本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的一種上皮細(xì)胞培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，具體涉及的是一種人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

人羊膜易于獲得，具有不引起倫理學(xué)爭(zhēng)議、所含羊膜干細(xì)胞（羊膜上皮干細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞）含量豐富、免疫原性低等特點(diǎn),可成為再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的重要種子細(xì)胞來源。

人羊膜上皮干細(xì)胞（amniotic epithelial stem cells,AESCs）是由羊膜分離獲得的干細(xì)胞之一。hAESC分化于原始的二胚層胚盤，是受精后第8天由外胚層細(xì)胞發(fā)育而來，早于三胚層胚胎的形成，這一獨(dú)特的組織胚胎學(xué)來源賦予了hAESC多向分化的潛能和獨(dú)特的干細(xì)胞樣特性。目前已可將其分化為神經(jīng)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。由于其不表達(dá)HLA-A，B,C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反應(yīng)；又因其缺少端粒酶，不能形成崎胎瘤，因此，對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的探索及生長特性的研究具有重要意義。

目前，在干細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)體系中均加入了一定比例的胎牛血清或新生小牛血清。由于上述異種動(dòng)物血清存在動(dòng)物攜帶的已知或未知病原體，因此，限制了干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)提供了可能。雖然已有發(fā)明專利羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（專利號(hào)CN201010252201.2），但由于上皮干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞屬于不同類別的干細(xì)胞，故需要的培養(yǎng)條件和需要的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基也不同；因此還需要進(jìn)行創(chuàng)新和改進(jìn)以克服其局限性，由于hAESCs不合成端粒酶，hAESCs植入體內(nèi)，并不形成畸胎瘤，在干細(xì)胞應(yīng)用的安全性方面較一般干細(xì)胞更具臨床應(yīng)用潛力。增強(qiáng)了臨床應(yīng)用的安全性，使其用途更具優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題而提供一種人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，本發(fā)明解決了上皮干細(xì)胞培養(yǎng)存在異種血清的問題，不形成畸胎瘤，應(yīng)用安全，同時(shí)也解決了同種異體、來源廣泛、不受倫理限制及無免疫原性問題。

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，包括：

DMEM／F12(按體積1:1混合)15.0～15.6g/L

表皮細(xì)胞生長因子0.005～0.015 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白1.0～7.0 mg/L

人胰島素5.5～15 mg/L

亞硒酸鈉5.0～7.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500 mg/L

L-丙氨酸10～25 mg/L

L-天冬酰胺4.9～10.9 mg/L

L-天冬氨酸9.3～17.3 mg/L

L-谷氨酸10.7～18.7 mg/L

甘氨酸5.5 ～8.5 mg/L

L-脯氨酸 7.5～15.5 mg/L

L-絲氨酸6.5～11.5 mg/L

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜上皮干細(xì)胞分離及單細(xì)胞懸液的制備

取人羊膜先用終濃度 2.5g/L胰蛋白酶，室溫消化30分鐘～60分鐘，共2～4次，得到細(xì)胞懸液；用200目～300目不銹鋼網(wǎng)過濾將消化下來的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1000轉(zhuǎn)/分鐘～1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘～15分鐘，用PH 7.2 磷酸緩沖液PBS洗2次；再離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘～2500轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15分鐘～35分鐘，棄去上清液，即獲得羊膜上皮干細(xì)胞；

（2）人羊膜上皮干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增

將第(1)步所得細(xì)胞接種于無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每24小時(shí)～48小時(shí)全量換液一次，使人羊膜上皮干細(xì)胞通過換液和傳代逐漸得到擴(kuò)增和純；。

所述人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，包括：

DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0～15.6g/L

表皮細(xì)胞生長因子0.005～0.015 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白1.0～7.0 mg/L

人胰島素5.5～15 mg/L

亞硒酸鈉5.0～7.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500 mg/L

L-丙氨酸10～25 mg/L

L-天冬酰胺4.9～10.9 mg/L

L-天冬氨酸9.3～17.3 mg/L

L- 谷氨酸10.7～18.7 mg/L

甘氨酸5.5 ～8.5 mg/L

L-脯氨酸 7.5～15.5 mg/L

L-絲氨酸6.5～11.5 mg/L

在上述第(2)步中，擇優(yōu)選擇將第(1)步所得細(xì)胞以2.5×l0⁷ L^-1～2.5×l0¹⁰ L^-1密度接種于上述無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

細(xì)胞擴(kuò)增和純化的過程如下：

將第(2)步所得細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每24小時(shí)～48小時(shí)全量換液一次，待細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合時(shí)，然后按1：2的比例或l：3的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代，傳代培養(yǎng)過程中每24小時(shí)～48小時(shí)全量換液1次，直至細(xì)胞貼壁彼此融合，鋪滿瓶底，重復(fù)上述操作進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并記為P1代，繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程，使人羊膜上皮干細(xì)胞逐漸得到擴(kuò)增和純化。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：人羊膜是胎兒出生后隨胎盤排出體外，并作為“廢棄物”丟棄，本發(fā)明在體外取羊膜提取人羊膜上皮干細(xì)胞，并進(jìn)行無血清培養(yǎng)，與用含有胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)人羊膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行比較，具有無其他動(dòng)物源性、不受倫理限制及異種免疫原性等優(yōu)越性。由于不合成端粒酶，hAESCs植入體內(nèi)不形成畸胎瘤，在干細(xì)胞應(yīng)用的安全性方面較一般干細(xì)胞更具臨床應(yīng)用潛力。適宜于不同個(gè)體之間的移植，是細(xì)胞治療的理想靶細(xì)胞。具有比骨髓干細(xì)胞更強(qiáng)的擴(kuò)增能力和免疫原性及成瘤性更低等骨髓干細(xì)胞無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比較，克服了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的取材困難及年齡等局限性，其臨床應(yīng)用的安全性和用途更具優(yōu)勢(shì)，具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用性和廣泛普及性，臨床應(yīng)用性更強(qiáng)。

附圖說明

圖1為原代培養(yǎng)hAESCs倒置顯微鏡（× 40）的示意圖。

圖2為細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)提取培養(yǎng)原代（P0）代hAESCs中上皮標(biāo)志物上皮角蛋白CK19（× 100）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白

（× 100）表達(dá)的示意圖。

圖3為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)P1代hAESCs 培養(yǎng)96小時(shí)倒置顯微鏡

（× 40）的示意圖。

圖4為含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)P1代hAESCs培養(yǎng)96小時(shí)倒置顯微鏡（× 40）的示意圖。

圖5為流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)96小時(shí)hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，簡(jiǎn)稱CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR的表達(dá)的示意圖。

圖6為流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)96小時(shí)hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，簡(jiǎn)稱CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR的表達(dá)的示意圖。

圖7為MTS增殖檢測(cè)分析檢測(cè)無血清培養(yǎng)基與含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)hAESCs細(xì)胞增殖能力的示意圖。

圖8為細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)體外誘導(dǎo)hAESCs向胰島素分泌細(xì)胞分化特異性標(biāo)志物Insulin、Glucagon、PPY 和Mafa基因（× 100）表達(dá)的示意圖。

圖9為實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAESCs向胰腺細(xì)胞分化能力的檢測(cè)Insulin、Glucagon、Ngn3、Pdx1和PPY基因表達(dá)的示意圖。

圖10為細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)體外誘導(dǎo)hAESCs 向神經(jīng)細(xì)胞分化特異性標(biāo)志物Nestin和β-tubulin Ⅲ基因（× 100）表達(dá)的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明：

實(shí)施例1

如圖1所示，原代培養(yǎng)hAESCs倒置顯微鏡（× 40）的示意圖。從人羊膜提取的原代羊膜上皮細(xì)胞形態(tài)均一，呈鵝卵石樣排列。

如圖2所示，細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)鑒定提取的hAECs表面標(biāo)志物，原代提取培養(yǎng)的P0代hAESCs中上皮標(biāo)志物上皮角蛋白CK19和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白（× 100）表達(dá)。應(yīng)用紅色熒光蛋白標(biāo)記的驢抗小鼠熒光二抗進(jìn)行雜交CK19表達(dá)強(qiáng)陽性，波形蛋白表達(dá)弱陽性。

如圖3 所示，無血清培養(yǎng)基對(duì)P1代hAESCs進(jìn)行培養(yǎng)96小時(shí)倒置顯微鏡圖（×40）。鏡下細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞呈鵝卵石樣排列。

如圖4所示，含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基對(duì)P1代hAESCs進(jìn)行培養(yǎng)96小時(shí)倒置顯微鏡圖（× 40）。鏡下細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞呈鵝卵石樣排列。

如圖5所示，流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定無血清培養(yǎng)96小時(shí)hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，簡(jiǎn)稱CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR 圖。結(jié)果顯示 hAESCs 陽性表達(dá) CD29 、CD31 、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和SSEA-4；

不表達(dá)Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、HLA-DR 。

如圖6所示，流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)96小時(shí)hAESCs中CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR 圖。結(jié)果顯示 hAESCs 陽性表達(dá) CD29 、CD31 、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和SSEA-4；不表達(dá)Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、HLA-DR 。

如圖7所示，無血清培養(yǎng)hAESCs細(xì)胞增殖能力無血清培養(yǎng)基與含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)hAESCs細(xì)胞增殖能力比較圖。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)（含不同濃度 0，0.02%、0.06%、0.10%、0.20%和0.40%）人血白蛋白）hAESCs，與含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)下，分別在培養(yǎng)24、48、72和96小時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行比較。結(jié)果24小時(shí)不添加人血白蛋白組與對(duì)照組無顯著差異；48和72小時(shí)不添加或添加0.02%人血白蛋白組與對(duì)照組無顯著差異；96小時(shí)不添加或添加0.02%與0.06%人血白蛋白組與對(duì)照組無顯著差異。

如8 所示，細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAESCs向胰腺細(xì)胞分化特異性標(biāo)志物檢測(cè)。A. 定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對(duì)無血清培養(yǎng)的hAESCs進(jìn)行培養(yǎng)，2周后檢測(cè)結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化的hAESCs細(xì)胞質(zhì)中Glucagon（綠色熒光）和PPY（綠色熒光）表達(dá)陽性。B. 定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對(duì)無血清培養(yǎng)的hAESCs進(jìn)行培養(yǎng)，3周后免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示Insulin（紅色熒光）和Mafa（綠色熒光）表達(dá)陽性。DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核藍(lán)色熒光均表達(dá)陽性。

如圖9所示，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAESCs向胰腺細(xì)胞分化能力的檢測(cè)。A. 定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對(duì)無血清培養(yǎng)的hAESCs進(jìn)行培養(yǎng)2周后檢測(cè)到hAESCs中Glucagon、Ngn3、Pdx1和PPY表達(dá)水平均升高。3周后檢測(cè)到hAESCs中Insulin表達(dá)水平顯著升高。

如圖10所示，細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAESCs定向誘導(dǎo)分化神經(jīng)特異性標(biāo)志物Nestin和β-tubulin Ⅲ表達(dá)陽性（×100）。檢測(cè)結(jié)果顯示定向誘導(dǎo)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hAECs 2周后倒置熒光顯微鏡下觀察顯示hAECs細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)神經(jīng)分化特異性標(biāo)志物綠色熒光蛋白標(biāo)記Nestin和β-tubulin Ⅲ綠色熒光和DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核藍(lán)色熒光均表達(dá)陽性。。

實(shí)施例2

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，包括：

達(dá)爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基／F12（簡(jiǎn)稱DMEM／F12）按體積1:1混合，15.0～15.6g/L

表皮細(xì)胞生長因子0.005mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白1.0 mg/L

人胰島素5.5 mg/L

亞硒酸鈉5.0×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300 mg/L

L-丙氨酸10mg/L

L-天冬酰胺4.9 mg/L

L-天冬氨酸9.3 mg/L

L-左旋谷氨酸10.7 mg/L

甘氨酸5.5 mg/L

L-脯氨酸 7.5 mg/L

L-絲氨酸6.5 mg/L

制成為水溶液。

實(shí)施例3

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，包括：

達(dá)爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基／F12（簡(jiǎn)稱DMEM／F12）按體積1:1混合，15.3 g/L

表皮細(xì)胞生長因子0.01 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白3.5mg/L

人胰島素10mg/L

亞硒酸鈉6.0×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽400mg/L

L-丙氨酸17mg/L

L-天冬酰胺7mg/L

L-天冬氨酸13mg/L

L-左旋谷氨酸14mg/L

甘氨酸7.0mg/L

L-脯氨酸 10mg/L

L-絲氨酸8mg/L

制成為水溶液。

實(shí)施例4

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，包括：

DMEM／F12（按體積1:1混合）15.6g/L

表皮細(xì)胞生長因子0.015 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白7.0 mg/L

人胰島素15 mg/L

亞硒酸鈉7.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽500 mg/L

L-丙氨酸25 mg/L

L-天冬酰胺10.9 mg/L

L-天冬氨酸17.3 mg/L

L-左旋谷氨酸18.7 mg/L

甘氨酸8.5 mg/L

L-脯氨酸15.5 mg/L

L-絲氨酸11.5 mg/L

制成為水溶液。

實(shí)施例5

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜上皮干細(xì)胞分離及單細(xì)胞懸液的制備

取供體符合醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)剖腹產(chǎn)或正常分娩的胎盤，并在胎盤娩出5分鐘內(nèi)，從胎膜上鈍性分離羊膜；進(jìn)行ABO/Rh血型檢測(cè)及HLA分型檢測(cè)和微生物學(xué)檢測(cè)，用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)漂洗后剪碎；用含1000U/ml慶大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸鹽緩沖液浸泡20分鐘。取人羊膜10×10cm2，用終濃度 2.5g/L胰蛋白酶，室溫消化30分鐘分鐘，共2次，收集消化液，用200目不銹鋼網(wǎng)過濾將消化下來的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘分鐘，用PH 7.2磷酸緩沖液PBS洗2次；再離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15分鐘，棄去上清液，即獲得羊膜上皮干細(xì)胞；

（2）人羊膜上皮干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增

將第(1)步所得細(xì)胞接種于75ml 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，內(nèi)含5ml無血清培養(yǎng)液，包括：

DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0g/L，

表皮細(xì)胞生長因子0.005 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白1.0 mg/L

人胰島素5.5 mg/L

亞硒酸鈉5.0×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300 mg/L

L-丙氨酸10 mg/L

L-天冬酰胺4.9 mg/L

L-天冬氨酸9.3 mg/L

L-谷氨酸10.7 mg/L

甘氨酸5.5 mg/L

L-脯氨酸 7.5 mg/L

L-絲氨酸6.5 mg/L

接種時(shí)細(xì)胞密度采用2.5×l0⁷ L^-1

置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO ₂的孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每24小時(shí)，全量換液1次，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每24小時(shí)，全量換液1次，待細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，按1：2的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代，傳代培養(yǎng)過程中每24小時(shí)全量換液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復(fù)上述操作進(jìn)行傳代，此傳代培養(yǎng)記為P1代，然后繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程。hAESCs呈鵝卵石樣排列。隨著傳代hAESCs培養(yǎng)5代以后，細(xì)胞增殖速度減慢，出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。

實(shí)施例6

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜上皮干細(xì)胞分離及單細(xì)胞懸液的制備

取供體符合醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)剖腹產(chǎn)或正常分娩的胎盤，并在胎盤娩出8分鐘內(nèi)，從胎膜上鈍性分離羊膜；進(jìn)行ABO/Rh血型檢測(cè)及HLA分型檢測(cè)和微生物學(xué)檢測(cè)，用0.9%生理鹽水反復(fù)漂洗后剪碎；用含1000U/ml慶大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的0.9%生理鹽水浸泡30分鐘。取人羊膜10×10cm2，用終濃度 2.5g/L胰蛋白酶，室溫消化45分鐘，共3次，收集消化液，用250目不銹鋼網(wǎng)過濾將消化下來的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1250轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，用PH 7.2磷酸緩沖液PBS洗2次；再離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為28分鐘，棄去上清液，即獲得羊膜上皮干細(xì)胞；

（2）人羊膜上皮干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增

將第(1)步所得細(xì)胞接種于75ml 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，內(nèi)含8ml無血清培養(yǎng)液，包括：

DMEM／F12（按體積1:1混合）15.3 g/L

表皮細(xì)胞生長因子0.010 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白3.0 mg/L

人胰島素10mg/L

亞硒酸鈉6.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽400 mg/L

L-丙氨酸18mg/L

L-天冬酰胺8.0mg/L

L-天冬氨酸13.0mg/L

L-谷氨酸14.0mg/L

甘氨酸7.0mg/L

L-脯氨酸 10.0 mg/L

L-絲氨酸8.0mg/L

接種時(shí)細(xì)胞密度采用2.5×l0⁷ L^-1

置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO ₂的孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每30小時(shí)，全量換液1次，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每30小時(shí)，全量換液1次，待細(xì)胞達(dá)到85％融合時(shí)，按1：2的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代，傳代培養(yǎng)過程中每48小時(shí)全量換液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復(fù)上述操作進(jìn)行傳代，此傳代培養(yǎng)記為P1代，然后繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程。hAESCs呈鵝卵石樣排列。隨著傳代hAESCs培養(yǎng)5代以后，細(xì)胞增殖速度減慢，出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。

實(shí)施例7

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜上皮干細(xì)胞分離及單細(xì)胞懸液的制備

取供體符合醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)剖腹產(chǎn)或正常分娩的胎盤，并在胎盤娩出10分鐘內(nèi)，從胎膜上鈍性分離羊膜；進(jìn)行ABO/Rh血型檢測(cè)及HLA分型檢測(cè)和微生物學(xué)檢測(cè)，用磷酸鹽緩沖液（PBS）或0.9%生理鹽水反復(fù)漂洗后剪碎；用含1000U/ml慶大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸鹽緩沖液浸泡40分鐘。取人羊膜10×10cm2，用終濃度 2.5g/L胰蛋白酶，室溫消化60分鐘，共4次，收集消化液，用300目不銹鋼網(wǎng)過濾將消化下來的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，用PH 7.2磷酸緩沖液PBS洗2次；再離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為35分鐘，棄去上清液，即獲得羊膜上皮干細(xì)胞；

（2）人羊膜上皮干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增

將第(1)步所得細(xì)胞接種于75ml 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，內(nèi)含10ml無血清培養(yǎng)液，包括：

DMEM／F12（按體積1:1混合）15.6g/L，

表皮細(xì)胞生長因子0.015 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白7.0 mg/L

人胰島素15 mg/L

亞硒酸鈉7.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽500 mg/L

L-丙氨酸25 mg/L

L-天冬酰胺10.9 mg/L

L-天冬氨酸17.3 mg/L

L-谷氨酸18.7 mg/L

甘氨酸8.5 mg/L

L-脯氨酸15.5 mg/L

L-絲氨酸11.5 mg/L

接種時(shí)細(xì)胞密度采用2.5×l0⁷ L^-1

置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO ₂的孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每48小時(shí)，全量換液1次，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長情況，48小時(shí)，全量換液1次，待細(xì)胞達(dá)到90％融合時(shí)，按l：3的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代，傳代培養(yǎng)過程中每72小時(shí)全量換液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復(fù)上述操作進(jìn)行傳代，此傳代培養(yǎng)記為P1代，然后繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程。hAESCs呈鵝卵石樣排列。隨著傳代hAESCs培養(yǎng)5代以后，細(xì)胞增殖速度減慢，出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。

實(shí)施例8

本發(fā)明人羊膜上皮干細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜上皮干細(xì)胞分離及單細(xì)胞懸液的制備

取從人胎膜上鈍性分離羊膜；用PH7.2的PBS（phosphate buffer saline，簡(jiǎn)稱PBS）磷酸鹽緩沖液反復(fù)漂洗后，取羊膜10×10cm²；置于1000U/ml慶大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸鹽緩沖液60ml中，浸泡30分鐘。用終濃度 2.5g/L胰蛋白酶，37℃溫箱消化30分鐘，共3次，收集消化液，用200目不銹鋼網(wǎng)過濾將消化下來的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，用PH 7.2磷酸緩沖液PBS洗2次；再離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15分鐘，棄去上清液，即獲得羊膜上皮干細(xì)胞；

（2）人羊膜上皮干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增

將第(1)步所得細(xì)胞接種于25ml 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，內(nèi)含5ml無血清培養(yǎng)液，包括：

DMEM／F12（按體積1:1混合）15.3 g/L，

表皮細(xì)胞生長因子0.012 mg/L

人轉(zhuǎn)鐵蛋白3.8mg/L

人胰島素16mg/L

亞硒酸鈉7.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽480 mg/L

L-丙氨酸22mg/L

L-天冬酰胺9.0mg/L

L-天冬氨酸15.0mg/L

L-谷氨酸16.0mg/L

甘氨酸9.0mg/L

L-脯氨酸 15.0 mg/L

L-絲氨酸9.0mg/L

接種時(shí)細(xì)胞密度采用2.5×l0¹⁰ L^-1 置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的C0₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，記為P0代；根據(jù)細(xì)胞的貼壁情況，24小時(shí)用上述無血清培養(yǎng)液5ml全量換液1次，待細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，按l：3的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。以此類推。

實(shí)施例9

本發(fā)明采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定無血清培養(yǎng)與10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)96小時(shí)hAESCs 表型中分化抗原簇（cluster of differentiation，簡(jiǎn)稱 CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR基因的表達(dá)，如下：

1.取hAESCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/mL；

2.取1mL細(xì)胞懸液，冷PBS洗細(xì)胞后100uL PBS重懸細(xì)胞；

3.實(shí)驗(yàn)組分別加入5uL單克隆抗體CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR基因，設(shè)置未加抗體組作為陰性對(duì)照組；

4. 4℃避光孵育30min，冷PBS沖洗3次；

5.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

實(shí)施例10

本發(fā)明MTS增殖檢測(cè)分析檢測(cè)無血清培養(yǎng)基與含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)hAESCs的細(xì)胞增殖能力。如下：

1.分別將無血清培養(yǎng)基與含10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)P2代hAESCs按8×10³/孔接種于96孔板內(nèi)；

2.待細(xì)胞貼壁后分別更換培養(yǎng)液；

3.于24、48、72和96小時(shí)分別向各孔加入20μL MTS/孔（5mg/ml）；

于37 ℃、5% CO₂的孵箱內(nèi)孵育2小時(shí)；

3. MTS增殖檢測(cè)各孔495nM處吸光值。

實(shí)施例11

本發(fā)明采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)無血清培養(yǎng)hAESCs向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，如下：

1、制備hAESCs細(xì)胞爬片：將處理好的干凈的蓋片，置入六孔板內(nèi)，以2×10⁵密度將經(jīng)誘導(dǎo)分化后的hAESCs接種到放入蓋片的六孔板內(nèi)，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5％的 CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2、固定：待細(xì)胞生長70～80％融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，室溫固定20分鐘；

3、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS，50rpm/min洗滌5分鐘，重復(fù)3次；

4、封閉：加入封閉液(0.2%Triton-X-100通透，含2.5%驢血清的PBS中)， 室溫封閉30分鐘～60分鐘；

5、一抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)

1∶200稀釋一抗Insulin（1:100）、Glucagon（1:100）、PPY（1:100）、Mafa（1:100）；覆蓋蓋片表面并置入濕盒內(nèi)，4℃，過夜；

6、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分鐘，重復(fù)3次；

7、二抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)

1∶500稀釋二抗；Insulin應(yīng)用紅色熒光蛋白標(biāo)記的驢抗大鼠熒光二抗進(jìn)行雜交；Glucagon、PPY、Mafa應(yīng)用綠色熒光蛋白標(biāo)記的驢抗山羊熒光二抗進(jìn)行雜交，室溫孵育60分鐘；

8、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分 鐘，重復(fù)3次；

9、核染色：用去離子水(ddH₂O)按1∶1000的比例稀釋二脒苯基吲哚(DAPI)儲(chǔ)存液，工作液濃度為1μg/ml，染色1分鐘，使用ddH₂O 洗3次，每次5分鐘；

10、封片：防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。觀察DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核表達(dá)藍(lán)色熒光、紅色熒光蛋白標(biāo)記的熒光二抗驢抗大鼠熒光二抗表達(dá)紅色熒光和綠色熒光蛋白標(biāo)記的驢抗山羊熒光二抗表達(dá)綠色熒光。

實(shí)施例12

本發(fā)明采用qRT-PCR檢測(cè)無血清培養(yǎng)hAESCs向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，如下：

分別收集實(shí)驗(yàn)組無血清培養(yǎng)hAESCs和對(duì)照組hAESCs，采用qRT-PCR方法對(duì)hAESCs進(jìn)行胰腺發(fā)育過程中相關(guān)標(biāo)志物胰島素（Insulin）、胰高糖素（Glucagon）、PPY和Mafa基因檢測(cè)。

1. 將二組hAESCs分別按照3×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔的密度種入預(yù)先用1%瓊脂鋪好的6孔板中，使其懸浮生長，待貼壁后，每3 天更換1次。誘導(dǎo)周期為14 天。

誘導(dǎo)體系完全培養(yǎng)基如下：DMEM/F12，10%胎牛血清，10mg/mL EGF，1% 非必須氨基酸，2mmol/mL L-谷氨酰胺；

2.誘導(dǎo)形成的胰島素分泌細(xì)胞能力的鑒定

用Trizol法分別提取細(xì)胞的RNA。對(duì)提取到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應(yīng)條件：在95℃ 20秒解鏈后，95℃ 5秒，60℃ 20秒，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR儀上，以所獲得的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè) Insulin，胰高血糖素，PPY，Mafa及GAPDH基因表達(dá)水平。以GAPDH表達(dá)作為內(nèi)參標(biāo)定各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)表達(dá)量，計(jì)算方法為2 ^–ΔΔCT相對(duì)定量法。

實(shí)施例13

本發(fā)明采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)無血清培養(yǎng)hAESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。

1、制備hAECs細(xì)胞爬片：將處理好的干凈的蓋片，置入六孔板內(nèi)，以2×10⁵密度將經(jīng)誘導(dǎo)分化后的hAESCs接種到放入蓋片的六孔板內(nèi)，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5％的 CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2、固定：待細(xì)胞生長70%～80％融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，室溫固定20分鐘；

3、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS，50rpm/min洗滌5分鐘，重復(fù)3次；

4、封閉：加入封閉液(0.2%Triton-X-100通透，含2.5%驢血清的PBS中)， 室溫封閉30分鐘～50分鐘；

5、一抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶200稀釋一抗Nestin和β-tubulin Ⅲ；覆蓋蓋片表面并置入濕盒內(nèi)，4℃，過夜；

6、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分鐘，重復(fù)3次；

7、二抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶500

稀釋熒光二抗，Nestin和β-tubulin Ⅲ應(yīng)用綠色熒光蛋白標(biāo)記的驢抗小鼠熒光二抗進(jìn)行雜交，室溫孵育1小時(shí)；

8、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分 鐘，重復(fù)3次；

9、核染色：用去離子水(ddH2O)按1∶1000的比例稀釋二脒苯基吲哚(DAPI)儲(chǔ)存液，工作液濃度為1μg/ml，染色1分鐘，使用ddH₂O 洗3次，每次5分鐘；

10、封片：防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。觀察DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核表達(dá)藍(lán)色熒光和綠色熒光蛋白標(biāo)記的驢抗小鼠熒光二抗綠色熒光表達(dá)。