專利名稱：造血前體細胞保護劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種造血前體細胞保護劑及其用途。更具體地說，涉及一種以凝血酶致敏蛋白(Thrombospondin，簡稱TSP)或其活性片段為有效成分的造血前體細胞保護劑及其在治療抗腫瘤藥物誘發(fā)的血細胞減少癥和擴增造血干細胞、祖細胞中的應(yīng)用。
現(xiàn)在最常用的治療腫瘤的方法是化學(xué)療法，即，使用一些抗腫瘤藥物將異常增殖的腫瘤細胞殺死。由于抗腫瘤藥物在殺死腫瘤細胞的同時，對正常細胞特別是骨髓造血細胞也有殺傷作用，造成血細胞減少，而白細胞減少會使機體抵御外來感染的能力降低，紅細胞減少會造成貧血，血小板減少則可導(dǎo)致機體出血。目前治療化學(xué)療法導(dǎo)致的血細胞減少的主要方法包括輸血和輸血液成份、使用能促使血細胞增殖的因子如G-CSF、GM-CSF、EPO和TPO等。
已知造血多能干細胞在一定的條件下能向粒單細胞、紅細胞或巨核細胞的祖細胞分化，進一步增殖產(chǎn)生成熟的白細胞、紅細胞或巨核細胞，每個巨核細胞又能產(chǎn)生數(shù)千個有功能的血小板。
造血細胞的增殖和分化受許多因子的調(diào)節(jié)，這些因子包括白細胞介素3、6、11、13和SCF、GM-CSF、TPO、MPO以及EPO。它們單獨使用或合用能刺激一個系列或多個系列造血細胞的生長和分化。在正常情況下，造血干細胞和祖細胞主要存在于骨髓中，新生兒臍帶血和胚胎肝臟中含量也較豐富，人末梢血中含量較低。骨髓、臍帶血、胚胎肝臟以及末梢血都可用作造血干細胞的來源，但上述來源十分有限，而且，骨髓、臍帶血和末梢血中可采集的造血干祖細胞絕對數(shù)較低，不能滿足移植的需要。
已知TSP是血小板α顆粒的主要成份之一，在內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和一些腫瘤細胞中也有合成。TSP在細胞與基質(zhì)、細胞與細胞的相互作用中起重要作用，還能促使包括造血干細胞在內(nèi)的許多細胞粘附到基質(zhì)上。此外，TSP還有抗血管形成作用。TSP是由同源三聚體構(gòu)成的糖蛋白，分子量450Kd，含有幾個功能區(qū)域，其中最令人注意的是能與肝素結(jié)合的區(qū)域，這些區(qū)域能促使TSP結(jié)合在細胞表面的硫酸肝素糖聚蛋白(proteoglycans)上，有調(diào)節(jié)細胞的功能。
本發(fā)明的目的在于提供一種造血前體細胞保護劑及使用該保護劑治療抗腫瘤藥物誘發(fā)的血細胞減少癥以及體外擴增造血前體細胞的方法。
本發(fā)明所述的造血前體細胞保護劑是以凝血酶致敏蛋白(TSP)和/或其活性片段作為有效成分的。
上述凝血酶致敏蛋白及其活性片段可以是天然的、基因重組的或它們的混合物。
凝血酶致敏蛋白的活性片段的具體例子包括由凝血酶致敏蛋白N末端的第1至第174個氨基酸殘基組成的片段，簡稱TSP1-174。
上述造血前體細胞是指造血多能干細胞(stem cell)和各系列定向祖細胞(progenitor cells)，包括HPP-CFC(高增殖潛能集落形成細胞)、CFU-Mix或CFU-GEMM(混合集落形成單位)、CFU-MK(巨核細胞集落形成單位)、CFU-GM(粒單細胞集落形成單位)、BFU-E(紅細胞集落形成單位)等，其來源包括人臍帶血、骨髓、末梢血和胚肝。
本發(fā)明是以下述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的觀察到TSP和其含肝素結(jié)合區(qū)域的片段TSP1-174對造血多能干細胞(HPP-CFC和CFU-GEMM)和巨核細胞祖細胞(CFU-MK)生長有抑制作用，這種抑制作用是可逆性的，用TSP或其活性片段作用過的造血前體細胞經(jīng)洗滌后，可在新的細胞培養(yǎng)液中增殖分化。另外，TSP及其活性片段的抑制作用能完全被肝素中和。
利用TSP及其活性片段對造血前體細胞有可逆性作用這一特點，本發(fā)明者設(shè)想以TSP或其活性片段作為造血前體細胞保護劑預(yù)處理造血前體細胞，使處理后的細胞因其增殖一時性受抑，對隨后加入的抗腫瘤藥物的敏感性降低，從而不被抗腫瘤藥物殺死。由此設(shè)計的一系列實驗的結(jié)果完全證實了TSP和其活性片段能降低造血干、祖細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，保護它們免受抗腫瘤藥物的殺傷。
在本發(fā)明的一個實施例中，將TSP先注射入小鼠體內(nèi)，然后再注射抗腫瘤藥物。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)先注射過TSP的小鼠，其造血功能的恢復(fù)較對照組小鼠快。這些體內(nèi)結(jié)果與上述體外結(jié)果相符合，表明TSP確實對骨髓造血前體細胞有保護作用，可預(yù)防或緩解化學(xué)療法誘發(fā)的骨髓衰竭和血細胞減少癥。
在治療由抗腫瘤藥物誘發(fā)的血細胞減少癥時，本發(fā)明的造血前體細胞保護劑除可單獨使用外，還可以與其它能促進血細胞生長的藥物合用，產(chǎn)生相加或協(xié)同作用。所述促進血細胞生長的藥物也即造血細胞生長因子的例子包括白細胞介素3(IL3)、白細胞介素6(IL6)、白細胞介素11(IL11)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒單細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細胞因子(SCF)、血小板生成素(c-Mpl Ligand)、巨核細胞生成素(MPO)以及粘多糖等。
在本發(fā)明的另一實施例中，先注射TSP到小鼠體內(nèi)，然后注射抗腫瘤藥物，最后再注射細胞生長因子G-CSF。實驗結(jié)果表明，合用TSP和生長因子，其加速化療后造血功能恢復(fù)的作用優(yōu)于TSP或生長因子的單獨使用。
將TSP單獨地或與上述造血細胞生長因子聯(lián)合使用，能在體外擴增造血干細胞和祖細胞，特別是巨核細胞及其祖細胞。其基本方法是將骨髓或臍帶血細胞和作為營養(yǎng)源的供體血清與TSP單獨地或加生長因子共孵育若干時間，或先經(jīng)生長因子孵育，后加入TSP再孵育若干時間，促使早期干細胞向祖細胞分化繁殖，同時阻止祖細胞進入G2/M期進行分裂增殖，從而使造血干細胞和祖細胞的比例和絕對值大大增高，獲得大量的造血干細胞和祖細胞。通過使用不同的造血細胞生長因子，可定向擴增不同的造血干細胞和祖細胞以及巨核細胞和血小板。
CD 34＋細胞通常被公認為造血祖細胞，因為CD34抗原只在CFU-GEMM、CFU-MK、CFU-GM和BFU-E等造血祖細胞中表達。在本發(fā)明的又一實施例中，采用從人臍帶血分離出來的CD 34＋細胞作為研究對象，將TSP與CD34＋細胞共孵育3天，然后再加入抗腫瘤藥物孵育24小時。與對照組相比，TSP對人臍帶血CD 34＋細胞具有明顯的保護作用，表明TSP對小鼠的作用同樣適用于人體。
本發(fā)明的造血前體細胞保護劑可用于治療腫瘤和其它疾病的化學(xué)治療或放射治療誘發(fā)的血細胞減少，特別是血小板減少，還可促使大劑量化學(xué)療法的開展，促進腫瘤的治愈。本發(fā)明的造血前體細胞保護劑還可用作體外擴增造血干細胞試劑，從人臍帶血、骨髓或胚肝細胞中大量擴增造血干細胞和祖細胞，用于供者本人或其他人在患血細胞或血小板減少癥、各種骨髓移植適應(yīng)癥時輸注或移植等臨床治療使用，或冷凍保存，建立細胞庫待用。
本發(fā)明實施例中使用的TSP系按Dubernard和Legrand的方法(J.Lab.&Clin.Med.，118446-457，1991)分離得到。TSP1-174為用大腸桿菌(E.Coli)表達的基因重組蛋白質(zhì)，由以色列Biotech-nology General Ltd.提供。
下面通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。實施例1取Balb/c小鼠的骨髓細胞，用血漿凝塊法(Han等，Br.J.Haematol，811-5，1992和J.Lab.&Clin.Med.，123610-6，1994)，將細胞(2×105/培養(yǎng)皿)加入含2-巰基乙醇10％、氯化鈣10％、牛血清白蛋白10％、豬血清5％、牛血漿10％的α-培養(yǎng)液中，于37℃在CO2孵箱中培養(yǎng)，分析TSP單獨或與小分子量肝素(Fraxiparin)合用對不同的造血祖細胞生長的影響，結(jié)果見表1。從表1可以看出，TSP和TSP1-174對CFU-MK、CFU-GEMM以及HPP-CFC有抑制作用，這種作用可被小分子肝素完全中和。表1.凝血酶致敏蛋白(TSP)和其片斷TSP1-174單獨或與小分子量肝素合用對不同的小鼠造血祖細胞體外生長的影響
結(jié)果以每105個種植骨髓單個核細胞所獲集落的平均數(shù)±標準誤表示，數(shù)據(jù)來自三個以上的獨立實驗。
*表示經(jīng)t檢驗，與對照組比較，p＜0.05。實施例2取Balb/c小鼠骨髓單個核細胞，將部分細胞立即作血漿凝塊法和甲基纖維素法(即，將細胞(10％)加入含甲基纖維素20％、胎牛血清20％、生長因子10％的IMDM培養(yǎng)液中，于37℃在CO2孵箱中培養(yǎng))培養(yǎng)，分析祖細胞含量。以每毫升106個細胞的濃度將細胞加入含10％胎牛血清、1％再障豬血清(作為生長刺激因子的來源)、1％牛血清白蛋白和10-4M 2-巰基乙醇的培養(yǎng)液中，在37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中第一次孵育3天。實驗組細胞加TSP，對照組加等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)。孵育結(jié)束后，將細胞用培養(yǎng)液洗滌，取一部分作血漿凝塊法和甲基纖維素法培養(yǎng)，分析祖細胞含量。將另一部分細胞與5-氟尿嘧啶(0.30μg/ml)共孵育24小時，然后洗滌，培養(yǎng)分析祖細胞含量，具體結(jié)果見表2。
表2.凝血酶致敏蛋白(TSP)對骨髓造血干細胞的保護作用
表中各種祖細胞數(shù)為總數(shù)。其中CFU-GEMM、CFU-GM和BFU-E采用甲基纖維素培養(yǎng)方法分析，CFU-MK則采用血漿凝塊法分析。*表示與PBS再孵育一天組比較，p＜0.01。從表2可以看出，TSP對造血細胞的抑制作用是可逆性的，TSP孵育后的細胞經(jīng)洗滌后仍可繼續(xù)生長，經(jīng)TSP預(yù)處理的細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性減低。這些結(jié)果表明，TSP能保護造血干細胞不受化療藥物損傷，因此，可用于腫瘤化療期間的骨髓保護。實施例3取8周齡Balb/c小鼠12只，分成二組，每組6只。在一組小鼠腹腔注射TSP，劑量為每只5微克，每小時一次，連續(xù)注射2次；將另一組小鼠作為對照，腹腔注射等體積PBS，注射次數(shù)和時間與實驗組的相同。第二次注射后20小時，對所有小鼠注射一次5-氟尿嘧啶(5-FU)，劑量為150毫克/公斤體重。5-氟尿嘧啶注射后第8天，對所有小鼠從眼眶靜脈取血約0.4毫升，作血象分析，然后取其股骨，采集骨髓細胞，培養(yǎng)分析造血祖細胞含量(Han等，C.R.Acad Sci.Paris 313553，1991)。
表3是三次實驗的平均數(shù)據(jù)。從中可以看出，經(jīng)TSP預(yù)處理的小鼠骨髓中的CFU-GEMM、CFU-MK、CFU-GM、單個巨核細胞數(shù)和末梢血中的血小板、白細胞數(shù)均比對照組高，說明TSP有保護造血細胞不被抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶殺傷、加速造血功能恢復(fù)的作用。
表3.TSP對5-FU處理小鼠骨髓造血前體細胞和末梢血細胞的體內(nèi)保護作用HPP-CFC CFU-GEMM CFU-GMCFU-MK 巨核細胞 白細胞 血小板/股骨 ×103/股骨 ×109/L ×109/L對照組10±25±210±24.5±130±47±21050±305-FU組203±16 9±24±1 9.6±146±43±1750±25TSP＋5-FU 462±24*14±2△ 12±2*16±2*65±5*5±1△ 980±20△表中數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。HPP-CFC、CFU-MK和巨核細胞是用血漿凝塊培養(yǎng)法分析。CFU-GEMM和CFU-GM是用甲基纖維素培養(yǎng)法分析。
末梢血白細胞和血小板數(shù)是用自動血細胞計數(shù)儀(Coulter T890型)測定。
*和△分別表示與5-FU組比較，經(jīng)t檢驗，p＜0.01和p＜0.05。實施例4取8周齡Balb/c小鼠20只，分成4組，每組5只。除G-CSF外，按與實施例3相同的注射劑量和時間，1)在TSP組小鼠腹腔注射二次TSP后，再注射一次5-FU；2)在與TSP組相同的時間，先在G-CSF組小鼠腹腔注射二次PBS，再注射一次5-FU，注射5-FU 24小時后，再注射G-CSF，每天一次，每次每鼠5微克，共注射5天；3)對TSP和G-CSF組小鼠，與TSP組同樣，先注射二次TSP，再注射一次5-FU，在注射5-FU 24小時后，與G-CSF組同樣，注射G-CSF5天；4)與G-CSF組同樣，在5-FU組小鼠腹腔，先注射二次PBS，再注射一次5-FU。在5-FU注射后第6天和第8天，按與實施例3相同的方法，對所有小鼠采集末梢血，作血象分析；采集股骨，取骨髓細胞作造血前體細胞分析。表4為一次實驗的數(shù)據(jù)，從中可以看出，TSP與G-CSF合用，有相加或協(xié)同作用，能明顯加速化療后造血功能的恢復(fù)。表4.TSP和G-CSF體內(nèi)合用對5-FU處理小鼠造血系統(tǒng)的影響HPP-CFC CFU-GEMM CFU-GM CFU-MK 巨核細胞 白細胞 血小板/股骨 ×103/股骨×109/L×109/L第6天5-FU組 320±16 12±3 2±1 3±121±3 2±1220±25TSP組460±22*22±3*6±2△ 7±2*40±5*4±1△ 320±30△G-CSF組 280±30 8±2 7±2△ 2±123±4 5±2△ 250±40TSP加G-CSF組 450±40*21±4*8±2*6±2*46±6*7±2*460±30*第8天5-FU組 194±22 10±2 8±2 10±2 40±5 3±1720±46TSP組436±30*18±2*19±3*17±3*64±4△ 5±2△ 990±30△G-CSF組 201±24 12±2 20±3*9±238±3 7±2△ 760±40TSP加G-CSF組 440±22*22±2*22±4*21±3*56±5△ 9±3*1100±40*表中數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示，測定方法與實施例3相同。實施例5將按免疫磁珠法(Xi等，Br.J.Haematol，90921-922，1995)分離得到的CD34＋細胞分成等量二管，每管2×104細胞，細胞濃度為104/500微升。在其中一管內(nèi)加TSP，使其最終濃度為5μg/ml，在另一管內(nèi)加等體積PBS作為對照。將細胞與TSP在37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育3天。孵育結(jié)束后，用培養(yǎng)液洗滌細胞，再加入5-氟尿嘧啶(0.3μg/ml)，共孵育24小時。然后洗滌，用甲基纖維素法和血漿凝塊法培養(yǎng)分析祖細胞含量，具體結(jié)果見表5。表5.凝血酶致敏蛋白(TSP)對人臍帶血CD34＋細胞的保護作用CFU-GEMM CFU-GMCFU-MKPBS＋5-FU組242±12 450±22 335±12TSP＋5-FU組427±18*640±17*742±24*本實驗共做三次，表中結(jié)果為總的細胞數(shù)。其中，CFU-GEMM和CFU-GM是用甲基纖維素法分析，CFU-MK是用血漿凝塊法分析。
*表示與PBS＋5-FU組比較，p＜0.05。
上述具體實施例的描述揭示了本發(fā)明的一般性質(zhì)，從而使本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)用目前的知識，為了各和應(yīng)用，能容易地修飾和/或改動這些具體實施例，代之以其它形式的實施例而不背離本發(fā)明的基本構(gòu)思和內(nèi)涵。這些改動和修飾因此應(yīng)屬于這些公開例子的等價事例的范圍。應(yīng)理解，此處所采用的措辭和術(shù)語是為了便于描述而不起限制作用。
權(quán)利要求
1.一種造血前體細胞保護劑，其特征在于，以凝血酶致敏蛋白和/或其活性片段為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的保護劑，其特征在于，所述活性片段至少含凝血酶致敏蛋白N-末端第1至第174個氨基酸殘基。
3.如權(quán)利要求2所述的保護劑，其特征在于，所述活性片段由凝血酶致敏蛋白N-末端第1至174個氨基酸殘基組成。
4.如權(quán)利要求1所述的保護劑在體外擴增造血前體細胞中的應(yīng)用，其特征在于，將所述保護劑與造血前體細胞共孵育。
5.如權(quán)利要求1所述的保護劑在體外擴增造血前體細胞中的應(yīng)用，其特征在于，將所述保護劑和造血細胞生長因子與造血前體細胞共孵育。
6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述造血前體細胞為造血多能干細胞和/或各系列定向祖細胞。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述造血多能干細胞和/或各系列定向祖細胞包括高增殖潛能集落形成細胞、混合集落形成單位、巨核細胞集形成單位、粒單細胞集落形成單位和紅細胞集落形成單位。
8.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述造血前體細胞為來自人臍帶血或骨髓、末梢血和胚肝的造血前體細胞。
9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述造血細胞生長因子為選自白細胞介素3、白細胞介素6、白細胞介素11、粒單細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、血小板生成素、巨核細胞生成素以及粘多糖中的一種或多種。
全文摘要
一種以凝血酶致敏蛋白(TSP)或其活性片段為有效成分的造血前體細胞保護劑?？勺鳛橹委熆鼓[瘤藥物誘發(fā)的血細胞減少癥。單獨地使用或與細胞生長因子合用，能體外或EX VIVO擴增造血干細胞和祖細胞。
文檔編號A61K38/36GK1151322SQ95121410
公開日1997年6月11日 申請日期1995年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月8日
發(fā)明者韓忠朝 申請人:上海貝特生物技術(shù)有限公司