)胞移植兩組Fahpm小鼠。在肝細(xì)胞移植前大約24-48小時(shí)，小鼠接受uPA腺病毒的靜脈內(nèi)注射(眼球后)。為了比較，平行地用人類肝細(xì)胞移植FRG小鼠。在移植后2和3個(gè)月，在Fahpm小鼠的外周血中檢測到了顯著高水平的(23yg/ml)人類血清白蛋白。這些人類血清白蛋白的血液水平，與在同時(shí)移植的FRG小鼠中發(fā)現(xiàn)的水平相似。這些結(jié)果表明，F(xiàn)ahpm小鼠可以用人類肝細(xì)胞再增殖到與FRG小鼠同樣的程度。因此，人源化的肝臟再增殖不是具有Fa"突變的FRG小鼠獨(dú)有的，而是可以用任何品系的Fah缺陷小鼠實(shí)現(xiàn)。本公開提供了用于人類肝細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增的方法。本公開還提供了可用于體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的遺傳修飾的免疫缺陷小鼠。顯然，所描述的方法的準(zhǔn)確細(xì)節(jié)可以被改變或修飾，而不背離所述發(fā)明的精神。我們對落于所附權(quán)利要求書的范圍和精神內(nèi)的所有這種修飾和改變的要求權(quán)利。權(quán)利要求用于體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法，包括1)將分離的人類肝細(xì)胞移植到Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠中，其中小鼠的Fah表達(dá)缺陷；2)使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增至少大約2周；以及3)從小鼠收集人類肝細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的方法，其中小鼠對Fah基因中的缺失是純合的。3.權(quán)利要求2的方法，其中小鼠是Fah+/Rag2+/I12rg+(FRG)小鼠。4.權(quán)利要求1的方法，其中小鼠對Fah基因中的點(diǎn)突變是純合的。5.權(quán)利要求4的方法，其中小鼠是FahP7Rag2v7ll2rg+(PmRG)小鼠。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中在注射人類肝細(xì)胞之前，將編碼人類尿激酶的載體施用于小鼠。7.權(quán)利要求6的方法，其中尿激酶是分泌形式的尿激酶。8.權(quán)利要求6的方法，其中尿激酶是非分泌形式的尿激酶。9.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的方法，其中載體是腺病毒載體。10.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的方法，其中載體是腺相關(guān)病毒載體。11.權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的方法，其中載體經(jīng)靜脈內(nèi)施用。12.權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)的方法，其中載體在肝細(xì)胞注射前大約24到48小時(shí)施用。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中在肝細(xì)胞注射之前，對小鼠施用2-(2_硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?-1，3環(huán)己二酮(NTBC)。14.權(quán)利要求13的方法，其中NTBC以大約0.05mg/kg/天到大約0.10mg/kg/天的劑量施用。15.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的方法，其中小鼠在肝細(xì)胞注射后，還施用NTBC至少大約3天。16.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的方法，其中小鼠在肝細(xì)胞注射后，還施用NTBC至少大約6天。17.權(quán)利要求16的方法，其中在肝細(xì)胞注射后，NTBC的劑量在6天的時(shí)間期間中逐漸減少。18.權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)的方法，其中NTBC在飲用水中進(jìn)行施用。19.權(quán)利要求18的方法，其中在肝細(xì)胞注射前在飲用水中進(jìn)行施用的NTBC的濃度是大約1到大約8mg/L。20.權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)的方法，其中NTBC在食物中進(jìn)行施用。21.權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)的方法，其中NTBC通過注射施用。22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增至少大約6周。23.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中使人類肝細(xì)胞擴(kuò)增多達(dá)大約6個(gè)月。24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中分離的人類肝細(xì)胞被注射到小鼠的脾臟或門靜脈中。25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞從小鼠的肝臟收集。26.權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的方法，其中人類肝細(xì)胞從器官供體的肝臟分離，從外科切除術(shù)分離，或源自于干細(xì)胞、單核細(xì)胞或羊水細(xì)胞。27.權(quán)利要求26的方法，其中肝細(xì)胞在注射前超低溫保藏。28.權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)的方法，還包括在肝細(xì)胞注射前從FRG小鼠消除巨噬細(xì)胞。29.權(quán)利要求28的方法，其中消除巨噬細(xì)胞包括化學(xué)消除。30.權(quán)利要求28的方法，其中消除巨噬細(xì)胞包括使用特異性結(jié)合巨噬細(xì)胞的抗體。31.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法，還包括通過連續(xù)移植擴(kuò)增所收集的人類肝細(xì)胞。32.遺傳修飾的小鼠，其基因組對于Fah、Rag2和I12rg基因中的缺失或一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變是純合的，使得所述缺失或點(diǎn)突變導(dǎo)致功能性FAH、RAG-2和IL_2Ry蛋白的表達(dá)的喪失，其中小鼠是免疫缺陷的，并表現(xiàn)出降低的肝功能，并且其中人類肝細(xì)胞可以在小鼠中擴(kuò)增，33.權(quán)利要求32的小鼠，其中所述缺失或點(diǎn)突變導(dǎo)致B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的完全喪失。34.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的小鼠，其中小鼠是FRG小鼠。35.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的小鼠，其中小鼠是FpmRG小鼠。36.權(quán)利要求32-35任一項(xiàng)的小鼠，其中小鼠表達(dá)人類尿激酶。37.權(quán)利要求36的小鼠，其中尿激酶是分泌形式的尿激酶。38.權(quán)利要求36的小鼠，其中尿激酶是非分泌形式的尿激酶。39.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的小鼠，其中人類尿激酶的表達(dá)是摻入編碼人類尿激酶的轉(zhuǎn)基因所致。40.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的小鼠，其中人類尿激酶的表達(dá)是施用編碼人類尿激酶的載體所致。41.權(quán)利要求40的小鼠，其中載體是腺病毒載體。42.權(quán)利要求40的小鼠，其中載體是腺相關(guān)病毒載體。全文摘要本文描述了使用還有延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的免疫缺陷小鼠，在體內(nèi)擴(kuò)增人類肝細(xì)胞的方法。方法包括將人類肝細(xì)胞移植到免疫缺陷和Fah缺陷小鼠中，允許肝細(xì)胞擴(kuò)增，以及收集擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞。方法還允許將人類肝細(xì)胞連續(xù)移植到次級、第三級、第四級或其它小鼠中。還提供了含有純合的Fah、Rag2和112rg基因中的缺失或點(diǎn)突變的突變小鼠。文檔編號C12N5/071GK101809156SQ200880100708公開日2010年8月18日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日發(fā)明者姆森·奧-達(dá)利米,希薩雅·阿祖嗎,馬克·A·凱,馬庫斯·葛洛佩申請人:俄勒岡健康科學(xué)大學(xué);利蘭·斯坦福初級大學(xué)理事會(huì)