專(zhuān)利名稱：：Ace2多肽的制作方法ACE2多肽本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的領(lǐng)域。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE2)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。它作為羧肽酶錨固于膜上，作為受體主要在肺細(xì)胞、腎細(xì)胞和心臟細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)并裂解各種肽底物。知名的代表底物是血管緊張素-II(Angn)，其被裂解為血管緊張素l-7(Ang1-7);血管緊張素-I，其被裂解為血管緊張素l-9;同樣地，還有即elin和緩激肽。AngII和Ang1-7是腎素_血管緊張素系統(tǒng)的拮抗劑。ACE2通過(guò)控制肽比例而決定性地負(fù)責(zé)血管厚度的調(diào)整以及內(nèi)皮細(xì)胞的通透性并因此影響有機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。ACE2的表達(dá)尤其受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)并且在各種炎癥中降低，這繼而導(dǎo)致Angn(ACE2最重要的底物之一)的病理性增加。ACE2用于治療急性肺病的兩種形式ARDS或ALI，隨這兩種病在肺中出現(xiàn)下調(diào)的ACE2表達(dá)。對(duì)于該種治療使用重組的可溶性人ACE2，其被全身性給予從而在最短的時(shí)間內(nèi)供整個(gè)有機(jī)體使用，以便降低增加的AngII濃度并與此同時(shí)產(chǎn)生Ang1_7。這補(bǔ)償了增加的AngII濃度的負(fù)性作用。為此，很希望擁有一種產(chǎn)物，其具有合適的藥學(xué)特征相應(yīng)地，其具有在有機(jī)體內(nèi)良好的分布、藥學(xué)上有意義的半衰期以及具有低免疫原性的適宜的物質(zhì)。特別是該產(chǎn)物必須是有酶活性的、可良好溶解的以及在溶液中穩(wěn)定的，并且可以以高純度可重復(fù)地和經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行制備。Tipnis等人(JBiolChem.275(43)(2000):33238-43)描述了ACE2(在此文中還被稱為ACEH)的分離和其cDNA的分離。通過(guò)在CH0細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)獲得了具有120kDa摩爾質(zhì)量的糖基化的蛋白質(zhì)單體。去糖基化后該蛋白質(zhì)具有85kDa的質(zhì)量。Donoghue(CircRes.87(5)(2000):1-9)描述了可溶性ACE2在CH0細(xì)胞中的表達(dá)，它沒(méi)有完全被糖基化，并且表征為約90kDa的摩爾質(zhì)量。此外，該文獻(xiàn)還涉及各種ACE2序列的序列對(duì)比和抗ACE2抗體。W02004/023270A2涉及ACE2單體在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中表達(dá)后ACE2的結(jié)晶。在此情況下，該蛋白質(zhì)的摩爾質(zhì)量在質(zhì)譜分析后給出89.6kDa。有效的酶替代療法的治療型轉(zhuǎn)變需要這樣的制備方法，其經(jīng)濟(jì)地和可重復(fù)地制備高純度的藥學(xué)上有效的產(chǎn)物。ACE2的可溶的、細(xì)胞外截段包含7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。非糖基化的ACE2是不溶的，傾向于聚集，是增強(qiáng)的免疫原并且具有縮短的半衰期。此外，它具有小的流體力學(xué)直徑，其主要地不會(huì)負(fù)面地影響純化。因此，本發(fā)明的目的是提供具有好的體內(nèi)半衰期的高活性ACE2。該目的通過(guò)權(quán)利要求的具體內(nèi)容來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明涉及重組ACE2多肽，其以二聚體存在。優(yōu)選的是糖基化的重組ACE2多肽，其中ACE2多肽單體的糖基基團(tuán)具有總計(jì)至少10、11、12、13、14、15或至少16個(gè)唾液酸殘基，優(yōu)選14個(gè)唾液酸殘基，并且其中ACE2多肽以二聚體存在。同樣地，本發(fā)明包含具有本文所述的糖基化的、摩爾加權(quán)平均的和進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明的ACE2單體。優(yōu)選所述二聚體是同二聚體，其單體單位特別地具有相同的序列和糖基化。通常，所述單體單位是非共價(jià)結(jié)合的二聚體。單體可以通過(guò)變性步驟毫無(wú)困難地從二聚體獲得。優(yōu)選所有本文所述的糖基化不但涉及二聚體而且也涉及單體，包括二聚體復(fù)合物的一個(gè)或兩個(gè)單體。特別優(yōu)選所述二聚體包含兩個(gè)鋅離子。6"唾液酸殘基"，特別地理解為N-乙酰神經(jīng)氨酸類(lèi)型(Neu5Ac)的殘基，特別是在N-或O-糖基化。原則上，對(duì)于其半衰期從而其效應(yīng)而言，治療劑的穩(wěn)定性是非常重要的標(biāo)準(zhǔn)。迄今為止，重組人ACE2僅鑒定為單體，并且在關(guān)于其功能、其晶體結(jié)構(gòu)以及關(guān)于其與高特異性抑制劑相互作用的文獻(xiàn)中也被描述為如此。因此，例如在參考Vickers等人(JBiolChem277(17)，2002:14838-14843)的情況下，Towler等人(JBiolChem279(17)，2004:17996-18007)描述了ACE2在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中的表達(dá)，其在作為最后純化步驟的小心的大小排阻色譜法之后以單體獲得。單體的摩爾質(zhì)量為89.6kDa。商購(gòu)可得的ACE2同樣以單體形式存在(來(lái)自R&DSystems,編錄號(hào)933-ZN,批號(hào)FIU035071)，其根據(jù)Tipnis等人(2000，同上)中的所述方法而制備，所不同的是，使用NSO代替CHO細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)。它被描述為單體，其不但在還原條件下而且在非還原條件下具有120kDa的摩爾重量。根據(jù)Donoghue等人(CircRes87，2000:el-e9)，ACE2單體在CHO細(xì)胞中表達(dá)，其分泌后顯示90kDa的分子量。所有本文列出的文獻(xiàn)和出版物通過(guò)弓|用而合并入本文。根據(jù)本發(fā)明，為了使根據(jù)本發(fā)明的治療劑穩(wěn)定，發(fā)展了一種方法，其僅導(dǎo)致穩(wěn)定的ACE2二聚體，所述二聚體相比于ACE2單體不但具有生產(chǎn)技術(shù)上的而且具有藥學(xué)上的優(yōu)點(diǎn)。所述二聚體化帶來(lái)下列的優(yōu)點(diǎn)在生理溶液中更好的溶解度和生物利用率該二聚體顯示高的溶解度和更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和利用率。無(wú)聚集體形成該ACE2二聚體了形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而不會(huì)附加更多的ACE2分子以形成二聚體。減少的蛋白酶攻擊因?yàn)閱未蔚鞍踪|(zhì)切割后，在此所有的可能性都表明C-末端部分在二聚體內(nèi)部，該c-末端不被降解。增加的半衰期由于低免疫原性、更好的溶解度和降低的對(duì)蛋白水解的易感性，所述蛋白質(zhì)的半衰期增加了。簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)純化ACE2二聚體的流體力學(xué)直徑基于其結(jié)構(gòu)和大于計(jì)算直徑的突出的溶劑化外殼。因此，ACE2二聚體能夠通過(guò)大小分離柱從來(lái)自蛋白質(zhì)表達(dá)的常規(guī)雜質(zhì)，例如血清白蛋白(67kDa)中出色地被分離。優(yōu)選重組ACE2多肽在可能的N-糖基化位置的至少80%處被糖基化并且具有大于10%(總ACE2的質(zhì)量％)或11%、12%、13%、14%，優(yōu)選大于15%或16%、17%、18%、19%，特別地大于20%或21%、22%、23%、24%或25%的糖部分。發(fā)展了一種制備方法，其可重復(fù)地制備高純度的且有酶活性的、高度復(fù)雜的糖基化ACE2。該產(chǎn)物表征為其高的糖部分(>20質(zhì)量％)和復(fù)雜的、高度支化的、部分帶負(fù)電荷的糖結(jié)構(gòu)。這對(duì)產(chǎn)物的溶解度、生物利用率、酶活性以及藥學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生積極作用。通過(guò)選擇合適的表達(dá)構(gòu)建體、合適的表達(dá)宿主、優(yōu)化的篩選策略，通過(guò)針對(duì)細(xì)胞代謝經(jīng)調(diào)整的培養(yǎng)基以及通過(guò)細(xì)致的伴隨克隆分析和篩選，可以制備分泌所希望產(chǎn)物的細(xì)胞系。ACE2已經(jīng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9和小鼠細(xì)胞NS0中進(jìn)行了表達(dá)。該物質(zhì)主要在體外試驗(yàn)中使用。ACE2在CH0細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)也有結(jié)果。至今還沒(méi)有產(chǎn)生具有方法適宜的生產(chǎn)率的細(xì)胞系。此外，還沒(méi)有進(jìn)行關(guān)于產(chǎn)物性質(zhì)(特別是關(guān)于N-糖基化)的相應(yīng)的克隆篩選。蛋白質(zhì)的溶解度不僅由其氨基酸序列而且由其折疊以及由翻譯后修飾所決定。主要是所負(fù)載的糖結(jié)構(gòu)，其決定性地增加蛋白質(zhì)的溶解度并影響其藥學(xué)特征。因此，就EPO而言，可以表明，復(fù)雜的支化糖結(jié)構(gòu)的存在積極影響這些蛋白質(zhì)的半衰期。原則上，為了進(jìn)行ACE2的重組表達(dá)，考慮各種表達(dá)系統(tǒng)，其中基于缺失的N-糖基化位點(diǎn)加工(Prozessierung)的原核生物宿主細(xì)胞不再進(jìn)行測(cè)試。優(yōu)選至少70%的糖基化的N-糖基化位點(diǎn)具有選自式1-8的相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)(式5)(式6)(式7)(式8)其中，GlcNAc圖Fuc么M<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>優(yōu)選所有可能的N-糖基化位點(diǎn)都被糖基化。優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少90%，特別地100%的糖基化的N-糖基化位點(diǎn)具有式1-8的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選二聚體的ACE2單體單位具有至少90kDa，優(yōu)選至少92kDa，尤其優(yōu)選至少94kDa，特別是至少96kDa，特別優(yōu)選至少98kDa，最優(yōu)選至少100kDa、100.5kDa、101kDa、101.5kDa或者至少102kDa的分子量。絕對(duì)摩爾質(zhì)量_即肽本身而沒(méi)有水合物外殼_可以通過(guò)肽圖譜來(lái)測(cè)定。更高的糖基化形式還可以具有至少103kDa、104kDa、105kDa、106kDa、107kDa或至少108kDa的摩爾質(zhì)量。由另外的因素例如水合物外殼所影響的摩爾質(zhì)量測(cè)定(例如在含水系統(tǒng)中的色譜法或凝膠電泳)還可以導(dǎo)致更高的結(jié)果。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，二聚體的ACE2單體(式l)(式2)(式3)(式4)單位具有至少101kDa或至少102kDa，優(yōu)選至少105kDa，尤其優(yōu)選至少109kDa，特別是至少113kDa，特別優(yōu)選至少117kDa，最優(yōu)選至少119kDa的表觀分子量，如通過(guò)凝膠電泳所測(cè)定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單體的分子量(表觀的或絕對(duì)的)最大為102kDa、103kDa、104kDa、108kDa、110kDa、112kDa、116kDa、120kDa、125kDa、130kDa、135kDa或140kDa。更高的分子量是由于可能的ACE2的修飾，例如PEG化。優(yōu)選所述單體(其沒(méi)有形成二聚體)具有至少82kDa，優(yōu)選至少86kDa，尤其優(yōu)選至少90kDa，特別是至少94kDa，特別優(yōu)選至少98kDa，最優(yōu)選至少101kDa或者最大102kDa、103kDa、104kDa、108kDa、110kDa或最大112kDa的分子量。這些分子量可以例如根據(jù)肽圖譜方法進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選ACE2多肽不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。因此，它是可溶性的ACE2。在這種情況下，特別優(yōu)選的實(shí)施方案包含ACE2-多肽，其多肽鏈由其中的氨基酸18-740或具有酶活性的片段組成。另外的多肽由SEQIDNO:1的氨基酸18-615組成。雖然對(duì)于大多數(shù)的治療性應(yīng)用人的ACE2(SEQIDNO:1)是優(yōu)選的，但是也可以使用其他哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、靈長(zhǎng)類(lèi)或牛的ACE2。ACE2是在所有哺乳動(dòng)物中普遍存在的酶，具有在不同物種中相同的底物Ang11。因此原則上，它也是在異種生物中可使用的。因此，可以與ACE2的來(lái)源(例如人、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、靈長(zhǎng)類(lèi)或牛)無(wú)關(guān)地用根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行治療。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ACE2的來(lái)源和被治療的生物是相同的。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Ser740(例如，C-末端)相應(yīng)的ACE2多肽的絲氨酸(或c-末端氨基酸)被O-糖基化。優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，特別是至少90%，最優(yōu)選100%的糖基化的N-糖基化位點(diǎn)具有唾液酸，優(yōu)選相應(yīng)于SEQIDN0:1的N-糖基化位點(diǎn)的Asn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690被唾液酸化。在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Asn53相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Asn90相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Asnl03相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Asn322相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Asn432相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。9在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Asn546相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Asn690相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1的Ser740相應(yīng)的絲氨酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。優(yōu)選至少30%，優(yōu)選至少40%，特別是至少55%，最優(yōu)選至少70%的糖基化的N-糖基化位點(diǎn)具有至少兩個(gè)唾液酸。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸如此被唾液酸化。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn53相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn90相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asnl03相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn322相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn432相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn546相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn690相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組ACE2多肽的制備，所述重組ACE2多肽包含如本文所定義的多肽(ACE2單體或二聚體或者二聚體的單體單位)，其中具有表觀分子量(如通過(guò)凝膠電泳測(cè)定的)低于100kDa或低于101kDa，優(yōu)選低于104kDa，特別優(yōu)選低于108kDa，特別是低于112kDa，尤其優(yōu)選低于117kDa，最優(yōu)選低于119kDa的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%，以及所有上述的組合而存在。例如，低于100kD的ACE2多肽可以以0%存在，低于100kDa的ACE2多肽可以以低于20%存在。所述部分與所有所涉及的ACE2形式有關(guān)并對(duì)此例如通過(guò)非變性凝膠電泳進(jìn)行在此類(lèi)似地，可以使用絕對(duì)摩爾質(zhì)量作為摩爾質(zhì)量范圍，所述絕對(duì)摩爾質(zhì)量可以通過(guò)肽圖譜進(jìn)行測(cè)定。因此，優(yōu)選具有表觀分子量(如通過(guò)凝膠電泳測(cè)定的)低于86kDa或低于89kDa，優(yōu)選低于92kDa，特別優(yōu)選低于94kDa，特別是低于97kDa，尤其優(yōu)選低于100kDa，最優(yōu)選低于101kDa的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%，以及所有上述的組合而存在。例如，低于86kD的ACE2多肽可以以0%存在，低于97kDa的ACE2多肽可以以低于20%存在。優(yōu)選具有跨膜結(jié)構(gòu)域的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。優(yōu)選ACE2多聚體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，特別優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。"ACE2多聚體"理解為具有3個(gè)或更多個(gè)ACE2多肽的復(fù)合物。在一個(gè)ACE2二聚體制劑中，此外優(yōu)選ACE2單體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。在一個(gè)ACE2單體制劑中，此外優(yōu)選ACE2二聚體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。優(yōu)選ACE2分子的ACE2二聚體部分總計(jì)至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，為此組合地或獨(dú)立地，ACE2分子的ACE2單體部分可以為至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDN0:1的Asn53的N_糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Asn90的N_糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Asnl03的N_糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Asn322的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Asn432的N_糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Asn546的N_糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Asn690的N_糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。優(yōu)選具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Ser740的0_糖基化的絲氨酸的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，基于Angl-7(血管緊張素l-7)轉(zhuǎn)化物，優(yōu)選ACE2多肽或制劑的催化活性kkat為至少4/s，優(yōu)選至少5/s，尤其優(yōu)選至少6/s，特別優(yōu)選至少7/s，最優(yōu)選至少7.6/s。Ang1_7由ACE2從AngII(血管緊張素II)形成。該轉(zhuǎn)化物可以如實(shí)施例中描述的那樣以簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行測(cè)定。該轉(zhuǎn)化物或ACE2的催化活性還可以從其他分析數(shù)據(jù)進(jìn)行外推。所述活性可以例如如W02008/046125A中描述的那樣進(jìn)行測(cè)量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于制備重組ACE2多肽或重組ACE2的制劑的方法，其包含這樣的步驟將編碼ACE2的多核苷酸，優(yōu)選編碼沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域的ACE2的多核苷酸，引入真核細(xì)胞中；表達(dá)ACE2多肽并收集經(jīng)表達(dá)的ACE2，尤其是以二聚體形式的。然后，可以選擇這樣的細(xì)胞，其產(chǎn)生如本文所描述的、尤其是具有高分子量的根據(jù)本發(fā)明的ACE2多肽。優(yōu)選將所述編碼ACE2的多核苷酸設(shè)計(jì)在載體上。優(yōu)選選擇具有標(biāo)記(優(yōu)選DHFR)的ACE2表達(dá)。優(yōu)選所述標(biāo)記位于載體上。優(yōu)選所述載體具有用于被表達(dá)的ACE2mRNA的IRES(或?qū)Υ司幋a的)。優(yōu)選所述真核細(xì)胞是CH0細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過(guò)如此方法獲得的重組ACE2多肽或重組ACE2多肽的制劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的、用編碼ACE2的多核苷酸轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系(或細(xì)胞)，優(yōu)選地CHO細(xì)胞系(或細(xì)胞)，其表達(dá)特別是如上文定義的ACE2。可以根據(jù)如上文指出的所希望的性質(zhì)，例如從具有分子量至少102kDa的單體單位產(chǎn)生二聚體，來(lái)選擇所述細(xì)胞系。所述細(xì)胞優(yōu)選地具有至少10pg/細(xì)胞/天，優(yōu)選至少15pg/細(xì)胞/天，尤其優(yōu)選至少20pg/細(xì)胞/天的ACE2生產(chǎn)率。優(yōu)選ACE2的表達(dá)在足夠的Zn2+離子存在下進(jìn)行。優(yōu)選使用至少0.5微摩爾，尤其直至5微摩爾的Zn2+，尤其是發(fā)酵可以在2.5-3.5微摩爾Zn2+的情況下進(jìn)行。例如，表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)基中的Zn2+濃度可以是至少0.5iiM、0.75iiM、1.0iiM、1.25iiM、1.5iiM、1.75iiM、2.0iiM、2.25iiM或至少2.5iiM或3.0iiM。優(yōu)選其他操作步驟同樣在Zn2+離子存在下進(jìn)行。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的ACE2產(chǎn)物的藥物的或藥學(xué)制劑。尤其是用于治療或預(yù)防高血壓、心功能不全(例如，充血性、急性或慢性心功能不全)、心肌梗死或動(dòng)脈硬化、腎病或腎功能不全、多囊腎病(Zystennieren)(多囊腎病，PKD)或肺病(例如慢性阻塞性肺病)、肺炎、哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、囊性纖維化、間質(zhì)性肺病、肺循環(huán)低壓(pulmonaleHypertonie)、肺栓塞、肺結(jié)節(jié)病、結(jié)核病、肺水腫、ALI、ARDS或肺癌。ACE2的通常治療適應(yīng)征在例如WO2004/000367A中提及，其也適合于根據(jù)本發(fā)明的ACE2產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，可以提供包含ACE2蛋白質(zhì)的藥學(xué)組合物或藥物。這樣的組合物可以包含相同的藥學(xué)上適宜的鹽、額外的緩沖液、張度組分(Tonizitatskomponenten)或藥學(xué)上適宜的載體。藥學(xué)載體物質(zhì)用于所述組合物的更好的相容性并允許所述活性物質(zhì)更好的溶解度以及更好的生物利用率。對(duì)此的實(shí)例是乳化劑、增稠劑、氧化還原組分、淀粉、醇溶液、聚乙二醇或脂質(zhì)。適宜的藥學(xué)載體的選擇極其依賴于施用的方法。對(duì)于口服施用可以使用液體或固體的載體，對(duì)于注射則必需是液態(tài)的最終組合物。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的ACE2組合物包含緩沖液物質(zhì)或張度物質(zhì)。借助于緩沖液可以調(diào)節(jié)藥物的pH值至生理?xiàng)l件，此外可以減弱或緩沖pH波動(dòng)。對(duì)此的實(shí)例是磷酸鹽緩沖液。張度物質(zhì)用于調(diào)節(jié)滲透性并且可以包含離子物質(zhì)，例如無(wú)機(jī)鹽(例如，NaCl或KC1)，或非離子物質(zhì)(例如，甘氨酸或碳水化合物)。12優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用的組合物或藥物適合用于全身性、局部地、口服或鼻內(nèi)施用或以吸入施用。本發(fā)明的組合物的這些施用方式使快速和簡(jiǎn)單的攝取成為可能。如果確定了ACE2組合物用于口服施用，則優(yōu)選考慮耐胃液的配制劑或者膠囊劑。為了進(jìn)行口服施用，可以例如將固體或液體的藥物直接或者經(jīng)溶解或經(jīng)稀釋地?cái)z入。根據(jù)本發(fā)明使用的藥物優(yōu)選地適合用于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。因此，適合于例如注射或輸液。血管系統(tǒng)(Blutbahn)的直接施用具有優(yōu)點(diǎn)，即藥物的活性物質(zhì)分布于整個(gè)機(jī)體并迅速到達(dá)靶組織。通過(guò)下面的附圖和實(shí)施例進(jìn)一步闡明而非限制本發(fā)明。附圖圖1:ACE2表達(dá)和篩選盒圖2:制備克隆歷史的ACE2特異的蛋白質(zhì)印跡分析圖3:ACE2單體的SDS-PAGE分析圖4:克隆選擇圖5:LC-MS糖基化分析圖6:ACE2的制備型大小分離圖7:ACE2在3個(gè)物種中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)圖8:用于Angl-7禾PAngII定量的校準(zhǔn)曲線。在WatersC18BondapakRP，2.lx300mm，10iim，125人柱上借助于RP-HPLC在所引用的濃度范圍內(nèi)分離肽。圖9:N-末端肽的MS/MS-譜。注Q和K具有相同的質(zhì)量。圖10:ACE2序列和N-糖基化預(yù)測(cè)圖11:糖基化位點(diǎn)103(A)、位點(diǎn)432(B)、位點(diǎn)546(C)、位點(diǎn)690(D)、位點(diǎn)90(E)的經(jīng)解譜的譜圖。圖12:C-末端0-糖基化肽的譜圖。結(jié)構(gòu)歸類(lèi)應(yīng)當(dāng)探試性地進(jìn)行分類(lèi)。圖13:LC-MS釋放的聚糖圖14:ACE2二聚體結(jié)構(gòu)的測(cè)定，借助于非變性PAGE(左側(cè)，蛋白質(zhì)條帶借助于銀染進(jìn)行可視化)和SEC(右側(cè)，ZorbaxG-450柱上，在220mM磷酸鈉存在下，在pH7.0下10%乙腈中進(jìn)行分離，該色譜在214nm處進(jìn)行)。圖15:ACE2二聚體的大小排阻色譜法的色譜(滯留8.55分鐘，8.93分鐘)。標(biāo)準(zhǔn)甲狀腺球蛋白(670kDa，7.43分鐘)、y-球蛋白(158kDa)、卵白蛋白(43kDa，10.08分鐘)、肌球蛋白(17kDa，11.08分鐘)、維生素B_12(l.3kDa，12.71分鐘)。圖16:來(lái)自皮質(zhì)(A)、腦(B)和ACE2-二聚體表達(dá)克隆(C)的細(xì)胞提取物的ACE2特異的蛋白質(zhì)印跡分析。在D中，加載了純的ACE2二聚體。圖17:ACE2單體形式的分析型SEC-HPLC色譜。運(yùn)行條件柱ZorbaxGF250，緩沖液220mMNa2HP04+10%CH3CN，pH8.0在lml/分鐘情況下。圖18:ACE2二聚體(A)和ACE2單體(B)的PAGE分析，蛋白質(zhì)借助于銀染(a)和ACE2特異的蛋白質(zhì)印跡(b)進(jìn)行檢測(cè)。圖19:ACE2單體相比于ACE2二聚體的酶活性的確定。在恒定的熒光標(biāo)記底物香豆素-APK-DNP的初始濃度和四種不同的酶濃度下進(jìn)行，并對(duì)比各個(gè)熒光曲線。圖20:ACE2二聚體形式給藥(2.5mg/kg，藍(lán)色柱)或ACE2單體形式給藥(2.5mg/kg，灰色柱)24和48小時(shí)后所測(cè)量的ACE2血清活性。實(shí)施例實(shí)施例1:高度糖基化的ACE二聚體的表達(dá)在表達(dá)載體中克隆人ACE2序列(SEQIDNO:1)的可溶性片段，在所述表達(dá)載體中首先插入可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記DHFR，以便導(dǎo)致增加的ACE2基因表達(dá)。為此在編碼ACE2和DHFR的基因之間引入衰減性IRES，其使得在同一mRNA上的ACE2和DHFR的雙順?lè)醋幼x碼成為可能。在圖1中圖解說(shuō)明了ACE2表達(dá)盒和篩選盒。這兩個(gè)蛋白質(zhì)在同一啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)之后，可以通過(guò)使用拮抗劑MTX進(jìn)行DHFR篩選針對(duì)性地提高ACE2的表達(dá)。通過(guò)這些策略可能獲得特別穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞系，其提供高產(chǎn)率的恒定質(zhì)量的產(chǎn)物。還可能在細(xì)胞系中獲得合理的產(chǎn)物滴度，其可能對(duì)于某些目標(biāo)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)是較不適宜的。將該載體轉(zhuǎn)化入CH0dhfr細(xì)胞并在持續(xù)增加的MTX壓力下擴(kuò)增ACE2基因的拷貝數(shù)。經(jīng)過(guò)多輪篩選和亞克隆，借助于細(xì)胞內(nèi)FACS分析和蛋白質(zhì)化學(xué)以及酶學(xué)分析根據(jù)最佳產(chǎn)物性質(zhì)來(lái)篩選最好的產(chǎn)物。為了選擇最適合的克隆，首先考慮特定的酶活性(其用3種不同的底物的測(cè)定)、產(chǎn)物同質(zhì)性、細(xì)胞生產(chǎn)率以及糖復(fù)雜性。在圖2中，顯示了單個(gè)克隆的相續(xù)的培養(yǎng)上清液的總結(jié)性重現(xiàn)的蛋白質(zhì)印跡，其被用于建立生產(chǎn)細(xì)胞系。單個(gè)克隆的產(chǎn)物性質(zhì)區(qū)別于從右到左增加的表達(dá)產(chǎn)物的糖部分，其通過(guò)明顯的質(zhì)量增加而可辨認(rèn)。這些通過(guò)高度糖基化的克隆的特定篩選而實(shí)現(xiàn)。最終，具有最高分子量表達(dá)產(chǎn)物的克隆(克隆5B9)被用于建立生產(chǎn)細(xì)胞系(1B4)。決定繼續(xù)進(jìn)行6個(gè)克隆，其表達(dá)高酶活性的和復(fù)雜的N-糖基化ACE2。當(dāng)可溶性ACE2具有83kDa的分子量時(shí)，選擇這樣的克隆，其在變性SDS-PAGE中表現(xiàn)為范圍直至120kDa的分子量(取決于其糖結(jié)構(gòu))。圖3顯示了通過(guò)本生產(chǎn)方法制備的ACE2(泳道B)，對(duì)比于在NS0中制備的標(biāo)準(zhǔn)ACE2(泳道A)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的ACE2多肽(此處作為單體進(jìn)行分析)是同質(zhì)的、高度糖基化的，并且因此表現(xiàn)為約120kDa的單一條帶時(shí)，參考物質(zhì)條帶顯示83kDa至120kDa，這暗示非常異質(zhì)的糖基化。將初始克隆移置于無(wú)蛋白質(zhì)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Polym皿)中。這種商購(gòu)可得的培養(yǎng)基是化學(xué)物質(zhì)確定的、無(wú)血清、沒(méi)有動(dòng)物蛋白質(zhì)并且在CHO中就糖蛋白的重組表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)酵在2.5-3.5yMZn2+下進(jìn)行。在培養(yǎng)基中維持所有6個(gè)克隆并且就其生產(chǎn)方法適宜性進(jìn)行檢查。特別是記錄生長(zhǎng)速率以及研究關(guān)于產(chǎn)物進(jìn)程和代謝物的上清液(圖4)。再次精確分析表達(dá)產(chǎn)物以及克隆。所有的克隆都表達(dá)高活性的ACE2并且具有20-30pg/細(xì)胞/天的生產(chǎn)率。此外，還分析糖結(jié)構(gòu)和其異質(zhì)性。最終選擇克隆1B4。它在整個(gè)生產(chǎn)進(jìn)程中具有同質(zhì)的糖結(jié)構(gòu)。在所有7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了糖基化，其中這些糖基化具有至少一個(gè)具有末端唾液酸的二-天線，有些甚至三天線的復(fù)雜的糖基化?；谶@些克隆制備了主細(xì)胞庫(kù)并進(jìn)行了測(cè)試，以及建立了GMP適用的純化方法和進(jìn)而GMP生產(chǎn)方法。SEQIDN0:1(ACE2蛋白質(zhì)序列，為了排出，由宿主細(xì)胞切除自體信號(hào)序列(加下劃線)):MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQST-PAHLLGD麗GRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMT-PFLLRNGANEGFHEAVGE頂SLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQAL-TIVGTLPFT預(yù)LEKWR麗VFKGEIPKDQ麗KK麗EMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLF-HVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGD-DIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS由于ACE2的二聚體化，全部疏水蛋白質(zhì)單位朝向復(fù)合體內(nèi)部，其中帶電荷的殘基，例如N-聯(lián)糖鏈朝外突出并且該結(jié)構(gòu)溶解于同樣帶電荷的生理介質(zhì)中。在Zn"存在下確認(rèn)通過(guò)完整的N-糖基化ACE2的表達(dá)的所述二聚體化。在這種情況下，所述二聚體復(fù)合物由2個(gè)相同的亞基組成，其彼此靜電結(jié)合并且在生理溶液中也不再分離。在這種情況下，能夠分泌每個(gè)ACE2分子上各具14個(gè)強(qiáng)帶電的唾液酸結(jié)構(gòu)以及在二聚體中28個(gè)唾液酸結(jié)構(gòu)的糖蛋白。每種情況下有2個(gè)Zn2+離子嵌入復(fù)合物中并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。糖鏈的強(qiáng)帶電使該分子溶解于生理水溶液并迫使所屬的帶電荷的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域朝向外面。這樣來(lái)建立生產(chǎn)方法，使得終產(chǎn)物中僅存在ACE2二聚體。這些是可能的，由于在產(chǎn)生ACE2時(shí)存在足夠的Zn2+離子(優(yōu)選地使用1.5_5微摩爾Zn"，尤其是發(fā)酵可以在2.5-3.5uMZn2+下進(jìn)行)并且后來(lái)進(jìn)一步的處理步驟在Zn2+離子存在下來(lái)進(jìn)行。純化通過(guò)使用陰離子交換步驟、硫酸銨沉淀以及HIC步驟、陽(yáng)離子交換步驟以及其他高溶解性陰離子交換步驟來(lái)進(jìn)行。過(guò)程中的所有介質(zhì)都是經(jīng)磷酸鹽緩沖的并含有氯化鈉。最后的試樣緩沖液是用于注射的生理甘氨酸溶液。實(shí)施例2:產(chǎn)物性質(zhì)基于共價(jià)結(jié)合的糖結(jié)構(gòu)，復(fù)雜的、高度糖基化的ACE2單體或二聚體的單體單位具有比其相應(yīng)的氨基酸序列明顯高的分子量。因此借助于肽圖譜測(cè)得102kDa的摩爾質(zhì)量，而非糖基化的ACE2只有83kDa。與此相應(yīng)地，糖部分占約23%并且對(duì)于下文所描述的產(chǎn)物性質(zhì)具有實(shí)質(zhì)性意義。由于強(qiáng)烈的水合作用，相比于參照標(biāo)準(zhǔn)，在SDS-PAGE中約120kDa處顯現(xiàn)單體單位(圖3)。不表達(dá)天然的、膜結(jié)合的ACE2，而僅表達(dá)ACE2的可溶性部分。由于膜結(jié)構(gòu)域的缺失而被完全糖基化。由于復(fù)雜的、高度糖基化的和因此帶強(qiáng)負(fù)電的糖結(jié)構(gòu)，ACE2具有相比于非糖基化的或未完全糖基化的ACE2而言明顯高的溶解度。因此，可以毫無(wú)問(wèn)題地制備直至15mg/ml、經(jīng)生理學(xué)緩沖的蛋白質(zhì)配制劑。除穩(wěn)定的二聚體化之外，該產(chǎn)物在溶液中還進(jìn)一步表現(xiàn)穩(wěn)定并且經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)貯存時(shí)間既不失去活性，也不傾向于降解或聚集。與此相反，去糖基化的ACE2在低濃度范圍下就已經(jīng)沉淀。其可借助于PNG酶F在制備型去糖基化起始物中顯示。針對(duì)ACE2計(jì)算出的理論穩(wěn)定指數(shù)為41.2，并且將該蛋白質(zhì)歸類(lèi)為不穩(wěn)定的，其中在該計(jì)算中，允許大于八的糖結(jié)構(gòu)。然而，因?yàn)樗雠渲苿┰谌芤褐斜憩F(xiàn)穩(wěn)定達(dá)數(shù)月之久，這明顯歸因于高的糖部分。此外，ACE2的更好的溶解導(dǎo)致這種配制劑僅由ACE2二聚體(或者在人工分離后僅從單體產(chǎn)生單體)組成，而非糖基化的ACE2傾向于多聚化和聚集。此外，由于高的帶電糖鏈部分，所述ACE2制劑的流體力學(xué)直徑、溶劑化外殼大大增加。這種情況可以用于通過(guò)大小分離柱進(jìn)行ACE2的制備型純化，其中，在此僅作為二聚體存在的蛋白質(zhì)具有相比于計(jì)算出的83kDa而言約250kDa的表觀分子量。制備型ACE2純化的色譜反映在圖6中。ACE2(第一幅圖)用69分鐘的滯留時(shí)間進(jìn)行洗脫。這相應(yīng)于在甲狀腺球蛋白(第一幅圖，在58分鐘時(shí)，670kDa)和Y-球蛋白(第一幅圖，在74分鐘時(shí)，158kDa)之間的表觀分子量。在該高分子量范圍內(nèi)在培養(yǎng)上清液中不具有雜質(zhì)，從而可以以非常簡(jiǎn)單的分離步驟分離高純度的產(chǎn)物。實(shí)施例3:產(chǎn)物的藥學(xué)性質(zhì)根據(jù)本發(fā)明的ACE2制劑作為穩(wěn)定的、高純度和濃縮的蛋白質(zhì)溶液存在于生理緩沖中，并且可以不需進(jìn)一步穩(wěn)定化地存放和施用。例如，可以使用磷酸鹽緩沖液。ACE2作為穩(wěn)定的單體或二聚體在溶液中是穩(wěn)定的，并且由于高的糖部分而不顯示出聚集。此外，ACE2制劑具有完全的酶活性。由于其溶解度，ACE2可以以靜脈內(nèi)推注(Bolus)進(jìn)行施用。出于同一原因，全身性地，生物利用率在給藥后很快就得到保證。由于高的、強(qiáng)烈支化的和復(fù)雜的糖部分，ACE2只緩慢地降解。由此導(dǎo)致至少10.5小時(shí)長(zhǎng)的半衰期，其是在各種物種，尤其是恒河猴(RhesusMakaken)中測(cè)得的。圖7展示了在3種物種中靜脈內(nèi)給予的ACE2的所測(cè)得的半衰期。此外，高的唾液酸部分造成沒(méi)有建立針對(duì)ACE2的中和性免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答不但可能對(duì)于ACE2的外源施用產(chǎn)生不良后果，而且還可能中和自體的、細(xì)胞固有的ACE2。因此，所描述的ACE2配制劑連同全部所涉及的產(chǎn)物性質(zhì)首次使得用rhACE2進(jìn)行有效的治療成為可能。實(shí)施例4:特定ACE2活性的測(cè)定通過(guò)測(cè)量AngII(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)的轉(zhuǎn)化物來(lái)測(cè)定ACE2制劑的特定活性。在lOOiU的初始體積中以三次測(cè)定來(lái)進(jìn)行全部測(cè)量。通過(guò)向在pH6.5下的50mMMES、300mMNaCl、10iiMZnCl2和0.01%Brij_30中的80iiMAngII溶液加入250ng/ml的ACE2啟動(dòng)酶促反應(yīng)。小心地混合樣品并在37。C下精確溫育18分鐘。通過(guò)加入100mMEDTA來(lái)終止酶促反應(yīng)。為了進(jìn)行分析，借助于RP-HPLC(WatersC18iiBond即ak，2.lx300mm，10iim，125人)在0.08%H3P04中的10至60%CH3CN線性梯度的使用下，流速為lml/分鐘下分離該溶液20分鐘。接著，辨認(rèn)并對(duì)色譜圖中的AngII和Ang1_7峰進(jìn)行積分。按照各自在圖8中所展示的校準(zhǔn)曲線來(lái)求得肽濃度。接著，測(cè)定酶促轉(zhuǎn)化物以及特定的酶活性。如前所述地測(cè)定ACE2產(chǎn)物的活性。在表1中展示了各自的峰積分(Peakintegration)結(jié)果以及計(jì)算出的酶數(shù)據(jù)。表l:酶數(shù)據(jù)和反應(yīng)條件。給出了三次測(cè)定的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ACE2制劑具有根據(jù)AngII轉(zhuǎn)化物所測(cè)得的8.0±0.3/skkat和鑒于Ang1-7轉(zhuǎn)化物的8.8±0.2/skkat的催化活性。這兩個(gè)值很好地相符并且明顯高于Vickers等人(JBiolChem.277(17)(2002):14838-43)的結(jié)果，其中公開(kāi)了3.5/s的ACE2催化活性。反應(yīng)條件是相同的。我們的制劑240%較高活性的原因可能是翻譯后修飾和在此尤其是N-糖基化，其在Vickers所使用的物質(zhì)中是明顯較少的。所述物質(zhì)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)并具有相同的氨基酸序列，然而在明顯較少的部分和支化程度上被糖基化。此外，還研究了R&DSystems的商購(gòu)可得的ACE2制劑(目錄編號(hào)933_ZN)，其同樣具有明顯較少的2.0±0.1/skkat的活性。根據(jù)本發(fā)明的制劑的一個(gè)重要的性質(zhì)是特別高的酶活性，其主要通過(guò)翻譯后修飾而成為可能。實(shí)施例5:重組ACE2的糖蛋白組的分析以兩種不同的方法來(lái)分析經(jīng)純化的、CHO表達(dá)的ACE2樣品首先，產(chǎn)生SDS-PAGE和S-烷基化后的胰蛋白酶肽并借助于LC-ESI-MS(和MS-MS)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)了N-末端肽和多個(gè)內(nèi)部肽。在具有聚糖結(jié)構(gòu)的糖基化形式中發(fā)現(xiàn)了七個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)中的五個(gè)，其主要包含具有巖藻糖和不同量的唾液酸的二天線聚糖。C-末端肽好像是O-糖基化的。其次，借助于碳-LC-ESI-MS來(lái)分析游離的、還原的N-聚糖。對(duì)于具有巖藻糖的二天線、二唾液酸聚糖可以顯示，所述巖藻糖與核心a1，6-相結(jié)合且唾液酸是a2，3結(jié)合的。此外，除單糖基化或二糖基化的、二天線的聚糖發(fā)現(xiàn)有數(shù)量相當(dāng)大的三天線寡糖。對(duì)糖基化ACE2質(zhì)量的粗略估計(jì)得出101-102kDa，即由約17%的碳水化合物組成。借助于SDS-PAGE分離的hBChE的蛋白質(zhì)水解消化對(duì)等份ACE2進(jìn)行SDS-PAGE、脫色、脲基甲基化，用測(cè)序質(zhì)量的胰蛋白酶進(jìn)行消化并如所描述的那樣從凝膠塊中提取。將提取物在速度真空濃縮器(SpeedVac-Konzentrator)中進(jìn)行干燥并在進(jìn)行隨后的LC-MS-分析前用含有0.1%甲酸的水進(jìn)行重構(gòu)。對(duì)于寡糖分析，用PNG酶F消化所述肽，并使用C18SPE-微柱(Spitzen)來(lái)純化聚糖。胰蛋白酶肽和糖肽的MS分析質(zhì)譜法分析如最近所描述的[Kolarich2006]，在Q-TOFUltimaGlobal(WatersMicromass)上進(jìn)行，后者配備有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧裝置、C即-LC-系統(tǒng)(WatersMicromass)和10端口溶劑轉(zhuǎn)換模土央(10-Port-L6SUngSmittel-Wechsel-Modul)(Rheodyne)。首先，使用水作為溶劑在AquasilC18_前柱(30x0.32mm，ThermoElectron)上捕捉樣品。在溶劑轉(zhuǎn)換前，首先以5X乙腈維持分析柱BiobasicC18-柱(100x0.18mm，ThermoElectron)，然后，施以具有2iU/分鐘的流速的5至50%乙腈的線性梯度。所有洗脫劑均含有0.1%的甲酸。樣品用MS-和MS-MS-方法進(jìn)行分析。用MassLynx4.0SP4軟件(WatersMicromass)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。ACE2的游離N-聚糖的分析在多孔石墨化碳柱上分離經(jīng)硼氫化物還原的聚糖并用質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例6:糖基化分析在此測(cè)定了ACE2的肽序列、其分子量、全部糖基化位點(diǎn)的位置以及所結(jié)合的糖的結(jié)構(gòu)。借助于胰蛋白酶消化、S-烷基化和LC-ESI-MS分析樣品。糖基化產(chǎn)物的求得的蛋白質(zhì)質(zhì)量為102kDa，其中糖部分相當(dāng)于總質(zhì)量的23%。*在這種情況下，確認(rèn)了N-末端肽以及全部序列內(nèi)部肽的存在(參見(jiàn)序列信息)。所有7個(gè)推斷的N-糖基化位點(diǎn)(位置53、90、103、322、432、546和690)確實(shí)都包含二天線、復(fù)雜的含唾液酸的巖藻糖基化的糖結(jié)構(gòu)(圖13)。C-末端肽被0-糖基化。通過(guò)碳-LC-ESI-MS根據(jù)其裂解和還原來(lái)測(cè)定這些糖鏈的結(jié)構(gòu)。所有二天線結(jié)構(gòu)各自都包含兩個(gè)a2，3-結(jié)合的唾液酸和一個(gè)a1，6_結(jié)合的巖藻糖。還發(fā)現(xiàn)少量的三天線結(jié)構(gòu)(圖11)。所應(yīng)用的篩選策略能夠獲得完全糖基化的和包含唾液酸的表達(dá)產(chǎn)物。方法樣品制備ACE2借助于SDS-PAGE進(jìn)行分離、脫色、烷基化并用胰蛋白酶進(jìn)行消化。(Kolarich等人，Proteomics6(2006):3369-3380)。對(duì)凝膠提取物進(jìn)行干燥并在進(jìn)行LC-MS分析之前溶解于0.1%甲酸中。對(duì)于糖分析，用PNG酶F消化所述肽并經(jīng)過(guò)C18SPE微柱進(jìn)行純化。MS分析所有質(zhì)譜法分析借助于具有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧裝置和C即-LC系統(tǒng)(WatersMicromass)的Q-T0FUltimaGlobal(WatersMicromass)進(jìn)行(Kolarich2006)。在AquasilC18前柱(30x0.32mm，ThermoElectron)上于水中富集樣品。在乙月青梯度的使用下采用C18柱(100x0.18mm，ThermoElectron)作為分離柱。樣品用MS和MSMS方法進(jìn)行測(cè)量。游離的N-聚體的分析在多孔石墨柱上分離用硼氫化物還原的聚糖并表征其質(zhì)量。實(shí)施例7:rhACE2的二聚體化根據(jù)實(shí)施例1制備的ACE2以二聚體獲得，并且在該實(shí)施例中也是對(duì)此進(jìn)行分析的，而不用分離二聚體。與變性的分析相反，通過(guò)天然處理保留了所獲得的所述二聚體(圖3)。取決于ACE2的二聚體化所有疏水蛋白質(zhì)單位朝向復(fù)合體的內(nèi)部，所述復(fù)合體中帶電荷的殘基，例如N-聯(lián)糖鏈朝外突出并且該結(jié)構(gòu)溶解于同樣帶電荷的生理介質(zhì)中。在Zn"存在下確認(rèn)通過(guò)完整的N-糖基化ACE2的表達(dá)的所述二聚體化。在這種情況下，所述二聚體復(fù)合物由2個(gè)相同的亞基組成，其彼此靜電結(jié)合并且在生理溶液中也不再分離。在這種情況18下，能夠分泌每個(gè)ACE2分子上各具14個(gè)強(qiáng)帶電的唾液酸結(jié)構(gòu)以及在二聚體中28個(gè)唾液酸結(jié)構(gòu)的糖蛋白。每種情況下有2個(gè)Zn2+原子嵌入復(fù)合物中并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。糖鏈的強(qiáng)帶電使該分子溶解于生理水溶液并迫使所屬的帶電荷的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域朝向外面。這樣來(lái)建立生產(chǎn)方法，使得終產(chǎn)物中僅存在ACE2二聚體。這些是可能的，由于在產(chǎn)生rACE2時(shí)存在足夠的Zn2+離子(優(yōu)選地使用1.5_5微摩爾Zn"，尤其是發(fā)酵可以在2.5-3.5uMZn2+下進(jìn)行)并且后來(lái)進(jìn)一步的處理步驟在Zn2+離子存在下來(lái)進(jìn)行。在圖14和15中，用不同的方法來(lái)檢測(cè)ACE2復(fù)合物的二聚體化。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在銀染后檢測(cè)到蛋白質(zhì)是約250kDa大小的單一條帶。用大小分離色譜法在ZorbaxG-450柱上，在220mM磷酸鈉鹽緩沖液中10X乙腈存在下于pH7.0，該產(chǎn)物同樣在相應(yīng)于約250kDa的分子量的滯留時(shí)間下顯示單個(gè)峰。值得注意的是，在這兩種情況下都僅能檢測(cè)到二聚體化的蛋白質(zhì)。既不能檢測(cè)到單體結(jié)構(gòu)，也不能檢測(cè)到高分子聚集體。實(shí)施例8:ACE2二聚體-與膜固有ACE2的區(qū)別ACE2作為跨膜蛋白質(zhì)在所有的高等物種中主要在腎臟、心臟、肺和肝的細(xì)胞上作為腎素_血管緊張素系統(tǒng)的重要酶被表達(dá)。膜錨固的ACE2在脂質(zhì)雙層膜中自然地被其他膜蛋白質(zhì)環(huán)繞，所述其他蛋白質(zhì)使ACE2穩(wěn)定在激活的構(gòu)象中，并且同樣保護(hù)ACE2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域免于蛋白酶水解的降解。為了提高可溶性ACE2的藥學(xué)性質(zhì)和特別是可溶性蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性，選擇僅導(dǎo)致穩(wěn)定的ACE2二聚體結(jié)構(gòu)的表達(dá)和生產(chǎn)策略。主要是蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域和翻譯后修飾，它們決定性地負(fù)責(zé)二聚體化。為了突出ACE2二聚體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，用非變性PAGE和ACE2特異的蛋白質(zhì)印跡來(lái)分析膜固有的ACE2的結(jié)構(gòu)(圖16)。在印跡A和B中加載細(xì)胞提取物(皮質(zhì)和腦)以及在印跡C中加載根據(jù)實(shí)施例1產(chǎn)生的ACE2二聚體生產(chǎn)克隆的細(xì)胞提取物。在這種情況下，膜固有的產(chǎn)物具有相比于根據(jù)實(shí)施例l(C和D)表達(dá)產(chǎn)物而言明顯較小的分子量，雖然前者只由細(xì)胞外部分組成。因此，這意味著膜固有的ACE2以單體存在。與此相反，表達(dá)產(chǎn)物由二聚體組成，所述二聚體賦予該產(chǎn)物藥學(xué)上的優(yōu)點(diǎn)。在印跡D中，分析了經(jīng)純化的終產(chǎn)物。它們僅還具有約240kDa分子量的單一條帶。實(shí)施例9:改善的ACE2二聚體的藥學(xué)性質(zhì)APN01是生理性的ACE2蛋白質(zhì)配制劑的名稱，其僅由ACE2二聚體結(jié)構(gòu)組成。在每種情況下，這兩個(gè)ACE2單體形成非共價(jià)相互結(jié)合的復(fù)合體。如此來(lái)選擇或設(shè)計(jì)分子生物學(xué)構(gòu)造、表達(dá)細(xì)胞系、發(fā)酵方法、純化和用于存放和應(yīng)用的緩沖液，從而在終產(chǎn)物中僅出現(xiàn)穩(wěn)定的ACE2二聚體。該二聚體既不聚集成更大的復(fù)合物也不在生理?xiàng)l件下分解為單體。在圖15中，分析型SEC-HPLC色譜APN01，相比于大小分離標(biāo)準(zhǔn)(Bio-RADGF-Standard，藍(lán)色曲線)。運(yùn)行條件柱ZorbaxGF250，緩沖液220mMNa2HP04+10%CH3CN，pH8.O，在lml/分鐘下。APN01以在8.6分鐘時(shí)的單一峰的形式被洗脫，它鑒于滯留時(shí)間，位于甲狀腺球蛋白(680kDa，滯留時(shí)間7.4分鐘)和牛Y-球蛋白(158kDa，滯留時(shí)間8.9分鐘)之間。該復(fù)合體的計(jì)算出的分子質(zhì)量約為214kDa。這大約相應(yīng)于每個(gè)102kDa的兩個(gè)ACE2單位的預(yù)期分子量。出于對(duì)比的目的，在CHO細(xì)胞中制備ACE2單體作為參照物質(zhì)，其同樣用SEC-HPLC進(jìn)行分析。在圖17中展示了與此相關(guān)的色譜圖。單體形式在9.0分鐘的滯留時(shí)間被洗脫，相當(dāng)于約110kDa的分子量。此外，用PAGE對(duì)比這兩種產(chǎn)物(參見(jiàn)圖18a)。而APN01(A)具有約240kDa分子量的蛋白質(zhì)條帶，在約100kDa顯現(xiàn)單體形式(B)。借助于ACE2特異的蛋白質(zhì)印跡來(lái)確定這兩種產(chǎn)物的同一性，如在圖18b中顯而易見(jiàn)的那樣。根據(jù)使用熒光標(biāo)記的底物的活性測(cè)試所測(cè)，這兩種產(chǎn)物顯示出相同的特定的酶活性。如在圖19中顯而易見(jiàn)的。相同酶濃度的單體和二聚體形式具有相疊的曲線。為了對(duì)比這兩種產(chǎn)物的藥學(xué)性質(zhì)，給Bl-6小鼠腹膜內(nèi)以推注注射方式施用2.5mg/kg的這兩種制劑并測(cè)量24和48小時(shí)后血清樣品中的ACE2酶活性(參見(jiàn)圖20)。如此來(lái)調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，從而使所有動(dòng)物分別獲得100i！1生理蛋白質(zhì)溶液。每次，7個(gè)動(dòng)物用APN01(ACE2-二聚體)和5個(gè)動(dòng)物用ACE2單體進(jìn)行處理。在給予ACE2之前，在血清樣品中檢測(cè)不到ACE2活性，然而在施用后，在所有情況下都測(cè)得全身性的ACE2活性。在應(yīng)用后24小時(shí)，兩個(gè)組明顯地區(qū)別開(kāi)來(lái)(t檢驗(yàn)，P<0.001):在用ACE2二聚體處理的動(dòng)物中，測(cè)得相當(dāng)于0.9iig/mlACE2濃度的活性，而在獲得ACE2單體的組中，僅發(fā)現(xiàn)0.2yg/ml的濃度的相應(yīng)活性。48小時(shí)后，在獲得ACE2同二聚體的組中發(fā)現(xiàn)還有0.2yg/ml的活性，而在獲得單體的組中，不再能檢測(cè)到全身性ACE2活性。這些數(shù)據(jù)表明了ACE2二聚體形式的非常明顯的藥學(xué)優(yōu)點(diǎn)。20權(quán)利要求重組ACE2多肽，其以二聚體存在。2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組ACE2多肽，其特征在于，它被糖基化，其中ACE2多肽單體的糖基基團(tuán)具有總共至少14個(gè)唾液酸殘基。3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組ACE2多肽，其特征在于，可能的N-糖基化位點(diǎn)的至少80%被糖基化并且具有大于10%(質(zhì)量％，相對(duì)于整個(gè)ACE2分子)，優(yōu)選大于15%，特別地大于20%的糖部分。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的重組ACE2多肽，其特征在于，糖基化的N-糖基化位點(diǎn)的至少70%相互獨(dú)立地選自式1-8的結(jié)構(gòu)上人(式l)(式2)(式3)(式4)(式6)(式7)(式8)Fuc△Xyl&Neu5Ac5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所有可能的N-糖基化位點(diǎn)是都被糖基化的。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少80%，優(yōu)選至少90%，特別地100%的糖基化的N-糖基化位點(diǎn)具有式1-8的結(jié)構(gòu)。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所述二聚體的ACE2單體單位具有至少90kDa，優(yōu)選至少92kDa，尤其優(yōu)選至少94kDa，特別是至少96kDa，特別優(yōu)選至少98kDa，最優(yōu)選至少101kDa的分子量。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所述ACE2多肽不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選ACE2多肽鏈由SEQIDNO:1的氨基酸18-740或其酶活性片段組成。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDNO:1的Ser740相應(yīng)的絲氨酸是0-糖基化的。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少70%，優(yōu)選地至少80%，特別是至少90%，最優(yōu)選100%的糖基化的N-糖基化位點(diǎn)具有唾液酸，優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690對(duì)應(yīng)的N_糖基化位點(diǎn)被唾液酸化。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少30%，優(yōu)選至少40%，特別是至少55%，最優(yōu)選至少70%的糖基化的N-糖基化位點(diǎn)具有兩個(gè)唾液酸。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDNO:l的Asn53相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn90相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn103相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。15.根據(jù)權(quán)利要求1至14之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn322相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn432相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。17.根據(jù)權(quán)利要求1至16之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn546相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。18.根據(jù)權(quán)利要求1至17之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn690相應(yīng)的天門(mén)冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。19.重組ACE2多肽的制劑，其包含至少根據(jù)權(quán)利要求1至18之一的多肽，其特征在于，具有通過(guò)凝膠電泳所測(cè)得的低于100kDa，優(yōu)選低于104kDa，特別優(yōu)選低于108kDa，特別是低于112kDa，尤其優(yōu)選低于117kDa，最優(yōu)選低于119kDa的分子量的所述ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。20.根據(jù)權(quán)利要求19的制劑，其特征在于，具有跨膜結(jié)構(gòu)域的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的制劑，其特征在于，ACE2的多聚體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。22.根據(jù)權(quán)利要求19至21之一的制劑，其特征在于，ACE2分子的ACE2二聚體部分為至少70%，優(yōu)選至少80%，尤其優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99%。23.根據(jù)權(quán)利要求19至22之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDN0:l的Asn53的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別為100%，并優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。24.根據(jù)權(quán)利要求19至23之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDN0:l的Asn90的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)地大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。25.根據(jù)權(quán)利要求19至24之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDN0:1的Asnl03的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。26.根據(jù)權(quán)利要求19至25之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDN0:1的Asn322的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。27.根據(jù)權(quán)利要求19至26之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDN0:1的Asn432的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。28.根據(jù)權(quán)利要求19至27之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Asn546的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。29.根據(jù)權(quán)利要求19至28之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDN0:1的Asn690的N-糖基化天門(mén)冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權(quán)利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結(jié)構(gòu)的聚糖。30.根據(jù)權(quán)利要求19至29之一的制劑，其特征在于，具有相應(yīng)于SEQIDNO:1的Ser740的0-糖基化絲氨酸的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%。31.根據(jù)權(quán)利要求1至30之一的ACE2多肽或制劑，其具有基于從AngII(血管緊張素II)至Ang1_7(血管緊張素1-7)的轉(zhuǎn)化的至少4/s，優(yōu)選至少5/s，尤其優(yōu)選至少6/s，特別優(yōu)選至少7/s，最優(yōu)選至少7.6/s的催化活性。32.用于制備優(yōu)選地根據(jù)權(quán)利要求1至31之一的重組ACE2多肽或重組ACE2的制劑的方法，其包含這樣的步驟將編碼ACE2的多核苷酸，優(yōu)選地沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼ACE2的多核苷酸引入真核細(xì)胞中；表達(dá)ACE2多肽并收集經(jīng)表達(dá)的ACE2，尤其是二聚體形式的，其中其中表達(dá)時(shí)優(yōu)選Zn2+濃度至少為1.5微摩爾。33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其特征在于，所述編碼ACE2的多核苷酸設(shè)計(jì)在載體上。34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的方法，其特征在于，所述ACE2表達(dá)用標(biāo)記、優(yōu)選DHFR進(jìn)行篩選。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于，所述標(biāo)記存在于載體上。36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其特征在于，所述載體具有用于所表達(dá)的ACE2mRNA的IRES。37.根據(jù)權(quán)利要求32至36之一的方法，其特征在于，所述真核細(xì)胞是CH0細(xì)胞。38.重組ACE2多肽或重組ACE2多肽的制劑，其通過(guò)前述權(quán)利要求的方法而獲得。39.穩(wěn)定地用編碼ACE2的多核苷酸轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系，優(yōu)選CHO細(xì)胞系，表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至31之一的ACE2。40.根據(jù)權(quán)利要求39的細(xì)胞，其具有至少10pg/細(xì)胞/天，優(yōu)選至少15pg/細(xì)胞/天，尤其優(yōu)選至少20pg/細(xì)胞/天的ACE2生產(chǎn)率。41.藥物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至18之一、31或38的重組ACE2多肽或根據(jù)權(quán)利要求19至31之一或38的制劑。全文摘要本發(fā)明涉及重組ACE2多肽，其中所述ACE2多肽以二聚體存在。所述二聚體特別地由糖基化的單體形成并且被用于制備具有延長(zhǎng)的半衰期的藥學(xué)產(chǎn)品。文檔編號(hào)C12N9/64GK101796183SQ200880100650公開(kāi)日2010年8月4日申請(qǐng)日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日發(fā)明者B·佩巴爾,B·瓦格內(nèi),E·揚(yáng)奇克-哈瓦拉特,H·洛博內(nèi),M·舒斯特,R·維克,S·斯蘭內(nèi)申請(qǐng)人:阿派隆生物制劑股份公司