本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的提取及其構(gòu)建干細(xì)胞庫(kù)的方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞(Stemcell，SC)是一種未分化細(xì)胞，這些細(xì)胞保持著高度增殖、自我更新和分化潛能的特性。干細(xì)胞可以定向分化為血液、骨骼、大腦及皮膚等其他組織?？赡茏鳛樾迯?fù)系統(tǒng)修復(fù)受損細(xì)胞。干細(xì)胞又可分為胚胎干細(xì)胞，臍血干細(xì)胞，成體干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞等類型。干細(xì)胞在成體組織中調(diào)控成體細(xì)胞增殖、分化、凋亡及保持細(xì)胞數(shù)目的平衡中起到十分重要的作用。

人的子宮內(nèi)膜是一個(gè)高度再生組織，在育齡期婦女中要經(jīng)歷400多次的增殖、分化和脫落。人子宮內(nèi)膜由腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和血管組成，近年越來(lái)越多的研究表明，子宮內(nèi)膜組織中存在一小群具有強(qiáng)大增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞，可不斷分裂增殖，及時(shí)補(bǔ)充脫落的終末分化細(xì)胞，使子宮內(nèi)膜始終保持自我更新和再生能力。在月經(jīng)周期的不同時(shí)期，內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞的集落形成活性無(wú)明顯差別。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞在增生期的集落形成能力超過(guò)分泌期，而上皮細(xì)胞在分泌期的集落形成能力更強(qiáng)。因此可以推斷，子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞具有子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的特性，在子宮內(nèi)膜周期性脫落，增長(zhǎng)中起到關(guān)鍵作用?，F(xiàn)代婦產(chǎn)科學(xué)研究向細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平發(fā)展，在體外成功的培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、代謝以及激素作用機(jī)制提供一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

由于子宮內(nèi)膜組織中干細(xì)胞存量較少，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)高效地子宮內(nèi)膜干細(xì)胞提取方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的提取及其構(gòu)建干細(xì)胞庫(kù)的方法。

本發(fā)明的第一方面提供了一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的提取方法，所述方法包括步驟：

1)預(yù)處理

在無(wú)菌條件下，對(duì)獲得的子宮內(nèi)膜組織材料，進(jìn)行剪碎處理放入冰浴DMEM/F12培養(yǎng)基中；

2)消化

加入約1-4倍體積的消化液，消化液中含膠原酶I(50U/ml)和膠原酶IV(50U/ml)，37℃消化30-90min，獲得單細(xì)胞懸液；將消化好的單細(xì)胞懸液移入離心管，靜置幾分鐘去除剩余的大塊組織；離心后，基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞存于上清液中；

3)原代培養(yǎng)

將步驟2)分離的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，含5-20％(v/v)胎牛血清、1％(w/v)青/鏈霉素，37℃、5％C0₂培養(yǎng)箱孵育，即獲得所述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟1)中，將子宮內(nèi)膜組織材料剪碎至0.5-2mm³。

進(jìn)一步地，步驟2)中，加入約2-3倍體積的消化液。

進(jìn)一步地，步驟2)中，所述消化液中還包括亞硫酸氫鈉。

優(yōu)選地，所述亞硫酸氫鈉的濃度為5-20mg/ml，更優(yōu)選為10mg/ml。

進(jìn)一步地，步驟2)中，37℃消化50-60min。

進(jìn)一步地，步驟2)中，離心條件為1000-1800rpm離心2-5min。

進(jìn)一步地，步驟2)中，離心條件為1500rpm離心3min。

進(jìn)一步地，步驟2)中，加入約2-3倍體積的消化液。

進(jìn)一步地，步驟3)中，細(xì)胞接種密度為3×10⁴-3×10⁵個(gè)/ml。

進(jìn)一步地，步驟3)中，細(xì)胞接種密度為2×10⁵個(gè)/ml。

進(jìn)一步地，步驟3)中，培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，含10％(v/v)胎牛血清。

本發(fā)明的第二方面提供了一種構(gòu)建子宮內(nèi)膜干細(xì)胞庫(kù)的方法，所述方法包括步驟:

a)根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法提供子宮內(nèi)膜干細(xì)胞；

b)對(duì)步驟a)中獲得的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

使用本發(fā)明提供的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的提取方法，獲得的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞存活率高而且在培養(yǎng)過(guò)程中具有較高的增殖能力

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1為P8子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的顯微照片。

圖2顯示了Nestin染色情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步陳述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如美國(guó)Sambrook.J等著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲得。

實(shí)施例1子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的原代培養(yǎng)

因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者(手術(shù)前3個(gè)月未服用激素類藥物)，組織學(xué)診斷未發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜有病理性改變。與患者簽署知情同意書，并本著對(duì)患者尊重、保密及公正的原則進(jìn)行取材，并保證患者的隱私不受傷害。

1)預(yù)處理

在無(wú)菌條件下取內(nèi)膜全層+子宮肌層5mm，取材遠(yuǎn)離病變部位，緩沖液(PBS)沖洗干凈后，移入無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，剪至lmm³大小放入冰浴DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone)中。

2)消化

實(shí)驗(yàn)組1：在培養(yǎng)皿中加入約2倍體積的膠原酶I(100U/ml)，37℃消化50-60min，獲得單細(xì)胞懸液。將消化好的單細(xì)胞懸液移入離心管，靜置幾分鐘去除剩余的大塊組織。1500rpm離心3min，基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞存于上清液中。

實(shí)驗(yàn)組2：在培養(yǎng)皿中加入約2倍體積的消化液，消化液中含膠原酶I(50U/ml)和膠原酶IV(50U/ml)，37℃消化50-60min，獲得單細(xì)胞懸液。將消化好的單細(xì)胞懸液移入離心管，靜置幾分鐘去除剩余的大塊組織。1500rpm離心3min，基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞存于上清液中。

實(shí)驗(yàn)組3：在培養(yǎng)皿中加入約2倍體積的消化液，消化液中含膠原酶I(50U/ml)、膠原酶IV(50U/ml)和亞硫酸氫鈉(10mg/ml)，37℃消化50-60min，獲得單細(xì)胞懸液。將消化好的單細(xì)胞懸液移入離心管，靜置幾分鐘去除剩余的大塊組織。1500rpm離心3min，基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞存于上清液中。

3)原代培養(yǎng)

用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

按照2×10⁵個(gè)/ml的細(xì)胞密度分別接種于75cm²的培養(yǎng)瓶中，DMEM/F12培養(yǎng)基中包含10％胎牛血清、青鏈霉素溶液，37℃、5％C0₂培養(yǎng)箱孵育，72h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，以后每2-3天換液一次，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。各組三個(gè)平行。

實(shí)驗(yàn)組3培養(yǎng)的原代細(xì)胞如圖1所示。原代細(xì)胞呈梭形，胞漿豐富透明，呈現(xiàn)中間稍寬兩端尖的形態(tài)，細(xì)胞核呈卵圓形。

各實(shí)驗(yàn)組分離的干細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)如表1所示。

表1

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組3的提取的活細(xì)胞數(shù)顯著高于實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，并且實(shí)驗(yàn)組3提取獲得干細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力顯著更強(qiáng)，原代培養(yǎng)7天后的活細(xì)胞數(shù)達(dá)到了實(shí)驗(yàn)組1的5倍以上。

實(shí)施例2子宮內(nèi)膜干細(xì)胞貼壁細(xì)胞的形態(tài)及傳代

原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形和紡錘形，貼壁細(xì)胞增殖迅速，細(xì)胞集落明顯增大、增多。將當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)至80％-90％進(jìn)行傳代：去除培養(yǎng)液，加消化液(0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA液)消化，用等量血清終止消化，1300r/min10min離心，去上清，加入傳代培養(yǎng)基，吹打散細(xì)胞，按5×10³個(gè)/ml傳代，37℃、5％C0₂培養(yǎng)箱孵育，72h后更換培養(yǎng)液，以后每2-3天換液一次。傳代培養(yǎng)依次標(biāo)記為P1、P2至P10。

傳代培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基含15％(v/v)的胎牛血清、1％(w/v)兩性霉素、1％(w/v)青/鏈霉素。

實(shí)施例3傳代過(guò)程中進(jìn)行細(xì)胞克隆增殖能力的檢測(cè)。

調(diào)整細(xì)胞懸液細(xì)胞密度后，分別以300個(gè)基質(zhì)細(xì)胞/cm²接種于6孔培養(yǎng)板中37℃、5％C0₂進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的傳代培養(yǎng)基如實(shí)施例2中所用。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2-3d換液1次，并每天觀察細(xì)胞集落形成情況。在培養(yǎng)的第15d，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，洗滌2次干燥后，結(jié)晶紫染色，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞大于50的克隆數(shù)。各組設(shè)置三個(gè)平行。

克隆形成率＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組3的干細(xì)胞的增殖能力顯著強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)組1。

表1

實(shí)施例4.流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的實(shí)驗(yàn)組各傳代的細(xì)胞集落，離心收集細(xì)胞，棄上清洗滌細(xì)胞兩次，制成濃度為1x10⁶L^-1細(xì)胞懸液，分別加入10微升CD29、CD45、CD90、CD34、CD73和CD133抗體(BD公司)，4℃避光孵育30分鐘。孵育完成后液洗滌細(xì)胞兩次以去除未結(jié)合的抗體，重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD45、CD90、CD34、CD73和CDl33的表達(dá)率。

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，擴(kuò)增傳代的各代細(xì)胞均具有預(yù)期的干細(xì)胞特性。說(shuō)明各傳代細(xì)胞仍然保持了干細(xì)胞特性。

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)組3的P8子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為10⁸/L接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1.5mL，貼壁48h后40g/L多聚甲醛固定，進(jìn)行nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，檢測(cè)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積。

圖2顯示了Nestin染色情況。

實(shí)施例5.子宮內(nèi)膜干細(xì)胞成脂、成骨誘導(dǎo)分化

1)成脂分化

取實(shí)驗(yàn)組3第8代細(xì)胞，2×10⁴細(xì)胞/孔接種于12孔板中。細(xì)胞達(dá)到70％-80％融合時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入成脂分化培養(yǎng)基，成脂分化培養(yǎng)基在IMDM培養(yǎng)基中補(bǔ)充10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10mmol/LL-谷氨酰胺、10μmol/L胰島素(Sigma公司)、200μmol/L吲哚美辛(Sigma公司)、1μmol/L地塞米松和0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，Sigma公司)。每隔2-3d更換新鮮的培養(yǎng)基。分化誘導(dǎo)21天后，進(jìn)行油紅O油滴染色。

成脂誘導(dǎo)分化21天，油紅O染色后在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)中充滿紅色的油滴，提示細(xì)胞已經(jīng)分化呈脂肪細(xì)胞。

2)成骨分化

取實(shí)驗(yàn)組3第8代細(xì)胞，2×10⁴細(xì)胞/孔接種于12孔板中。細(xì)胞達(dá)到70％-80％融合時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入成骨分化培養(yǎng)基，成骨分化培養(yǎng)基在低糖IMDM培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10％胎牛血清、100μmol/L抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鹽和100mmol/L地塞米松(Sigma公司)。每隔2-3d換液新鮮的成脂分化培養(yǎng)基。分化誘導(dǎo)21天后，用茜素紅進(jìn)行油滴染色。

成骨誘導(dǎo)分化21天后，運(yùn)用茜素紅進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)染色，致密生長(zhǎng)的細(xì)胞中散現(xiàn)大小不一的橘紅色礦化結(jié)節(jié)。染色結(jié)果顯示擴(kuò)增的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞均有成骨分化能力。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。