一種提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。一種大量提取造血前體干細(xì)胞的方法，包含以下步驟：(1)從胎盤中分離單個(gè)核細(xì)胞；(2)從單個(gè)核細(xì)胞中先分選出CD133+陽性細(xì)胞群，然后再?gòu)腃D133+陽性細(xì)胞群中分選出其中的CD133+CD34+細(xì)胞群，而流出的細(xì)胞群即為CD133+CD34-的造血前體干細(xì)胞。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在胎盤中含有比臍帶血濃度高10倍以上，含量高30倍以上的CD133+CD34-干細(xì)胞群，這種細(xì)胞群不但是造血干/祖細(xì)胞的起始細(xì)胞，具有長(zhǎng)期重建造血細(xì)胞的能力，是移植給宿主后可以長(zhǎng)期植活的干細(xì)胞，而且還具有較強(qiáng)的可塑性，在再生醫(yī)學(xué)和治療細(xì)胞損傷等疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】-種提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種大量提取造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用， 具體涉及一種從人體健康胎盤中大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在特定條件下可經(jīng)誘導(dǎo)分化為其它種類細(xì) 胞，人們期望將來用該種方法進(jìn)行組織修復(fù)，用于治療帕金森癥、糖尿病、老年性癡呆、也臟 病、脊髓損傷等。我們的專利"從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫的方 法"，專利號(hào)；ZL011311908,國(guó)際專利主分類號(hào)；C12N5/08中指出胎盤中含有豐富的造血干 細(xì)胞，因此可W代替異體骨髓來恢復(fù)重建患者的骨髓，換言之，即用它來置換骨髓。同時(shí)在 我們的另一篇專利中也提出了 "一種從剖腹產(chǎn)胎盤組織中提取原始間充質(zhì)和造血干/祖細(xì) 胞方法"（專利號(hào)：200610098886)。該種方法可W用來收集來自于胎盤組織的單個(gè)核細(xì)胞 去建立造血前體干細(xì)胞庫。應(yīng)用該些方法可W收集并長(zhǎng)期凍存現(xiàn)在廢棄的新生兒胎盤內(nèi)的 細(xì)胞，胎盤組織內(nèi)的造血干細(xì)胞，建立自體或異體的胎盤造血前體干細(xì)胞儲(chǔ)存庫，提供全國(guó) 乃至全世界患者選擇胎盤造血前體干細(xì)胞為細(xì)胞治療應(yīng)用。
[000引 CD34分子一直被認(rèn)為是服C/造血祖細(xì)胞她C)的表面標(biāo)記。血液界到目前為止 都W CD34+的HSC的含量作為移植能否成功的值標(biāo)。1997年有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物體內(nèi) 存在一群CD34-細(xì)胞也有重建造血的功能，表明CD34+是較為成熟的細(xì)胞，而CD34 -細(xì)胞是 更原始的服C。W后又有人提出表達(dá)CD133,不論是CD34陽性或陰性的服C/HPC移植到免 疫缺陷小鼠可W形成異位造血組織。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD133巧SC具有更強(qiáng)的促進(jìn)血管形成的作用。 廝血CD133+細(xì)胞群中不僅富含服C (實(shí)際上當(dāng)時(shí)沒有人認(rèn)識(shí)到廝帶血只含有少量的CD34-細(xì)胞，大部分是CD34+細(xì)胞），而且該一群細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖潛能和長(zhǎng)期造血重建功能，該 些提示CD133是比CD34更原始更幼稚的干細(xì)胞標(biāo)志。研究證實(shí)，處于G。期的CD133+細(xì)胞 較處于Gi期的CD133-細(xì)胞更易大量富集而被激活參與造血，其長(zhǎng)期造血功能優(yōu)于CD34+細(xì) 胞群。
[0004] 自從發(fā)現(xiàn)、純化、標(biāo)記抗CD34單克隆抗體開始，使流式細(xì)胞定量檢測(cè)在廝帶和胎 盤血或骨髓中的CD34陽性造血干細(xì)胞成為了可能。CD34抗原存在于各種祖細(xì)胞上，其中包 括多能干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。CD34抗原的分子量為105-120KD，具有一個(gè)高度糖基化的 類粘蛋白的結(jié)構(gòu)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，對(duì)全血進(jìn)行溶血來去除紅細(xì)胞，標(biāo)本中直接加入英 光標(biāo)記的CD34抗體進(jìn)行染色，然后用流式機(jī)進(jìn)行分析和計(jì)算。人CD34陽性細(xì)胞是造血干 細(xì)胞移植時(shí)的關(guān)鍵細(xì)胞，決定著移植成功與否的重要條件。目前，臨床上對(duì)是否能夠移植都 WCD34陽性細(xì)胞數(shù)量為唯一重要標(biāo)準(zhǔn)。人CD133抗原為5次跨膜糖蛋白，目前發(fā)現(xiàn)的同源 性抗原有CD133_1和CD133_2。其基因分別定位在人類的4號(hào)和2號(hào)染色體上。CD133首 先是作為造血干/祖細(xì)胞表面標(biāo)志物而被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為是比CD34更早期的表面抗原。利 用取自人類骨髓血經(jīng)增生后的CD133+，帶有該種標(biāo)記的細(xì)胞也稱為血管先驅(qū)細(xì)胞。細(xì)胞直 接注入也肌梗塞的大鼠也臟，有也肌細(xì)胞恢復(fù)的功能。從外周血中也可W分離出CD34+細(xì) 胞，在體外將其誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，植入動(dòng)物下肢缺血模型中局部形成新生血管。還可能 治療缺血性疾病如也肌梗死、動(dòng)脈硬化閉塞癥、糖尿病等，該些引起了人們的廣泛興趣。近 來發(fā)現(xiàn)CD133分子是服Cs (造血干細(xì)胞）特異性標(biāo)志。CD133是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的造血干細(xì)胞 表面標(biāo)志，在服Cs分化成熟過程中，CD133的含量迅速降低，而CD34抗原開始表達(dá)，當(dāng)向血 液細(xì)胞分化時(shí)，CD34抗原表達(dá)開始消失。
[0005] 上述大量的臨床實(shí)踐已證實(shí)，來自于骨髓、動(dòng)員周圍血及廝帶血中含有大量的造 血干/祖細(xì)胞，即CD34+細(xì)胞，該種細(xì)胞能夠重建受損傷的造血組織恢復(fù)造血功能。而該種 CD34+細(xì)胞來自于其更早期的細(xì)胞，即從CD133陽性細(xì)胞分化而來，而正是該種CD133+CD34+ 或CD33+CD34-細(xì)胞群移植給宿主后可W長(zhǎng)期植活。廝帶血中僅含有少量CD133+CD34-細(xì)胞， 該也造成廝帶血移植后，部分造血干細(xì)胞不易植活，或需要植活的時(shí)間長(zhǎng)的重要原因之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)廝帶血中不含有CD33+CD34-細(xì)胞，而胎盤血和胎盤組織富含該類 細(xì)胞，僅管骨髓也有該類細(xì)胞，但骨髓不能規(guī)模提取。本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述 不足，提供一種從胎盤大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供胎盤造血前體干細(xì)胞的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明的目的可通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明從胎盤血和胎盤組織中發(fā)現(xiàn)一種新型的干細(xì)胞群，命名為胎盤早期造血前 體干細(xì)胞：
[0010] (1)該種細(xì)胞群來自于去除廝帶血后殘留在胎盤內(nèi)的血液或是從胎盤組織中經(jīng)過 機(jī)械處理（沖洗、擠壓、碼磨），或酶消化（膜酶、膠原酶、木瓜酶）等獲得的單個(gè)核細(xì)胞。
[0011] (2)該種細(xì)胞群在流式細(xì)胞儀（FACS)的檢測(cè)中為CD133+CD34XDl(n-CD29-CD3r， 幾乎不存在于正常人周圍血和廝帶血中。
[001引 做造血前體干細(xì)胞為一群CD133+CD34-和CD133+CD34+的干細(xì)胞群，而 〔0133+〔034^為早期造血前體干細(xì)胞，該種干細(xì)胞存在于提取的胎盤干細(xì)胞內(nèi)，它可^通過 胎盤分離濃縮后于液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存。
[0013] (4)該種細(xì)胞群在干細(xì)胞集落培養(yǎng)試驗(yàn)中，其形成集落細(xì)胞（即每個(gè)細(xì)胞能擴(kuò)增 成50個(gè)細(xì)胞W上）遠(yuǎn)較CD133-CD34+細(xì)胞為晚，在培養(yǎng)后的24小時(shí)，后者即可形成大量 成堆的細(xì)胞群的集落，而早期造血前體干細(xì)胞細(xì)胞需96小時(shí)W上。CD133-CD34+細(xì)胞能 生成早期集落，但不易長(zhǎng)期生長(zhǎng)，而是CD33+細(xì)胞可W長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)，移植標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該W程度 CD133+的含量多少來預(yù)測(cè)移植物的植活效果
[0014] (5)該種細(xì)胞群可W和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子佑-CSF、GM-CSF、SCF等）或血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子（VEG巧等共同培養(yǎng)，該細(xì)胞群可貼壁生長(zhǎng)，具有明顯的遷移性，形成單層細(xì)胞，具有向 內(nèi)皮細(xì)胞分化的功能，即該類細(xì)胞可分化為CD133+的血管內(nèi)皮干/祖細(xì)胞。
[0015] (6)該類細(xì)胞在有干細(xì)胞刺激因子佑-CSF，EP0)的培養(yǎng)液中，具有大量增殖的功 能，可W擴(kuò)增到1000倍W上，其擴(kuò)增后的終未細(xì)胞主要為紅細(xì)胞系，巧PO的刺激下），但如 果和白細(xì)胞刺激因子共同培養(yǎng)，也可擴(kuò)增為大量的白細(xì)胞。
[0016] (7)該類細(xì)胞具有更大的可塑性，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，當(dāng)該類細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)W后， 加入組織細(xì)胞相應(yīng)的刺激因子，具有向肝臟細(xì)胞，骨細(xì)胞，也臟細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞等形成的能 力。
[0017] (8)在移植免疫免疫缺陷病小鼠動(dòng)物模型中，W同等劑量，用來自胎盤的早期造血 前體干細(xì)胞CD133+CD34-細(xì)胞群和CD133+CD34+細(xì)胞群注射給干細(xì)胞移植小鼠動(dòng)物，早期造 血干細(xì)胞具有長(zhǎng)期植活效能。
[0018] (9)早期造血前體干細(xì)胞的標(biāo)志為CD133+CD34-，而CD133分子量為120邸a,具有5 個(gè)跨膜區(qū)，它在體外培養(yǎng)中，可W形成各種紅細(xì)胞，（CFU-E)，白細(xì)胞（CFU-GM和CFU-GEMN) 集落群?？蒞采用MACS磁珠分選的方法，體外純化該種造血前體干細(xì)胞。
[0019] 一種大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法，優(yōu)選包含W下步驟：
[0020] (1)從胎盤組織或胎盤血中分離單個(gè)核細(xì)胞；
[0021] (2)從單個(gè)核細(xì)胞純化CD133陽性細(xì)胞中的早期造血前體干細(xì)胞。
[0022] 其中，所述的從胎盤中分離的單個(gè)核細(xì)胞優(yōu)選進(jìn)行濃縮后在進(jìn)行分選。
[0023] 步驟（2)從單個(gè)核細(xì)胞純化CD133陽性細(xì)胞中的早期造血前體干細(xì)胞優(yōu)選W下任 一方法，進(jìn)一步優(yōu)選W下的磁珠法。
[0024] (1)磁珠法，0)流式法，0)雙抗體法，（4)活體培養(yǎng)法
[00巧]磁珠法：采用帶抗CD133抗體的磁珠和來自胎盤的單個(gè)核細(xì)胞混合，賠育，然后通 過一個(gè)和磁珠相結(jié)合的分離柱，所有帶有CD133抗原的細(xì)胞都結(jié)合在柱子上，其它的細(xì)胞 均沖洗掉。然后改變酸堿度的緩沖液沖洗殘留在柱子內(nèi)的帶CD133抗原的細(xì)胞，該個(gè)細(xì)胞 群為所有CD133+的細(xì)胞，該種方法回收率在80% W上，純度可高達(dá)90%。把濃縮后的CD133 陽性細(xì)胞，再經(jīng)過含抗CD34抗體的磁珠，用同樣的方法分離，所有CD133+CD34-細(xì)胞先行洗 脫下來，殘留在柱子體內(nèi)的為CD133+CD34+細(xì)胞群。
[0026] 流式細(xì)胞儀分選法；采用流式細(xì)胞儀雙抗體帶各種英光標(biāo)記方法，可W從單個(gè)細(xì) 胞分選所需要的細(xì)胞，在此采用的是抗CD133抗原及抗CD34抗原的雙抗體，能夠從胎盤分 離和濃縮后的單個(gè)核細(xì)胞分選所需要的CD133+CD34-和CD133+CD34+的細(xì)胞群。
[0027] 雙抗體法：此時(shí)采用當(dāng)抗體和具有該抗原的細(xì)胞給合后，再加入抗第一抗體的第 二抗體，則可把該細(xì)胞從溶液中分流出來。該兒也是采用如鼠抗人CD133抗體，鼠抗人CD34 抗體，然后再加入羊抗鼠IgG的抗體，則可成功的把所需要的細(xì)胞分離出來。
[0028] 活體培養(yǎng)法；采用無免疫功能的小鼠，把大量從胎盤中分離，濃縮后的單個(gè)核細(xì)胞 輸注給小鼠，在一定的時(shí)間，如2,4周，從小鼠骨髓中提取干細(xì)胞，其內(nèi)含有大量人來源的 能維持長(zhǎng)期植活的造血干細(xì)胞，然后再結(jié)合著磁珠或流式分選法，分選出具有CD133+的細(xì) 胞。
[0029] 步驟（1)所述的從胎盤血和胎盤組織中分離單個(gè)核細(xì)胞的方法優(yōu)選：
[0030] (1)收集胎盤，向廝帶靜脈內(nèi)注入含有25到50毫升抗凝劑和抗生素的生理等滲溶 液或緩沖液，采用廝帶動(dòng)、靜脈灌注法收集胎盤血。
[0031] (2)采用有機(jī)溶劑及生理緩沖液清除胎盤組織和廝帶外表的透明質(zhì)粘液，采用機(jī) 械擠壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液；
[0032] (3)離也收集胎盤組織干細(xì)胞；將胎盤組織、羊膜和絨毛膜組織用生理鹽水洗涂 后剪碎，采用0. 25%的膜酶、0. 1-1 %的膠原酶II、0. 5% Dispense II酶，或加入0. 05到 0. 2%的邸TA,在37C溫箱內(nèi)賠育或攬拌30到60min，收集、過慮、離也獲得的細(xì)胞為胎盤單 個(gè)核細(xì)胞。
[0033] 其中，步驟（3)所述的過濾、離也的蓋體方法為：
[0034] 過濾；收集后的胎盤血和組織干細(xì)胞均通過各層尼龍或鋼絲濾網(wǎng)，最小的為 50um,最大的為100mm，收集單個(gè)核細(xì)胞；
[0035] 離也；將W上細(xì)胞收集到50毫升的離也管內(nèi)，在離也機(jī)中W l，500g離也10分鐘， 去掉70 %的液體，然后按照W下任一方法進(jìn)行處理：
[0036] (a)收集的細(xì)胞和淋己細(xì)胞分離液按1:4的比例混合，在離也機(jī)中W 2500g離也 30分鐘，去掉殘存紅細(xì)胞W及成熟的粒細(xì)胞，收集液面間的細(xì)胞，細(xì)胞用1640培養(yǎng)液洗二 次；
[0037] 化）將提取的含有胎盤組織或胎盤血干細(xì)胞溶液和6%高分子輕己基淀粉按1:3 到1:6比例混合，150化pm, 4°C離也5到20min，棄去紅細(xì)胞，保留上清液，然后用低分子右 旋糖?。ê}）將其洗涂H次，把所收集的細(xì)胞制成單個(gè)核細(xì)胞混息液。
[0038] 按照本發(fā)明所述的方法提取的胎盤CD133+CD34-早期造血前體干細(xì)胞在制備幫助 和促進(jìn)干細(xì)胞再生的藥物中的應(yīng)用。采用胎盤組織造血前體干細(xì)胞移植能夠幫助、加速干 細(xì)胞移植的存活。
[0039] 按照本發(fā)明所述的方法提取的胎盤早期CD133+CD34-造血前體干細(xì)胞在制備治療 腦積水、也腦血管疾病、肝壞死、肝硬化、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、肺纖維化（塵肺）自體免疫性病、 脊髓損傷性疾病、紅斑狼瘡、硬皮病、腎炎、性細(xì)胞功能障礙性疾病、先天性或后天性疾病的 藥物中的應(yīng)用。
[0040] 所述的也腦血管疾病優(yōu)選腦溢血，腦血栓、也肌梗塞、冠也病中的任意一種；所述 的糖尿病優(yōu)選重型糖尿病，或膜島素依賴性糖尿?。凰龅年P(guān)節(jié)炎優(yōu)選關(guān)節(jié)退化的骨關(guān)節(jié) 炎；所述的性細(xì)胞功能障礙性疾病優(yōu)選性冷淡或陽瘦；所述的先天性或后天性疾病優(yōu)選肌 肉服大癥、腦萎縮或老年性癡呆癥中的任意一種。
[0041] 在造血干細(xì)胞移植中，組織配型相符的前體造血干細(xì)胞可W和廝帶血、胎盤間充 質(zhì)干細(xì)胞、骨髓血、或動(dòng)員周圍血干細(xì)胞同時(shí)輸注給病人，加速造血干細(xì)胞的植活。
[0042] 當(dāng)應(yīng)用于臨床時(shí)，可W采用新鮮胎盤前體造血前體干細(xì)胞，也可采用冷凍保存，再 融化，再培養(yǎng)的前體造血前體干細(xì)胞。
[0043] 采用胎盤早期造血前體干細(xì)胞用于臨床時(shí)，可W不用或僅需要做HLA低分辨配 型，不會(huì)有排斥反應(yīng)，可W在病人體內(nèi)長(zhǎng)期存活，有長(zhǎng)期植活的功效。
[0044] 胎盤早期造血前體干細(xì)胞可W在體外培養(yǎng)后應(yīng)用于病人。每次應(yīng)用為IXIOVkg 至5X10 Vkg體重。
[0045] 所采用的胎盤早期造血前體干細(xì)胞可W制備成針劑，袋裝靜脈輸液袋，也可制備 成瓶裝輸液瓶。在病人臨床應(yīng)用時(shí)，由我公司直接制備成各種針、水劑，直接供病人應(yīng)用，也 可W冰凍袋在-8(TC的條件下，輸送到病人所在醫(yī)院應(yīng)用。如果是W冰凍袋或保存袋的形式 到醫(yī)院直接供病人應(yīng)用，需按照我公司的說明書，即用4C的生理鹽水，等滲葡萄糖液，DMEM 培養(yǎng)液或含高滲葡萄糖的PBS (磯酸鹽緩沖液）進(jìn)行稀釋，離也后才能應(yīng)用。
[004引發(fā)明詳述
[0047] 收集胎盤：把胎盤放于無菌盒子內(nèi)運(yùn)輸?shù)綗o菌間，向廝帶靜脈內(nèi)注入含有25?50 毫升抗凝劑和抗生素的溶液，該抗凝劑可W是肝素，或構(gòu)稼酸軸，抗生素是1 %的青霉素，鏈 霉素，慶大霉素，也可加制霉菌素，溶液可W是0. 9%的生理鹽水等滲磯酸緩沖液或DMEM細(xì) 胞培養(yǎng)液，然后用夾子夾住廝帶，豎起廝帶一分鐘（用手順著廝帶往胎盤處向下持，讓溶液 進(jìn)入胎盤。把整個(gè)胎盤無菌的放到無菌容器和采集箱。
[0048] 收集胎盤血；在無菌環(huán)境下，向廝帶靜脈內(nèi)注入含抗生素，如1%的青霉素，鏈霉 素，慶大霉素，也可加制霉菌素，溶液可W是0.9%的生理鹽水等滲磯酸緩沖液或DMEM細(xì)胞 培養(yǎng)液，然聯(lián)接廝帶動(dòng)脈，中間聯(lián)接生物粟，形成循環(huán)，時(shí)間在1到24小時(shí)，收集來自于胎盤 內(nèi)的血，命名為胎盤血，胎盤血內(nèi)的細(xì)胞為單個(gè)核細(xì)胞。
[0049] 清洗胎盤組織：當(dāng)胎盤進(jìn)入無菌環(huán)境后，采用有機(jī)溶劑及生理緩沖液清除胎盤組 織和廝帶外表的透明質(zhì)粘液和母血。采用1號(hào)消毒劑（酒精、氯化軸、磯酸氨二軸、磯酸二氨 軸和楓），該消毒劑內(nèi)，酒精濃度為50 %?75 % W及含有0. 1?0. 5 %的楓和0. 1到0. 25M 的磯酸緩沖液，抑為7. 2到7. 6之間，用于清洗胎盤及廝帶表面，殺滅任何可能存在胎盤 膜和廝帶表面上的微生物污染，清除胎盤組織和廝帶外表的透明質(zhì)粘液。采用2號(hào)有機(jī)溶 劑（在1號(hào)消毒劑的基礎(chǔ)上減去楓，該消毒劑內(nèi)，酒精濃度為50%?75%，含0. 1?0. 25M 磯酸緩沖液，抑為7. 2到7. 6之間）用于清洗胎盤及廝帶表面。3號(hào)消毒劑清潔液（酒精 和0. 9%氯化軸，其中，酒精濃度為50%?75%，氯化軸濃度為0. 9%，抑為7. 2到7. 6之 間）用于清洗胎盤及廝帶表面，也可W用磯酸緩沖液（pH7. 4)或低分子右旋糖酢或細(xì)胞培 養(yǎng)液（DMEM)清洗。采用機(jī)械擠壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液。 該緩沖液可W含有抗菌素，像青霉素（lOOU/ml)，鏈霉素（lOOg/ml)也可含有2500到10， 000單位的無防腐劑的肝素；該生理緩沖液的成分可W是生理鹽水，低分子右旋糖甘，磯酸 緩沖液（phosphate-buffered saline)或細(xì)胞培養(yǎng)液，像 1640，DMEM值U化ecco's modified Eagle' S medium)，其所含單個(gè)核的細(xì)胞稱為單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞總量在0. 3到10. 5X109間。
[0050] 收集胎盤組織單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞；采用輸液器（可W用注射器或輸液粟）從廝帶靜 脈或廝帶動(dòng)脈注入0. 25%膜酶（Tirpsion)，或0. 1-1 %膠原酶II (Collegenase)，或0. 5% Dispense II 酶，也可加入 0.05 到 0.2% 的巧thylene diamine tetra acetic acid) (邸TA)，在37°C溫箱內(nèi)賠育含有組織細(xì)胞分離酶的胎盤30分鐘到90分鐘，然后在廝帶靜脈 或廝帶動(dòng)脈內(nèi)灌注生理緩沖液沖洗，該生理緩沖液的成分可W是生理鹽水，低分子右旋糖 甘，磯酸緩沖液（phosphate-buffered saline)或細(xì)胞培養(yǎng)液，像1640, DMEM值U化ecco' S modifie祀agle'S medium),每沖洗一次，然后擠壓一次，收取含有W胎盤單個(gè)核細(xì)胞為主的 血液和組織液的混合液，沖洗，擠壓3到5次，時(shí)間在30到90分鐘之間，該樣收取的緩沖液 的混合物為含有胎盤單個(gè)核細(xì)胞，其體積在100到800毫升之間。該緩沖液可W含有抗菌 素，像青霉素（lOOU/ml)，鏈霉素（lOOg/ml)也可含有2500到10,000單位的無防腐劑的肝 素。該種用酶消化，攬拌，擠壓，洗涂等方法收集的細(xì)胞稱為胎盤組織單個(gè)核細(xì)胞。
[0051] 收集胎盤組織（膜）單個(gè)核細(xì)胞；從胎盤組織分離羊膜和絨毛膜組織，用生理鹽 水洗涂后剪碎，采用0. 25%的膜酶（Tirpsion)或0. 1-1 %的膠原酶II (Collegenase)，或 0.5% Dispense II 酶，或加入 0.05 到 0.2%的巧th}dene diamine tetra acetic acid) (邸TA)，在37度溫箱內(nèi)賠育或攬拌30到60分鐘，收集、過慮、離也獲得的細(xì)胞為胎盤組織 單個(gè)核細(xì)胞。（從膜或胎盤組織內(nèi)一起獲得的細(xì)胞統(tǒng)稱為胎盤組織單個(gè)核細(xì)胞）圖1可W 清楚的看到染色單個(gè)核細(xì)胞。
[0052] 收集到的胎盤單個(gè)核細(xì)胞均通過下述處理方法：
[0053] 1)收集的胎盤血或組織干細(xì)胞均通過各層尼龍或鋼絲濾網(wǎng)，最小的為50um，最大 的為100mm，收集單個(gè)核細(xì)胞。
[0054] 2)將來自于胎盤的細(xì)胞收集到50毫升的離也管內(nèi)，在離也機(jī)中W l，500g離也10 分鐘，去掉70%的液體。然后可有W下二種方法。
[0055] 2. 1)收集的細(xì)胞和淋己細(xì)胞分離液按1:4的比例混合。在離也機(jī)中W 2500g離 也30分鐘，去掉殘存紅細(xì)胞W及成熟的粒細(xì)胞，收集液面間的細(xì)胞，細(xì)胞用1640培養(yǎng)液洗 二次。
[0056] 2. 2)另一種方法是將提取的含有胎盤組織原始間充質(zhì)和造血干/祖細(xì)胞溶液和 6%高分子輕己基淀粉Ofespan,大于60,000道爾頓）按1:3到1:6比例混合，150化pm巧00 到1，OOOg), 4度離也5到20分鐘，棄去紅細(xì)胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酢（含 鹽）將其洗涂H次，把所收集的細(xì)胞為濃縮單個(gè)核細(xì)胞，將其制成單個(gè)核細(xì)胞混息液，并做 單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算CD34、CD4、CD8細(xì)胞含量及做體外培養(yǎng)的白細(xì)胞集落 (CFU-GM)，紅，白細(xì)胞集落（CFU-GEMM)和間充質(zhì)集落（CFU-F)。圖2為濃縮后的胎盤細(xì)胞， 染色的細(xì)胞為單個(gè)核細(xì)胞。
[0057] 將做完各種檢測(cè)，包括，病毒，細(xì)菌培養(yǎng)和組織配型的廝帶血（是采用廝帶血做 檢測(cè)而不是用于提?。?，胎盤血和胎盤組織干細(xì)胞按照上述方法分別制成單個(gè)核細(xì)胞，W IXlO 7到IXlO8Ail的濃度和DMSO (二甲亞諷）混合，且W 10 %的終濃度DMSO和低分子右旋 糖酢降溫到零下8(TC，然后轉(zhuǎn)移到液氮（-186C)液相中深低溫分別保存保存，W備移植時(shí) 應(yīng)用。
[005引提取胎盤造血前體干細(xì)胞；VlM'消枝術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞磁性可W分選CD34陽性和 CD133陽性的細(xì)胞金標(biāo)準(zhǔn)，有其強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)和廣泛的用途；從小量分選到大規(guī)模分選，從高 頻細(xì)胞到稀有亞群的細(xì)胞分選，可W高效的、可重復(fù)的及高質(zhì)量的細(xì)胞分離結(jié)果來自于胎 盤內(nèi)的干細(xì)胞群，可W實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的全自動(dòng)分選，而不需要專口的人員或技巧。細(xì)胞分選試劑 可W從各種物種和樣品中獲得幾乎所有類型的細(xì)胞，選柱用于快速分選被MACS磁珠標(biāo)記 的細(xì)胞，細(xì)胞即可被分選柱放大的磁場(chǎng)捕獲。溫和的分選環(huán)境，在保證細(xì)胞的回收率和純度 的同時(shí)，更保護(hù)了細(xì)胞表面抗原表位，因此，分選得到的細(xì)胞表位完好，細(xì)胞功能不受影響， 用于從抗凝處理的全血中快速進(jìn)行細(xì)胞的陰性分選，最多一次處理30血全血，無需密度梯 度離也等步驟，可W加速紅細(xì)胞的沉降，W便去除非目的細(xì)胞，即可方便地從上清液中獲得 目的細(xì)胞。先采用含抗CD133的磁珠抗體從胎盤干細(xì)胞中濃縮純化含CD133的細(xì)胞，再用 抗CD34磁珠抗體從含CD133的細(xì)胞群內(nèi)分離出CD133+CD34-的干細(xì)胞群，也稱為早期造血 前體干細(xì)胞，像圖2所示，采用磁珠純化后的細(xì)胞染色，著色細(xì)胞大，細(xì)胞核幾乎占據(jù)整個(gè) 細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)疏松。
[0059] 胎盤早期造血前體干細(xì)胞的培養(yǎng)；取塑料IOOcm2或75cm2的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，在培 養(yǎng)皿內(nèi)放到l-5ml的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液可用DMEM或2-Mebicm，或1640培養(yǎng)液，其中含有10% 的血清，該血清可W是胎盤血清（FB巧，也可W是無血清培養(yǎng)液，含有細(xì)胞刺激因子，像纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子，白細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，培養(yǎng)時(shí)間為每3天換液一次，此時(shí)，細(xì)胞經(jīng)過用培養(yǎng)液 清洗后，可W再次培養(yǎng)和再次保存，胎盤早期造血前體干細(xì)胞仍然保持原有的特性。
[0060] 對(duì)胎盤早期造血前體干細(xì)胞的檢測(cè)；胎盤自進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室或公司后，首先要做各種 病毒的推測(cè)，像己型肝炎表面抗體，丙型肝炎病毒抗體，艾滋病毒抗體，巨瞻細(xì)胞病毒抗體 W及梅毒抗體，只有在各種檢測(cè)為陰性時(shí)，才能進(jìn)行下一步的胎盤沖洗和清除殘留紅細(xì)胞 程序。在獲得胎盤造血前體干細(xì)胞后，首先要進(jìn)行胎盤霉菌培養(yǎng)，只有在各種培養(yǎng)陰性后， 提取的胎盤早期造血前體干細(xì)胞需進(jìn)行組織配型（HLA)的分子生物學(xué)低、高分辨檢測(cè)，HLA 一類抗原（A，B)和HLA二類抗原值時(shí)，所有資料將由電腦軟件和條形碼控制和管理。所有 培養(yǎng)后的胎盤造血前體干細(xì)胞需要流式細(xì)胞儀檢測(cè)。圖3,為采用磁珠分離后的胎盤造血 前體細(xì)胞流式檢測(cè)。該圖為磁珠抗CD133抗體純化后的細(xì)胞，可見有CD133和CD34雙陽性 的細(xì)胞，圖4為再次采用抗CD34磁珠抗體純化去除CD34陽性細(xì)胞，為CD133陽性的細(xì)胞群。 圖5為白細(xì)胞集落檢測(cè)（CFU-GM)和圖6為紅一白細(xì)胞集落檢測(cè)（CFU-GEMM)，每一堆細(xì)胞都 是來自于一個(gè)早期造血前體干細(xì)胞。
[0061] 胎盤造血前體干細(xì)胞的臨床適應(yīng)癥：縱上所述，胎盤造血前體干細(xì)胞的治療機(jī)理， 一是利用該干細(xì)胞的多能分化型，他可W在特定的環(huán)境下，分化成人體組織的各種細(xì)胞，像 神經(jīng)，皮膚，骨骼，軟骨，肌肉，肝臟，也臟，脂肪和膜島細(xì)胞，二是利用該細(xì)胞能分化各種細(xì) 胞趨化因子和細(xì)胞刺激因子來幫助受損細(xì)胞核組織修復(fù)和幫助受損細(xì)胞再生，據(jù)此該干細(xì) 胞在臨床上可用于下列疾病的治療：
[0062] 腦血管??；腦出血、腦血塞、老年癡呆等
[0063] 也血管?。阂布」Ｈ?、也絞痛、也肌病
[0064] 內(nèi)分化性疾?。惶悄虿?br> [0065] 消化性疾?。桓斡不?br> [0066] 呼吸系統(tǒng)疾?。悍斡不吻?br> [0067] 自體免疫性疾??；紅細(xì)胞疾病肺纖維化，紅斑狼瘡，硬皮病，腎小球腎炎
[0068] 免疫排斥性疾?。阂浦参锟顾拗鞑?br> [0069] 造血前體干細(xì)胞臨床使用方法；經(jīng)過培養(yǎng)收集后的胎盤造血前體干細(xì)胞在臨床使 用前，需要再次進(jìn)行下列檢測(cè)：
[0070] ①流式細(xì)胞儀分析；其早期造血前體干細(xì)胞中為CD133+和CD34-陰性細(xì)胞需占整 個(gè)細(xì)胞群體的70% W上。
[0071] ②培養(yǎng)胎盤造血前體干細(xì)胞的上清液需再次做細(xì)菌培養(yǎng)，必須確認(rèn)無任何微生物 生長(zhǎng)和外來動(dòng)物蛋白。
[0072] ③復(fù)查HLA配型，需用的胎盤造血前體干細(xì)胞其HLA低分辨中的I類和II類抗原 必須有4個(gè)W上任意和使用者的HLA配型相符。
[0073] ④檢測(cè)胎盤造血前體干細(xì)胞的活性，要求在需使用時(shí)，其活性要大于90% W上。
[0074] ⑥檢測(cè)胎盤造血前體干細(xì)胞的數(shù)量，要求再次給予病人的造血前體干細(xì)胞數(shù)要大 于1.0X 1〇5/公斤體重。
[00巧]輸注胎盤造血前體干細(xì)胞的輸液袋，要求是無菌，無毒，符合國(guó)家衛(wèi)生部要求，輸 液袋要有明顯的標(biāo)簽，XX胎盤造血前體干細(xì)胞的含量，活性和HLA配型W及生產(chǎn)廠家和生 產(chǎn)日期，失效日期等。
[0076] 該專利提供了一種采用胎盤造血前體干細(xì)胞用于免疫調(diào)節(jié)的方法，描述了如何生 產(chǎn)和培養(yǎng)、篩選有活性的胎盤造血前體干細(xì)胞。來自于胎盤的造血前體干細(xì)胞，在體外通過 培養(yǎng)和擴(kuò)增，至少具有下列細(xì)胞表面標(biāo)志；CD133+，W及不具有CD34, CD45。含有胎盤早期 造血前體干細(xì)胞的塑料輸液袋，該輸液袋為密封和無菌，中間有管道用于靜脈輸液。本專利 提供了一種從胎盤中提取，鑒定，培養(yǎng)，低溫保存和培養(yǎng)，擴(kuò)增，保存的胎盤早期造血前體干 細(xì)胞。
[0077] 胎盤造血前體干細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞分化和分泌體內(nèi)各種刺激因子的功能，可用 于治療各種慢性炎癥性疼痛，也血管疾病和肝硬化，糖尿病及自身免疫疾病。
[0078] 按照我們的方法，提取的胎盤早期造血前體干細(xì)胞都是活性大于90% W上。能 分泌巧tokines (化-1，alpla,比-1，beta, IFN-gamma, TFN,蛋白小分子激素（Hormones, an化Ogen,雌激素，膜島素，prolectin素，膠原蛋白等。至少1. 7X lOVkg，最好是2. 5X IO6/ kg造血前體干細(xì)胞可用于抗炎癥（anti-inflammation)的效果，可用于任何炎癥疾病，而 且該種炎癥可W表現(xiàn)在任何組織，任何器官，像肌肉，神經(jīng)，腦，脊髓，周圍神經(jīng)，血管組織， 也臟，膜島，腸，消化道，肝臟，肺，腎，生殖系統(tǒng)，內(nèi)皮和內(nèi)分泌系統(tǒng)，也可W用來治療自身 免疫疾病，尤其是伴有炎癥時(shí)，像糖尿病，amylotrophic lateral sclerosis, myasthenia fravis diabeticmeutropaathy, inpus,Alzheimer' s,Pakinson' s.sickle cell anemia, pompe' S diseases, pheny化etonuria(PKU)胎盤早期造血前體干細(xì)胞非常適合外傷W 后，細(xì)胞和組織的恢復(fù)，該些外傷包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病損傷，像腦出血，腦血 栓，脊髓或周圍神經(jīng)損傷，也肌損傷，像也肌梗塞，也肌缺血，肌肉或骨骼損傷（像肌肉或 初帶損傷），骨折，消化系統(tǒng)損傷，像肝硬化，肝炎，結(jié)腸炎，生殖系統(tǒng)損傷，像不育癥，泌尿 系統(tǒng)損傷，像腎小球腎炎，內(nèi)分泌系統(tǒng)損傷，像膜島素依賴型糖尿病，W及一切由于物理 原因的皮膚或黏膜損傷，像燒傷，核放射，凍傷等。該種早期造血前體干細(xì)胞也非常適合 于老年性細(xì)胞退行性變而引發(fā)的疾病，像老年性關(guān)節(jié)炎，阿莫而氏病ACS，帕金森綜合癥 (Parkinson' S)。
[0079] 本專利提出HLA相符的胎盤早期造血前體干細(xì)胞治療能夠大大增強(qiáng)維持干細(xì)胞 的療效，因而采用自體胎盤早期造血前體干細(xì)胞保存，不但能維持自體保存人的應(yīng)用，而且 可造福于整個(gè)家族，對(duì)于異體早期造血前體干細(xì)胞的應(yīng)用，也是要建立一個(gè)鹿大的異體早 期造血前體干細(xì)胞庫，并對(duì)自體保存每一例的早期造血前體干細(xì)胞HLA配型，在臨床使用 時(shí)，HLA有分子生物學(xué)低分辨4個(gè)W上位點(diǎn)相符（HLA:A，B，DR)胎盤早期造血前體干細(xì)胞在 使用前的保存溫度，如果是在冰凍時(shí)保存，應(yīng)該W干冰形式運(yùn)輸，也可W在小型液氮罐中， 如果是已經(jīng)在培養(yǎng)液中存活的細(xì)胞，則應(yīng)保存在4-l(TC。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，保存時(shí)間不一；在 液氮管中可W長(zhǎng)期保存，在干冰中可W保存18-21天，而在培養(yǎng)液內(nèi)為24-48小時(shí)。
[0080] 胎盤早期造血前體干細(xì)胞的使用劑量；應(yīng)用胎盤造血前體干細(xì)胞作為細(xì)胞治療， 必須要給病人高劑量的細(xì)胞才能發(fā)揮療效，小劑量的注射只能對(duì)病人有害，使病人發(fā)生免 疫反應(yīng)，產(chǎn)生過度應(yīng)激狀態(tài)，我們采用2倍W上的造血干細(xì)胞移植的劑量，如在造血干細(xì) 胞移植時(shí)應(yīng)用1 X IO9單個(gè)核細(xì)胞，如若是來自于骨髓血，則相當(dāng)于0. 1-0. 6X IO7造血干 細(xì)胞，而我們采用的胎盤造血前體干細(xì)胞的含量為1-10 X IO5/每體重公斤胎盤造血前體 干細(xì)胞的使用量，該些干細(xì)胞可W-次性注入，也可W間隔數(shù)天分多次注入。注射的部位 多通過周圍靜脈輸注，但根據(jù)病情，也可W局部應(yīng)用，像周圍靜脈注射，脊髓腔注射，腦部 注射，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射或也冠狀動(dòng)脈注射，也可在體內(nèi)任何組織或器官損傷部位注射含胎盤 造血前體干細(xì)胞的輸液袋。培養(yǎng)，擴(kuò)增后的胎盤早期造血前體干細(xì)胞保存在無菌輸液袋 中，該袋子的長(zhǎng)為18,寬為15,高為10,為一透明無毒無菌國(guó)家衛(wèi)生部口許可應(yīng)用與人類 靜脈輸注的輸液袋該袋子的外部標(biāo)有出廠單位，時(shí)間，袋內(nèi)胎盤造血前體干細(xì)胞的數(shù)量，活 性，名稱，保存溫度，保存時(shí)間W及血型和HLA配型。胎盤造血前體干細(xì)胞的輸液袋需裝 在一個(gè)不怕?lián)p壞的鉛盒中，W保證該輸液袋在運(yùn)輸過程中不會(huì)被損壞，該種鉛盒，長(zhǎng)19,寬 19,高12,打開鉛盒后可W放入輸液袋，然后蓋上鉛盒，盒的上方有一開口，可W觀察輸液 袋內(nèi)的情況。在該輸液袋內(nèi)除含有胎盤造血前體干細(xì)胞W外，還可含有細(xì)胞刺激因子，像 GM-CSF，紅細(xì)胞刺激因子巧PO),干細(xì)胞刺激因子（FIT)等，也可含有各種白介素刺激因子， 像比-2,比-4,比-6, CD401，IFN-alpha，TNF-alpha，IFN-beta-3,也可 W含有各種細(xì)胞組織 的干細(xì)胞刺激因子，像肝細(xì)胞刺激因子化巧atowte growth化Ctor),也肌細(xì)胞刺激因子 (cardiotropin-l)，血管緊張刺激因子 I，II ,III (angiotensin)，IFN-famma,內(nèi)皮細(xì)胞刺激 因子，巧piciermalf;row1:h factor),纖維細(xì)胞刺激因子化asic fibroblast growth factor), 也可W含有抗菌素，像10-100單位/ml的青霉素和10-100微克的鏈霉素。
[0081] 凍融和造血前體干細(xì)胞移植治療；當(dāng)臨床確認(rèn)需應(yīng)用某例胎盤干細(xì)胞時(shí)，在病人 床前從液氮內(nèi)取出干細(xì)胞，于37C電動(dòng)水浴箱內(nèi)融化，在血細(xì)胞幾乎即將凍融完畢時(shí)，加入 低分子右旋糖酢等量混合，按順序給病人輸注。
[0082] 根據(jù)病人的病情需要，可W分別凍融多種來源的干細(xì)胞，也可一次性的凍融多種 細(xì)胞聯(lián)合給病人應(yīng)用。對(duì)體重小于10公斤的病人可W只用一袋廝帶血，對(duì)體重大于10公 斤小于30公斤的病人可W用廝帶血和胎盤血干細(xì)胞，對(duì)體重大于30公斤W上的病人廝帶 血、胎盤血造血干細(xì)胞W及胎盤組織造血前體干細(xì)胞。
[0083] 本發(fā)明制備的胎盤組織早期造血前體干細(xì)胞一般W靜脈輸入為主，但也可W局 部直接進(jìn)入到骨髓組織內(nèi)，也可通過任何其它的途徑，像動(dòng)脈注入等方法輸注給病人。本 發(fā)明主要應(yīng)用的藥學(xué)成分或含有生理鹽水、低分子右旋糖酢、廝帶血漿、DMEM值U化ecco' S Modified Essential Medium)培養(yǎng)液、注射用水等。W上所用溶液均是無菌、無熱原制備W 及可用臨床移植的病人。
[0084] 有益效果：
[0085] 干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和向各種細(xì)胞分化潛能的原始細(xì)胞，是形成生命機(jī)體各組 織器官的起源細(xì)胞。人類個(gè)體的發(fā)育過程實(shí)際實(shí)質(zhì)就是干細(xì)胞的自我更新和增殖分化的過 程，而各個(gè)器官的細(xì)胞也是分別來源于各個(gè)器官的干細(xì)胞，像肝臟，神經(jīng)，腦組織，膜腺，皮 膚等。按干細(xì)胞的種類有：
[008引 1.胚胎干細(xì)胞
[0087] 胚胎干細(xì)胞是最原始，可分化程度最高的細(xì)胞，也是受精卵結(jié)合后形成胚胎的初 始階段，它可W分化成各種細(xì)胞，甚至可W采取核移植的方法，利用自體體細(xì)胞分化成各種 細(xì)胞。臨床應(yīng)用時(shí)必須破壞胚胎，讓其分化成其它細(xì)胞，由于細(xì)胞的高度分化性，易形成腫 瘤細(xì)胞，因而不可能用該類細(xì)胞提取任何造血干細(xì)胞。
[0088] 2轉(zhuǎn)基因多能干細(xì)胞
[0089] 轉(zhuǎn)基因多能干細(xì)胞，也稱為induced pluripotent stem cell (iP巧是由日本科學(xué) 家（獲得諾貝爾獎(jiǎng)）首先發(fā)現(xiàn)的自體成體細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)染后具有胚胎干細(xì)胞的功能，但最 大疑問就是轉(zhuǎn)染細(xì)胞也可W同時(shí)具有腫瘤細(xì)胞的可能性，要全面應(yīng)用于臨床，還需要大量 的科研和時(shí)間，因而不可能用該類細(xì)胞提取任何造血干細(xì)胞，它的主要用途還是用于組織 修復(fù)。
[0090] 3成體干細(xì)胞：
[0091] 成體干細(xì)胞是人出生W后，各器官還自行保留能再生的細(xì)胞。該種干細(xì)胞是越年 輕的機(jī)體，含量越豐富，可分化程度越高。1998年，在美國(guó)Wisconsin大學(xué)首先發(fā)現(xiàn)在成人 骨髓中也具有能分化成各種組織細(xì)胞的干細(xì)胞，隨后人們認(rèn)識(shí)到人體內(nèi)各種組織細(xì)胞都存 在著該種細(xì)胞，稱為成人干細(xì)胞（ASC細(xì)胞），它具有和胚胎干細(xì)胞同樣的功能。成體干細(xì)胞 可分為：
[0092] 3. 1成人骨髓干細(xì)胞：主要是含有能分化成人體血液細(xì)胞的干細(xì)胞，像白細(xì)胞，紅 細(xì)胞，血小板等。有人采用骨髓研究，MACS分選后CD133+細(xì)胞功能性研究表明，CD133+細(xì) 胞具有長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞（Long-term州hure-initiating cells,LTC-IC)和長(zhǎng)期重建造 血細(xì)胞（Long term r巧opulation cells, LTRC)的能力，為最原始的造血細(xì)胞，移植給宿主 后可W長(zhǎng)期植活。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)LTC-IC主要見于AC133+CD34+亞群，一小群CD1337 CD34-細(xì)胞也具有長(zhǎng)期增殖潛能。顯然，由于來源的困難，采用骨髓只能用于科研，不能用于 大規(guī)模提取。
[0093] 3. 2周圍血干細(xì)胞；正常人周圍血內(nèi)不含有或有很少量的干細(xì)胞，但是在應(yīng)用了 一種稱為白細(xì)胞刺激因子的藥物后，骨髓血中的干細(xì)胞可W釋放到周圍血中，所W也稱為 周圍動(dòng)員血干細(xì)胞，該類細(xì)胞W CD34+細(xì)胞為主，只含有少量的CD133+細(xì)胞，同骨髓一樣，由 于來源的困難，采用周圍血干細(xì)胞只能用于科研，不能用于大規(guī)模提取。
[0094] 3. 3廝帶血干細(xì)胞。是新生兒出生后，廝帶血中的干細(xì)胞，它含有豐富的造血干細(xì) 胞。由于來源方便，取材容易，所W對(duì)它的研究最為廣泛，所做的廝帶血CD34和CD133分選 研究發(fā)現(xiàn)同一份標(biāo)本的CD34+細(xì)胞擴(kuò)增潛能低于CD133+細(xì)胞。因此AC133分選可能優(yōu)于 CD34分選。但正如在我們表1中指出的那樣，廝帶血中含有豐富的CD133+CD34+細(xì)胞，但幾 乎不含有CD133+CD34 -細(xì)胞，而胎盤血正好相反，血中含有豐富的CD133+CD34-細(xì)胞，但僅含 有只占10%左右的CD133+CD34+細(xì)胞，因而，廝帶血的工作僅是造血前體干細(xì)胞，而不是早 期造血前體干細(xì)胞。那么，為何沒有人研究胎盤干細(xì)胞；該主要是：
[0095] 1)把廝帶血干細(xì)胞的科技帶到國(guó)內(nèi)是由本發(fā)明人在1996年首先在國(guó)內(nèi)開發(fā)的。
[0096] 2)發(fā)現(xiàn)胎盤血內(nèi)含有豐富的造血干細(xì)胞的國(guó)內(nèi)外第一篇論文也是本作者在2004 年首先發(fā)表。
[0097] 3)本作者在2005年申請(qǐng)了胎盤干細(xì)胞專利。
[0098] 4)更重要的是本作者掌握了如何無菌，保證細(xì)胞活性，是提取胎盤干細(xì)胞的關(guān)鍵， 而該正是本作者獲得成功，在該個(gè)基礎(chǔ)上，在此前，沒有任何人想到和發(fā)現(xiàn)廝帶血和胎盤血 在該方面有如此巨大的差異，我們發(fā)現(xiàn)了胎盤內(nèi)含有廝帶血中不含或很少量的早期造血前 體干細(xì)胞。
[0099] 表1 ;廝帶血和胎盤血組份的比較
[0100]

【權(quán)利要求】
1. 一種從人體健康胎盤中大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法，其特征為：所述的早 期造血前體干細(xì)胞為一群⑶133+⑶的細(xì)胞群，來源于去除臍帶血后殘留在胎盤內(nèi)的血 液或是從胎盤組織經(jīng)過機(jī)械處理或酶消化獲得的單個(gè)核細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀的檢測(cè)中為 ⑶133+CD34TD105TD29XD3r，幾乎不存在于正常人周圍血和臍帶血中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包含以下步驟： (1) 從胎盤血或胎盤組織中分離單個(gè)核細(xì)胞； (2) 從單個(gè)核細(xì)胞中先分選出CD133+陽性細(xì)胞群，然后再?gòu)腃D133+陽性細(xì)胞群中分選 出其中的⑶133+⑶34+細(xì)胞群，而流出的細(xì)胞群即為⑶133+CD34_的造血前體干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的從胎盤中分離的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行濃 縮后再進(jìn)行分選。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟（2)通過從濃縮后的胎盤單個(gè)核細(xì)胞 中采用MACS磁珠分選出CD133+CD341 勺早期造血前體干細(xì)胞，或者從濃縮后的胎盤單個(gè)核 細(xì)胞中采用任何抗CD34或抗CD133的抗體和生物反應(yīng)素結(jié)合，或者和第二抗體結(jié)合去分選 ⑶133+CD3C的早期造血前體干細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于采用MACS磁珠分選的方法，用抗CD133磁 珠單克隆抗體從單個(gè)核細(xì)胞中先分選出CD133+陽性細(xì)胞群，然后再?gòu)腃D133+陽性細(xì)胞群 中應(yīng)用抗CD34磁珠單克隆抗體分選出其中的CD133+CD34+細(xì)胞群，而流出的細(xì)胞群即為 ⑶133+CD3C的早期造血前體干細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的從胎盤血或胎盤組織中分離單個(gè)核 細(xì)胞的方法為： (1) 收集胎盤，向臍帶靜脈內(nèi)注入含有25?50毫升抗凝劑和抗生素的生理等滲溶液或 緩沖液；采用臍帶動(dòng)、靜脈灌洗法收集胎盤血；其中，所述的抗生素選自青霉素、鏈霉素或 制霉囷素； (2) 采用有機(jī)溶劑及生理緩沖液清除胎盤組織和臍帶外表的透明質(zhì)粘液，采用機(jī)械擠 壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液； (3) 離心收集胎盤組織干細(xì)胞：將胎盤組織、羊膜和絨毛膜組織用生理鹽水洗滌后剪 碎，采用0. 25%的胰酶、0. 1-1 %的膠原酶II、0. 5% Dispense II酶，或加入0. 05到0. 2% 的EDTA，在37°C溫箱內(nèi)孵育或攪拌30到90min，收集、過濾、離心獲得的細(xì)胞為胎盤組織干 細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟（3)所述的過濾、離心的具體方法為： 收集的胎盤血干細(xì)胞和胎盤組織干細(xì)胞均通過各層尼龍或鋼絲濾網(wǎng)，最小的為50um， 最大的為100mm，收集單個(gè)核細(xì)胞； 將來自于胎盤或胎盤血的單個(gè)核細(xì)胞收集到50毫升的離心管內(nèi)，在離心機(jī)中以 1，500g離心10分鐘，去掉70 %的液體，然后按照以下二種方法之一進(jìn)行處理： (a) 收集的細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分離液按1:4的比例混合，在離心機(jī)中以2500g離心30分 鐘，去掉殘存紅細(xì)胞以及成熟的粒細(xì)胞，收集液面間的細(xì)胞，細(xì)胞用1640培養(yǎng)液洗二次，得 到濃縮后的胎盤單個(gè)核細(xì)胞； (b) 將提取到的濃縮后的胎盤單個(gè)核細(xì)胞和6%高分子羥乙基淀粉按1:3到1:6比例 混合，1500rpm，4°C離心5到20min，棄去紅細(xì)胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酐（含 鹽）將其洗滌三次，把所收集的細(xì)胞制成單個(gè)核細(xì)胞混懸液。
8. 按照權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的方法提取的早期造血前體干細(xì)胞在制備幫助和 促進(jìn)干細(xì)胞再生的藥物中的應(yīng)用。
9. 按照權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的方法提取的期造血前體干細(xì)胞在制備治療腦積 水、心腦血管疾病、肝壞死、肝硬化、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、肺纖維化（塵肺）自體免疫性病、脊髓 損傷性疾病、紅斑狼瘡、硬皮病、腎炎、性細(xì)胞功能障礙性疾病、先天性或后天性疾病的藥物 中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心腦血管疾病為腦溢血，腦血栓、 心肌梗塞、冠心病中的任意一種；所述的糖尿病為重型糖尿病，或胰島素依賴性糖尿??；所 述的關(guān)節(jié)炎為關(guān)節(jié)退化的骨關(guān)節(jié)炎；所述的性細(xì)胞功能障礙性疾病為性冷淡或陽痿；所述 的先天性或后天性疾病選自肌肉肥大癥、腦萎縮或老年性癡呆癥中的任意一種。
【文檔編號(hào)】A61P15/10GK104357396SQ201410610588
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】周勝利, 鄭超 申請(qǐng)人:賽歐帕克（江蘇）干細(xì)胞生物工程有限公司