專利名稱：自結(jié)合重組抗體融合蛋白的制作方法
專利說(shuō)明自結(jié)合重組抗體融合蛋白 本發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及由至少一個(gè)A部分和至少一個(gè)B部分組成的配合物。本發(fā)明還涉及編碼所述配合物的核酸和/或載體。另外，該配合物的整體部分還包括C部分，C部分由B部分的正交底物組成，它以化學(xué)方式連接在化學(xué)或固體物質(zhì)上。C部分通過(guò)共價(jià)結(jié)合反應(yīng)以底物特異性方式添加到B上，以將它所固有的物理化學(xué)特性轉(zhuǎn)移給配合物ABC。
本
背景技術(shù)：
目前，有一系列得到許可的方法可用于人類惡性疾病的診斷和/或治療，如癌，慢性炎性疾病和變態(tài)反應(yīng)。傳統(tǒng)的治療方法由于它們相對(duì)缺少選擇性(例如，用于癌癥治療的放療和化療)具有很多嚴(yán)重的副作用。
在診斷領(lǐng)域，存在很多新的高分辨成像技術(shù)，它使得可以對(duì)諸如固體腫瘤疾病等進(jìn)行非常精確的拓?fù)鋵W(xué)定位(X-光照片/磁共振成像(MRI))。盡管有正確定位，但腫瘤生物學(xué)和生理學(xué)對(duì)于最佳的治療方式來(lái)說(shuō)仍是十分重要的。
現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，如抗體技術(shù)開啟了診斷和治療的新的可能性和途徑。因?yàn)獒槍?duì)診斷/治療的選擇性成分和融合配偶體可以靶定幾乎每一種所希望的細(xì)胞/組織特異性標(biāo)記。它們還能明顯改善治療的特異性，并且限制假象，假陽(yáng)性/假陰性診斷的發(fā)生幾率。
它們?cè)谧鳛槊庖咴\斷工具或作為免疫治療劑(例如，免疫毒素)應(yīng)用之前，必須使用可檢測(cè)的試劑或效應(yīng)分子對(duì)完整長(zhǎng)度的抗體進(jìn)行修飾。黃金標(biāo)準(zhǔn)仍然是化學(xué)方法。不過(guò)，抗體的化學(xué)修飾經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致問(wèn)題復(fù)雜化，如其結(jié)合活性或特異性的喪失。一般蛋白的化學(xué)特性，如可溶性，在某些情況下也會(huì)受到負(fù)面影響。由于越來(lái)越復(fù)雜的用途，非常需要功能修飾過(guò)的抗體。
本領(lǐng)域的另一發(fā)展是重組抗體與效應(yīng)分子的遺傳融合。不幸的是，所得到的每一種融合蛋白局限于一種或少數(shù)幾種用途。對(duì)每一種新的用途領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，所述抗體必須與其他合適的效應(yīng)分子結(jié)合，結(jié)果是每一種情況都有一個(gè)麻煩的優(yōu)化過(guò)程。另外，該方法只局限于肽類效應(yīng)分子。
本發(fā)明的一個(gè)目的是盡量避免由于全長(zhǎng)抗體的化學(xué)修飾，例如，用于細(xì)胞靶定的融合蛋白的化學(xué)修飾而導(dǎo)致的結(jié)合活性和特異性的喪失。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種化合物，它使得技術(shù)人員可以使用相似或相同的工具進(jìn)行疾病的診斷和治療。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種化合物，它避免了免疫原性/免疫治療的強(qiáng)副作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供傳統(tǒng)治療方法和更特異性的新技術(shù)之間所缺少的環(huán)節(jié)。
本發(fā)明概述 本發(fā)明涉及新型化合物，特別是融合蛋白，它包括至少一個(gè)抗原特異性結(jié)合部分和至少一種酶型蛋白，它能與特異性底物共價(jià)反應(yīng)。
本發(fā)明的目的是通過(guò)一種化合物實(shí)現(xiàn)的，該化合物包括A，B和C三個(gè)部分，這些部分共價(jià)結(jié)合形成具有A-B-C結(jié)構(gòu)的化合物，其中 A部分對(duì)抗原具有特異性結(jié)合親和力， B部分與A部分共價(jià)結(jié)合 C部分是具有烷基化嘌呤或嘧啶(如鳥嘌呤、胞嘧啶等)部分或輔酶A部分的化合物，并且在它上面連接了具有生理效應(yīng)的部分，其前提是 B部分具有催化或受體活性，使C部分與共價(jià)結(jié)合的A-B部分偶連。
在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案中，所述化合物可以表達(dá)成具有以下通用結(jié)構(gòu)的配合物 抗原結(jié)合部分(A)-酶型蛋白(B)-C 本發(fā)明的化合物，特別是異源配合物包括至少一種重組融合蛋白，其包括至少一個(gè)特異性結(jié)合的A部分，特別是細(xì)胞特異性結(jié)合部分和包括一種酶型蛋白B，以及至少一個(gè)與B共價(jià)結(jié)合的附加C部分。
在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方案中，所述化合物是異源配合物，包括至少一種重組融合蛋白，其包括至少一個(gè)與可溶性抗原結(jié)合的A部分和一種酶型蛋白B，以及至少一個(gè)與B共價(jià)結(jié)合的附加C部分。
在一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有通過(guò)B部分而以C部分對(duì)A部分的共價(jià)修飾。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物的A部分是具有多肽類抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)的化學(xué)部分，B部分是與A部分連接的酶型蛋白. 在另一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的B部分能夠以底物特異性方式與C部分起反應(yīng)，由此共價(jià)連接配合物AB和C部分。
具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明化合物的A部分屬于下列一組抗原結(jié)合多肽/蛋白靶細(xì)胞型特異性標(biāo)記，特別是，A部分是針對(duì)病原物質(zhì)或病原體的疾病特異性結(jié)構(gòu)的。A部分的某些代表包括來(lái)自親和物質(zhì)的親和部分或親和物質(zhì)整體的部分，其選自下列一組抗體，受體/受體配體，包括蛋白A/IgG，和抗生物素蛋白/生物素等，酶底物，外源凝集素，白介素，細(xì)胞因子，趨化激素，淋巴因子，過(guò)敏原，肽類過(guò)敏原，重組過(guò)敏原，過(guò)敏原-獨(dú)特型抗體，自身免疫-刺激結(jié)構(gòu)，組織排斥誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)，免疫球蛋白恒定區(qū)及其衍生物，變體或其組合。另外，A部分也可以與疾病/環(huán)境/食品和飼料安全或生物防御(例如，毒素)的可溶性標(biāo)記結(jié)合。
A部分還可以具有對(duì)抗原的特異性結(jié)合親和力，它只有在與免疫原性分子結(jié)合時(shí)才在免疫學(xué)上相關(guān)。所述化合物通常被確定為半抗原，例如，低分子物質(zhì)，作為個(gè)體，它們不會(huì)引起免疫反應(yīng)，但是，在與免疫原性化合物，如蛋白連接之后可以引起免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的B部分是能與特異底物共價(jià)反應(yīng)的多肽。特別是，B部分可以是人類DNA修復(fù)蛋白O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT)的衍生物。所述B部分可以來(lái)自?；d體蛋白(ACP)?？梢岳斫獾氖?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在DNA或氨基酸水平上進(jìn)行多種改變和改進(jìn)，這會(huì)使得有關(guān)部分具有等同的功能。
在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案中，B部分的底物由O6-芐基鳥嘌呤，O2-芐基胞嘧啶或輔酶A(CoA)組成。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明的化合物中，A-B部分是共價(jià)結(jié)合的多肽。
C部分具有轉(zhuǎn)移給配合物AB的物理化學(xué)或生理學(xué)特性。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的C部分是藥物、可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分。
在本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的C部分是固相或支持物。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的C部分包括作為B部分底物的部分。
特別是，C部分可以具有結(jié)構(gòu) (X)n1-(Y)-(Z)n2 其中，X是B部分的特異性底物，n1是1或更大的數(shù)，優(yōu)選1-3，Z是藥物、可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分，n2是1或更大的數(shù)。
C部分的結(jié)構(gòu)元件Y可以滿足以下功能介導(dǎo)X和Z之間(如B和C之間的方式)所需彈性的間隔物，確保組裝的配合物中每一個(gè)部分的功能。
另外，所述接頭結(jié)構(gòu)成分可以包括能夠在相互作用(如化學(xué)反應(yīng))期間，某些環(huán)境條件下受控制地釋放Z的結(jié)構(gòu)(例如，pH敏感型結(jié)構(gòu)或用于在核內(nèi)體或細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)釋放的可還原結(jié)構(gòu))。
所述接頭結(jié)構(gòu)成分Y還可以具有線性，分支，樹狀或聚合物結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了表達(dá)框，包括編碼所述多肽，特別是嵌合多肽的多核苷酸，包括A部分和B部分，順序?yàn)锳B或BA。其他不同的形式也是可能的AAB，ABB，AAAB，AAAAB，BAA；BBA，BAAA，BAAAA，BAB和ABA。
本發(fā)明的核酸分子和本發(fā)明的表達(dá)框還可以是載體或載體系統(tǒng)的一部分，適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)配合物AB(BA)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)主題是載體。
在另一種實(shí)施方案中，提供了用于表達(dá)編碼本發(fā)明的重組化合物的重組基因的方法。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種使用包括上述本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，并且在適合表達(dá)本發(fā)明的相關(guān)配合物的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的方法。
所述宿主細(xì)胞被進(jìn)一步限定為原核細(xì)胞宿主細(xì)胞或真核細(xì)胞宿主細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物，植物或酵母細(xì)胞。
另外，本發(fā)明涉及讓配合物AB(BA)與化合物C起反應(yīng)的方法，化合物C包括對(duì)B專一的一種或多種酶底物，并且還攜帶一個(gè)或多個(gè)藥物拷貝、可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分。
另外，本發(fā)明涉及制備和在體外和體內(nèi)給細(xì)胞施用本發(fā)明相關(guān)配合物的方法，其中，C攜帶一個(gè)或多個(gè)藥物拷貝、可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分。
本發(fā)明相關(guān)配合物的的用途包括體外和體內(nèi)診斷方法，用于人類和動(dòng)物疾病領(lǐng)域，以及分析方法，用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，生態(tài)毒理學(xué)和生物傳感器應(yīng)用領(lǐng)域，其中，C是或包括可檢測(cè)標(biāo)記。
在上述用途的某些實(shí)施方案中，配合物被用于治療人類和動(dòng)物疾病，其中，C是或包括藥物或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的部分。
在一種具體實(shí)施方案中，A部分通過(guò)C部分直接固定在特定表面(平面，珠體)上，以便可以將所述標(biāo)記富集在特定部位。
在另一種具體實(shí)施方案中，A部分被用于檢測(cè)位于獨(dú)特部位(斑點(diǎn)，珠體)上的富集的標(biāo)記(優(yōu)選可溶性的，例如，可溶性CD30/CEA/PSA/sIL-2R/sFAS/sCD23/sCD26/sCD40L/sCD40/CRP/sVCAM-1/MCP1/血栓調(diào)節(jié)蛋白/血漿C4bBP/蛋白C/激活的蛋白C/蛋白S/血管性假血友病因子/TNFR/p55/p75/Fas(CD95)/神經(jīng)生長(zhǎng)因子R/CD27/CD30/生長(zhǎng)激素R/GM-CSF/促紅細(xì)胞生成素-R/血小板生成素/G-CSF/IL-IRI/IL-IRII/IL-2Ra(Tac，CD25)IL-4R/IL-5Ra/IL-7R/IL/CNTFR/LIFR/瘦素R/IL-11R/IL-12/干細(xì)胞因子R(c-kit)/干擾素R/脂多糖R(CD14)/補(bǔ)體受體I型/透明質(zhì)酸鹽R(CD44)/CD58/IgER(FceRII，CD23)/IgGR(FcgRII)/ICAM-1(CD54)/ICAM-3(CD50)/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子bRIII/表皮生長(zhǎng)因子R(c-erb B)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子R/血小板衍生的生長(zhǎng)因子R/成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子/集落刺激因子-1R(MCFR，c-fms)/ARK/Tie/胰島素R/胰島素-樣生長(zhǎng)因子-IIR/甘露糖6-磷酸R)，所述標(biāo)記是通過(guò)C部分固定的，具有以下特性光學(xué)方面包括熒光，磁性方面包括resp.珠體(例如，F(xiàn)eOH為基礎(chǔ)的)，放射性標(biāo)記包括γ射線發(fā)射核素，如锝-99m，鉈-201，鎵-67，氟-18，銦-111，超聲波方面包括resp.氣泡，電化學(xué)方面包括酶，如堿性磷酸酶，寡核苷酸，如用于PCR的雜交探針。
所述特定細(xì)胞的體外/體內(nèi)檢測(cè)是通過(guò)具有上述特征的C部分進(jìn)行的。
在另一種具體實(shí)施方案中，所述A部分與被內(nèi)在化的細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合(EGFR，CD30R，和BCR等)；C部分是選自下列一組試劑具有細(xì)胞毒性/抑制細(xì)胞活性的小分子。
在另一種具體實(shí)施方案中，所述A部分與沒(méi)有被內(nèi)在化的細(xì)胞表面標(biāo)記(MUC1，共結(jié)合蛋白聚糖1)結(jié)合；C部分是輸送CpG基序的試劑，β射線發(fā)射核素，如碘-131，釔-90，镥-177，或激活細(xì)胞毒性劑的酶(定向酶藥物前體治療DEPT，例如，使用羧肽酶作為酶)。
在另一種具體實(shí)施方案中，A部分包括或者是由D-氨基酸組成，通過(guò)人工過(guò)程拷貝上述蛋白/肽，這些蛋白或肽在自然條件下是由L-氨基酸合成的。
在具體實(shí)施方案中，A部分和B部分由下述物質(zhì)修飾，或包括下述物質(zhì)標(biāo)記聚糖的化學(xué)修飾過(guò)的疊氮和炔基單糖前體，攜帶非天然氨基酸的疊氮化物和用于殘基特異性蛋白標(biāo)記的炔或用于檢測(cè)脂化蛋白的疊氮脂底物。
上述方法被稱為生物正交標(biāo)記，可以通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)法對(duì)A部分或B部分進(jìn)行位點(diǎn)專一性修飾，參見如Baskin，J.and Bertozzi C.(2007)。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明 通過(guò)以下說(shuō)明可以理解本發(fā)明的其他目的，特征和優(yōu)點(diǎn)。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)理解的是，用于說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明和具體例子僅僅是以說(shuō)明的方式提供的，因?yàn)樵诒景l(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)的各種改變和改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在閱讀該詳細(xì)說(shuō)明之后是顯而易見的。
本發(fā)明還涉及該異源配合物的診斷，治療或分析組合物，生產(chǎn)該配合物的方法，以及在體外和體內(nèi)使用所述配合物的方法。
在本文中，詞語(yǔ)“a”或“an”可以表示一個(gè)或一個(gè)以上。在本文的權(quán)利要求書中，在與詞語(yǔ)“comprising”組合使用時(shí)，詞語(yǔ)“a”和“an”可以是1或比1大。在本文中“another”可以表示至少另一個(gè)或更多。
在本文中，術(shù)語(yǔ)配合物的“A部分”表示本發(fā)明配合物主動(dòng)結(jié)合結(jié)構(gòu)。所述A部分選自下列一組主動(dòng)結(jié)合結(jié)構(gòu)，包括抗體或它們的衍生物或其片段，合成肽，如scFv，模擬表位肽等或化學(xué)分子，如碳水化合物，脂類，核酸，肽，維生素等，和/或具有高達(dá)100個(gè)原子的小分子，具有受體-結(jié)合活性，如配體，特別是單個(gè)原子，肽類分子，非肽類分子等，和/或細(xì)胞表面碳水化合物結(jié)合蛋白，及其配體，如外源凝集素，特別是鈣聯(lián)蛋白，c-型外源凝集素，1-型外源凝集素，m-型外源凝集素，p-型外源凝集素，r-型外源凝集素，半乳凝素及其衍生物，和/或受體結(jié)合分子，如分化(CD)抗原簇的天然配體，如CD30，CD40等，細(xì)胞因子，如趨化激素，集落刺激因子，1型細(xì)胞因子，2型細(xì)胞因子，干擾素，白介素，淋巴因子，單核細(xì)胞激活素等，和/或粘附分子，包括它們的衍生物和變體，和/或上面所列舉的任何主動(dòng)結(jié)合結(jié)構(gòu)的衍生物或組合，它們與CD抗原，細(xì)胞因子受體，激素受體，生長(zhǎng)因子受體，離子泵，通道形成蛋白結(jié)合。所述A部分還可以選自下列一組被動(dòng)結(jié)合結(jié)構(gòu)，包括過(guò)敏原，肽類過(guò)敏原，重組過(guò)敏原，過(guò)敏原獨(dú)特型抗體，自身免疫刺激結(jié)構(gòu)，組織排斥誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)，免疫球蛋白恒定區(qū)及其衍生物，變體或其組合。選自上述各組的至少兩個(gè)相同或不同結(jié)合結(jié)構(gòu)的組合，便可以產(chǎn)生具有更高效價(jià)的A部分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，A部分與屬于分化抗原簇(CD-抗原，表1)的健康或病變細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合。
在另一種具體實(shí)施方案中，所述A部分是趨化因子或它的特異性結(jié)合片段，如在表2中列舉的，與它的特異性細(xì)胞受體結(jié)合。
在另一種實(shí)施方案中，A部分是白介素或它的特異性結(jié)合片段，如在表3中列舉的，與它的特異性細(xì)胞受體結(jié)合。
在另一種實(shí)施方案中，A部分是在表1中列舉的分化抗原簇的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)部分，與可溶性因子特異性結(jié)合，并且被用于檢測(cè)可溶性抗原或可溶性抗原家族。
在另一種具體實(shí)施方案中，A部分是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，趨化行為和/或功能活性的血管生成因子或它的特異性結(jié)合片段，包括AcSDKP，aFGF，ANF，血管生成素，血管調(diào)節(jié)素，血管營(yíng)養(yǎng)素，AtT20-ECGF，B61，bFGF，bFGF誘導(dǎo)活性物，CAM-RF，ChDI，CLAF，ECGF，ECI，EDMF，EGF，EMAP-2，Neurothelin(參見EMMPRIN)，血管內(nèi)皮抑制素，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，內(nèi)皮細(xì)胞活性保持因子，Epo，F(xiàn)GF-5，IGF-2(參見血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)活性物)，HBNF，HGF，HUAF，IFN-γ，IL1，K-FGF，LIF，MD-ECI，MECIF，NPY，制瘤素M，PD-ECGF，PDGF，PF4，PlGF，催乳激素，TNF-α，TNF-β，轉(zhuǎn)鐵蛋白，VEGF。某些所述因子是最初由某些其他生物學(xué)活性物檢測(cè)到的蛋白因子，并且隨后被證實(shí)能夠促進(jìn)血管生成。體內(nèi)血管生成活性的蛋白因子的例子包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(參見FGF)，血管生成素，血管生成素-1，EGF，HGF，NPY，VEGF，TNF-α，TGF-β，PD-ECGF，PDGF，IGF，IL8，生長(zhǎng)激素。業(yè)已證實(shí)纖維蛋白片段E也具有血管生成活性。另外，還有如血管生成素-1等因子，不是像傳統(tǒng)生長(zhǎng)因子那樣對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起作用，而是在血管發(fā)生和血管生成過(guò)程中發(fā)揮突出的作用。
在另一種實(shí)施方案中，所述A部分是毒力因子或它與人類細(xì)胞亞類結(jié)合的相應(yīng)部分，如121R，14.7kDa orf病毒蛋白，145R，16kDa orf病毒蛋白，2C，牛痘病毒的38K基因，3a，5EL，5-HL，7a，A224L，A238L，A39R，A41L，AcMNPV ORF32，伴放線放線桿菌細(xì)胞致死擴(kuò)張毒素，伴放線放線桿菌白細(xì)胞毒素，腺病毒死亡蛋白，腺病毒E1B 19kDa蛋白，腺病毒E310.4K/14.5kDa蛋白，腺病毒E314.7kDa蛋白，腺病毒E319kDa蛋白，氣溶素，AgMNPV IAP3，AHV-Sema，AIP56，α-溶血素，α-HL，α-毒素，抗-細(xì)胞因子，凋亡素，細(xì)胞凋亡，B13R，B15R，B18R，B8R，炭疽桿菌毒素，Bacteriokine，桿狀病毒p35蛋白，桿狀病毒P49蛋白，BAD1，BALF-1，BARF1，BCK，BCL2，BCRF-1，B-溶血素，B-毒素，BHRF-1，Bm-MIF，BmNPV FGF，包特氏菌屬皮膚壞死毒素，BORFE2，BPV-1E6，BZLF1，C12L，C21L，CADD，彎曲菌屬細(xì)胞致死擴(kuò)張毒素，caspase-7-樣蛋白，Caspases，CDT，Ce-MIF，趨化激素，Circo病毒2型ORF3，CLAP，魏氏桿菌α-毒素，魏氏桿菌β-毒素，CMV IL10，CMV RR1，CNF1，CNF2，COPE version 15.8，COPE version 8.7，COPE，crmA，crmB，crmC，crmD，crmE，細(xì)胞因子分析，細(xì)胞因子種間反應(yīng)性，細(xì)胞因子，D7L，δ-溶血素，δ-毒素，E1.1，E1B-55K，E2，E3-6.7，E3L，E3L-樣蛋白，E4orf4，E5，E6，E7，E8，早期響應(yīng)基因，EBNA-LP，ECRF-3，缺肢畸形痘病毒p13，缺肢畸形病毒p28蛋白，EHV-2E1 ORF，EHV-2 IL10，EP153R，EP402R，Erns，大腸桿菌細(xì)胞致死擴(kuò)張毒素，F(xiàn)1L，F(xiàn)LIP，F(xiàn)PV016蛋白，F(xiàn)ractalkine，腐馬素毒素，壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素，G4R，G5R，GAM-1，γ-溶血素，GIF，糖蛋白G，gp120，GPCMV-MIP，H3L，H4R，H83，杜克雷嗜血桿菌細(xì)胞致死擴(kuò)張毒素，HBx，螺桿菌屬細(xì)胞致死擴(kuò)張毒素，溶血素BL，松鼠猴皰疹病毒BCL2，HJ1，HP1118，HP-NAP，HSGF-2，HVP IL10，HVS13，IAP，ICP0，ICP10PK，ICP22，ICP27，ICP34.5，IE1，IE2，IE2579aa，IMP，甲流病毒NS1蛋白，IpaB，ITA，K13，K2，K2R，K3R，K4.1，K6，KSHV ORF4，KSHV，L*，LANA-2，墨西哥利什曼原蟲半胱氨酸蛋白酶CPB2.8，LMP2A，M11L，m131/129，M3，M33，M78，MALP-404，溶血性曼氏桿菌白細(xì)胞毒素，MC148R，MC159，MC53L，MC54L，MDM，MDV003，MDV078，MEQ，MGF，微囊藻毒素-LR，Microkine，調(diào)制蛋白，M-T1，M-T7，MyD，N1R，Nipah病毒P蛋白，Nipah病毒V蛋白，Nipah病毒W(wǎng)蛋白，Npro，NS1，NS2，NS5A，orf病毒IL10，orf病毒，ORF，ORF13，ORF152，ORF16，ORF390，ORF45，ORF50，ORF74，ORFK2，ORFK4.1，ORFK4，ORFK5，ORFK6，ORFK7，ORFK9，ORFV2-VEGF，p13，Panton-Valentine殺白細(xì)胞素，多殺性巴氏桿菌毒素，PB1-F2，痘病毒生長(zhǎng)因子，PRGF，綠濃假單胞菌外毒素A，RK-BARF0，RRV ORF74，RSV糖蛋白G，RTA，SARS冠狀病毒E蛋白，SARS冠狀病毒N蛋白，SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白-1，SCMV IL10，SERP1，SERP2，SERP3，SFGF，志賀氏菌屬細(xì)胞致死擴(kuò)張毒素，σC，SipB，sis，Sliap，Slp49，SPI-2，SPV146，金黃色葡萄球菌α-毒素，金黃色葡萄球菌δ-毒素，金黃色葡萄球菌γ-毒素，STI，鏈球菌溶血素O，SV40大T抗原，SV5V蛋白，豬痘病毒SPV003/148蛋白，T2，TAIP，Tanapox病毒2L蛋白，Tanapox病毒38kDa蛋白，托高土病毒病毒ML蛋白，Trypanokine，U12，U51，U83，U83A，UL111.5A，UL111a，UL119-UL118，UL141，UL144，UL146，UL147，UL18，UL3蛋白，UL36，UL37，UL69蛋白，UL82，US27，US28，US3，Us5，V蛋白，VacA，牛痘19kDa蛋白，牛痘生長(zhǎng)因子，牛痘病毒生長(zhǎng)因子，牛痘病毒蛋白磷酸酶VH1，vBCK，vBCL2，vC4bBP，vCCI，vCCL1，vCKBP，vCKBP-1，vCKBP-2，vCKBP-3，vCKBP-4，VCP，vCSF1BP，VEGF-E，vFGF，VG71，vGPCR，vICA，vIL17，vIL18BP，vIL6，vIL8，病毒BCK，病毒BCL2，病毒C4b結(jié)合蛋白，病毒CCL1，病毒CD30，病毒趨化因子結(jié)合蛋白，病毒趨化因子結(jié)合蛋白-1，病毒趨化因子結(jié)合蛋白-2，病毒趨化因子結(jié)合蛋白-3，病毒趨化因子結(jié)合蛋白-4，病毒趨化因子抑制劑，病毒CSF1結(jié)合蛋白，病毒細(xì)胞因子受體s，病毒細(xì)胞因子，病毒EGF，病毒Fc-γR2，病毒Fc-γR3，病毒FLICE-抑制蛋白，病毒G-蛋白結(jié)合的受體，病毒IFN-γ/IL2/IL5結(jié)合蛋白，病毒IL10，病毒IL17，病毒IL18結(jié)合蛋白，病毒IL6，病毒IL8，細(xì)胞凋亡蛋白的病毒抑制劑，caspase激活的病毒抑制劑，病毒干擾素調(diào)節(jié)因子，病毒干擾素調(diào)節(jié)因子-1，病毒干擾素調(diào)節(jié)因子-2，病毒干擾素調(diào)節(jié)因子-3，病毒M-CSF結(jié)合蛋白，病毒MIP-1，病毒MIP-1-α，病毒MIP-1-β，病毒MIP-2，病毒NGF-β，病毒OX2，病毒腦信號(hào)蛋白，病毒TGF-β，病毒VEGF，vIRF，vIRF1，vIRF2，vIRF3，病毒受體，病毒因子，vMCC-1，vM-CSFBP，vMIA，vMIP-1，vMIP-1-α，vMIP-1-β，vMIP-2，vMIP-3，vNGF-β，vOX2，VP35蛋白，VP5，vTGF-β，vTNFR，VVGF，Y134R，雅巴猴腫瘤病毒2L蛋白，YLDV IL10，YopJ，ZmpB，Zta。
在本文中，術(shù)語(yǔ)″抗體″表示多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、單鏈抗體及其片段，如Fab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v，和其他片段，它保留了親代抗體的抗原結(jié)合功能和特異性。
在本文中，術(shù)語(yǔ)″單克隆抗體″表示具有同種抗體群體的抗體組合物，該術(shù)語(yǔ)不局限于所提到的抗體種類或來(lái)源，也不局限于形成它們的方式。該術(shù)語(yǔ)包括所有免疫球蛋白以及片段，如Fab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v，以及其他保留了所述抗體的抗原結(jié)合功能和特異性的其他部分。任何哺乳動(dòng)物的單克隆抗體都可用于本發(fā)明中。不過(guò)，在實(shí)踐中，所述抗體通常是大鼠或鼠類來(lái)源的，因?yàn)榇笫蠡蚴箢惣?xì)胞系可用于制備需要的雜交細(xì)胞系或雜交瘤，以生產(chǎn)單克隆抗體。
在本文中，術(shù)語(yǔ)″人類抗體″表示免疫球蛋白的框架區(qū)來(lái)自人類免疫球蛋白序列。
在本文中，術(shù)語(yǔ)″單鏈抗體片段″(scFv)表示通過(guò)確定結(jié)合抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(包括重鏈和輕鏈)，并且補(bǔ)充連接部分而制備的抗體，它可以保留所述結(jié)合功能。實(shí)質(zhì)上，這形成了根本上簡(jiǎn)化了的抗體，它僅具有與抗原結(jié)合所需要的可變結(jié)構(gòu)域部分。單鏈抗體的確定和構(gòu)建可以參見Ladner等的US-A-4,946,778。
B部分是源于烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT)的酶樣蛋白，它具有O6-芐基鳥嘌呤或O6雜芳基甲基鳥嘌呤的底物特異性。所述酶樣蛋白能夠通過(guò)以前在WO/2005/085470中披露的反應(yīng)，從底物轉(zhuǎn)移某些標(biāo)記。
在一種具體實(shí)施方案中，所述酶樣蛋白業(yè)已被修飾成能識(shí)別2-氨基-4-芐氧基嘧啶的，參見WO/2006/114409。
B部分還可以是來(lái)自蛋白烷基胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶(ACT)的酶樣蛋白，它具有對(duì)O2-芐基胞嘧啶衍生物和相關(guān)的O2雜芳基甲基-胞嘧啶衍生物的底物特異性，參見WO/2008/012296。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，B由?；d體蛋白或其片段組成。輔酶A衍生物能夠在存在修飾酶鹵-?；d體蛋白(ACPS)或其修飾或其變體的情況下，將它的標(biāo)記轉(zhuǎn)移給ACP或ACP的一部分，參見WO/2004/104588。
本發(fā)明的DNA序列可以工程改造，為改變嵌合編碼序列，以便用于各種修飾，包括，但不局限于修飾過(guò)程和表達(dá)基因產(chǎn)物方面的改變。例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)引入突變，例如，定向誘變或SOE-PCR，以便插入或除掉限制位點(diǎn)，從而改變活性中心的糖基化或磷酸化方式或改變底物特異性。
在本文中，術(shù)語(yǔ)配合物的“C部分”表示通過(guò)共價(jià)結(jié)合添加在配合物AB上的特異性額外功能。C部分是藥物、可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分。C可以是固相。
C還包括起著B部分的底物作用的部分。
C部分可以具有結(jié)構(gòu)(X)n1-(Y)-(Z)n2，其中，X是B部分特異底物，n1是1或更大的數(shù)，優(yōu)選1-3，Z是藥物、可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分，n2是1或更大的數(shù)。
Y被設(shè)計(jì)成用于功能性連接X(jué)和Z的連接結(jié)構(gòu)。Y可以滿足以下功能介導(dǎo)X和Z之間(以至B和C之間的)所需彈性的間隔物，確保組裝的配合物中每一種成分的功能。
另外，所述接頭可以包括使得Z在某些環(huán)境條件下能受控釋放的結(jié)構(gòu)(例如，pH敏感型或可還原結(jié)構(gòu)，以便在核內(nèi)體或細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)釋放或酶可降解的接頭)。例如，所述連接結(jié)構(gòu)可以是順式烏頭酰連接，包括酯鍵接頭，酸敏感型腙接頭，溶菌酶可降解的肽接頭，自我消除的間隔物，sulphhydryl接頭，光敏感型接頭(參見Dyba et al.)。
另外，所述接頭可以包括螯合劑，如DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸)或DTAP(二乙三胺五乙酸)，例如，它可用于與放射性同位素絡(luò)合。
Y可以具有線性，分支，樹狀或聚合物結(jié)構(gòu)。
可用作C部分的藥物包括可在靶細(xì)胞上表現(xiàn)出作用模式的所有類型的物質(zhì)，以及在轉(zhuǎn)移到體內(nèi)的特定部位后可能更有效的物質(zhì)。優(yōu)選的是，被證明具有效力的化合物，例如，化療制劑。所述物質(zhì)可選自下列一組烷基化制劑(例如環(huán)磷酰胺，苯丁酸氮芥)，安血定制劑(阿霉素，道諾霉素)，美登素類化合物(美登素類化合物DM1)，抗代謝產(chǎn)物，植物堿和萜類，如吲哚類生物堿(長(zhǎng)春花堿，長(zhǎng)春新堿，民諾賓，長(zhǎng)春地辛)足葉草毒素及其衍生物和紫杉烷(紫杉醇，多西紫杉醇，泰素帝)或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(喜樹堿)，合成毒素，如玫瑰樹堿類似物或腫瘤抗生素的合成類似物，如雙聯(lián)霉素或CC1065，其他微管蛋白結(jié)合劑，如軟海綿素B，半星海膽素和海兔毒素或類似物，如單甲基-auristatin E；C部分還可以選自下列一組具有細(xì)胞毒性/抑制細(xì)胞的活性的小分子，如烷基化制劑(如環(huán)磷酰胺，二氯甲基二乙胺，苯丁酸氮芥，美法侖)或蒽環(huán)類藥(如去甲氧柔紅霉素，阿霉素，表柔比星，黃膽素，米托蒽醌，戊柔比星)或cytoskeletal disruptors(如紫杉醇，多西紫杉醇)或埃坡西龍(如)或拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制劑(如足葉乙甙，替尼泊甙，Tafluposide)或核苷酸類似物和前體類似物(如azacididine，咪唑硫嘌呤，卡培他濱，阿糖胞苷，doxofluridine，氟尿嘧啶，吉西他濱，巰基嘌呤，甲氨蝶呤，硫鳥嘌呤)或肽抗生素(如博來(lái)霉素)或鉑基制劑(如卡波鉑，順氯氨鉑，奧克賽鉑)或類維生素A(如所有順式視黃酸)或吲哚類生物堿和衍生物(如長(zhǎng)春花堿，長(zhǎng)春新堿，vindestine，長(zhǎng)春瑞濱)，β射線發(fā)射核素，如碘-131，釔-90，镥-177，選自下列一組的物質(zhì)芳香酶抑制劑(如氨魯米特，阿那曲唑，來(lái)曲唑，伏氯唑，依西美坦，4-雄烯-3，6，17-三酮，1，4，6-androstatrien-3，17-二酮，福美司坦，睪內(nèi)酯)，碳酸酐酶抑制劑(如乙酰唑胺，美舍唑咪，多佐胺，托吡酯)，膽堿脂酶抑制劑(有機(jī)磷酸，如美曲磷酯，氨基甲酸酯，如毒扁豆堿，新斯的明，吡啶斯的明，阿伯農(nóng)，Demarcarium，利凡斯的明，Phananthrine，如加蘭他敏，哌啶，如多奈哌齊，他克林，Edophonium，或吩噻嗪)，環(huán)加氧酶抑制劑(如塞來(lái)昔布，羅非克西，依托昔布，醋氨酚，雙氯芬酸，異丁苯丙酸)，也算拮抗劑(如甲氨蝶呤)，羥甲基戊二酰基-CoA還原酶抑制劑(如阿托伐他汀，西立伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，羅素他汀，辛伐他汀，維托力，Advicor，Caduet)，整合酶抑制劑(如雷特格韋，Elvitegravir)，脂加氧酶抑制劑(如Zileutron)，單胺氧化酶抑制劑(如異唑肼，嗎氯貝胺，苯乙肼，反苯環(huán)丙胺，司立吉林，雷沙吉蘭，煙肼酰胺，異煙酰異丙肼，異丙氯肼，托洛沙酮，雷奈佐利，色胺，嚏根草甙，Detxtroamphetamine)，核酸合成抑制劑，磷酸二酯酶抑制劑(如咖啡因，Theopyline，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，長(zhǎng)春西汀，EHNA，依諾他賓，Lirinone，PDE3，松葉菊堿，咯利普蘭，異丁司特，西地那非，他達(dá)那非，伐地那非，Udenafil，阿伐那非)，蛋白酶抑制劑(如沙奎那韋，利托那韋，茚地那韋，奈非那韋，安普那韋，洛匹那韋，阿扎那韋，福沙那偉，替拉那韋，地瑞那韋)，蛋白激酶抑制劑(如伊馬替尼，吉非替尼，哌加他尼，索拉非尼，達(dá)沙替尼，蘇尼替尼，埃羅替尼，尼羅替尼，拉帕替尼)，蛋白合成抑制劑(如茴香霉素，環(huán)己酰亞胺，氯霉素，四環(huán)素，鏈霉素，紅霉素，嘌呤霉素等)，質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑，羊毛二烯，埃索美拉唑，泮托拉唑，雷貝拉唑)，選自下列一組的物質(zhì)寡核苷酸核酸，如小干擾RNAs(siRNAs)或短發(fā)夾RNA(shRNA)，反義DNA或RNA，雙鏈RNA(dsRNA)或微RNA(miRNA)，可用于下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控途徑上的特定關(guān)鍵因子。
在一種具體實(shí)施方案中，C部分是聚合物或樹枝狀化合物，攜帶若干如上文所述的細(xì)胞抑制/細(xì)胞毒性制劑，如紫杉醇或氨甲喋呤分子，攜帶芐基鳥嘌呤(BG)/芐基胞嘧啶(BC)-基團(tuán)，并且被修飾過(guò)，例如PEG化，以便改善其生物適應(yīng)性。
另外，所述藥物可以是選自下列一組的放射性同位素可用于放療的β射線同位素(例如，碘-131，镥-177，釔90)。
在另一個(gè)例子中，所述藥物可以是核酸或核酸類似物，它可以在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生生物學(xué)活性。更具體地講，所述核酸分子可以被設(shè)計(jì)成允許編碼的蛋白在靶細(xì)胞中表達(dá)(用于基因治療)或介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)包括小干擾RNAs(siRNAs)或短發(fā)夾RNA(shRNA)，反義DNA或RNA，雙鏈RNA(dsRNA)或微RNA(miRNA)。
在一種具體實(shí)施方案中，C部分是如上文所定義的siRNA或接頭結(jié)構(gòu)，具有與siRNAs相關(guān)的一種或多種功能，單一特異性或若干不同的特異性。所述RNAi介導(dǎo)化合物可以針對(duì)任何需要的細(xì)胞mRNA。所述RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)化合物可以被設(shè)計(jì)成直接或間接下調(diào)對(duì)靶細(xì)胞的存活來(lái)說(shuō)關(guān)鍵的因子的表達(dá)(例如，siRNA介導(dǎo)的伸長(zhǎng)因子II的剔除(eEFII或多種抗-細(xì)胞凋亡因子，如BCL2，BCL-xL或其他癌基因)或可以被設(shè)計(jì)成改變?cè)诎屑?xì)胞中的基因表達(dá)形式，從而發(fā)揮治療作用。
在一種具體例子中，配合物AB-C包括EGFR特異性單鏈抗體或與SnapTag融合的人EGF，在它上面連接了針對(duì)人伸長(zhǎng)因子II、核纖層蛋白A/C、或用BG修飾過(guò)的GFP的siRNA。
C部分還可以是藥物前體，它是在進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)可被激活的，例如通過(guò)細(xì)胞蛋白酶激活。
所述藥物還可以是對(duì)靶細(xì)胞具有毒性活性的肽或多肽。
其例子包括ADP核糖基化酶，假單胞菌外毒素A，白喉，霍亂，百日咳-和肉毒桿菌毒素。核糖體失活蛋白diathin，皂角毒蛋白，bryodin，gelonin，篦麻毒素，相思豆毒素或局限曲菌素。核糖核酸酶(磷酸二酯酶)RNAse H，血管生成素，嗜曙紅細(xì)胞-衍生的神經(jīng)毒素(EDN)，嗜曙紅細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白，onconase和牛蛙列康肽。C表示的其他蛋白包括藥物前體活化酶，如caliceamicin，葡萄糖氧化酶，羧肽酶，堿性磷酸酶，cytosindeaminase，β-糖苷酶，β-葡萄糖醛酸苷酶，β-內(nèi)酰胺酶，硝基還原酶，胸苷激酶或嘌呤-核苷磷酸化酶。其他組織蛋白酶，顆粒酶及其組合和上述蛋白家族的可能的變體。
優(yōu)選的是經(jīng)過(guò)確認(rèn)的毒素，如篦麻毒素A，α帚曲菌素(外源凝集素家族)，白喉毒素和假單胞菌外毒素A。它們具有若干臨床研究用途，并且它們的效力在文獻(xiàn)中有大量報(bào)道。
C部分還可以表示有毒的肽，如防御素，抗真菌肽或例如從圓鰭魚或海綿中分離的若干種肽。
可檢測(cè)標(biāo)記是熒光染料，如熒光素，若丹明，香豆素和青色素及其衍生物。優(yōu)選的熒光團(tuán)可以在680-950nm的近紅外(NIR)范圍內(nèi)發(fā)射。該波長(zhǎng)導(dǎo)致非常低的背景熒光，和出色的組織滲透能力，因此很適合體內(nèi)熒光檢測(cè)。在一種具體實(shí)施方案中，腫瘤特異性抗體或與Snap-tag融合的其他配體是用NIR染料的BG衍生物標(biāo)記的。所述標(biāo)記的抗體或配體起著成像工具的作用，可用于觀察體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和/或治療。
在一個(gè)具體例子中，發(fā)射波長(zhǎng)為782nm的NIR染料的BG衍生物結(jié)合在單鏈抗體片段SNAP-tag融合蛋白靶定的EGFR上。將所得到的體內(nèi)成像探針用于檢測(cè)EGFR在胰腺癌異種移植模型中的表達(dá)。在其他具體例子中，將熒光團(tuán)結(jié)合的幾種配合物AB用于流式細(xì)胞測(cè)定術(shù)和共焦顯微術(shù)。
另外，所述可檢測(cè)標(biāo)記可以是γ射線放射性同位素，例如，碘-131，镥-177，釔90或任何其他診斷上相關(guān)的同位素，通常用絡(luò)合劑如DOTA或DTAP與其結(jié)合。
另外，所述可檢測(cè)標(biāo)記可以是由重金屬，如CdSe或InGaP，組成的量子斑。量子斑是優(yōu)選的光學(xué)成像制劑，因?yàn)樗鼈兊母吡孔赢a(chǎn)量和光穩(wěn)定性。C部分所代表的熒光標(biāo)記的另一種可能性可以是貴金屬納米簇，由少量(8-12)金或銀原子組成，或由俘獲在二氧化硅制得的納米顆粒中的合成熒光團(tuán)組成。
其他可檢測(cè)標(biāo)記是用于MRI基分子成像的超順磁氧化鐵顆粒。
熒光蛋白，如GFP或dsRED或其衍生物可用作檢測(cè)標(biāo)記，與配合物AB結(jié)合。目前，熒光蛋白覆蓋了很大范圍的可見光譜和近紅外光譜。
其他可檢測(cè)標(biāo)記可以是酶，如堿性磷酸酶，過(guò)氧化物酶和半乳糖苷酶，它們常用于各種免疫測(cè)定。
C部分還可以是固相，如珠體，生物芯片表面或ELISA-平板。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“抗原”表示與任何A部分結(jié)合的任何靶結(jié)構(gòu)。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“配合物”是化學(xué)實(shí)體，它可以是由形成化合物的不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)建的，所述不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過(guò)共價(jià)鍵和/或離子鍵以及疏水性和/或親水性相互作用彼此結(jié)合。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“治療的”表示配合物ABC至少導(dǎo)致疾病穩(wěn)定的任何應(yīng)用。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“診斷的”表示配合物ABC導(dǎo)致醫(yī)學(xué)，科學(xué)，工程，環(huán)境，食品和飼料，商業(yè)，貿(mào)易等方面確定問(wèn)題性質(zhì)的任何用途。
術(shù)語(yǔ)“靶細(xì)胞”和或“靶組織”，表示攜帶有能與配合物的A部分主動(dòng)或被動(dòng)結(jié)合的細(xì)胞外表面結(jié)構(gòu)的細(xì)胞或組織。因此，靶細(xì)胞和靶組織是配合物的A部分可以結(jié)合的細(xì)胞和組織。
術(shù)語(yǔ)”重組”表示通過(guò)分子生物學(xué)領(lǐng)域公知的任何一種方法，由不同的來(lái)源制備分子，特別是共價(jià)結(jié)合的分子。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)″重組″特別是表示抗體或配體A部分與酶樣蛋白B部分通過(guò)分子生物學(xué)領(lǐng)域的任何一種已知方法，如通過(guò)單鏈抗體產(chǎn)生而融合。編碼包括抗體/配體部分和酶型蛋白部分的重組融合蛋白的重組DNA分子是重組表達(dá)的。通過(guò)這種方法生產(chǎn)的本發(fā)明的重組配合物，可以通過(guò)適合這一目的的重組DNA表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域的任何已知技術(shù)來(lái)分離。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”表示突變的或修飾的蛋白，它保留了它的特有活性，即結(jié)合活性或酶促活性。特別優(yōu)選的是組成型活性衍生物。術(shù)語(yǔ)衍生物包括蛋白，它攜帶至少一個(gè)氨基酸的取代、缺失、添加、單一結(jié)構(gòu)域的交換或至少一個(gè)氨基酸的至少一種修飾。特別是，具有盡可能多的修飾，但又不會(huì)破壞本發(fā)明的化合物的功能的衍生物屬于本發(fā)明的范圍，尤其是攜帶大約20個(gè)這樣的改變或攜帶大約10個(gè)這樣的改變或攜帶1-5個(gè)這樣的改變的蛋白。
“衍生物”的其他含義是蛋白在它的側(cè)鏈上的化學(xué)修飾，例如，糖基化、磷酸化、羧基的修飾，如酰胺化，酯化、硫醇或羥基的修飾，例如烷基化或氧化或二硫化物連接、氨基的修飾，它可以起著親核部分的作用，如?；?、烷基化或其他親電子攻擊。
另外，術(shù)語(yǔ)“衍生物”表示類似于母結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它是通過(guò)其他或多或少的配合基團(tuán)延長(zhǎng)或修飾過(guò)的，例如，熒光團(tuán)作為母結(jié)構(gòu)，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)活性基團(tuán)，例如，馬來(lái)酰亞氨基團(tuán)使之延長(zhǎng)。
在本文中，術(shù)語(yǔ)″載體″包括DNA和RNA形式的質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，噬菌粒，它們的衍生物，或病毒。載體包括控制序列和編碼序列。
術(shù)語(yǔ)″編碼重組配合物的重組基因的表達(dá)″，其中，所述重組配合物是單鏈抗體/配體-酶型蛋白融合多肽，表示用編碼所述配合物的核酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并且培養(yǎng)選自下列一組的所述宿主細(xì)胞細(xì)菌，如大腸桿菌，和/或酵母，如S.cerevisiae，和/或建立的哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞系，如CHO，NS0，COS，BHK，293T和MDCK細(xì)胞，和/或原代細(xì)胞，如人類細(xì)胞，非人脊椎動(dòng)物細(xì)胞，和/或無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞，如昆蟲細(xì)胞，和相應(yīng)mRNA的合成或翻譯，最終得到所述重組蛋白，即所述重組配合物。更具體地講，術(shù)語(yǔ)″編碼所述重組配合物的重組基因的表達(dá)″包括以下步驟 用重組載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞宿主，所述載體插入了編碼該融合蛋白的核苷酸序列，該序列受合適調(diào)控因子的控制，特別是通過(guò)宿主細(xì)胞的聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子。對(duì)于原核宿主來(lái)說(shuō)，合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)還位于編碼所述融合蛋白的核苷酸序列前面，以便能夠在所述細(xì)胞宿主中翻譯，對(duì)于真核宿主來(lái)說(shuō)，可以提供任何人工信號(hào)序列或前/原序列，或采用天然信號(hào)序列。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞宿主在能夠表達(dá)所述插入序列的條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明也要求保護(hù)細(xì)胞或體外翻譯系統(tǒng)，在用本發(fā)明的核酸分子或載體，或加入本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染之后，便能合成本發(fā)明的完整配合物或其各部分。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是細(xì)胞腔室或除人類之外的有機(jī)體，所述腔室或有機(jī)體用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。所述細(xì)胞腔室可以是原核來(lái)源的，特別是來(lái)自E.coli，B.subtilis，S.carnosus S.coelicolor，和/或Marinococcus sp.，或低等真核生物，如Saccharomyces sp.，Aspergillus sp.，Hansenulapolymorpha，Arxula adeninivorans，Spodoptera sp.和/或P.pastoris，高等非人真核生物，如植物和/或動(dòng)物，并且所述細(xì)胞也可是原代或培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如新分離的人類細(xì)胞或真核細(xì)胞系，如CHO，NS0，COS，BHK，293T和MDCK。
本發(fā)明的細(xì)胞或有機(jī)體是原核來(lái)源的，特別是來(lái)自E.coli，B.subtilis，S.carnosus，S.coelicolor，Marinococcus sp.，或者真核來(lái)源的，特別是來(lái)自Saccharomyces sp.，Aspergillus sp.，Spodoptera sp.，P.pastoris，原代或培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，真核細(xì)胞系(例如，CHO，Cos或293)，植物(例如N.tabacum)，或酵母(例如S.cerevisiae，H.polymorpha，A.adenivorans)。
本發(fā)明還涉及藥品和分析/診斷工具，包括本發(fā)明的配合物和/或編碼本發(fā)明配合物的核酸或載體。一般，本發(fā)明的配合物是以生理學(xué)上可接受的劑型施用的。其中包括，例如，Tris，NaCl，磷酸緩沖液以及所有得到批準(zhǔn)的緩沖系統(tǒng)，特別包括以添加得到批準(zhǔn)的蛋白穩(wěn)定劑為特征的緩沖系統(tǒng)，所述施用具體通過(guò)腸胃外，靜脈內(nèi)，皮下，肌內(nèi)，腫瘤內(nèi)，經(jīng)皮給藥，以及通過(guò)經(jīng)粘膜涂敷等實(shí)現(xiàn)的。
施用本發(fā)明配合物的劑量必須通過(guò)臨床階段I研究法(劑量逐步加大研究)，針對(duì)每一種新治療疾病的每一種應(yīng)用來(lái)確定。
本發(fā)明的配合物，編碼它的核酸分子和/或細(xì)胞或體外翻譯系統(tǒng)可用于制備藥品，用于治療腫瘤疾病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病、和慢性/急性炎性反應(yīng)，或用于制備所述疾病的診斷工具。另外，可以治療惡性疾病和組織/移植排斥反應(yīng)。
有關(guān)重組蛋白工程的其他細(xì)節(jié)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知或在閱讀被收作本文參考的Rosenblum(US 2006/0280749A1)的文獻(xiàn)之后便可以了解。
實(shí)施例 下面是對(duì)實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明。不過(guò)，它們不是限定性例子，其他實(shí)施例和方法也可用于實(shí)施本發(fā)明。
I C部分的化學(xué)合成 縮寫 BC-NH2＝2-(4-氨甲基芐氧基)-4-氨基嘧啶(氨甲基芐基胞嘧啶)。
BG-PEG4-NH2＝6-(4-((2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)芐氧基)-9H-嘌呤-2-胺(peg化的O6-芐基鳥嘌呤)。
CDI＝N，N′-羰基二咪唑 CoA-SH＝輔酶A DCC＝二環(huán)己基碳二亞胺 DCU＝二環(huán)己基脲 DIPEA＝二異丙基乙胺 DMF＝二甲基甲酰胺 DMSO＝二甲基亞砜 DTT＝二硫蘇糖醇 EDC＝1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺 eq＝當(dāng)量 ESI-MS＝電噴射離子化質(zhì)譜分析 Et3N＝三乙胺 EtOAc＝乙酸乙酯 EtOH＝乙醇 FAB-MS＝高速原子轟擊質(zhì)譜分析 HOBT＝1-羥基苯并三唑 HPLC＝高壓液相層析 Lys＝賴氨酸 MeNH2＝甲胺 MeOH＝甲醇 NHS＝N-羥基琥珀酰亞胺 NMP＝N-甲基吡咯烷 PEG12＝-(CH2CH2O)12- PMe3＝三甲基膦 PYBOP＝六氟代磷酸(苯并三唑-1-基氧基)-三吡咯烷基-鎓鹽 TFA＝三氟乙酸 Tris＝三(羥甲基)甲胺 分子生物學(xué)相關(guān)術(shù)語(yǔ)的縮寫 BG O6-芐基鳥嘌呤(衍生物) CT O2-芐基胞嘧啶(衍生物) LB Luria肉湯 TB terrific brith IMAC 固定化金屬親和層析 μ 微 M毫 M摩爾 mAk 單克隆抗體 Min 分鐘 mRNA (“信使“)核糖核酸(RNA) siRNA短干擾核糖核酸 DNA 脫氧核糖核酸 Mw 分子量 N納米 N-term 氨基末端(用于蛋白/寡肽) C-term 羧基-末端(用于蛋白/寡肽) ORF 開放讀框 PAA 聚丙烯酰胺 PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳 pAk 多克隆抗體 PBS 磷酸緩沖鹽水 PBS-TPBS+0，05％(v/v)Tween-20 PCR 聚合酶鏈反應(yīng) PEG 聚乙二醇 pelBE.coli中靶定外周質(zhì)的細(xì)菌引導(dǎo)肽 RT 反轉(zhuǎn)錄酶 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄酶PCR s 秒 scFv單鏈可變片段 SDS 十二烷基磺酸鈉 Taq 水生棲熱菌 Tris三(羥甲基)氨基甲烷 Tween 20聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯 U 單位 o.n.過(guò)夜 RPM 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) UV 紫外線 V 伏 v/v 體積/體積 VH/VL 可變區(qū)重鏈(H)或輕鏈(L)免疫球蛋白 Vol.體積 W 瓦特 w/v 重量/體積 scFv H22針對(duì)人CD64的人源化scFv scFv 40 抗apple scrap spores的鼠類抗體 CD40L CD40的天然配體 CD30L CD30的天然配體 scFv Ki4針對(duì)人CD30的鼠類scFv scFvKi3 針對(duì)人CD30的鼠類scFv scFvKi2 針對(duì)人CD30的鼠類scFv scFv 425(Hai) 針對(duì)人EGF受體(EGFR)的鼠類scFv。
hEGF與人EGF受體結(jié)合的人表皮生長(zhǎng)因子 接頭3 接頭3由紅細(xì)胞漿質(zhì)可裂解的+膜轉(zhuǎn)移肽組成 scFv 14.1 針對(duì)胰腺癌細(xì)胞的鼠類scFv MOG 髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白 scFv35 針對(duì)胎兒乙酰膽堿受體的人scFv TAT 來(lái)自HIV基因組轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄活化劑 scFvM12 針對(duì)CEA的人scFv(癌胚抗原) PIGF磷脂酰肌醇聚糖，F(xiàn)級(jí)別蛋白 VEGF血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 mSNAPSNAP-Tag的SfiI限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)缺失形式 (SNAP 26m) SNAPSNAP-Tag(SNAP26m/SNAP26b基因) IL1-IL31白介素1-白介素31 CXCL9(MIG) 趨化因子CXC基序配體9 CXCL10(IP10)干擾素-γ-可誘導(dǎo)蛋白10 CXCL11 趨化因子CXC基序配體11 CXCL13 趨化因子CXC基序配體13 CXCL16 趨化因子CXC基序配體16 CCL11(嗜酸細(xì)胞 趨化因子CC基序配體11 趨化因子-1) CCL14 趨化因子CC基序配體14 CCL16 趨化因子CC基序配體16 CCL18 趨化因子CC基序配體18 CCL27 趨化因子CC基序配體27 CCL28 趨化因子CC基序配體28 XCL1趨化因子C基序配體1 (Lymphotatcin) CX3CL1(神經(jīng)趨 趨化因子CX3C基序配體1 化蛋白) TGFβ TGFβ受體，I型 G-CSF 粒細(xì)胞-集落刺激因子 NGF神經(jīng)生長(zhǎng)因子 HGF肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/分散因子 sCD64 可溶性CD64(FCγ受體I) 例1 三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲胺(

圖1)的化學(xué)合成。
向溶解在4.0mL的新開瓶的DMSO中的三(羥甲基)甲胺(Tris，2.42g，20.0mmol)冷卻到15.0℃。然后，攪拌注入0.4mL的5.0M NaOH，然后滴加注入丙烯酸叔丁酯(10.0mL，68mmol)。對(duì)于該反應(yīng)來(lái)說(shuō)，在DMSO中制備的5-10％的水的溶劑混合物是最佳的。讓所述反應(yīng)混合物達(dá)到室溫，并且攪拌24小時(shí)。然后將粗制混合物傾注到水中，并且用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)備用(圖1)。所述化合物直接用于下一個(gè)步驟，不需要進(jìn)一步純化。FAB-MSm/z 506[M+H]+。
例2 N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基三氟乙酰胺(圖2)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在MeOH(30mL)中的三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲胺(圖1)(10mmol，5.05g)溶液中添加三乙胺(1eq，10mmol，1.39mL)。然后，在室溫下緩慢添加三氟乙酸乙酯(1.3eq，13mmol，1.55mL)，用時(shí)20分鐘。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。然后，蒸發(fā)所述溶劑，用EtOAc(100mL)稀釋殘余物，并且用飽和的NaCl溶液洗滌。有機(jī)相在MgSO4上干燥并且在減壓下濃縮。經(jīng)快速層析法(環(huán)己烷/EtOAc，2/1→1/1)得到了需要的化合物(圖2)。
ESI-MSm/z 602.31[M+H]+。
例3 N-三{[2-(羧基)乙氧基]甲基}甲基三氟乙酰胺(圖3)的化學(xué)合成。
N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基三氟乙酰胺(圖2)(4.81g，8mmol)在80mL的96％甲酸中攪拌18小時(shí)。然后，在減壓下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成無(wú)色油狀物。
ESI-MSm/z 434.12[M+H]+。
例4 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基三氟乙酰胺(圖4)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(10mL)中的圖3化合物(433mg，1mmol，1eq)和BG-PEG4-NH2(1.34g，3mmol，3eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(495μL，3mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，3mL，3mmol，3eq)和DCC(620mg，3mmol，3eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用250mL的EtOAc稀釋所述混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)。經(jīng)快速層析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(圖4)。ESI-MSm/z 1718.77[M+H]+。
例5 三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲胺(圖5)的化學(xué)合成。
向溶解在EtOH(15mL)中的圖4化合物(1.03g，0.6mmol)的溶液中添加MeNH2溶液(30％in EtOH，30mL)。相應(yīng)的溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。獲得了渾濁的混合物。通過(guò)過(guò)濾除去固體，并且蒸發(fā)得到清澈溶液，為需要的化合物(圖5)。不需要進(jìn)一步純化。ESI-MSm/z 1621.79[M+H]+。
例6 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基熒光素-5-甲酰胺(圖6)和相應(yīng)的熒光素-6-甲酰胺(圖7)的化學(xué)合成。
化合物(圖5)(29mg，0.018mmol)和5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(8.5mg，0.018mmol)溶解在1mL的DMF和Et3N(2.7μL，0.018mmol)中，并且在31℃加熱過(guò)夜。減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖6)和(圖7)，使用水∶乙腈的95∶5-20∶80線性梯度液洗脫，用時(shí)20min(0.08％TFA)。ESI-MSm/z 1980.84[M+H]+。
例7 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基苯丁酸氮芥-甲酰胺(圖8)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的苯丁酸氮芥(22mg，0.072mmol)溶液中添加PYBOP(38mg，0.072mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖5)(116mg，0.072mmol)和DIPEA(12μL，0.072mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用150mL的EtOAc稀釋該混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)。經(jīng)快速層析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(圖8)。
ESI-MSm/z 1906.86[M+H]+。
例8 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基5-馬來(lái)酰亞氨基戊烷甲酰胺(圖9)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的6-馬來(lái)酰亞氨基-己酸(8mg，0.036mmol)的溶液中添加PYBOP(19mg，0.036mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖5)(58mg，0.036mmol)和DIPEA(6μL，0.036mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用150mL的EtOAc稀釋該混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)。快速層析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(圖9)。
ESI-MSm/z 1815.86[M+H]+。
例9 三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基6-馬來(lái)酰亞氨基-己酰胺siRNA共軛物(圖10)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL化合物溶液(圖9)(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室溫下培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)純化三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲酰胺-馬來(lái)酰亞胺-寡核苷酸共軛物(圖10)。
例10 N-2-(2-(2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基-N′-三[2-(叔-丁氧基羰基)乙基]甲基脲(圖11)的化學(xué)合成。
向溶解在DMF(2mL)中的11-疊氮-3，6，9-三氧雜十一-1-胺(1.55g，1eq，7.1mmol)的溶液中添加異氰酸三[2-(叔-丁氧基羰基)乙基]甲酯(3.1g，1eq，7.1mmol)和Et3N(988μL，1eq，7.1mmol)。在31℃下攪拌該溶液過(guò)夜。然后將粗制混合物傾注到水上，并且用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)產(chǎn)物(圖11)備用。不需要進(jìn)一步純化。
FAB-MSm/z 660.41[M+H]+. 例11 4-[2-羧基乙基]-4-(2-(2-(2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基氨基羰基氨基)-1，7-庚烷二羧酸(圖12)的化學(xué)合成。
化合物(圖11)(3.3g，5mmol)在50mL的96％甲酸中攪拌18h。然后，在減壓下，在50℃下除去甲酸，生成無(wú)色油狀化合物(圖12)。ESI-MSm/z 492.22[M+H]+。
例12 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖13)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(50mL)中的化合物(圖12)(491mg，1mmol，1eq)和BG-PEG4-NH2(1.34g，3mmol，3eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(495μL，3mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，3mL，3mmol，3eq)和DCC(620mg，3mmol，3eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用250mL的EtOAc稀釋所述混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)?？焖賹游龇?CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(圖13)。ESI-MSm/z 1776.87[M+H]+。
例13 N-三-(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖14)的化學(xué)合成。
向溶解在二氧六環(huán)(10mL)中的化合物(圖13)(708mg，0.4mmol)的溶液中添加水(1mL)。然后添加PMe3(2.40mL 1M，在THF中溶解，6eq)，并且在室溫下攪拌該溶液2h。在減壓下除去所述溶劑，并且通過(guò)制備HPLC純化獲得所述化合物(圖14)ESI-MSm/z 1750.88[M+H]+。
例14 N-三-(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-熒光素-5-甲酰氨基-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖15)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖16)的化學(xué)合成。
化合物(圖14)(18mg，0.01mmol)和5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(5mg，0.01mmol)溶解在800μL DMF和Et3N(1.6μL，0.01mmol)中，并且在31℃下加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖15)和(圖16)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z2108.93[M+H]+。
例15 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-苯丁酸氮芥-甲酰氨基-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖17)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(3mL)中的苯丁酸氮芥(18mg，0.06mmol)溶液中添加PYBOP(31mg，0.06mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖14)(103mg，0.06mmol)和DIPEA(10μL，0.06mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5分鐘。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用150mL的EtOAc稀釋該混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)?？焖賹游龇?CH2Cl2/MeOH，10/15/1)得到了需要的化合物(圖17)。ESI-MSm/z 2050.99[M+H]+。
例16 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-(6-馬來(lái)酰亞氨基-己酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖18)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的6-馬來(lái)酰亞氨基己酸(10mg，0.046mmol)溶液中添加PYBOP(24mg，0.046mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖14)(80mg，0.046mmol)和DIPEA(7.7μL，0.046mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5分鐘。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用150mL的EtOAc稀釋該混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)。快速層析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(圖18)。
ESI-MSm/z 1959.99[M+H]+。
例17 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-(6-馬來(lái)酰亞氨基己酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共軛物(圖19)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL化合物(圖18)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室溫下培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化所述siRNA共軛物(圖19)(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)。
例18 疊氮-PEG12-丙酸2-馬來(lái)酰亞氨基乙酰胺(圖20)的化學(xué)合成。
N-(2-氨基乙基)馬來(lái)酰亞胺三氟乙酸酯(343mg，1.35mmol)和疊氮-PEG12-丙酸NHS酯(1g，1.35mmol)溶解在5mL DMF和Et3N(188μL，1.35mmol)中，并且在31℃加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離產(chǎn)物，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z 766.40[M+H]+。
例19 疊氮-PEG12-丙酸2-馬來(lái)酰亞氨基乙酰胺CoA-SH共軛物(圖21)的化學(xué)合成。
向溶解在DMF(2mL)中的馬來(lái)酰亞胺衍生物(圖20)(192mg，1eq，252μmol)的溶液中添加溶解在Tris緩沖液(pH 7.5，200μL)中的CoA-SH(248mg，1.2eq，304μmol)。所述反應(yīng)混合物在31℃下振蕩過(guò)夜。然后在真空下除去溶劑，并且通過(guò)制備型HPLC純化粗制混合物。ESI-MSm/z 1554.48[M-Na]-。
例20 氨基-PEG12-丙酸2-馬來(lái)酰亞氨基乙酰胺CoA-SH共軛物(圖22)的化學(xué)合成。
向溶解在二氧六環(huán)(3mL)中的化合物(圖21)(204mg，0.13mmol)的溶液中添加水(450μL)。然后添加PMe3(800μL 1M，在THF中溶解，6eq)，并且在室溫下攪拌該溶液2h。減壓下除去所述溶劑。通過(guò)制備型HPLC純化獲得所述化合物。
ESI-MSm/z 1527.48[M-Na]-。
例21 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基三氟乙酰胺(圖23)的化學(xué)合成。
在室溫下，溶解在DMF(1mL)中的圖3化合物(21mg，0.05mmol，1eq)和圖22化合物(232mg，0.15mmol，3eq)的溶液中，連續(xù)添加DIPEA(25μL，0.15mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，150μL，0.3mmol，3eq)和DCC(31mg，0.15mmol，3eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下除去所述溶劑，并且通過(guò)制備型HPLC純化獲得所述化合物(圖23)。ESI-MSm/z 5010.4[M-Na]-。
例22 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲胺(圖24)的化學(xué)合成。
向溶解在EtOH(1.5mL)中的化合物(圖21)(100mg，0.02mmol)的溶液中添加MeNH2溶液(3mL，30％，溶解在EtOH中)。相應(yīng)的溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。蒸發(fā)所述溶劑，得到需要的化合物(圖24)。不需要進(jìn)一步純化。ESI-MSm/z 4914.4[M-Na]-。
例23 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基熒光素-5-甲酰胺(圖25)和相應(yīng)的熒光素-6-甲酰胺(圖26)的化學(xué)合成。
化合物(圖24)(19mg，0.004mmol)和5(6)-羧基熒光素NHS酯(2mg，0.004mmol)溶解在600μL DMF和Et3N(0.6μL，0.004mmol)中，并且在31℃加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖25)和(圖26)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z5272.7[M-Na]-。
例24 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基苯丁酸氮芥-甲酰胺(圖27)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的苯丁酸氮芥(1.8mg，0.006mmol)的溶液中添加PYBOP(3mg，0.006mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖24)(29mg，0.006mmol)和DIPEA(0.9μL，0.006mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。然后在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。在減壓下除去所述溶劑。在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離化合物(圖27)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。
ESI-MSm/z 5200.6[M-Na]- 例25 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)-乙基-氨基羰基-PEG12)乙基氨基-羰基)乙氧基甲基}甲基6-馬來(lái)酰亞氨基-己酰胺(圖28)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的6-馬來(lái)酰亞氨基-己酸(0.844mg，0.004mmol)的溶液中添加PYBOP(2.08mg，0.004mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖24)(19mg，0.004mmol)和DIPEA(0.66μL，0.004mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后，在減壓下除去所述溶劑。在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z 5107.7[M-Na]-。
例26 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基-羰基-PEG12)-乙基氨基-羰基)乙氧基甲基}甲基6-馬來(lái)酰亞氨基己酰胺siRNA共軛物(圖29)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL化合物(圖28)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室溫下培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化所述共軛物(圖29)(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)。
例27 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-疊氮乙氧基)-乙氧基)乙氧基)乙脲(圖30)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(5mL)中的化合物(圖12)(49mg，0.1mmol，1eq)和化合物(圖22)(134mg，0.3mmol，3eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(49μL，0.3mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，0.3mL，0.3mmol，3eq)和DCC(62mg，0.3mmol，3eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下除去所述溶劑。在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖30)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z 5068.6[M-Na]-。
例28 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基)乙氧基)乙脲(圖31)的化學(xué)合成。
向溶解在二氧六環(huán)(3mL)中的化合物(圖30)(127mg，0.025mmol)的溶液中添加水(450μL)。然后添加PMe3(154μL的1M THF溶液，6eq)，并且在室溫下攪拌該溶液2h。在減壓下除去所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)HPLC分離獲得所述化合物(圖31)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z 5042.5[M-Na]-。
例29 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基-氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-熒光素-5-甲酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖32)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖33)的化學(xué)合成。
化合物(圖31)(20mg，0.004mmol)和5(6)-羧基熒光素NHS酯(2mg，0.004mmol)溶解在600μL DMF和Et3N(0.6μL，0.004mmol)中，并且在31℃加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖32)和(圖33)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z5400.9[M-Na]-。
例30 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-苯丁酸氮芥-甲酰氨基-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖34)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的苯丁酸氮芥(2.1mg，0.007mmol)的溶液中添加PYBOP(3.5mg，0.007mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖31)(35mg，0.007mmol)和DIPEA(1.1μL，0.007mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5分鐘。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后，在減壓下除去所述溶劑。在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離化合物(圖34)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。
ESI-MSm/z 5327.8[M-Na]-。
例31 N-三-{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-(6-馬來(lái)酰亞氨基-己酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖35)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的6-馬來(lái)酰亞氨基-己酸(1mg，0.005mmol)的溶液中添加PYBOP(2.5mg，0.005mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖31)(24mg，0.005mmol)和DIPEA(0.8μL，0.005mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5分鐘。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后，在減壓下除去所述溶劑。在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離化合物(圖35)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。ESI-MSm/z 5235.7[M-Na]-。
例32 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-(6-馬來(lái)酰亞氨基-己酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共軛物(圖36)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL化合物(圖35)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室溫下培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化所述共軛物(圖36)(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中水；溶劑B乙腈)。
例33 5-熒光素-Lys-Fmoc-OH(圖37)和6-熒光素-Lys-Fmoc-OH(圖38)的化學(xué)合成。
Fmoc-Lys-OH(184mg，0.5mmol)和5(6)-羧基熒光素NHS酯(237mg，0.5mmol)溶解在5mL的DMF和Et3N(70μL，0.5mmol)中，并且在31℃加熱過(guò)夜。然后將粗制混合物傾注到水中(100mL)。用NaOH(1M)將水相堿化(pH＝9)。用乙酸乙酯洗滌水相。在用乙酸酸化水相時(shí)，形成了黃色沉淀物。通過(guò)過(guò)濾收集固體，以同分異構(gòu)體的混合物的形式得到需要的化合物(圖37)和(圖38)。
ESI-MSm/z 727.7[M+H]+。
例34 5-熒光素-Lys-OH(圖39)和6-熒光素-Lys-OH(圖40)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(3mL)中的化合物混合物(圖37)和(圖38)(300mg，0.4mmol)的溶液中添加二乙胺(600μL)。在室溫下攪拌該溶液3h。在減壓下除去所述溶劑，所需化合物混合物(圖39)和(圖40)被直接用于下一個(gè)步驟。
ESI-MSm/z 505.15[M+H]+。
例35 N-5-熒光素-N’-苯丁酸氮芥-Lys-OH(圖41)和N-6-熒光素-N’-苯丁酸氮芥-Lys-OH(圖42)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(3mL)中的苯丁酸氮芥(106mg，0.35mmol)的溶液中添加PYBOP(182mg，0.35mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加同分異構(gòu)體的混合物(圖39)和(圖40)(176mg，0.35mmol)和DIPEA(58μL，0.35mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后將粗制混合物傾注到水(60mL)上。用NaOH(1M)將水相堿化(pH＝9)。用乙酸乙酯洗滌水相。在用乙酸酸化水相時(shí)，形成了黃色沉淀物。通過(guò)過(guò)濾收集固體，以同分異構(gòu)體的混合物的形式得到需要的化合物(圖41)和(圖42)。
ESI-MSm/z 789.23[M+H]+. 例36 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)-甲基N’-5-熒光素-N”-苯丁酸氮芥-Lys-酰胺(圖43)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖44)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的同分異構(gòu)體的混合物(圖41)和(圖42)(15mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖5)(32mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。將所述溶液傾注到水上，過(guò)濾沉淀物并且用水洗滌。需要的化合物(圖43)和(圖44)是作為固體獲得的。ESI-MSm/z 2393.01[M+H]+。
例37 N-5-熒光素-N’-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-OH(圖45)和N-6-熒光素-N’-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-OH(圖46)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(3mL)中的6-馬來(lái)酰亞氨基-己酸(66mg，0.31mmol)的溶液中添加PYBOP(161mg，0.31mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加(圖39)和(圖40)化合物的混合物(156mg，0.31mmol)和DIPEA(51μL，0.31mmol)，并且在50℃下加熱該溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后將粗制混合物傾注到水上(60mL)。用NaOH(1M)將水相堿化(pH＝9)。用乙酸乙酯洗滌水相。在用乙酸酸化水相時(shí)，形成了黃色沉淀物。通過(guò)過(guò)濾收集固體，以同分異構(gòu)體的混合物的形式得到需要的化合物(圖45)和(圖46)。ESI-MSm/z 699.23[M+H]+。
例38 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-5-熒光素-N”-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-酰胺(圖47)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖48)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的同分異構(gòu)體的混合物(圖45)和(圖46)(9mg，0.013mmol)的溶液中添加PYBOP(6.5mg，0.013mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖5)(21mg，0.013mmol)和DIPEA(2.1μL，0.013mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。將所述溶液傾注到水上，過(guò)濾沉淀物并且用水洗滌。需要的化合物為固體同分異構(gòu)體的混合物(圖47)和(圖48)。
ESI-MSm/z 2302.01[M+H]+。
例39 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-5-熒光素-N”-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-酰胺siRNA共軛物(圖49)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖50)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL同分異構(gòu)體的混合物(圖47)和(圖48)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且，所述反應(yīng)混合物在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化共軛物的混合物(圖49)和(圖50)(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)。
例40 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-熒光素-N”’-苯丁酸氮芥-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙脲(圖51)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖52)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(3mL)中的同分異構(gòu)體的混合物(圖41)和(圖42)(19mg，0.024mmol)的溶液中添加PYBOP(13mg，0.024mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖14)(42mg，0.024mmol)和DIPEA(4μL，0.024mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。將所述溶液傾注到水上，過(guò)濾沉淀物并且用水洗滌。需要的化合物以同分異構(gòu)體的混合物的形式獲得(圖51)和(圖52)。
ESI-MSm/z 2521.10[M+H]+。
例41 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-熒光素-N”’-6-馬來(lái)酰亞胺己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖53)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖54)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(3mL)中的同分異構(gòu)體的混合物(圖45)和(圖46)(21mg，0.03mmol)的溶液中添加PYBOP(16mg，0.03mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖14)(53mg，0.03mmol)和DIPEA(5μL，0.03mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。將所述溶液傾注到水上，過(guò)濾沉淀物并且用水洗滌。需要的化合物以同分異構(gòu)體的混合物的形式獲得(圖53)和(圖54)。
ESI-MSm/z 2430.10[M+H]+。
例42 N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-熒光素-N”’-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙脲siRNA共軛物(圖55)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖56)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL同分異構(gòu)體(圖53)和(圖54)的混合物溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室溫下培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化共軛物的混合物(圖55)和(圖56)(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)。
例43 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}-甲基N’-5-熒光素-N”-苯丁酸氮芥-Lys-酰胺(圖57)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖58)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的同分異構(gòu)體(圖41)和(圖42)的混合物(12mg，0.015mmol)的溶液中添加PYBOP(8mg，0.015mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖24)(73mg，0.015mmol)和DIPEA(2.5μL，0.015mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。在減壓下除去所述溶劑，并且所述化合物是通過(guò)制備型HPLC純化作為同分異構(gòu)體的混合物獲得的(圖57)和(圖58)。
ESI-MSm/z 5686.1[M-Na]-。
例44 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-5-熒光素-N”-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-酰胺(圖59)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖60)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的同分異構(gòu)體(圖45)和(圖46)的混合物(7mg，0.01mmol)的溶液中添加PYBOP(5mg，0.01mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖24)(50mg，0.01mmol)和DIPEA(1.65μL，0.01mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。在減壓下除去所述溶劑，所述化合物通過(guò)制備型HPLC純化，作為同分異構(gòu)體的混合物獲得(圖59)和(圖60)。
ESI-MSm/z 5594.1[M-Na]-。
例45 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-5-熒光素-N”-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-酰胺siRNA共軛物(圖61)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖62)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL同分異構(gòu)體(圖59)和(圖60)的混合物的溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室溫下培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化共軛物的混合物(圖61)和(圖62)(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)。
例46 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-熒光素-N”’-苯丁酸氮芥-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖63)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖64)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的同分異構(gòu)體(圖41)和(圖42)的混合物(5mg，0.006mmol)的溶液中添加PYBOP(3mg，0.006mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖31)(30mg，0.006mmol)和DIPEA(1μL，0.006mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。在減壓下除去所述溶劑，所述化合物是通過(guò)制備型HPLC純化作為同分異構(gòu)體的混合物獲得的(圖63)和(圖64)。
ESI-MSm/z 5814.9[M-Na]-。
例47 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-熒光素-N”’-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖65)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖66)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的同分異構(gòu)體(圖45)和(圖46)的混合物(14mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖31)(100mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。在減壓下除去所述溶劑，所述化合物是通過(guò)制備型HPLC純化作為同分異構(gòu)體的混合物獲得的(圖65)和(圖66)。
ESI-MSm/z 5722.2[M-Na]-。
例48 N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亞氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-熒光素-N”’-6-馬來(lái)酰亞氨基己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共軛物(圖67)和相應(yīng)的6-熒光素衍生物(圖68)的化學(xué)合成。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL同分異構(gòu)體(圖65)和(圖66)的混合物溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室溫下培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化共軛物(圖67)和(圖68)的混合物(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)。
例49 2-苯二甲酰亞氨基-N-(BG-PEG4)-琥珀酸單酰胺(圖69)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在(15mL)中的BG-PEG4-NH2(620mg，1.3mmol，1eq)的溶液中添加2-苯二甲酰亞氨基-琥珀酸酐(340mg，1.39mmol，1eq)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4h，然后將粗制混合物注入水(225mL)中。用NaOH(1M)將水相的pH調(diào)節(jié)到8，并且使沉淀物消失。用EtOAc洗滌水相(2次，100mL)。然后將pH調(diào)節(jié)到4，并且收集沉淀物。ESI-MSm/z 692.69[M+H]+。
例50 N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖70)的化學(xué)合成。
向溶解在DMF(3mL)中的11-疊氮-3，6，9-三氧雜十一-1-胺(73μL，1eq，0.37mmol)的溶液中添加CDI(60mg，1eq，0.37mmol)。該溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。向該溶液中添加BC-NH2(85mg，1eq，0.37mmol)，并且該混合物在65℃下加熱3h。然后將粗制混合物傾注到水上，并且用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相在MgSO4上干燥，減壓下蒸發(fā)得到需要的化合物。不需要進(jìn)一步純化。
TLC(CH2Cl2/MeOH 10∶1)。ESI-MSm/z 475.51[M+H]+。
例51 N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖71)的化學(xué)合成。
向溶解在二氧六環(huán)(3mL)中的化合物(圖70)(54mg，0.12mmol)的溶液中添加水(360μL)。然后添加PMe3(720μL 1M，在THF中溶解，6eq)，并且在室溫下攪拌該溶液2h。在減壓下除去所述溶劑，并且通過(guò)制備型HPLC純化獲得所述化合物(圖71)。ESI-MSm/z 449.52[M+H]+。
例52 化學(xué)合成N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-苯二甲酰亞氨基-丙酰基氨基乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙脲(圖72)。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的化合物(圖71)(45mg，0.1mmol，1eq)和化合物(圖69)(69mg，0.1mmol，1eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(17μL，0.1mmol，1eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，0.1mL，0.1mmol，1eq)和DCC(21mg，1mmol，1eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用50mL EtOAc稀釋所述混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)。以快速層析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(圖72)。
ESI-MSm/z 1123.19[M+H]+。
例53 N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-氨基-丙?；被已趸?乙氧基)乙氧基)乙脲(圖73)的化學(xué)合成。
向溶解在EtOH(3mL)中的化合物(圖72)(45mg，0.04mmol)的溶液中添加甲胺(300μl)，并且在室溫下攪拌該溶液12h。在減壓下除去所述溶劑，通過(guò)制備型HPLC純化獲得化合物(圖73)。ESI-MSm/z 993.09[M+H]+。
例54 N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-(熒光素-5-甲酰氨基)丙?；被?乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖74)和相應(yīng)的熒光素-6-甲酰胺(圖75)的化學(xué)合成。
化合物(圖73)(9mg，0.009mmol)和5(6)-羧基熒光素NHS酯(4mg，0.009mmol)溶解在800μL DMF和Et3N(1.35μL，0.009mmol)中，并且在31℃加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖74)和(圖75)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。
ESI-MSm/z 1351.39[M+H]+。
例55 N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-(6-馬來(lái)酰亞氨基己?；被?丙酰基-氨基-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(圖76)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的6-馬來(lái)酰亞氨基-己酸(4.4mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖73)(20mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用150mL EtOAc洗脫所述混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)?？焖賹游龇?CH2Cl2/MeOH，10/1 5/1)得到了需要的化合物(圖76)。ESI-MSm/z 1186.29[M+H]+。
例56 化學(xué)合成N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-(6-馬來(lái)酰亞氨基己酰基氨基)丙?；被?乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共軛物(圖77)。
通過(guò)在室溫下與溶解在200μL Tris緩沖液pH 8.5中的200mM DTT一起培養(yǎng)1小時(shí)還原5’-硫醇修飾的寡核苷酸(43nmol)。通過(guò)凝膠過(guò)濾除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脫所述寡核苷酸。合并濃度最大的級(jí)份，得到的總體積為800μL。添加300μL化合物(圖76)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且將所述反應(yīng)混合物在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用水稀釋到總體積為2mL，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾除去多余的馬來(lái)酰亞胺。然后通過(guò)HPLC純化所述共軛物(圖77)(溶劑A0.1M乙酸四乙銨pH 6.9，溶解在水中；溶劑B乙腈)。
例57 化學(xué)合成N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)芐基-N’-2-(2-(2-(2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-苯丁酸氮芥羧氨基-丙?；被已趸?乙氧基)乙氧基)乙脲(圖78)。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的苯丁酸氮芥(6mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖73)(20mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑，并且用150mL的EtOAc稀釋該混合物。用水洗滌有機(jī)層，在MgSO4上干燥，并且在減壓下蒸發(fā)。以快速層析法(CH2Cl2/MeOH，10/1 5/1)得到了需要的化合物(圖78)。
ESI-MSm/z 1276.56[M+H]+。
例58 BG-PEG12-NHFmoc(圖79)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的Fmoc-酰氨基-PEG12-酸(1g，1.19mmol)的溶液中添加PYBOP(619mg，1.19mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加O6-氨甲基芐基鳥嘌呤(320mg，1.19mmol)和DIPEA(196μL，1.19mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。然后在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。粗制混合物傾注在乙醚上。收集沉淀物，并且用乙醚洗滌。將得到的固體溶解在MeOH中，并且將所述溶劑濃縮至干燥。不需要進(jìn)一步純化。MS(ESI)m/z 1093[M+H]+。
例59 BG-PEG12-NH2(圖80)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在二氧六環(huán)(10mL)中的化合物(圖79)(1.5g，1.72mmol)的溶液中添加二乙胺(2.5mL)。在室溫下攪拌該溶液3h。然后，在減壓下除去所述溶劑。粗制混合物溶解在DMF(1.5mL)中，并且注入到乙醚(10mL)中。收集得到的沉淀物。不需要進(jìn)一步純化。MS(ESI)m/z 871[M+H]+. 例60 三{[2-羧基乙氧基]甲基}甲胺(圖81)的化學(xué)合成。
三{[2-叔-丁氧基羰基]乙氧基}甲基}甲胺(圖1)(4.3g，8mmol)在80mL的96％甲酸中攪拌18小時(shí)。然后在減壓下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成無(wú)色油狀物。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)8.2(m，2H)，7.45(m，3H)，3.6(m，6H)，3.4(m，6H)，2.45(m，6H)。
例61 N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酰胺(圖82)的化學(xué)合成。
化合物(圖81)(66mg，0.195mmol)和7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸N-琥珀酰亞胺酯(70mg，0.195mmol)溶解在2mL的DMF和Et3N(28μL，0.195mmol)中，并且在40℃下加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖82)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。MS(ESI)m/z 581[M+H]+。
例62 N-三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基ATTO-495-甲酰胺(圖83)的化學(xué)合成。
三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲胺(圖1)(4.8mg，9.45μmol)和ATTO-495N-琥珀酰亞胺酯(5.2mg，9.45μmol)溶解在2mL DMF和Et3N(1.3μL，9.45μmol)，并且在40℃下加熱過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖83)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。MS(ESI)m/z 841[M+H]+。
例63 N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基ATTO-495-甲酰胺(圖84)的化學(xué)合成。
化合物(圖83)(210mg，0.25mmol)在250μL的96％甲酸中攪拌18h。然后在減壓下在5℃下除去甲酸，以定量方式生成無(wú)色油狀物。MS(ESI)m/z 672[M+H]+。
例64 N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基尼羅紅-氧乙酰胺(圖85)的化學(xué)合成。
向溶解在DMF(50mL)中的尼羅紅-氧乙酸(9-二乙基氨基-5-氧代-苯并[a]吩噁嗪-2-氧乙酸，100mg，0.255mmol，1eq)的溶液中連續(xù)添加DCC(160mg，0.765mmol，3eq)和NHS(90mg，0.765mmol，3eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。然后通過(guò)離心除去DCU鹽。在室溫下向該溶液中添加化合物(圖1)(130mg，0.255mmol，1eq)和DIPEA(42μL，0.255mmol，1eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下除去溶劑?？焖賹游龇?CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(圖85)。MS(ESI)m/z 881[M+H]+。
例65 N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基尼羅紅-氧乙酰胺(圖86)的化學(xué)合成。
化合物(圖85)(70mg，0.08mmol)在250μL的96％甲酸中攪拌18h。然后在減壓下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成無(wú)色油狀物。MS(ESI)m/z 712[M+H]+。
例66 N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基5-馬來(lái)酰亞氨基戊烷甲酰胺(圖87)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(5mL)中的6-馬來(lái)酰亞氨基-己酸(106mg，0.5mmol)溶液中添加PYBOP(260mg，0.5mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加化合物(圖1)(253mg，0.5mmol)和DIPEA(83μL，0.5mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑。以快速層析法(環(huán)己烷/乙酸乙酯，1/1)得到了需要的化合物(圖87)。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)6.7(s，2H)，3.7(s，6H)，3.65(m，6H)，3.5(m，2H)，2.45(m，6H)，2.1(m，2H)，1.6(m，4H)，1.45(m，27H)，1.35(m，2H)。
例67 N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基5-馬來(lái)酰亞氨基-戊烷甲酰胺(圖88)的化學(xué)合成。
化合物(圖87)(214mg，0.305mmol)在3mL的96％甲酸中攪拌18h。然后在減壓下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成無(wú)色油狀物。所述化合物被直接用于下一個(gè)步驟。
例68 N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}甲基7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酰胺(圖89)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基7-(二乙基氨基)-香豆素-3-甲酰胺(圖82)(10mg，0.018mmol)和BG-PEG12-NH2(圖80)(54mg，0.062mmol，3.6eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(8μL，0.062mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，18μL，0.018mmol，1eq)和EDC(12mg，0.062mmol，3.6eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖89)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度洗脫。所述化合物(圖89)啟動(dòng)蛋白三聚體形成的構(gòu)造能力，通過(guò)使用實(shí)施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。通過(guò)SDS-PACE證實(shí)了蛋白三聚體的形成，然后對(duì)蛋白進(jìn)行考馬斯染色。
例69 N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基ATTO-495-甲酰胺(圖90)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基ATTO-495-甲酰胺(圖84)(4mg，0.005mmol)和BG-PEG12-NH2(圖80)(15mg，0.0175mmol，3.6eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(3μL，0.0175mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，5μL，0.005mmol，1eq)和EDC(4mg，0.0175mmol，3.6eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖90)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。所述化合物(圖90)啟動(dòng)蛋白三聚體形成的構(gòu)造能力，通過(guò)使用實(shí)施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的體外實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
例70 N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基尼羅紅-氧乙酰胺(圖91)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基尼羅紅-氧乙酰胺(圖86)(8mg，0.011mmol)和BG-PEG12-NH2(圖80)(34mg，0.039mmol，3.6eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(7μL，0.039mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，11μL，0.01mmol，1eq)和EDC(8mg，0.039mmol，3.6eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖91)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。所述化合物(圖91)啟動(dòng)蛋白三聚體形成的構(gòu)造能力，通過(guò)使用例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的體外實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
例71 N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基5-馬來(lái)酰亞氨基戊烷甲酰胺(圖92)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基5-馬來(lái)酰亞氨基戊烷甲酰胺(圖88)(8mg，0.016mmol)和BG-PEG12-NH2(圖80)(50mg，0.057mmol，3.6eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(10μL，0.057mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，16μL，0.016mmol，1eq)和EDC(2mg，0.057mmol，3.6eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖92)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。所述化合物(圖92)啟動(dòng)蛋白三聚體形成的構(gòu)造能力，通過(guò)使用實(shí)施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的體外實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
例72 3-[2-(2-馬來(lái)酰亞氨基乙基)二磺?；鵠丙酸(圖93)的化學(xué)合成。
將溶解在乙酸/甲苯混合物(3/1，3mL)中的3-[2-(2-氨基乙基)二磺酰基]丙酸(250mg，1.38mmol)和馬來(lái)酐(272mg，2.76mmol)的溶液在120℃下加熱過(guò)夜。然后將粗制混合物冷卻到室溫，并且在冰浴中進(jìn)一步冷卻到0℃。添加戊烷(50mL)，并且形成沉淀物。將乙醚添加該沉淀物中，并且除去所形成的白色固體。在真空下濃縮乙醚溶液，得到產(chǎn)物(圖93)。不需要進(jìn)一步純化。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)7.4(s，1H)，6.7(s，2H)，3.7(m，2H)，2.9(m，4H)，2.6(m，2H)。
例73 N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基3-[2-(2-馬來(lái)酰亞氨基乙基)二磺?；鵠丙酰胺(圖94)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(2mL)中的3-[2-(2-馬來(lái)酰亞氨基乙基)二磺?；鵠丙酸(圖93)(188mg，0.72mmol)的溶液中添加PYBOP(376mg，0.72mmol)。在室溫下攪拌該溶液20分鐘。然后添加三{[2-叔-丁氧基羰基]乙氧基}甲基}甲胺(圖1)(364mg，0.72mmol)和DIPEA(119μL，0.72mmol)，并且在50℃下加熱所述溶液5min。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜。然后在減壓下除去所述溶劑。以快速層析法(環(huán)己烷/乙酸乙酯，2/1)得到了需要的化合物(圖94)。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)6.6(s，2H)，3.8(m，2H)，3.6(m，6H)，3.55(m，6H)，2.8(m，4H)，2.5(m，2H)，2.35(m，6H)，1.4(m，27H)。
例74 N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基3-[2-(2-馬來(lái)酰亞氨基乙基)二磺?；鵠丙酰胺(圖95)的化學(xué)合成。
化合物(圖94)(112mg，0.15mmol)在1.5mL的96％甲酸中攪拌18小時(shí)。然后在減壓下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成無(wú)色油狀物。所述化合物直接用于下一個(gè)步驟。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)7.0(s，2H)，3.7(m，2H)，3.55(m，12H)，2.75(m，4H)，2.45(m，6H)。
例75 N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基-3-[2-(2-馬來(lái)酰亞氨基乙基)二磺?；鵠丙酰胺(圖96)的化學(xué)合成。
在室溫下向溶解在DMF(1mL)中的化合物(圖95)(10mg，0.017mmol)和BG-PEG12-NH2(圖80)(120mg，0.138mmol，8eq)的溶液中連續(xù)添加DIPEA(17μL，0.069mmol，4eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，17μL，0.017mmol，1eq)和EDC(14mg，0.069mmol，4eq)。所得到的混合物攪拌過(guò)夜。在減壓下蒸發(fā)所述溶劑，并且在C18柱上通過(guò)反相HPLC分離所述化合物(圖96)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用時(shí)20min，0.08％TFA)的線性梯度液洗脫。所述化合物(圖96)啟動(dòng)蛋白三聚體形成的構(gòu)造能力，通過(guò)使用實(shí)施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的體外實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
例76 用FKBP-AGT融合蛋白確定化合物(圖89)，(圖90)，(圖91)，(圖92)和(圖96)的反應(yīng)性 將1μL與從Covalys公司以SNAP26TM商品名買到的AGT變體融合的FKBP蛋白的591μM溶液和1μL 100μM化合物(圖89)，(圖90)，(圖91)，(圖92)或(圖96)的溶液添加到8μL的50mM Tris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl；0.1％Tween20TM；1mM DTT溶液中。然后在室溫下培養(yǎng)4小時(shí)之后，添加15μL的100mM Tris-HCl pH 6.8；2％SDS；35％甘油；10mM EDTA；20mM DTT溶液，在95℃下將該混合物煮沸5分鐘。在冷卻到室溫之后，將25μL的該溶液加樣到4-20％線性梯度SDS-PAGE凝膠上。電泳之后，對(duì)凝膠中的蛋白進(jìn)行考馬斯染色，以顯現(xiàn)蛋白三聚體。
II 表達(dá)載體的A部分和B部分的組裝和表達(dá) 真核表達(dá)載體 為了構(gòu)建編碼重組配合物AB的載體，用儲(chǔ)存載體pSS26m(COVALYSAG)進(jìn)行PCR克隆提供了具有SNAP 26m基因的修飾過(guò)的pSecTac基哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pMS，

et al.，2003)。有兩種版本可供使用，可以將A部分連接在B部分的N-末端或連接在B部分的C-末端，如附圖中所示(97A+B)。在所述載體的其他版本中，除去了SNAP26m基因(Covalys)的內(nèi)部SfiI核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)，以便可以通過(guò)常規(guī)SfiI/NotI克隆快速更換scFv融合配偶體(圖97F+G)。所述SNAP-Tag的SfiI的缺失版本被稱作mSNAP。
所述載體的表達(dá)框包括以下關(guān)鍵結(jié)構(gòu)人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子序列(CMV)，牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)(BGH pA)和內(nèi)部IVS核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。所述SNAP-tag融合蛋白是通過(guò)Igkappa前導(dǎo)肽分泌的，而位于IRES位點(diǎn)的3′的報(bào)導(dǎo)EGFP基因缺少分泌信號(hào)，因此積累在細(xì)胞質(zhì)中。
植物表達(dá)載體 設(shè)計(jì)了植物表達(dá)載體系統(tǒng)，以便在植物中瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)SNAP-tag融合蛋白(圖97C)。該載體包括以下結(jié)構(gòu) KDEL植物ER保留信號(hào)；LPH密碼子優(yōu)化的鼠類信號(hào)肽；Bla氨芐青霉素抗性(E.coli)，羧芐青霉素抗性(A.tumefaciens)；nptII卡那霉素抗性植物；SAR煙草RB7基因的支架附著區(qū)；P35SS轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；CHS來(lái)自查耳酮合成酶的5′UTR；pA35S來(lái)自CaMV的聚腺苷酸化信號(hào)；RK3 oriA.tumefaciens的ori；ColE1 oriE.coli的ori；LB/RB左/右邊界；pAnos胭脂堿合成酶聚腺苷酸化信號(hào)；Pnos胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子。
原核細(xì)胞表達(dá)載體 這里所提到的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒是基于pET26bTM系統(tǒng)(Novagen)的，并且是為了C/N-末端SNAP-tag融合蛋白在E.coli中進(jìn)行外周質(zhì)表達(dá)而設(shè)計(jì)的(圖97D)。所述SNAP-tag版本(26b)是進(jìn)行過(guò)密碼子優(yōu)化的，并且用購(gòu)自Covalys公司的儲(chǔ)存載體pSET7-26b進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述表達(dá)是通過(guò)T7啟動(dòng)子調(diào)控的；同時(shí)具有宿主編碼的T7聚合酶，該表達(dá)的調(diào)控是極其嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹Ｋ隹敲顾乜剐曰蛟试S選擇轉(zhuǎn)化細(xì)菌。所述pelB引頭將重組蛋白導(dǎo)入細(xì)胞周質(zhì)間隙。
酵母表達(dá)載體 基于CoMedTM系統(tǒng)的酵母表達(dá)質(zhì)粒是由Pharmedartis(Aachen，Germany)提供的(圖97E)。所述載體主鏈?zhǔn)菢?biāo)準(zhǔn)E.coli載體的衍生物，結(jié)合了ColE1 ori和氨芐青霉素抗性(bla)序列。變體I包括f1(-)起點(diǎn)，變體II沒(méi)有所述序列。業(yè)已工程改造了多克隆位點(diǎn)(MCS)，以便攝取各種模塊。為了插入，在ARS/CEN模塊(模塊1)旁側(cè)具有SacII/BcuI限制位點(diǎn)，rDNA片段(模塊2)旁側(cè)是BcuI/Eco47III位點(diǎn)，選擇標(biāo)記模塊(模塊3)旁側(cè)是Eco47III/SalI位點(diǎn)，而表達(dá)框(模塊4)旁側(cè)是SalI/ApaI位點(diǎn)。在變體II上存在額外的SphI和BsiWI克隆位點(diǎn)。
對(duì)所述質(zhì)粒進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便與各種酵母菌株一起工作 酵母菌株(選擇) 種營(yíng)養(yǎng)缺陷型 Arxula adeninivorans (LS3)野生型；leu2 Arxula adeninivorans (CBS7350)野生型；leu2 Arxula adeninivorans (CBS1738)野生型；leu2 Hansenula polymorpha (CBS4732)野生型；ura3；leu2 ura3；arg1 leu2 ura；ade1 leu2 ura3 Kluyveromyces lactis met-ura3 Pichia pastoris 野生型；ura3；ura3 his3 Saccharomyces cerevisiae 野生型；ura3；leu2 ura3 trp1 lys2 Yarrowia lipolytica E150 野生型；ura3；leu2；ura3 leu2 將所述關(guān)鍵結(jié)構(gòu)細(xì)分成四個(gè)模塊，而具體載體構(gòu)建體的模塊可以包括一個(gè)或多個(gè)以下結(jié)構(gòu) 模塊1由ARS/CEN序列組成，以便在酵母內(nèi)復(fù)制 HARS1(H.polymorpha-衍生的自發(fā)復(fù)制序列) ARS(S.cerevisiae) CEN(S.cerevisiae) 模塊2由rDNA靶序列組成，用于酵母基因組整合 NTS2-ETS-18SrDNA-ITS1(H.polymorpha，Arxula adeninivorans) 模塊3由選擇標(biāo)記組成，用于轉(zhuǎn)化體選擇 1.顯性選擇標(biāo)記 TEF啟動(dòng)子(A.gossypii；A.adeninivorans)-hph(E.coli)-TEF終止子(潮霉素抗性) TEF啟動(dòng)子(A.gossypii；A.adeninivorans)-kanMX(E.coli) -TEF終止子(慶大霉素抗性) 2.互補(bǔ)選擇標(biāo)記 URA3(S.cerevisiae) LEU2(S.cerevisiae，A.adeninivorans) dLEU2(A.adeninivorans)(缺陷啟動(dòng)子) TRP1(S.cerevisiae) 模塊4包括SNAP-tag融合蛋白表達(dá)框，它由啟動(dòng)子-克隆位點(diǎn)-終止子組成，而終止子序列主要來(lái)自MOX，不過(guò)還可以來(lái)自TEF和PHO5。
與B部分融合的A部分的開放讀框的構(gòu)建 將不同的A部分，如抗體片段和受體的天然配體包括可溶性配體，受體，趨化激素，生長(zhǎng)因子或白介素或其片段與SNAP-tag一起克隆到開放讀框(ORF)中。所提到的ORFs是通過(guò)它們的序列表示的(表達(dá)是在克隆到哺乳動(dòng)物pMS載體構(gòu)建體中之后舉例說(shuō)明的)(圖98和112)。參見圖112中列舉的序列ID 1-71。
SNAP-tag融合蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá) 在TransFast-介導(dǎo)(Promega，Mannhein，Germany)轉(zhuǎn)化到293T-細(xì)胞中之后，重組SNAP-tag融合蛋白按照

M.et al.，2003中披露的方法表達(dá)。簡(jiǎn)單地講，1μg質(zhì)粒-DNA(如Ki4-SNAP(抗-CD30scFv)；SNAP-EGF(EGFR配體)；Hai-SNAP(抗-EGFR scFv 425)；H22-SNAP(抗-CD64 scFv)或SNAP-CD30L(CD30配體))和3μl TransFast按照生產(chǎn)商推薦的方法用于12孔細(xì)胞培養(yǎng)平板。通過(guò)計(jì)數(shù)綠色熒光確定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為75-95％。在首次轉(zhuǎn)染3天之后，分析細(xì)胞培養(yǎng)上層的重組蛋白。然后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)入中等細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Nunc；85m2)，并且在補(bǔ)充了100μg/ml Zeocin的RPMI復(fù)合培養(yǎng)基中生產(chǎn)。1-2周之后，生產(chǎn)性轉(zhuǎn)染克隆產(chǎn)生綠色熒光，因此，可以通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)。通過(guò)繼代培養(yǎng)所述克隆建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞群體。
SNAP-tag融合蛋白的植物表達(dá) 為了在植物(例如，煙草-Nicotiana benthamiana)中瞬時(shí)表達(dá)SNAP-tag融合蛋白，選擇根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。
因此，將A.tumefaciens(例如，菌株GV3101pMP90RK)作成電感受態(tài)(Shen & Forde，1989)并且將100μl的感受態(tài)細(xì)胞與50-200ng的二元載體(pTRAkc based)在0.1cm的electrogap樣品池(BioRad)中混合，所述載體包括編碼SNAP-Tag融合蛋白的表達(dá)框。通過(guò)電脈沖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使用基因Pulser(BioRad)，設(shè)定為1.8kV，25mF和200V。電穿孔的細(xì)胞在1ml Luria-Bertani(LB)肉湯中培養(yǎng)2小時(shí)，然后鋪平板到LB培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有50mg羧芐青霉素ml-1，50mg利福平ml-1和30mg卡那霉素ml-1。
為了在煙草植物中進(jìn)行A.tumefaciens介導(dǎo)的SNAP-tag融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)，A.tumefaciens培養(yǎng)物含有pTRAkc載體，它具有SNAP-tag融合蛋白表達(dá)框克隆，補(bǔ)充了50mg羧芐青霉素ml-1和50mg利福平ml-1。培養(yǎng)物在含有合適抗生素LB的肉湯中在27℃下振蕩生長(zhǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期(OD600大約為0.8)。通過(guò)以4000g的速度離心收集細(xì)胞，重新懸浮在含有合適抗生素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(LB肉湯，pH 5.6，含有10mM MES，20mM乙酰丁香酮和2mM MgSO4)，并且按上述方法生長(zhǎng)。通過(guò)以4000g的速度離心收集細(xì)胞，并且重新懸浮在浸潤(rùn)培養(yǎng)基(10mM MgCl2，10mMMES，2％蔗糖和150mg乙酰丁香酮ml-1，pH 5.6)中。所述土壤桿菌懸浮液在浸潤(rùn)培養(yǎng)基中稀釋到OD600為1.0，并且在22℃下保存2-3小時(shí)。
有兩種浸潤(rùn)方法，直接注射和真空浸潤(rùn)。對(duì)于注射來(lái)說(shuō)，對(duì)土壤桿菌懸浮液進(jìn)行稀釋，并且在浸潤(rùn)培養(yǎng)基中合并。使最終的OD600都達(dá)到0.25。當(dāng)土壤桿菌(pTRAkc)與上述懸浮液共同浸潤(rùn)時(shí)，它在最終的OD600為0.0125時(shí)使用。來(lái)自2-4周大的Nicotiana benthamiana植物的葉片通過(guò)以下方法浸潤(rùn)，從葉片下面將所述細(xì)菌懸浮液注入軸外的空氣間隙。例如，用每一種細(xì)菌混合物對(duì)6個(gè)葉片進(jìn)行土壤桿菌浸潤(rùn)(三個(gè)植株，每個(gè)植株兩個(gè)葉片)。所述植物在16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，22℃的條件下生長(zhǎng)5-6天。
對(duì)于真空浸潤(rùn)來(lái)說(shuō)，土壤桿菌培養(yǎng)物在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。將得到的細(xì)胞重新懸浮在1-8l浸潤(rùn)培養(yǎng)基中，使每一種培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.25。將去掉了根的完整的Nicotiana tabacum L.‘Petite Havana’SR1植株浸沒(méi)在細(xì)菌懸浮液中，并且在290kPa的真空下處理5-10分鐘，偶然進(jìn)行攪拌，以便釋放滯留的空氣泡。迅速解除所述真空(大約10kPa s-1)。將所述植物莖稈放入水飽和的花狀泡沫中。所述植物在16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，22℃下生長(zhǎng)3天。
為了進(jìn)行重組蛋白萃取，從土壤桿菌浸潤(rùn)的葉片上收集N.tabacum葉子圓片(使用微型離心管的蓋子切割)并且在每盤250ml高鹽磷酸緩沖液(0.5M NaCl)中研磨。提取物以13000r.p.m.的速度離心5分鐘，收集上清液并且重復(fù)離心。
為了進(jìn)行Western印跡分析，植物提取物在加樣緩沖液(Sambrook etal.，1989)中在95℃下培養(yǎng)2分鐘。通過(guò)SDS-PAGE(10％凝膠)分離，然后通過(guò)半干燥電吸印轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗His-tag mAb(1∶5000)檢測(cè)重組SNAP-tag融合蛋白。檢測(cè)反應(yīng)是用DAB ragent(SIGMAFAST，Sigma)進(jìn)行的。
所述SNAP-tag融合蛋白還可以通過(guò)添加合適量的BG染色SNAP-vistagreen在細(xì)胞提取物中檢測(cè)。染色條件和反應(yīng)條件按照生產(chǎn)商推薦的方法進(jìn)行。通過(guò)SNAP-vista green染色的重組SNAP-tag融合蛋白可以在凝膠文件編制所用的標(biāo)準(zhǔn)UV透照器上觀察。
本領(lǐng)域的科學(xué)家可以理解的是，不同的A.tumefaciens菌株與除了pTRAkc之外其他二元A.tumefaciens的質(zhì)粒載體一起，也可導(dǎo)致煙草植物的成功轉(zhuǎn)化，因此實(shí)現(xiàn)SNAP-Tag融合蛋白的功能表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解的是，可以采用本文所采用的基于A.tumefaciens的方法轉(zhuǎn)化多種不同的宿主植物。
SNAP-tag融合蛋白的酵母表達(dá) 酵母菌株，如A.adeninivorans LS3，A.adeninivorans 135，A.adeninivorans G1211([aleu2-]，D.hansenii H158，D.polymorphus H120，P.pastoris GS115(his4-)和H.polymorpha MedHp1(odc1-)，以及S.cerevisiae C13ABYS86(MATαleu2 ura3 his pra1 prb1 prc1 cps-)被用作可能的宿主(Steinborn，G.et al.，2006)。所有菌株在非選擇條件下在復(fù)合培養(yǎng)基(YEPD)中生長(zhǎng)或在選擇條件下在添加了2％的選擇的碳源的酵母基本培養(yǎng)基(YMM)中生長(zhǎng)(Steinborn，G.et al.，2006)。培養(yǎng)是在30℃下進(jìn)行的。按照

h等1988和Dohmen RJ等1991中所披露的方法轉(zhuǎn)化A.adeninivorans LS3，A.adeninivorans 135，A.adeninivorans G1211，D.hansenii H158，D.polymorphus H120，H.polymorpha MedHp1，P.pastorisGS115和S.cerevisiae C13ABYS86。在選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行一系列傳代之后獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。在用hph選擇標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化之后，在補(bǔ)充了150-400mg l-1潮霉素B的YEPD瓊脂平板上選擇潮霉素B-抗性菌落(200mg l-1用于A.adeninivorans LS3和135，250mg l-1用于D.hansenii H158和D.polymorphus H120，400mg l-1用于H.polymorphaMedHp1，150mg l-1用于P.pastoris GS115和S.cerevisiae C13ABYS86)。分離單一菌落，并且在30℃下在YEPD培養(yǎng)基和潮霉素B上生長(zhǎng)2天。重復(fù)該步驟三次，然后將細(xì)胞鋪平板到非選擇性YEPD瓊脂上，并且在30℃下生長(zhǎng)3-5天。然后分離來(lái)自每一個(gè)轉(zhuǎn)化體的單一菌落并且定義為菌株。
對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)型來(lái)說(shuō)，在缺少相應(yīng)氨基酸的YMM瓊脂平板上選擇所述轉(zhuǎn)化體。
通過(guò)Western印跡實(shí)驗(yàn)分析SNAP-tag融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外表達(dá)水平，將抗-His-Tag抗體用于新制備的表達(dá)酵母細(xì)胞系。
為此，將每個(gè)酵母菌種的五個(gè)轉(zhuǎn)化體放在YMM12％葡萄糖中在30℃下培養(yǎng)72小時(shí)。所述SNAP-tag融合蛋白還可以通過(guò)添加合適量的BG染色SNAP-vista green在細(xì)胞提取物中檢測(cè)。染色條件和反應(yīng)條件按照生產(chǎn)商推薦的方法進(jìn)行。通過(guò)Vista green染色的重組SNAP-tag融合蛋白可以在用于凝膠文件編制的標(biāo)準(zhǔn)UV透照器上觀察。
SNAP-tag融合蛋白的細(xì)菌表達(dá) 為了進(jìn)行SNAP-tag融合蛋白的細(xì)菌表達(dá)，將需要的融合配偶體克隆到“表達(dá)載體的構(gòu)建”中披露的、來(lái)自細(xì)菌外周質(zhì)表達(dá)載體的pET26b+中。
對(duì)合適E.coli菌株(例如ROSETTA，EMD Biosciences，Darmstadt，Germany)的熱休克感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，是例如進(jìn)行熱休克轉(zhuǎn)化。將在含有卡那霉素的瓊脂平板上生長(zhǎng)的選擇的克隆(pET編碼的KanR提供具有抗性基因的細(xì)菌)用于表達(dá)。
質(zhì)粒編碼的SNAP-Tag融合蛋白的表達(dá)是使用滲透壓脅迫表達(dá)方法進(jìn)行的，參見Barth et al.，2000. 重組RFT5-SNAP-tag融合蛋白是在IPTG可誘導(dǎo)T7 lac啟動(dòng)子的控制下在E.coli ROSETTA(DE3)中表達(dá)的。細(xì)菌在26℃下在Terrific肉湯(TB)(Sambrook&Maniatis，1989)中生長(zhǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)基中含有50mg卡那霉素/ml和0.5mM ZnCl2，因?yàn)樵缦葮I(yè)已證實(shí)在添加這種鹽時(shí)可以顯著減弱外周質(zhì)蛋白裂解(Baneyx，F(xiàn).，and G.Georgiou.1992.)。振蕩培養(yǎng)物在200mL的相同培養(yǎng)基中稀釋30倍。在600nm下的光學(xué)密度(OD600)為2，其中添加了0.5M山梨糖醇，4％NaCl，和10mM甘氨酸甜菜堿，然后在26℃下再培養(yǎng)30-60分鐘。然后通過(guò)添加2mM IPTG在26℃下誘導(dǎo)SNAP-tag融合蛋白產(chǎn)生。
15小時(shí)之后，通過(guò)以3,700 3g的速度在4℃下離心10分鐘收獲細(xì)胞。對(duì)所有以下步驟來(lái)說(shuō)，試管是在冰上冷卻的。對(duì)細(xì)菌沉淀物進(jìn)行離心，并且測(cè)定其濕重量。細(xì)胞在-80℃下冷凍直到進(jìn)一步處理。
RFT5-SNAP的表達(dá)和純化是通過(guò)IMAC進(jìn)行的，參見“通過(guò)IMAC純化哺乳動(dòng)物表達(dá)的SNAP-Tag融合蛋白”章節(jié)。
通過(guò)IMAC純化哺乳動(dòng)物表達(dá)的SNAP-Tag融合蛋白 His-標(biāo)記的蛋白的純化是通過(guò)Ni-NTA金屬親和法進(jìn)行的(Hochuli，V.，1989，Porath，J.et al.，1975)。所述蛋白純化采用的是Qiagen公司提供的用于純化天然蛋白的方法的改進(jìn)方案(The Expressionist 07/97)。為進(jìn)行蛋白的微量制備，在900μl離心澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中添加300μl的4x培養(yǎng)緩沖液(200mM NaH2PO4，pH 8.0；1.2M NaCl；40mM咪唑)和30μl 50％Ni-NTA。在培養(yǎng)1小時(shí)之后，通過(guò)離心使Ni-NTA樹脂沉淀。在用175μl 1x培養(yǎng)緩沖液洗滌培養(yǎng)物兩次之后，用30μl的洗脫緩沖液(50mM NaH2PO4，pH 8.0；1.2M NaCl；和40mM咪唑)和30μl 50％Ni-NTA洗脫結(jié)合的蛋白。在培養(yǎng)1小時(shí)之后，通過(guò)離心使Ni-NTA樹脂沉淀。用175μl 1x培養(yǎng)緩沖液洗滌沉淀物兩次之后，在室溫下用30μl的洗脫緩沖液(50mM NaH2PO4，pH 8.0；300mM NaCl；250mM咪唑)用20分鐘時(shí)間洗脫結(jié)合的蛋白。多至500ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液的真核表達(dá)蛋白的較大規(guī)模純化是在AEKTAFPLC系統(tǒng)(Amersham-Pharmacia，USA)上進(jìn)行的。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液加樣到Ni-NTA柱上，然后在上述條件下洗脫His-標(biāo)記的蛋白。
圖(101)表示12％SDS-PAGE凝膠(AUV光，B考馬斯染色)，它上面加載有5μg不同哺乳動(dòng)物表達(dá)的和IMAC(Immobilized Metal AffinityChromatography)純化的蛋白。所述凝膠包括1Ki4-SNAP；2SNAP-EGF；3Hai-SNAP；4H22-SNAP；5SNAP-CD30L；M預(yù)染色的蛋白標(biāo)記(NEB)。
III配合物ABC及其應(yīng)用 用有機(jī)熒光團(tuán)的BG衍生物標(biāo)記SNAP-tag融合蛋白 第一步，對(duì)SNAP-tag融合蛋白(Ki4-SNAP)進(jìn)行Ni-NTA純化，參見“通過(guò)IMAC純化哺乳動(dòng)物表達(dá)的SNAP-Tag融合蛋白”部分。同時(shí)通過(guò)His-Tag-鎳相互作用仍然結(jié)合在樹脂上的Ki4-SNAP蛋白可以用一種SNAP-tag特異性BG底物進(jìn)行標(biāo)記，如BG505，參見附圖(99c)。
CT-505的2mM標(biāo)記溶液是在1×Ni-NTA洗滌緩沖液(300mM NaCl，50mM磷酸鈉，pH＝7,5)中配制的。制備與估算的Ni-NTA樹脂空隙空間一樣多的溶液，并且添加到所述柱中。培養(yǎng)在室溫下在黑暗中進(jìn)行30分鐘。用5倍床體積的Ni-NTA洗滌緩沖液洗脫兩次。CT-熒光團(tuán)標(biāo)記的His-tagged蛋白的洗脫是用Ni-NTA洗脫緩沖液(300mM NaCl，50mM磷酸鈉，500mM咪唑，pH＝7,5)進(jìn)行的。
通過(guò)SDS-PAGE記錄所述標(biāo)記反應(yīng)的成功，然后在UV透照器(BioRadGel Doc XR凝膠文件編制)下進(jìn)行分析(圖99c)。
另外，也可用Intas CRI-Maestro體內(nèi)成像儀記錄標(biāo)記的成功。
用CT衍生物標(biāo)記CLIP-tag融合蛋白 CLIP-tag融合蛋白進(jìn)行Ni-NTA純化，與純化SNAP-tag構(gòu)建體的方法一樣。當(dāng)通過(guò)His-Tag-鎳相互作用仍然結(jié)合在樹脂上時(shí)，用一種CLIP-tag特異性CT底物對(duì)CLIP-Tag融合蛋白進(jìn)行標(biāo)記，如CT-360，CT-430，CT-FL/CT-PF，CT-488，CT-505，CT547，CT-TMR，CT-647CT-生物素，CLIP-vista Green等。
CT-505的2μM標(biāo)記溶液是在1x Ni-NTA洗滌緩沖液(300mM NaCl，50mM磷酸鈉，pH＝7,5)中配制的。配制與估算的Ni-NTA樹脂空隙空間一樣多的溶液，并且添加到所述柱中。培養(yǎng)在室溫下在黑暗中進(jìn)行30分鐘。用5倍床體積的Ni-NTA洗滌緩沖液洗樹脂兩次。CT-熒光團(tuán)標(biāo)記的His-tagged的蛋白的洗脫是用Ni-NTA洗脫緩沖液(300mM NaCl，50mM磷酸鈉，500mM咪唑，pH＝7,5)進(jìn)行的。
通過(guò)SDS-PAGE記錄所述標(biāo)記反應(yīng)的成功，然后在UV透照器(BioRadGel Doc XR凝膠文件編制)下分析。
另外，也可用Intas CRI-Maestro體內(nèi)成像儀記錄標(biāo)記的成功。
用CoA-衍生物在活細(xì)胞中標(biāo)記ACP-/MCP-tag融合蛋白 用含有血清的組織培養(yǎng)基洗滌ACP-Tag-嗜酸細(xì)胞趨化因子/MCP-Tag-CXCL9表達(dá)HEK293細(xì)胞三次。將一小瓶ACP-tag底物溶解在25μL的DMSO中，得到用DMSO配制的1mM的標(biāo)記儲(chǔ)備溶液。在混合10分鐘之后，溶解所有的ACP-tag底物。
以1∶200的比例用培養(yǎng)基稀釋1mM ACP-tag底物儲(chǔ)備溶液，以便得到5μM的標(biāo)記培養(yǎng)基。然后添加MgCl2使最終濃度為10mM。最后，添加ACP-合酶使最終濃度為1μM。
表達(dá)ACP-tag融合蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)基位于細(xì)胞膜內(nèi)或細(xì)胞膜上，使所述ACP-tag朝向所述細(xì)胞外側(cè)，與所述標(biāo)記培養(yǎng)基進(jìn)行交換，并且培養(yǎng)30分鐘。
然后除去所述標(biāo)記培養(yǎng)基，并且更換新的細(xì)胞培養(yǎng)基，再培養(yǎng)20分鐘，除去未反應(yīng)的ACP-tag底物。再次更換培養(yǎng)基，并且將所述細(xì)胞用于顯微鏡觀測(cè)，流式細(xì)胞計(jì)量分析或FACS分選。
用表達(dá)MCP-Tag融合蛋白的細(xì)胞重復(fù)相同的過(guò)程。因此，標(biāo)記底物是相同的，即CoA衍生物，但以SFP-合酶取代ACP-合酶用于催化所述標(biāo)記反應(yīng)。
用CoA衍生物標(biāo)記純化的ACP-/MCP-tag融合蛋白 ACP/MCP-tag融合蛋白是使用與SNAP-Tag構(gòu)建體相同的方法進(jìn)行Ni-NTA純化的。當(dāng)通過(guò)His-Tag-鎳相互作用仍然結(jié)合在樹脂上時(shí)，用一種ACP/MCP-tag特異性CoA基底物對(duì)ACP/MCP-Tag融合蛋白進(jìn)行標(biāo)記，如CoA-488，CoA-547，CoA-647和CoA-生物素等。
將一小瓶ACP-tag底物溶解在25μL的DMSO中，以便得到用DMSO配制的濃度為1mM的標(biāo)記儲(chǔ)備溶液。在混合10分鐘之后，所有ACP-tag底物都被溶解。
制備與估算的Ni-NTA樹脂空隙空間一樣大的溶液，并且添加到所述柱中。培養(yǎng)在室溫下在黑暗中進(jìn)行30分鐘。用5倍床體積的Ni-NTA洗滌緩沖液洗樹脂兩次。BG-熒光團(tuán)標(biāo)記的His-tagged蛋白的洗脫是用Ni-NTA洗脫緩沖液(300mM NaCl，50mM磷酸鈉，500mM咪唑，pH＝7,5)完成的。
用表達(dá)MCP-Tag融合蛋白的細(xì)胞進(jìn)行相同的過(guò)程。因此，標(biāo)記底物是相同的，即CoA衍生物，但用SFP-合酶取代ACP-合酶用于催化所述標(biāo)記反應(yīng)。
通過(guò)SDS-PAGE記錄所述標(biāo)記反應(yīng)的成功，然后在UV透照器(BioRadGel Doc XR凝膠文件編制)下分析。
另外，也用Intas CRI-Maestro體內(nèi)成像儀記錄標(biāo)記的成功。
純合/雜合二價(jià)抗體-SNAP-tag共軛物 本發(fā)明相關(guān)配合物的分子結(jié)構(gòu)允許兩種SNAP-tag構(gòu)建體與具有不同/相同結(jié)合特異性的(抗體)融合配偶體相結(jié)合，該結(jié)合通過(guò)包括兩個(gè)或兩個(gè)以上BG殘基的接頭結(jié)構(gòu)結(jié)合，得到雙特異性分子。
為了構(gòu)建雜合二價(jià)(雙特異性)構(gòu)建體，整個(gè)過(guò)程包括兩個(gè)步驟，以便使構(gòu)建的雜合二聚體的數(shù)量最大化。
在第一步，通過(guò)His-Tag-鎳相互作用，將具有特異性1的重組SNAP-tag融合蛋白結(jié)合在樹脂上。
用1x Ni-NTA洗滌緩沖液(300mM NaCl，50mM磷酸鈉，pH＝7,5)配制所需的2μM純合雙功能BG-交聯(lián)劑(圖3b)溶液。制備與估算的Ni-NTA樹脂空隙空間一樣多的溶液，并且添加到所述柱中。培養(yǎng)在室溫下在黑暗中進(jìn)行30分鐘。用5倍床體積的Ni-NTA洗滌緩沖液洗樹脂兩次，以便除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑。
BG-交聯(lián)劑標(biāo)記的His-tagged蛋白的洗脫是用Ni-NTA洗脫緩沖液(300mM NaCl，50mM磷酸鈉，500mM咪唑，pH＝7.5)進(jìn)行的。
在第二步，以與預(yù)標(biāo)記的蛋白1相同的摩爾比添加具有特異性2的重組SNAP-tag融合蛋白。然后在溶液中在4℃下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)過(guò)夜。
通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯染色記錄交聯(lián)反應(yīng)的成功(圖99a)。凝膠顯示Ki4-SNAP(泳道1x)及其交聯(lián)的形式(泳道2x)一起具有分子量標(biāo)記(泳道M)。通過(guò)密度分析測(cè)定分子量，單一Ki4-SNAP的分子量為53kDa，而交聯(lián)形式的分子量為122kDa。交聯(lián)是通過(guò)純化雙功能交聯(lián)劑，包括PEG 12間隔物的SV 305實(shí)現(xiàn)的(圖99b)。包括熒光團(tuán)的交聯(lián)劑，如圖(99b)用CRi-Maestro體內(nèi)成像儀(INTAS，

，Germany)額外記錄，它能夠激發(fā)并且檢測(cè)從430nm到800nm的所有類型的熒光團(tuán)。它能夠評(píng)估500到900nm的發(fā)射波長(zhǎng)。
取決于熒光團(tuán)的量子產(chǎn)量，成功結(jié)合的SNAP-tag融合蛋白，即使少至50ng都可以檢測(cè)到。
雙-/多聚體SNAP-tag融合蛋白共軛物 與在“雙特異性抗體-SNAP-tag共軛物”部分所披露的方法類似，具有一種結(jié)合特異性的雙或多聚體配合物可以通過(guò)具有兩個(gè)或兩個(gè)以上BG部分的交聯(lián)劑產(chǎn)生。
所述反應(yīng)還可以借助于用于雙特異性的I MAC基質(zhì)，但也不是單一步驟的反應(yīng)來(lái)完成。
對(duì)于單一步驟的反應(yīng)來(lái)說(shuō)，將IMAC純化的SNAP-tag融合蛋白與所述交聯(lián)劑按以下比例混合，即對(duì)于具有特定數(shù)量BG殘基BGn的交聯(lián)劑來(lái)說(shuō)，該混合物的配制是 (n)mol SNAP融合體+1M BGn 反應(yīng)混合物在4℃下在黑暗中培養(yǎng)12小時(shí)。
圖(100a-d)表示，(圖100a)用三種不同熒光團(tuán)標(biāo)記的純合三聚體交聯(lián)劑標(biāo)記、并且通過(guò)Cri-MAESTRO體內(nèi)成像儀觀察的Hai-SNAP融合蛋白合成圖像。(圖100b)相同的凝膠進(jìn)行考馬斯染色和(圖100c)相同的考馬斯染色的凝膠用密度分析軟件進(jìn)行分析。HaiSNAP與交聯(lián)劑以3∶1的摩爾比進(jìn)行混合。所述熒光團(tuán)可以使用常用的發(fā)射過(guò)濾器裝置很好地檢測(cè)。樣品1用BG430標(biāo)記的C1776-4(Ex 421nm，Em 444nm和484nm)，2用Atto 495標(biāo)記的C1884-4(Ex495，Em527)；3用尼羅紅標(biāo)記的C1883-4(ex.554nm；ex638)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)可以參見圖15，16和17?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式可以參見附圖(89-91)。
圖(100d)表示用Hai-SNAP的SV305交聯(lián)版本進(jìn)行的共焦顯微術(shù)。通過(guò)100kDA MWCO旋轉(zhuǎn)柱(Pall Nanosep)將交聯(lián)的蛋白與非交聯(lián)的版本分開。簡(jiǎn)單地講，將25μg交聯(lián)的樣品添加到所述柱上，并且以10.000g的速度離心10分鐘。然后添加500μl 1xPBS再次對(duì)樣品進(jìn)行離心，直到體積減少為50μl。重復(fù)該步驟，并且將所述柱中的殘余物用于顯微分析。
對(duì)5x105L3.6pl細(xì)胞進(jìn)行染色，參見“SNAP-tag融合蛋白的共焦顯微術(shù)應(yīng)用”部分。
抗體-核酸共軛物(RNA) 通過(guò)Dharmacon合成優(yōu)化的siRNAs，在正義鏈的3’或5’末端具有氨基和C(6)間隔物。將siRNA雙鏈體溶解在PBS中，并且在室溫下與溶解在無(wú)水DMF中的50倍摩爾余量的BG-GLA-NHS(Covalys)反應(yīng)4小時(shí)。下一步，用乙醇使siRNA沉淀，并且通過(guò)凝膠過(guò)濾柱(Centri-spin 10，Princeton separations)除去殘余的BG-GLA-NHS。類似地，在用DTT還原硫醇之后，修飾的RNA可以與BG-馬來(lái)酰亞胺一起使用。圖(104A)表示si-RNA與SNAP-tag融合蛋白結(jié)合的示意過(guò)程。
針對(duì)H22-SNAP和Hai-SNAP的抗eEFII siRNA的結(jié)合反應(yīng)結(jié)果在10％SDS-PAGE上分離。凝膠表示以下樣品1H22-SNAP+eEFII-BG；2H22-SNAP；3Hai-SNAP+eEFII-BG和4Hai-SNAP。圖(104B)是在標(biāo)準(zhǔn)UV透照器(BioRad)下分析的溴化乙錠染色的凝膠。圖(104C)是隨后進(jìn)行考馬斯染色的相同的凝膠。所述siRNA結(jié)合的SNAP-tag融合蛋白與它們的非結(jié)合形式相比表現(xiàn)出明確的電遷移率。SiRNA結(jié)合的配合物以預(yù)期的大約15kDa的大小移動(dòng)。而實(shí)際尺寸較大(65kDa而不是50kDa)。
抗體-核酸共軛物(DNA) 為了靶向輸送DNA分子，用芐基鳥嘌呤修飾所述DNA，可以用末端芐基鳥嘌呤(BG)或芐基胞嘧啶(BC)直接修飾寡核苷酸。對(duì)于較長(zhǎng)的DNA鏈或完整的質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，通過(guò)PCR擴(kuò)增所述DNA片段，將BG或BC修飾的寡核苷酸用作兩種引物之一。
所述PCR產(chǎn)物是通過(guò)商業(yè)質(zhì)粒制備試劑盒(EndoFree Plasmid MaxiKit QIAGEN，Hilden Germany)從未反應(yīng)的BG或BC修飾的寡核苷酸中純化的。
然后將純化的PCR產(chǎn)物與SNAP-tag融合蛋白以2∶1的摩爾比(RNASNAP-tag融合蛋白)在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色監(jiān)測(cè)結(jié)合反應(yīng)的成功，只有DNA標(biāo)記的SNAP-tag融合蛋白被染色，而SNAP-tag融合蛋白本身不會(huì)被染色。DNA標(biāo)記的和非標(biāo)記的融合蛋白之間的區(qū)別也可通過(guò)標(biāo)記蛋白的電遷移率來(lái)識(shí)別。
成功的DNA標(biāo)記的Ki4-SNAP-tag融合蛋白能夠通過(guò)它們超量表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記CD30來(lái)靶定癌細(xì)胞。
在結(jié)合蛋白-DNA配合物之后，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程將其內(nèi)在化。內(nèi)在化的另一個(gè)途徑是在配合物與核轉(zhuǎn)染因子(AMAXA)結(jié)合之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。
在另一種具體實(shí)施方案中，所述SNAP-tag融合蛋白-DNA配合物首先通過(guò)特異性DNA-DNA相互作用結(jié)合在DNA加載的表面上。在結(jié)合之后，所述配合物能夠?qū)⒊勘磉_(dá)CD30的細(xì)胞固定在某些部位。其中，所述蛋白-DNA配合物此前已被固定。
SNAP-tag融合蛋白直接固定在顆粒上 在某些實(shí)施方案中，使用尺寸分布在20-80nm之間并且用若丹明熒光團(tuán)包裹的二氧化硅納米珠。所述珠體的濃度為9.5mg/ml，具有5.3x1015氨基(NH2)基團(tuán)(8.76x10-3μmol/ml)。
以1500g的速度使500μl珠體(包括4.38nmol NH2基團(tuán))離心2分鐘，用無(wú)水DMF洗滌2次，并且重新懸浮在80μl DMF中。
將懸浮在DMF中的珠體添加到過(guò)量的BG-GLA-NHS(

倍摩爾過(guò)量)中，并且在25℃下振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。
用800μl PBS洗滌兩次，重新懸浮在用PBS/1mM DTE制備的200mlKi4-SNAP(100μg，2nmol)中，并且在室溫下培養(yǎng)一小時(shí)。
用800μl PBS洗滌珠體兩次，并且在使用之前重新懸浮在100μl PBS中。
圖(102A)表示Ki4-SNAP功能化納米珠結(jié)合CD30-陽(yáng)性L540細(xì)胞的共焦顯微分析?；谌舻っ鞯闹轶w發(fā)射光線為紅色(A)和Draq5的發(fā)射為擬藍(lán)色(B)，overlay(D)具有灰度級(jí)圖片(C)。
圖(102B)表示與不同數(shù)量(0.5和5μl)的Ki4-SNAP結(jié)合的若丹明斑點(diǎn)納米珠一起培養(yǎng)的cD30超量表達(dá)L540cy細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量分析。作為對(duì)照，將5μl未結(jié)合的珠體加樣到L540cy細(xì)胞上。
圖(102C)表示與不同數(shù)量(0.5和5μl)的Ki4-SNAP結(jié)合的若丹明斑點(diǎn)納米珠一起培養(yǎng)的CD30陰性U937細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量分析。作為對(duì)照，將5μl未結(jié)合的珠體加樣到U937細(xì)胞上。
用SNAP-tag融合蛋白直接進(jìn)行ELISA 用分析物涂敷96孔ELISA平板，用移液管將25μl的包被緩沖液(100mM碳酸鈉，pH 9,6)轉(zhuǎn)移到每一個(gè)孔中，然后在每一個(gè)孔中與25μl分析物溶液混合。
在室溫下包被2小時(shí)之后用1xPBS洗滌平板兩次，然后添加50μl的檢測(cè)抗體溶液(SNAP-tag融合蛋白，50-100ng)。所述SNAP-tag融合蛋白事先用SNAP-vista green熒光團(tuán)(Covalys)進(jìn)行標(biāo)記，參見“用有機(jī)熒光團(tuán)的BG衍生物標(biāo)記SNP-tag融合蛋白”章節(jié)。所述檢測(cè)抗體溶液在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，并且用1xPBS洗滌平板兩次。然后在熒光ELISA讀數(shù)器上分析所述平板，使用適合SNAP-tag結(jié)合的熒光團(tuán)的濾光器裝置。
用SNAP-tag融合蛋白進(jìn)行夾心ELISA分析 ELISA平板表面可以用BG-PEG-NH2修飾，以便它們使SNAP-tag融合蛋白共價(jià)固定化。表面激活是使用標(biāo)準(zhǔn)氨基-結(jié)合方法完成的(如接觸NHS和EDC)。然后按以下方式修飾該表面將1.4mg(0.0031mmol)bG-PEG-NH2溶解在10mL HBS緩沖液中，并且離心(20,000xg，室溫，20min)。用移液管將100μL的該溶液轉(zhuǎn)移到具有羧基化表面的96孔ELISA平板的每一個(gè)孔中。在培養(yǎng)30分鐘之后，通過(guò)添加乙醇胺(10mmol)將多余的活性基團(tuán)淬火，并且再培養(yǎng)10分鐘。在用1x PBS洗滌三次之后，所述ELISA平板表面就可用于直接固定樣品中的SNAP-tag融合蛋白。然后用移液管將100ng純化的Ki2 mab(溶解在50μl PBS中)轉(zhuǎn)移到每一個(gè)孔中，并且在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)或在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
在用1x PBS洗滌兩次之后，用移液管將含有分析物(分泌的CD30)的樣品(50μl)轉(zhuǎn)移到所述孔中，并且在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。然后用1x PBS洗滌平板兩次，然后添加50μl的檢測(cè)抗體溶液(scFv Ki3，200ng/孔)。所述檢測(cè)抗體包括scFv-GFP融合蛋白或熒光團(tuán)標(biāo)記的scFv-SNAP-tag融合蛋白，用于熒光讀數(shù)。
免疫-PCR 該方法基本上是由Niemeyer等2007披露的定量免疫-PCR(qIPCR)方法的改進(jìn)形式。
該分析方法的基本原理取決于夾心免疫測(cè)定，隨后是qPCR 1由涂敷在96孔PCR/ELISA平板上的非標(biāo)記的抗體(Ki2mab)捕捉抗原，和2從血清中捕捉sCD30抗原，和3通過(guò)Ki3scFv環(huán)繞SNAP-tag的融合蛋白檢測(cè)所述捕捉的sCD30，所述融合蛋白是事先用dsDNA PCR模板進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記的，以及最后4用于信號(hào)放大和讀數(shù)的qPCR步驟。
部分1-3表示常見的夾心ELISA方案，與以前公開的方法類似。在圖(103)中給出了示意性綜述。
所述測(cè)定必須在薄壁聚碳酸酯平板上進(jìn)行，它適合免疫測(cè)定，并且適合熱循環(huán)為基礎(chǔ)的應(yīng)用(例如，Nunc TopYield starter kit)。
為了避免被PCR產(chǎn)物污染，免疫-PCR產(chǎn)物DNA的操作是與較早的免疫-PCR步驟嚴(yán)格分開的，這兩種操作是在不同的，完全隔離的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的。
所述方法是按以下方式實(shí)施的 最初的工作步驟主要是參見“夾心ELISA“方法進(jìn)行的。唯一的區(qū)別是，使用薄壁聚碳酸酯PCR級(jí)96孔平板或條帶取代常規(guī)ELISA平板。
用DNA模板結(jié)合檢測(cè)抗體配合物取代熒光團(tuán)標(biāo)記的檢測(cè)抗體(SNAP-tag融合蛋白)。
為了除去未結(jié)合的靶DNA，用PBS+Tween(0.01％)嚴(yán)格洗滌所述平板五次。在每一個(gè)循環(huán)期間用洗滌緩沖液浸泡孔3分鐘，然后用超純凈的0.2mm過(guò)濾水洗滌兩次。在添加PCR試劑之后，對(duì)所述平板進(jìn)行30輪的PCR擴(kuò)增，使用96孔實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀，例如，ABIprism 7000(AppliedBiosystems)系統(tǒng)。
按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用所披露的引物1，引物2和探針濃度制備TaqMan Universal PCR Mastermix。通過(guò)移液管將30μl的PCR Mastermix轉(zhuǎn)移到每一個(gè)孔中。用粘性箔密封所述模塊。將平板或PCR條放入預(yù)先凈化的實(shí)時(shí)PCR儀中，并且進(jìn)行典型的PCR程序。初始變性5分鐘95℃，然后進(jìn)行30輪變性步驟30s，50℃，合成步驟30s，72℃和變性步驟12s，95℃。在運(yùn)行以上程序之后，通過(guò)軟件評(píng)估所獲得的數(shù)據(jù)。
SNAP-tag融合蛋白的流式細(xì)胞計(jì)量應(yīng)用 含有起靶定作用的A部分的SNAP-tag融合蛋白的細(xì)胞結(jié)合活性使用FACS Calibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器和細(xì)胞Quest軟件(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)或免費(fèi)軟件WinMDI 2.8進(jìn)行評(píng)估。所述SNAP-tag融合蛋白是在使用之前標(biāo)記的，參見“用有機(jī)熒光團(tuán)的BG衍生物標(biāo)記SNAP-tag融合蛋白”章節(jié)。冰上培養(yǎng)30分鐘，用熒光團(tuán)標(biāo)記的SNAP-tag配合物標(biāo)記細(xì)胞。然后用500μl冷卻的PBS在自動(dòng)化細(xì)胞洗滌器(DadeSerocent；Baxter)中洗滌細(xì)胞兩次。作為對(duì)直接配合物進(jìn)行染色的替代，通過(guò)聚組氨酸標(biāo)記來(lái)檢測(cè)SNAP-tag融合蛋白(僅為AB)的結(jié)合，該方法使用Penta-His Alexa Fluor 488抗體(Qiagen，Hilden，Germany)。
在該方法的某些實(shí)施方案中，采用靶定人類細(xì)胞表面分子CD30(霍奇金淋巴瘤)，CD64(激活的巨噬細(xì)胞上的(FcγRI))和EGF受體(位于胰腺，乳腺，肺和非小細(xì)胞肺癌)的抗體SNAP-tag融合構(gòu)建體。
a)靶定CD30 所述scFv Ki4，親代CD30特異性單克隆抗體(Barth e al.2000)的單體重組形式及其對(duì)應(yīng)體CD30配體以融合蛋白形式克隆到SNAP-tag上。位置(N-或C-末端)的選擇是為保持兩種融合配偶體的所有功能而進(jìn)行的。
圖(105A)表示用結(jié)合在CD30超量表達(dá)細(xì)胞系L540cy上的SNAP-vistaGreen(Covalys)標(biāo)記的Ki-SNAP的流式細(xì)胞計(jì)量分析的評(píng)估。
簡(jiǎn)單地講，5×105 L540cy細(xì)胞與不同數(shù)量的SNAP-vista Green標(biāo)記的Ki4-SNAP(5，50和500ng)在500μl PBS中混合。結(jié)合反應(yīng)在冰上在黑暗中進(jìn)行20分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。
圖(105B)表示用結(jié)合在CD30超量表達(dá)細(xì)胞系L540cy上的SNAP-vistaGreen(Covalys)標(biāo)記的SNAP-CD30L的流式細(xì)胞計(jì)量分析的評(píng)估。
簡(jiǎn)單地講，5×105 L540cy細(xì)胞與500ng的Vista Green標(biāo)記的SNAP-CD30L在500μl PBS中混合。該結(jié)合反應(yīng)在冰上在黑暗中進(jìn)行20分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。作為陰性對(duì)照，用相同的方法對(duì)CD30陰性細(xì)胞系L3.6pl進(jìn)行染色和分析。
b)靶定EGFR scFv 425(又被稱作Hai)，親代EGFR特異性單克隆抗體(Haisma et.al.，2000)的單體重組形式和天然EGFR配體EGF以融合蛋白形式克隆到SNAP-tag上。位置(N-或C-末端)的選擇是為保持兩種融合配偶體的所有功能決定的。
圖(105C)表示用結(jié)合在EGFR超量表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)431上的SNAP-vistaGreen(Covalys)標(biāo)記的Hai-SNAP的流式細(xì)胞計(jì)量分析的評(píng)估。
簡(jiǎn)單地講，5×105A431細(xì)胞與500ng的SNAP-vista Green標(biāo)記的HAi-SNAP在500μl PBS中混合。結(jié)合反應(yīng)在冰上在黑暗中進(jìn)行20分鐘。并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。作為陰性對(duì)照，對(duì)EGFR陰性細(xì)胞系Monomac進(jìn)行相同的染色。
圖(105D)表示用結(jié)合在EGFR超量表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)431上的SNAP-vistaGreen(Covalys)標(biāo)記的SNAP-EGF的流式細(xì)胞計(jì)量分析的評(píng)估。
簡(jiǎn)單地講，5×105A431細(xì)胞與500ng的Vista Green標(biāo)記的SNAP-EGF在500μl PBS中混合。結(jié)合反應(yīng)在冰上在黑暗中進(jìn)行20分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。作為陰性對(duì)照，對(duì)EGFR陰性細(xì)胞系CHO K1進(jìn)行相同的染色。
c)靶定CD64 H22，親代抗CD64特異性單克隆抗體(Tur等，2003)的單體重組形式作為融合蛋白N-末端克隆到SNAP-tag上。
簡(jiǎn)單地講，5×105U937細(xì)胞(CD64陽(yáng)性)與500ng的SNAP-vista Green標(biāo)記的H22-SNAP在500μl PBS中混合。結(jié)合反應(yīng)在冰上在黑暗中進(jìn)行20分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。作為陰性對(duì)照，對(duì)CD64陰性細(xì)胞系L540進(jìn)行相同的染色。
圖(105E)表示用結(jié)合在CD64超量表達(dá)細(xì)胞系U937而不是結(jié)合在CD64陰性細(xì)胞系L540上的SNAP-vista Green(Covalys)標(biāo)記的H22-SNAP的流式細(xì)胞計(jì)量分析的評(píng)估。
d)靶定胰腺癌 為了區(qū)分炎性胰腺炎和胰腺癌，在胰腺炎衍生的細(xì)胞材料上耗盡免疫鼠類scFv噬菌體的展示文庫(kù)，隨后進(jìn)行三輪噬菌體展示選擇。選擇一個(gè)胰腺癌特異性scFv克隆(clone 14.1)作為胰腺癌衍生的細(xì)胞系L3.6pl和A431的特異性粘合劑，而在胰腺炎細(xì)胞膜上是陰性的。
簡(jiǎn)單地講，5×105A431/L3.6pl細(xì)胞與SNAP-vista Green標(biāo)記的14.1-SNAP在500μl PBS中混合。結(jié)合反應(yīng)在冰上在黑暗中進(jìn)行20分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。作為陰性對(duì)照，對(duì)EGFR陰性細(xì)胞系L540進(jìn)行相同的染色，參見圖(105F)。
SNAP-tag融合蛋白的共焦顯微術(shù)應(yīng)用 制備靶細(xì)胞，參見“SNAP-tag融合蛋白的流式細(xì)胞計(jì)量應(yīng)用”，不過(guò)在最后的洗滌步驟之后是用甲醛固定的。因此，將300μl冰鎮(zhèn)的0.4％甲醛-PBS溶液添加到放置在冰上的細(xì)胞中，并且培養(yǎng)30分鐘。再次在自動(dòng)化細(xì)胞洗滌機(jī)中用PBS洗滌所述細(xì)胞。為了對(duì)核進(jìn)行對(duì)染，將所述細(xì)胞與2μl的Draq5(BioStatus，Leicestershire，UK)的1/100的稀釋液混合。在培養(yǎng)5分鐘之后，將10μl的細(xì)胞懸浮液裝載到玻璃載玻片上，用玻璃蓋玻片覆蓋，并且用Leica熒光(DMR)和共焦顯微鏡(TSC SP)研究。
圖(106)表示用BG505(Covalys)標(biāo)記的Ki4-SNAP染色的L540cy細(xì)胞的共焦照片。
體內(nèi)成像 L3.6pl(EGFR+)腫瘤異種移植的體內(nèi)成像是使用Intas Cri Maestro體內(nèi)成像儀進(jìn)行的。
將L3.6pl胰腺癌5×105細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到6周大的雌性SCID小鼠體內(nèi)，并且在生長(zhǎng)1周之后，通過(guò)retrobulbic注射70μg用BG-782NIR染料標(biāo)記的Hai-SNAP而觀察到。按前面披露的方法進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，參見“用有機(jī)熒光團(tuán)的BG衍生物標(biāo)記SNP-tag融合蛋白”章節(jié)。成像是在注射Hai-SNAP-BG782成像劑之后5分鐘，12，24和72小時(shí)用麻醉的小鼠進(jìn)行的。
圖(107)表示來(lái)自完整小鼠的紅外線照片，它是以Intas Cri-Maestro體內(nèi)成像儀，采用未混合背景信號(hào)的光譜獲得和分析的。位于小鼠腹部的大腫瘤根據(jù)Hai-SNAP的積累可以很好地觀察。在24小時(shí)范圍內(nèi)，可以清楚地看到注射的腫瘤圖像底物從注射部位向腫瘤的明顯運(yùn)動(dòng)。
圖(108)表示來(lái)自完整小鼠的紅外線照片，它是以Intas Cri-Maestro體內(nèi)成像儀，采用未混合背景信號(hào)的光譜獲得和分析的。與圖片10相反，穩(wěn)定的EGFP表達(dá)L3.6pl胰腺癌5×105細(xì)胞注射到6周大雌性SCID小鼠的皮膚下面，位于右側(cè)和左側(cè)股骨區(qū)，并且在生長(zhǎng)1周之后觀察，通過(guò)retrobulbic注射70μg用BG-782NIR染料標(biāo)記的Hai-SNAP而顯現(xiàn)。標(biāo)記反應(yīng)是按前述方法進(jìn)行的，參見“用有機(jī)熒光團(tuán)的BG衍生物標(biāo)記SNP-tag融合蛋白”章節(jié)。在注射Hai-SNAP-BG782成像劑24小時(shí)之后用麻醉的小鼠進(jìn)行成像。
當(dāng)遮蓋Cri-Maestro體內(nèi)成像儀拍攝的相應(yīng)照片時(shí)，綠色熒光和紅外熒光信號(hào)明顯重疊。
用SNAP-tag融合蛋白進(jìn)行受體內(nèi)在化研究 制備EGFR-陽(yáng)性靶細(xì)胞，按“SNAP-tag融合蛋白的共焦顯微術(shù)應(yīng)用”章節(jié)所述，但是在SNAP-tag融合蛋白應(yīng)用之后的不同的時(shí)間點(diǎn)用甲醛固定。因此，在4℃/37℃下培養(yǎng)15，30和60分鐘之后，將300μl的冰鎮(zhèn)0.4％甲醛-PBS添加到放置在冰上的細(xì)胞中，并且培養(yǎng)30分鐘。在自動(dòng)化細(xì)胞洗滌器中用PBS再次洗滌所述細(xì)胞。為了進(jìn)行核對(duì)染，將所述細(xì)胞與2μl的Draq5(BioStatus，Leicestershire，UK)的1/100稀釋液混合。在培養(yǎng)5分鐘之后，將10μl的細(xì)胞懸浮液裝載到玻璃載玻片上，用玻璃蓋玻片覆蓋，并且用Leica熒光(DMR)和共焦顯微鏡(TSC SP)研究。
圖(109)表示用BG505(Covalys)標(biāo)記的Hai-SNAP染色的L3.6pl細(xì)胞的共焦照片。與4℃的樣品相比，當(dāng)在37℃下培養(yǎng)時(shí)，結(jié)合的Hai-SNAP進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)在化率明顯更高。EGFR陰性細(xì)胞系，如L540和U937在相同的條件下不會(huì)染色。
圖(110)表示在內(nèi)在化之后Hai-SNAP BG505標(biāo)記的和轉(zhuǎn)鐵蛋白ALEXA 594標(biāo)記的是共處的(參見(圖109E)中的黑色箭頭)。圖(109A)表示內(nèi)在化的HaiSNAP-BG505為綠色；(圖109B)表示網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白-ALEXA594內(nèi)在化為藍(lán)色，(圖109C)表示A和B和D的重疊是C與非透射光照片的重疊；(圖109E)(圖109D)的放大，箭頭表示包含標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白和HaiSNAP-BG505的小泡。存在轉(zhuǎn)鐵蛋白和HaiSNAP-BG505的高度的重疊定域。
已知轉(zhuǎn)鐵蛋白可以通過(guò)網(wǎng)格蛋白支持的內(nèi)在化而實(shí)現(xiàn)內(nèi)在化。還報(bào)導(dǎo)了EGFR的這種內(nèi)在化形式。因此，Hai-SNAP和轉(zhuǎn)鐵蛋白的共處表明了EGFR的原始內(nèi)在化途徑不受結(jié)合Hai-SNAP的影響。
將SNAP-tag融合蛋白用于基于流式細(xì)胞測(cè)定術(shù)的高產(chǎn)菌株篩選 可以將細(xì)胞滲透SNAP-tag染色底物，如BG-430，BG-505，BG-DAF和TMR-Star(Covalys)等用于在活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)對(duì)SNAP-tag融合蛋白進(jìn)行特異性標(biāo)記。為了檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 293或CHO細(xì)胞(使用pMS基載體，參見圖1A+B和5)表達(dá)率，所述細(xì)胞用細(xì)胞滲透TMRstar培養(yǎng)。
按照生產(chǎn)商(Covalys)的說(shuō)明，將TMS-Star底物溶解在DMSO中。將5μM TMR-Star稀釋到最終工作濃度為1μM。在37℃下在黑暗中標(biāo)記細(xì)胞30分鐘，然后用培養(yǎng)基洗滌兩次，并且在成像之前再培養(yǎng)30分鐘，以便使未反應(yīng)的底物擴(kuò)散到細(xì)胞外面。所有步驟都是在層流下進(jìn)行的，并且使用消毒過(guò)濾的溶液。
為了進(jìn)行顯微鏡預(yù)評(píng)估，用DRAQ5TM溶液的1∶2000的稀釋液對(duì)1×105TMR染色的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)染2分鐘，然后用PBS洗滌。染色溶液的濃度和在TMR染色之后的洗滌條件是通過(guò)顯微鏡檢查仔細(xì)確定的，直到非轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或假轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的TMR背景值低到足以獲得表達(dá)SNAP-tag融合蛋白的細(xì)胞達(dá)到良好的信噪比為止。
其余的適當(dāng)染色的細(xì)胞根據(jù)TMR信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行適當(dāng)分選。對(duì)具有最強(qiáng)TMR信號(hào)的百分之十的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中。
根據(jù)需要重復(fù)該程序，以便得到純合的高產(chǎn)細(xì)胞群體，用于擴(kuò)大哺乳動(dòng)物表達(dá)的規(guī)模。
圖(111)表示HEK293細(xì)胞的TMR染色，所述細(xì)胞表達(dá)Hai-SNAP融合蛋白和EGFP報(bào)導(dǎo)蛋白，它是雙順?lè)醋觤RNA上編碼的3′末端。圖(111A)表示EGFP報(bào)導(dǎo)物的信號(hào)，(圖111B)表示屬于SNAP-Tag融合蛋白的TMR信號(hào)，(圖111C)表示Draq5核對(duì)染，和(圖111D)表示相同細(xì)胞的透射光照片。
通過(guò)SNAP-tag融合蛋白靶向輸送干擾RNA 抗eEFII siRNA和Hai-SNAP融合蛋白的結(jié)合，基本上是按照“抗體-核酸共軛物(RNA)”部分所披露的方法進(jìn)行的。
將配合物添加到靶細(xì)胞上，濃度范圍為10ng/孔(1×105靶細(xì)胞)-100ng/孔(EGFR超量表達(dá)細(xì)胞系L3.6pl)，并且在添加siRNA配合物之后62小時(shí)通過(guò)westen印跡和定量PCR檢測(cè)所述細(xì)胞的靶基因的特異性剔除。
該方法能方便地適應(yīng)其他配體和核糖核酸基分子，例如，具有不同特異性的miRNAs/shRNA。
在其他應(yīng)用中，RNA分子的結(jié)合是通過(guò)純合三功能或雜合三功能以及包括馬來(lái)酰亞胺功能的純合雙功能/雜合雙功能的交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)這種方式包括末端主要SH基團(tuán)的RNA分子(優(yōu)選具有RNA干擾特性，如siRNA)得以結(jié)合。
然后以2∶1摩爾比將預(yù)形成的交聯(lián)劑-RNA配合物添加到預(yù)先純化的SNAP-/CLIP-tag融合蛋白中，并且按上述方法反應(yīng)。
在圖(77)中，提供了具有雜合雙功能RNA的交聯(lián)劑的例子(一個(gè)BG和一個(gè)BC殘基用于交聯(lián)一個(gè)SNAP-tag和一個(gè)CLIP-tag融合蛋白)。
在圖(10，19，50)中提供了具有雜合三功能RNA的交聯(lián)劑的例子(三個(gè)BG殘基用于三個(gè)SNAP-tag融合蛋白的交聯(lián))。該交聯(lián)劑(圖50)還包括熒光素殘基，使得它可以通過(guò)例如顯微鏡分析的方法跟蹤配合物。
通過(guò)SNAP-tag融合蛋白靶向輸送細(xì)胞毒性/細(xì)胞抑制劑 在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案中，靶向配合物AB是由EGFR靶向抗體(Hai)或天然配體(EGF)組成的，而SNAP-tag與芐基鳥嘌呤修飾的細(xì)胞毒性劑，如紫杉醇結(jié)合。該紫杉醇代表本發(fā)明相關(guān)的C部分，并且與AB配合物一起以細(xì)胞毒性有效負(fù)荷量輸送到靶定的細(xì)胞中(EGFR超量表達(dá))。
為了提高每一個(gè)結(jié)合的配合物AB的毒性有效負(fù)荷，將所述毒性部分加載到樹枝狀化合物結(jié)構(gòu)上，參見Jongdoo Lim等，2007文獻(xiàn)中對(duì)紫杉醇所作的披露，或加載到氨甲喋呤上，參見Gong Wu等，2006文獻(xiàn)。
簡(jiǎn)單地講，將攜帶大量細(xì)胞毒性部分的芐基鳥嘌呤修飾的樹枝狀化合物結(jié)合在Hai-SNAP上，如在“用有機(jī)熒光團(tuán)的BG衍生物標(biāo)記SNAP-tag融合蛋白”部分所述。
然后將純化的(透析)樹枝狀化合物-Hai-SNAP配合物涂敷在靶細(xì)胞上，并且通過(guò)XTT基細(xì)胞活性測(cè)定法檢測(cè)特異性細(xì)胞毒性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將毒性分子，如苯丁酸氮芥結(jié)合在純合三功能交聯(lián)劑上。然后以3∶1的摩爾比將預(yù)形成的交聯(lián)劑-苯丁酸氮芥配合物添加到預(yù)先純化的SNAP-/CLIP-tag融合蛋白中，并且按上述方法反應(yīng)。
在圖(17，43，51)中提供了具有雜合三功能承載苯丁酸氮芥的交聯(lián)劑的例子(三個(gè)BG殘基用于交聯(lián)三個(gè)SNAP-tag蛋白)。
使用SNAP-/CLIP-tag和ACP-tag技術(shù)純化多標(biāo)記融合蛋白 所述蛋白配合物的一般結(jié)構(gòu)是SNAP-/CLIP-tag-蛋白酶裂解位點(diǎn)-靶蛋白(+His-Tag)-ACP-tag。
所有步驟都是在FPLC系統(tǒng)中進(jìn)行的，以便更好地監(jiān)測(cè)每一個(gè)工藝步驟的蛋白濃度。簡(jiǎn)單地講，所述蛋白首先通過(guò)SNAP-/CLIP-tag與SNAP-/CLIP-俘獲純化樹脂而共價(jià)結(jié)合。在該步驟之后，對(duì)所述樹脂進(jìn)行充分洗滌，直到在洗滌級(jí)份中不再能檢測(cè)到蛋白信號(hào)。然后，通過(guò)添加需要的蛋白酶，裂解所述靶蛋白，并且從所述樹脂中釋放。然后將洗脫的蛋白直接結(jié)合在IMAC(Ni-NTA)柱上，以便通過(guò)His-Tag重新結(jié)合所述靶蛋白，并且通過(guò)簡(jiǎn)單的洗滌步驟除去所述蛋白酶。然后在所述柱上用熒光團(tuán)等在ACP-tag位點(diǎn)對(duì)所述蛋白進(jìn)行標(biāo)記。然后，將未反應(yīng)的ACP底物洗掉，并且可以將標(biāo)記的高純度靶蛋白從Ni-NTA柱上洗脫。
通過(guò)閱讀本說(shuō)明書，無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)就可以制備和實(shí)施本文所披露的并且要求保護(hù)的所有方法和組合物。盡管業(yè)已以優(yōu)選實(shí)施方案的形式對(duì)本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不超出本發(fā)明的構(gòu)思，實(shí)質(zhì)和范圍的前提下可以對(duì)本發(fā)明的方法和步驟或本發(fā)明的方法步驟的順序加以改變。更具體地講，可以理解的是，某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的試劑可以取代本文所披露的試劑，并且可以獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)所有這些類似的取代和改變都被視為屬于由所述權(quán)利要求書確定的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍和構(gòu)思。
表1

















表2 援引自R.Thorpe et al.，Cytokine 21(2003)48-49
表3
參考文獻(xiàn)
1.Baneyx F，Georgiou GDegradation of secretedproteins in Escherichia coli.Ann N Y Acad Sci 1992，665301-308.
2.Baskin JM，Prescher JA，Laughlin ST，Agard NJ，Chang PV，Miller IA，Lo A，Codelli JA，Bertozzi CRCopper-freeclick chemistry for dynamic in vivo imaging.ProcNatl Acad Sci U S A 2007，10416793-16797.
3.Dyba M，Tarasoya NI，Michejda CJSmall moleculetoxins targeting tumor receptors.Curr Pharm Des2004，102311-2334.
4.GAUTIER A，JOHNSSON，K.，KINDERMANN，M.，JUILLERAT，A.，BEAUFILS，F(xiàn).PCT/EP2007/057597LABELLING OF FUSION PROTEINS WITH SYNTHETICPROBES.2008.
5.Hochuli ELarge-scale chromatography ofrecornbinant proteins.J Chromatogr 1988，444293-302.
6.JACCARD H，JOHNSSON，K.，KINDERMANN，M.，SIELAFF，I.C.PCT/EP2005/050900SPECIFIC SUBSTRATESFOR O6-ALKYLGUANINE-DNA ALKYLTRANSFERASE.2005.
7.JOHNSSONK，GEORGE，N.PCT/IB2004/001733METHODS FOR PROTEIN LABELING型ON ACYLCARRIER PROTEIN.2004.
8.KINDERMANN M，SCHWAB，M.PCT/EP2006/061798PYRIMIDINES REACTING WITHO6-ALKYLGUANINE-DNA ALKYLTRANSFERASE.2006.
9.Porath J，Carlsson J，Olsson I，Belfrage GMetal chelateaffinity chromatography，a new approach to proteinfractionation.Nature 1975，258598-599.
10.Steinborn G，Boer E，Scholz A，Tag K，Kunze G，GellissenGApplication of a wide-range yeast vector(CoMed)system to recornbinant protein production indimorphic Arxula adeninivorans，methylotrophicHansenula polymorpha and other yeasts.Microb CellFact 2006，533.
11.Stocker M，Tur MK，Sasse S，Krussmann A，Barth S，Engert ASecretion of functionalanti-CD30-angiogenin immunotoxins into thesupernatant of transfected 293T-cells.Protein ExprPurif 2003，28211-219.
12.Thorpe，R.，et al.，Cytokine 21(2003)48-49
權(quán)利要求
1.一種化合物，包括A，B和C三個(gè)部分，這些部分共價(jià)結(jié)合形成具有結(jié)構(gòu)A-B-C的化合物，其中
A部分對(duì)抗原具有特異性結(jié)合親和力，B部分與A部分共價(jià)相連
C部分是具有烷基化嘌呤或嘧啶，如鳥嘌呤、胞嘧啶之類的部分，或具有輔酶A部分的化合物，并且在它上面連接了具有生理效應(yīng)的部分，其前提是
B部分具有催化或受體活性，使C部分與共價(jià)結(jié)合的A-B部分相連。
2.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述化合物是包括至少一種重組融合蛋白的異源配合物，其含有至少一個(gè)結(jié)合部分A，特別是細(xì)胞特異性結(jié)合部分和含有一種酶型蛋白B，以及與B共價(jià)結(jié)合的至少一個(gè)附加部分C。
3.如權(quán)利要求1和/或2的化合物，其中，所述化合物是包括至少一種重組融合蛋白的異源配合物，其含有至少一個(gè)與可溶性抗原結(jié)合的部分A和一種酶型蛋白B，以及與B共價(jià)結(jié)合的至少一個(gè)附加部分C。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的化合物，其具有通過(guò)B部分而以C部分對(duì)A部分的共價(jià)修飾。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的化合物，其中，A部分是具有多肽結(jié)構(gòu)型抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)的化學(xué)部分，B部分是與A部分連接的酶型蛋白。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的化合物，其中，B部分能夠以底物特異性方式與C部分起反應(yīng)，由此使配合物AB與C部分共價(jià)連接。
7.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的化合物，其中，A部分屬于下列一組抗原結(jié)合多肽/蛋白靶定細(xì)胞類型特異性標(biāo)記，特別是A部分是針對(duì)病原物質(zhì)或病原物的疾病特異性結(jié)構(gòu)的，或A部分是與疾病/環(huán)境/食品和飼料安全或生物防御(例如，毒素)的可溶性標(biāo)記相結(jié)合的。
8.如權(quán)利要求7的化合物，其中，A部分包括來(lái)自親和物質(zhì)的親和部分或親和物質(zhì)整體的部分，其選自下列一組抗體，受體配體，酶底物，外源凝集素，細(xì)胞因子，淋巴因子，白介素，血管生成或毒性因子，過(guò)敏原，肽類過(guò)敏原，重組過(guò)敏原，過(guò)敏原獨(dú)特型抗體，自身免疫刺激結(jié)構(gòu)，組織排斥誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)，免疫球蛋白恒定區(qū)及其衍生物，變體或其組合。
9.如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的化合物，其中，B部分是能與特異底物共價(jià)反應(yīng)的多肽。
10.如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的化合物，其中，B部分是人類DNA修復(fù)蛋白O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT)的衍生物。
11.如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的化合物，其中，B部分是?；d體蛋白(ACP)的衍生物。
12.如權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的化合物，其中，所述B部分的底物由O6-芐基鳥嘌呤，O2-芐基胞嘧啶或輔酶A(CoA)組成。
13.如權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)的化合物，其中，所述共價(jià)結(jié)合的AB部分是多肽。
14.如權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)的化合物，其中，C部分是藥物，可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分。
15.如權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)的化合物，其中，C部分是固相或支持物。
16.如權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)的化合物，其中，C部分包括作為B部分的底物的部分。
17.如權(quán)利要求1-16中任意一項(xiàng)的化合物，其中，C部分可以具有結(jié)構(gòu)(X)n1-(Y)-(Z)n2，其中，X是B部分的特異性底物，n1是1或更大的數(shù)，特別是1-3，Z是藥物，可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分，n2是1或更大的數(shù)，Y是被設(shè)計(jì)成用于功能性連接X(jué)和Z的接頭結(jié)構(gòu)成分。
18.如權(quán)利要求17的化合物，其中，Y是X和Z之間的間隔物，用于確保組裝的化合物內(nèi)的每一種成分的功能。
19.如權(quán)利要求17和/或18的化合物，其中，所述接頭結(jié)構(gòu)成分包括能使Z在反應(yīng)條件下受控制地釋放的結(jié)構(gòu)元件，如pH敏感型結(jié)構(gòu)、或在核內(nèi)體或細(xì)胞溶質(zhì)中釋放的可還原結(jié)構(gòu)。
20.如權(quán)利要求17-19中任意一項(xiàng)的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)元件Y還可以具有線性，分支，樹狀或聚合物結(jié)構(gòu)。
21.一種編碼權(quán)利要求13的多肽的核酸分子。
22.一種包括權(quán)利要求21核酸的載體。
23.一種用于表達(dá)編碼權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的重組化合物的重組基因的方法。
24.一種使用包括權(quán)利要求22的載體的宿主細(xì)胞并且在適合表達(dá)權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的化合物的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的方法。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
26.一種細(xì)胞腔室或除人類之外的有機(jī)體，所述腔室或有機(jī)體被用權(quán)利要求21的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
27.如權(quán)利要求26的細(xì)胞腔室，它來(lái)自原核生物，特別是來(lái)自E.coli，B.subtilis，S.carnosus S.coelicolor，和/或Marinococcus sp.，或低等真核生物，如Saccharomyces sp.，Aspergillus sp.，Hansenula polymorpha，Arxulaadeninivorans，Spodoptera sp.和/或P.pastoris，高等非人真核生物，如植物和/或動(dòng)物，并且，所述細(xì)胞是原代或培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如新分離的人類細(xì)胞或真核細(xì)胞系，如CHO，NS0，COS，BHK，293T和MDCK。
28.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的化合物的方法，該方法系讓AB部分或BA部分與C部分起反應(yīng)，所述C部分包括對(duì)B專一性的一種或多種酶底物，并且還攜帶一個(gè)或多個(gè)藥物拷貝，可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分。
29.一種制備并且在體外和體內(nèi)給細(xì)胞施用權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的化合物的方法，該化合物具有攜帶一個(gè)或多個(gè)藥物拷貝，可檢測(cè)標(biāo)記或能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的其他成分的C部分。
30.一種使用權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的化合物的方法，于人類和動(dòng)物疾病領(lǐng)域的體外和體內(nèi)診斷應(yīng)用，以及于環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的分析應(yīng)用，于生態(tài)毒理學(xué)和生物傳感器的應(yīng)用，其中，化合物具有的C部分作為可檢測(cè)標(biāo)記。
31.一種將權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的化合物用于治療人類和動(dòng)物疾病的方法，其中，化合物具有的C部分作為藥物或作為能在靶定的細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)生物活性的成分。
32.一種通過(guò)C部分將A部分直接固定在珠子之類的支持物表面上，以便在獨(dú)特部位富集標(biāo)記的方法。
33.一種藥品，包含權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的化合物，權(quán)利要求21的核酸，權(quán)利要求22的載體和/或權(quán)利要求26或27的細(xì)胞腔室或有機(jī)體。
34.將權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的化合物，權(quán)利要求21的核酸，權(quán)利要求22的載體和/或權(quán)利要求26或27的細(xì)胞腔室或有機(jī)體，用于生產(chǎn)治療惡性疾病，變態(tài)性疾病，自身免疫反應(yīng)，慢性炎性反應(yīng)或組織/移植排斥反應(yīng)的藥品的應(yīng)用。
全文摘要
一種化合物，包括A，B和C三個(gè)部分，這些部分共價(jià)結(jié)合形成具有結(jié)構(gòu)A-B-C的化合物，其中，A部分對(duì)抗原具有特異性結(jié)合親和力，B部分與A部分共價(jià)結(jié)合，C部分是具有烷基化嘌呤或嘧啶(如鳥嘌呤、胞嘧啶等)部分或輔酶A部分的化合物，并且在它上面連接了具有生理效應(yīng)的部分，其前提是B部分具有催化或受體活性，將C部分與共價(jià)結(jié)合的A-B部分連接。
文檔編號(hào)G01N33/532GK101828113SQ200880100453
公開日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日
發(fā)明者馬庫(kù)斯·里貝特, 斯特凡·巴思, 弗洛里安·坎普邁耶 申請(qǐng)人:德國(guó)弗勞恩霍夫協(xié)會(huì)債權(quán)安格萬(wàn)特學(xué)術(shù)研究所, 亞琛工業(yè)大學(xué)