專利名稱：：亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基。技術(shù)背景隨著我國(guó)亞麻花藥培養(yǎng)研究的不斷進(jìn)展，花藥培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用于亞麻抗性育種領(lǐng)域。利用單倍體細(xì)胞繼代培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的高頻率變異，可在細(xì)胞水平上篩選各類(lèi)型突變體。由于產(chǎn)生突變的單倍體，只有一套染色體，所以不產(chǎn)生嵌合體，顯性和隱性的突變形狀同時(shí)表達(dá)，而且突變形狀穩(wěn)定，可加快抗性育種進(jìn)程。目前,細(xì)胞懸浮培養(yǎng)已在抗性細(xì)胞篩選中廣泛應(yīng)用，通過(guò)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可以得到單細(xì)胞群體，在誘變劑和選擇劑作用時(shí)比較均勻，不易產(chǎn)生嵌合體。G.Melchers(1959)在金魚(yú)草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中得到了溫度突變體.Zenk(1974)從單倍體煙草的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物篩選出抗2.4—D的細(xì)胞系。在亞麻抗性突變體篩選研究中多采用愈傷組織為篩選材料，由于愈傷組織在突變體篩選過(guò)程中，并非所有的細(xì)胞都能與培養(yǎng)基直接接觸，從而使細(xì)胞不能均勻地受到選擇壓力的作用，不利于突變體的篩選。N6、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中亞麻花粉愈傷組織分散性不好，雖然細(xì)胞增殖速度較快，但獲得的單細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞團(tuán)的比重較大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有在亞麻抗性突變體篩選中多采用愈傷組織為篩選材料，由于愈傷組織在突變體篩選過(guò)程中，由于細(xì)胞不能全部與培養(yǎng)基直接接觸，從而使細(xì)胞不能均勻地受到選擇壓力的作用，不利于突變體的篩選；N6、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中花粉愈傷組織的分散性不好，雖然細(xì)胞增殖速度較快，.但獲得的單細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞團(tuán)的比重較大的問(wèn)題，提供了一種亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基，解決該問(wèn)題的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基(YHX)由1/2N6大量元素、B/微量元素、維生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶劑合成，其每升培養(yǎng)基中按重量由1/2N6大量元素2186:1mg、Bs微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素120mg、鹽酸吡哆素110mg、脯氨酸100300mg、谷氨酰胺100500mg、活性炭1050mg、2.4—Dl.0mg、6—BAO,1mg、蔗糖2040g和余量為蒸餾水合成；合成后培養(yǎng)基的PH值為5.56.0。1/2Ne大量元素成分按重量由硝酸鉀1415mg、硫酸銨231mg、硫酸鎂92mg、氯化鈣83mg、磷酸二氫鉀200mg、硫酸亞鐵27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg和肌醇100mg構(gòu)成。B5微量元素成分按重量由硫酸錳10mg、硼酸3mg、碘化鉀0.75mg、硫酸鋅2mg、硫酸銅0.025mg和氯化鈷0.025mg構(gòu)成。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了1050mg/L的活性炭，不僅可以促進(jìn)單倍體細(xì)胞的發(fā)育，而且可以清除細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的毒副作用物質(zhì)。將亞麻花粉愈傷組織轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基(YHX)中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，與其它培養(yǎng)基相比，不僅分散性好，而且獲得的單細(xì)胞較多，懸浮培養(yǎng)3天，細(xì)胞開(kāi)始分裂，最終獲得的單倍體胚性細(xì)胞色澤鮮黃、細(xì)胞分裂旺盛、分散性好和細(xì)胞團(tuán)的比重??；本發(fā)明能大幅度提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，經(jīng)再生的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，成小球狀，表面有小顆粒結(jié)構(gòu)。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式由1/2N6大量元素、Bs微量元素、維生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶劑合成，其每升培養(yǎng)基中的濃度按重量由1/2Ne大量元素2186.1mg、Bf微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素120mg、鹽酸吡哆素l10mg、脯氨酸100300mg、谷氨酰胺100500mg、活性炭1050mg、2.4—D1.0mg、6—BA0.1mg、蔗糖2040g和余量為蒸餾水合成；合成后培養(yǎng)基的PH值為5.56.0。亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基是建立單倍體細(xì)胞懸浮系的關(guān)鍵因子。具體實(shí)施方式二:本實(shí)施方式的1/2N6大量元素成分按重量由硝酸鉀1415mg、硫酸銨231mg、硫酸鎂92mg、氯化鈣83tng、磷酸二氫鉀200mg、硫酸亞鐵27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg和肌醇100mg構(gòu)成；Bs微量元素成分按重量由硫酸錳10mg、硼酸3mg、碘化鉀0.75mg、硫酸鋅2mg、硫酸銅0.025mg和氯化鈷0.025mg構(gòu)成。具體實(shí)施方式三本實(shí)施方式的與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)在于活性炭的添加量為每升培養(yǎng)基30mg。其它于具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式四本實(shí)施方式選擇繼代培養(yǎng)1個(gè)半月左右的色澤嫩綠、有小顆粒組成的結(jié)構(gòu)緊密的花粉愈傷組織分別接種到培養(yǎng)基YHX、N6、B5、MS中，每25ml液體培養(yǎng)基中接入35g愈傷組織，放入振蕩培養(yǎng)箱中150次/min，溫度為25°C、在黑暗條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)510天，對(duì)獲得的細(xì)胞懸浮液，通過(guò)單層無(wú)菌紗布過(guò)濾后，再經(jīng)離心機(jī)在500rpm/min的條件下收集小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞。接入到Y(jié)HX中的花粉愈傷組織分散性好、細(xì)胞分裂速度快，獲得的單細(xì)胞較多。而接入到Ne、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中的花粉愈傷組織分散性不好，雖然細(xì)胞增殖速度較快；但獲得的單細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞團(tuán)的比重較大。將從YHX、N6、B5、MS懸浮培養(yǎng)基中收集的小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入到淺層液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，5天后，轉(zhuǎn)入固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。15天后，統(tǒng)計(jì)亞麻單倍體胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。淺層液體培養(yǎng)基1/2N6+0.5mg/L2.4—D。固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基丄/2N6+2.4—D1.5mg/L+6—BA0.5mg/L表l不同培養(yǎng)基中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明亞麻單倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基(YHX)胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)率較高，經(jīng)再生的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，成小球狀，表面有小顆粒結(jié)構(gòu)。權(quán)利要求1、亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于它由1/2N6大量元素、B5微量元素、維生素、氨基酸、植物激素、添加活性炭、蔗糖和溶劑合成，其每升培養(yǎng)基中按重量由1/2N6大量元素2186.1mg、B5微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素1～20mg、鹽酸吡哆素1～10mg、脯氨酸100～300mg、谷氨酰胺100～500mg、活性炭10～50mg、2.4—D1.0mg、6—BA0.1mg、蔗糖20～40g和余量為蒸餾水合成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于1/2Ns大量元素成分按重量由硝酸鉀1415mg、硫酸銨231mg、硫酸鎂92mg、氯化鈣83mg、磷酸二氫鉀200mg、硫酸亞鐵27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉37.3mg和肌醇100mg構(gòu)成。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于B5微量元素成分按重量由硫酸錳10mg、硼酸3mg、碘化鉀0.75mg、硫酸鋅2mg、硫酸銅O.025mg和氯化鈷0.025mg構(gòu)成。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于活性炭的添加量為每升培養(yǎng)基30mg。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻單涪體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的PH值為5.56.0。全文摘要亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基，它涉及亞麻單倍體細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基。它解決了N₆、B₅、MS懸浮培養(yǎng)基中的花粉愈傷組織分散性不好、單細(xì)胞數(shù)量少和細(xì)胞團(tuán)的比重大的問(wèn)題。本發(fā)明在其每升培養(yǎng)基中的濃度按重量由1/2N₆大量元素2186.1mg、B₅微量元素15.8mg、鹽酸硫胺素1～20mg、鹽酸吡哆素1～10mg、脯氨酸100～300mg、谷氨酰胺100～500mg、活性炭10～50mg、2.4-D1.0mg、6-BA0.1mg、蔗糖20～40g和余量為水合成；合成后培養(yǎng)基的pH值為5.5～6.0。本發(fā)明獲得的單倍體胚性細(xì)胞色澤鮮黃、細(xì)胞分裂旺盛、分散性好和細(xì)胞團(tuán)的比重小；能大幅度提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，經(jīng)再生的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，成小球狀，表面有小顆粒結(jié)構(gòu)。文檔編號(hào)C12N5/04GK101531990SQ200910071778公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者宋淑敏申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院亞麻綜合利用研究所