專利名稱：產(chǎn)生單倍體和雙單倍體植物胚的方法
產(chǎn)生單倍體和雙單倍體植物胚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生單倍體和雙單倍體植物胚的新方法。本發(fā)明進一步涉 及如此獲得的植物胚和涉及由其再生的植物，以及涉及這些植物的子代、 細胞、組織和種子。
自從Guha & Maheshwari ( 〃由re 204: 497 )于1964發(fā)現(xiàn)植物可以 從單倍體孢子產(chǎn)生，已經(jīng)進行了許多研究以獲得類似的關(guān)于其他物種的知 識(參見，例如"In vitro Haploid production in Higher plants" Vol. 1， 2， 3， 4, 5， Eds: S. Jain, S. Sopory和R. Veilleux (1996) Ki羅r Academic Publishers)。
在現(xiàn)代化的當(dāng)代植物育種中，雙單倍體(doubled haploids， DHs ) 的使用已經(jīng)成為一種十分有價值的工具以便加速遺傳上純的品系的產(chǎn)生以 及評價和監(jiān)控困難的性狀，例如由多個基因/等位基因編碼的那些性狀。
知的(參見例如Thomas W.等人(2003)， Doubled haploid production in crop plants. A Manual. Eds. M. Maluszynski， K. Kasha, B. Forster 和I. Szarejko. Kluwer Academic Publishers, pp 337-349 )。 一般地， 雙單倍體可以從來自雄性器官的孢子獲得。在這種情形中，所述孢子稱為
"小孢子"，并且所述體外培養(yǎng)稱為"小孢子培養(yǎng)"。雙單倍體也可以從 雌性器官或"大孢子"獲得。相應(yīng)的體外培養(yǎng)通常稱為"雌核發(fā)育"。
很長時間來，在蕓莒屬(Ara^ica)中完善建立了典型的小孢子培養(yǎng) (參見例如Keller等人，(1984) K. Giles, S. Sen (eds.)， Plant Cell Cul ture in Crop Improvement pp 169-183. Plenum Pub. Corp., New York )。 典型的雌核發(fā)育培養(yǎng)對于甜菜來說是已知的(參見例如Hosemans D.和 Bossoutrot， Z. Pflanzenziichtg. 91:74-77 (1983))。此外，在黃瓜中， 雌核發(fā)育是十分完善建立的技術(shù)(參見EP 0 374 755 )。
獲得雌核發(fā)育的方法基于利用經(jīng)輻射的花粉通過孤雌生殖來誘導(dǎo)卵
細胞的胚胎發(fā)生。已經(jīng)公開了關(guān)于甜瓜的一個眾所周知的實例，并且其目
前在數(shù)個育種公司中常規(guī)應(yīng)用(參見Sauton A和R. Dumas de Vaulx， j^r^咖/e 7:141-148 (1987))。在孤雌生殖中，新的植林從未受精的卵 發(fā)育而來。這種技術(shù)的成功率低。
盡管有大量可利用的技術(shù)并且有超過30年的研究經(jīng)驗，許多技術(shù)的 成功局限于易受影響的(amenable)基因型。這意味著，使用DH的巨大好 處還不能盡其最大程度利用。除了某些基因型的響應(yīng)度不同外，幾種作物 物種例如番茄和棉花仍然不能用于誘導(dǎo)DH。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于產(chǎn)生單倍體或雙單倍體植物胚的新方法。
在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可通過用含有細胞分裂誘 導(dǎo)分子的花粉或小孢子對印細胞進行授粉來誘導(dǎo)其經(jīng)歷胚胎發(fā)生。然后引 發(fā)該卵細胞形成胚而無需受精。由于所述花粉沒有實際使卵細胞受精，所 以沒有形成二倍體合子并且得到的胚保持單倍性。在細胞分裂期間于授粉 后的某一階段，可以發(fā)生自發(fā)的染色體加倍，導(dǎo)致形成胚，其為部分或完 全的DH。染色體加倍也可以例如通過已知的化學(xué)手段如秋水仙素來誘導(dǎo)。
因而，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生單倍體植物胚的方法，所述方法包括以下
步驟
a) 提供包含細胞分裂誘導(dǎo)分子的小孢子或花粉；
b) 對植物的胚嚢細胞特別是卵細胞進行授粉，所述植物的單倍體胚 待用所述小孢子或花粉來產(chǎn)生；
c) 讓所述小孢子或花粉將所述細胞分裂誘導(dǎo)分子釋放在胚嚢細胞特 別是卵細胞中或其附近，以引發(fā)其分裂從而獲得單倍體植物胚。
在一個備選的實施方案中，本發(fā)涉及用于產(chǎn)生雙單倍體植物胚的方 法，所述方法包括以下步驟
a) 提供包含細胞分裂誘導(dǎo)分子的小孢子或花粉；
b) 對植物的胚嚢細胞特別是卵細胞進行授粉，所述植物的雙單倍體 胚待用所述小孢子或花粉來產(chǎn)生；
c) 讓所述小孢子或花粉將所述細胞分裂誘導(dǎo)分子釋放在胚嚢細胞特
6別是卵細胞中或其附近，以引發(fā)其分裂從而獲得單倍體植物胚，
其中在授粉后的某一階段，特別是在細胞分裂過程中或在獲得所述胚 后，發(fā)生染色體數(shù)目的加倍。
因而，本發(fā)明涉及花粉或小孢子作為載體來在胚嚢細胞或卵細胞中引 發(fā)細胞分裂的用途。
在第一個實施方案中，所述細胞分裂誘導(dǎo)分子瞬時地在花粉中表達， 例如從存在于質(zhì)粒上的核酸表達。所述細胞分裂誘導(dǎo)分子(其可以是核酸 或蛋白質(zhì))通過從所述質(zhì)粒的組成型表達而在花粉或小孢子中產(chǎn)生。在授 粉后，如此產(chǎn)生的細胞分裂誘導(dǎo)分子被釋放入卵細胞中。
在第二個實施方案中，所述細胞分裂誘導(dǎo)分子從穩(wěn)定地整合入花粉基
因組中的核酸表達。所述細胞分裂誘導(dǎo)分子(其可以是核酸或蛋白質(zhì))通 過組成型表達而在花粉或小孢子中產(chǎn)生。在授粉后，如此產(chǎn)生的細胞分裂 誘導(dǎo)分子被釋放入胚嚢細胞或卵細胞中。
在第三個實施方案中，所述細胞分裂誘導(dǎo)分子通過從處于胚嚢細胞或
述核酸借助于用含有該核酸的花粉或小孢子進行授粉而被引入胚嚢細胞或 卵細胞中。在所述胚嚢細胞或卵細胞中，開啟所述組織特異性啟動子，因 而導(dǎo)致產(chǎn)生細胞分裂誘導(dǎo)分子。
在第四個實施方案中，花粉或小孢子不是直接轉(zhuǎn)化的，而是在轉(zhuǎn)基因 植物上形成，所述轉(zhuǎn)基因植物攜帶編碼所述細胞分裂誘導(dǎo)分子的核酸。此 類轉(zhuǎn)基因花粉或小孢子可以處于組成型啟動子或者花粉或小孢子特異性啟 動子或者胚嚢細胞或卵細胞特異性啟動子的控制下。在第一種情形中，優(yōu) 選的是該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對植物無害。在第二種情形中，所述轉(zhuǎn)基因僅在花粉或 小孢子中表達，并且所述細胞分裂誘導(dǎo)分子僅在花粉或小孢子中產(chǎn)生。在 第三種情形中，當(dāng)在受精后所述核酸進入卵細胞或胚嚢細胞時，所迷轉(zhuǎn)基 因才得以表達。
在所有這些實施方案中，必須避免通過花粉對卵細胞真正受精。這可 以借助于輻射或通過對于花粉和卵細胞使用不同物種來獲得。輻射特別適 合于其中蛋白質(zhì)在花粉中產(chǎn)生的實施方案，因為蛋白質(zhì)不會或幾乎不會受
輻射損害。在要將核酸從花粉或小孢子轉(zhuǎn)移至胚嚢或卵細胞中的情形之中， 優(yōu)選將另一物種用作卵細胞供體。
根據(jù)本發(fā)明的一個特別的實施方案，含有細胞分裂誘導(dǎo)分子的小孢子 或花粉可通過用核酸進行轉(zhuǎn)化來獲得。轉(zhuǎn)化可以以任何合適的方式進行，
例如借助于根瘤土壤桿菌(Jgro6flcfer/zM f咖e尸ac/e;^)或借助于氺立子轟 擊(生物射彈)。
這些轉(zhuǎn)化技術(shù)是眾所周知的。借助于根瘤土壤桿菌來轉(zhuǎn)化植物細胞是 被完善建立的，并且例如在De la Riva等人，i575 Vol. 1 (3) (1998)和 Bent, Plant Physiol. 124:1540-1547 (2000)中綜述。
最近，發(fā)現(xiàn)植物的遺傳轉(zhuǎn)化并不只局限于土壤桿菌(々ro&WeW咖)， 而是其他細菌也具有轉(zhuǎn)化植物的能力(Broothaerts等人，Ai3,zyre 433， 629-633 (2005)，將其引入本文作為參考)。通過獲得去攻擊性的 (disarmed) Ti質(zhì)粒和合適的二元載體兩者，可將這些植物相關(guān)的共生細 菌變得有能力用于基因轉(zhuǎn)移。此類轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也適合用于本發(fā)明。
生物射彈轉(zhuǎn)化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也是眾所周知的，并且用于此 類應(yīng)用的工具多年前已可商業(yè)獲得(Ralph Bock， QiagenNews， Issue No. 5， 1997 )。
適合用于本發(fā)明的技術(shù)例如還由Barinova等人(/ Jo" 53 (371) :1119-29 (2002))描述，其中顯示了 DM在小孢子水平上的遞送 及其在金魚草(^J〃rr力/刀咖邊aj'iAy)中的瞬時表達，或者由Ramaiah等人 (73: 674-682 (1997))描述用于苜蓿(腐/c，w〃m L.)。
用于在煙草中用生物射彈轟擊進行小孢子或花粉轉(zhuǎn)化的方法可以在 Baubak Bajoghli (Matrikel number: 9802743， University of Vienna, Experimentelle Genetic III. Plant Biotechnology by Alisher Touraev， July— 2001 )中4戈至'j。 Van der Leede—Plegt等人,rr5/2i^eaic' Aesesrc力 4 (2): 77-86 (1995)描述了借助于微粒轟擊將DNA直接遞送入煙草(心葉煙 (治'co〃a"a Wi7〃/Josa))的花粉中。這些和其他技術(shù)可以用于轉(zhuǎn)化用于 本發(fā)明的花粉或小孢子。
在一個具體的實施方案中，花粉和小孢子因而依靠核酸的存在而包含 細胞分裂誘導(dǎo)分子。所引入的核酸可以是細胞分裂誘導(dǎo)分子本身，或者可 以編碼細胞分裂誘導(dǎo)分子。在后一種情形中，所述誘導(dǎo)分子是蛋白質(zhì)或肽。 在第一種情形中，所述誘導(dǎo)分子是核酸。所述核酸本身可以是可誘導(dǎo)的，
或者其可以阻斷其他核酸被表達。例如，所述核酸可以是或編碼對抗Kip-相關(guān)蛋白家族的成員或成視網(wǎng)膜細胞瘤的RNAi (參見例如Park J等人， 戶/a/^/卯/7 <2/ 42: 153-163 (2005))。成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白調(diào)控植物中的 細胞增殖、分化和核內(nèi)再復(fù)制。
備選地，所述核酸可以編碼細胞分裂誘導(dǎo)分子的前體或產(chǎn)生細胞分裂 誘導(dǎo)分子的酶。當(dāng)所述核酸編碼酶時，這種酶可以是或直接產(chǎn)生所述誘導(dǎo) 分子的酶，或者是作為最終導(dǎo)致形成所述誘導(dǎo)分子的途徑的一部分的酶。 此處所使用的"細胞分裂誘導(dǎo)分子"旨在包括直接或間接引發(fā)細胞分裂的 所有分子。
本發(fā)明基于這樣的原理細胞分裂誘導(dǎo)分子借助于轉(zhuǎn)化的花粉或小孢 子而被遞送至胚嚢或卵細胞。能夠開啟細胞分裂的基因構(gòu)建體或分子本身 是已知的，并且可用于本發(fā)明的新方法中。
可以根據(jù)本發(fā)明使用的基因的實例描述于Stone等人(尸W51 98， 11806-11811 (2001))中，其公開了，被程序化而繼續(xù)營養(yǎng)生長的體細胞 (營養(yǎng)細胞)易于通過用編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化它們而轉(zhuǎn)變至胚胎生長。 另外的實例是Baby Boom ( Bouti 1 ier等人，r力e戶7a/2f 14， 1737-1749 (2002))或leafy cotyledon (Stone S等人，25:11806-11811 (2001))。這些以及其他基因可用于編碼本發(fā)明的細胞分裂誘導(dǎo)分子。
Zuo等人(r力e /a/2f /owr加/ 30: 1-12 (2002))描述了 ，發(fā)現(xiàn)通 過過表達所謂的Wuschel基因，可以在擬南芥(^ra6/f/o/7S")的所有組織 中誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生而無需植物激素。該技術(shù)也描述于US2003/0082813 中。與本發(fā)明的不同是，在US2003/0082813中植物細胞是用Wuschel DNA 序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的而不是瞬時轉(zhuǎn)化的。這種穩(wěn)定引入的Wuschel基因隨后在 其中穩(wěn)定整合了該基因的組織中過表達，并且在該組織中誘導(dǎo)細胞分裂和 胚形成。
根據(jù)本發(fā)明，編碼細胞分裂誘導(dǎo)分子(其可以是Wuschel基因的表達 產(chǎn)物)的核酸沒有穩(wěn)定整合入應(yīng)當(dāng)進行細胞分裂的細胞的基因組中。編碼
正在分裂的細胞中瞬時表達，或者在花粉中表達，其后所編碼的細胞分裂 誘導(dǎo)分子被釋放入要經(jīng)引發(fā)以開始細胞分裂的細胞(卵細胞或胚嚢細胞) 中。因此，所述花粉或小孢子是將所述分子本身(Wuschel基因表達產(chǎn)物， 而不是編碼序列)引入要經(jīng)引發(fā)以開始細胞分裂的細胞中的載體。
卵細胞誘導(dǎo)基因的應(yīng)用不限于基因的異位和瞬時表達例如上面提及 的那些，而通過使用編碼可以產(chǎn)生激素如iaaM和iaaH的酶的基因(參見 Thomashow等人，(1986) 5W認e 231， 616-618 )和編碼細胞細胞周期蛋 白的基因，也可以獲得類似的結(jié)果。
此外，基因的組合可用于進一步優(yōu)化對卯細胞的分裂和胚胎發(fā)生的誘 導(dǎo)。細胞周期基因的瞬時表達也可以引起卵細胞的分裂(關(guān)于細胞周期基 因的綜述，參見MurrayA ( Ce// 116: 221-234 (2004))。特別地，細胞 周期蛋白E和D單獨地或組合地瞬時表達可以用于引發(fā)卵細胞分裂。
根據(jù)本發(fā)明，所述核酸或者在小孢子或花粉中表達，或者瞬時或在穩(wěn) 定整合入基因組中后表達，或者在卵細胞中從卵細胞特異性啟動子瞬時表 達。通過這種方式避免了在得到的胚中的組成型表達。
瞬時表達可以以組織或細胞特異性的方式出現(xiàn)。在一個備選的實施方
時表達。組織特異性啟動子合適地是花粉或小孢子特異性啟動子。花粉特 異性啟動子是眾所周知的，并且在單子葉植物和雙子葉植物中都已顯示了 瞬時表達。這些類型的啟動子的實例例如描述于Twell， D等人， Z ,7"細"09 (3): 705-713 (1990); Hami 1 ton, D等人，尸/a"f #。7. 18:211-218 (1992)中。
因此，根據(jù)本發(fā)明，通過使用轉(zhuǎn)化小孢子(例如通過土壤桿菌轉(zhuǎn)化或 生物射彈轉(zhuǎn)化)或花粉粒的常規(guī)方法，這些方法導(dǎo)致基因例如Baby Boom、 Wuschel、 leafy cotyledon、細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶 (CDK) 、 E2F (高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員；Zheng, N等人， Genes Dev. 13: 666 (1999) )、DP (Magyar Z等人，F(xiàn)EBS Lett. 486 (1) : 79-87 (2000))等的瞬時表達，有可能在當(dāng)用經(jīng)轉(zhuǎn)化的小孢子或花粉粒對雌性受 體進行授粉時誘導(dǎo)卵細胞的分裂。
優(yōu)選地，所述花粉或小孢子的生殖核被失活或破壞。通過這種方式， 肯定避免了卵細胞的受精。生殖核的失活或破壞優(yōu)選在花粉或小孢子的轉(zhuǎn) 化之前進行，以便不會不必要地損害所述誘導(dǎo)分子。失活或破壞合適地借 助于輻射來實現(xiàn)。
對花粉細胞核進行輻射是眾所周知的降解生殖核的方法，但取決于輻 射的劑量，這種方法不妨礙花粉管形成并釋放進卵細胞中。Grant等人( Zea/s/^ /o固a/ 射,18， 339-341 (1980))描述了這種技術(shù)。
然后，將經(jīng)輻射并隨后經(jīng)轉(zhuǎn)化的花粉/小孢子細胞轉(zhuǎn)移到植物的雌蔬 上，所述植物來自相同物種或其中可發(fā)生所述花粉/小孢子細胞的花粉釋放 的物種。異源授粉的實例是將屬于茄科(^/a/ "eae)的物種用作花粉供 體，而將番茄作為受體。其他實例描述于de Martinis等人，戶/a/ " 214(5): 806-812 (2002)和Dore C等人，/VaW Ce// Ae/7or" 15: 758-761 (1996) 中。 一般地，適合用于異源授粉的物種屬于相同的科。
取決于物種，可以收獲源自從卵細胞或子房分裂的種子。備選地，胚 珠培養(yǎng)可能對于救援(rescue)正在發(fā)育的胚是必要的。
因此，基本上，失活的花粉粒以瞬時的方式攜帶能誘導(dǎo)卵細胞分裂和 胚胎形成的信號分子。由于所述分子的瞬時性質(zhì)，印細胞DM不被穩(wěn)定轉(zhuǎn) 化。
因此，在一個特別的實施方案中本發(fā)明涉及細胞分裂分子(蛋白質(zhì)、 DNA、 RNA)的利用，所述細胞分裂分子在通過輻射進行失活以便使生殖核 失活的小孢子或花粉粒中瞬時存在并表達，由此當(dāng)通過花粉管釋放入卵細 胞或其附近時所述細胞分裂分子發(fā)揮它們的作用。
在另一個實施方案中，即使花粉或小孢子的供體植物用編碼細胞分裂 誘導(dǎo)分子的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，卵細胞誘導(dǎo)分子的表達也是瞬時的。在這個特 定的實施方案，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供花粉或小孢子的植物從而使得其基因組DNA 攜帶編碼細胞分裂分子的基因或基因構(gòu)建體，所述基因或基因構(gòu)建體優(yōu)選
地處于胚嚢細胞或卵細胞特異性啟動子的控制下。當(dāng)在胚嚢細胞特別是卵 細胞中或其附近釋放時，所迷基因或基因構(gòu)建體得以表達。得到的細胞分 裂誘導(dǎo)分子引發(fā)細胞分裂。
在授粉前，對花粉或小孢子進行輻射以使生殖核失活。備選地，將花 粉或小孢子轉(zhuǎn)移至另一物種的雌蕊上，在所述另一物種中可以發(fā)生所述花 粉/小孢子細胞的花粉釋放。這種方法的優(yōu)點是，編碼細胞分裂誘導(dǎo)分子的 核酸被攜帶在生殖核中，并最終結(jié)束于精細胞中。優(yōu)選地，多個拷貝的細 胞分裂誘導(dǎo)分子存在于供體植物中，并因而存在于精細胞中。為了避免所 述基因構(gòu)建體的存在干擾花粉或小孢子的發(fā)育，使用了可誘導(dǎo)的或特異性 的啟動子，優(yōu)選胚嚢細胞或卵細胞特異性啟動子，這使得所述基因或基因 構(gòu)建體僅在它們轉(zhuǎn)移至胚嚢細胞特別是卵細胞中時才表達。
本發(fā)明進一步涉及可通過本發(fā)明的方法獲得的單倍體胚和雙單倍體 胚，以及涉及從此類單倍體胚或雙單倍體胚再生的植物、此類植物的子代， 并且涉及來自此類植物或其子代的種子、細胞、組織、小孢子和卵細胞。
在本申請中，卵細胞這個詞有時為了易讀性而單獨使用，但仍旨在理 解為"胚嚢細胞，特別是卵細胞"。
本發(fā)明將在后面的實施例中進一 步闡明，所述實施例僅希望用于舉例 說明目的而不應(yīng)該理解為以任何方式限制了本發(fā)明。
實施例
實施例1
通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化擬南芥
將DM質(zhì)粒pCAMBIA 1301和pExo70:: GFP: GUS用于包被1 iim金顆粒。 pCAMBIA 1301是一種二元載體，其舍有受800個核苷酸的CaMV 35S啟動 子調(diào)控的GUS( Roberts等人，pCAMBIA Vector release manual version 3. 05 (1998) ) 。 pExo70:: GFP: GUS含有3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS )和綠色熒光蛋 白(GFP )(圖6 )。
將擬南芥p35S:AP2mut的三枚花序置于培養(yǎng)皿的中間(


圖1)。將培 養(yǎng)皿置于粒子槍中并發(fā)射三槍包被的金顆粒。轟擊后兩天研究表達。圖2 顯示了如此獲得的GUS陽性花粉。
在粒子槍中在第3水平上用培養(yǎng)皿重復(fù)相同的實驗。在2200 psi的 壓力下發(fā)射兩槍。圖3A-D顯示了該實驗的代表性結(jié)果。
從該實驗可以得出結(jié)論，粒子轟擊可用于轉(zhuǎn)化花粉。
實施例2
粒子轟擊后的體外花粉發(fā)芽
成熟的花粉是休眠的。在將花粉粒置于雌林的柱頭上后，開始花粉發(fā) 芽的過程，這伴隨著通過從柱頭轉(zhuǎn)移水份而進行再水化。在本實施例中， 在粒子轟擊后使花粉體外發(fā)芽。
圖4顯示了番茄的15個不同的開花階段。階段l、 5和14的花粉用 于本試驗。階段1的花粉是完全成熟的，和階段5的花粉也是成熟的。階 段14是后期單核/早期雙核階段。
在200 pi NLN13培養(yǎng)基(NLN培養(yǎng)基(Lichter R. ， Z戶/7si3ze"^iec力f 105:427-437 (1982))，補充有13%蔗糖)中分離階段1、 5和14中的花 的花粉。將這20f) pl點樣在基因篩選(genescreen)膜上并干燥5分鐘。 然后將該膜置于^MS瓊脂平板上并用經(jīng)Exo70::GFP:GUS包被的1 pm金顆 粒在2200 psi下轟擊。轟擊后，將膜置于6孔滴定板中。將階段1和5 的花粉在1.5ml發(fā)芽培養(yǎng)基A(Clarke) (20mMMES、 0. 07% Ca (N03) 2. H20、 0.02% MgS04.7H20、 0.01% KN03、 0.01% H3B03、 2%蔗糖和15% PEG4000 )中 孵育。將階段14的小孢子在NLN13培養(yǎng)基中孵育。孵育三小時后，加入 1.5ml 2xGUS染色緩沖液，并將樣品在37'C下放置過夜。圖5顯示了GUS 陽性花粉管的代表性實例。顯然，在轉(zhuǎn)化后花粉仍能形成花粉管。
實施例3
制備用于在用這些花粉授粉后誘導(dǎo)卵細胞的細胞分裂的、攜帶細胞分裂刺 激因子的花粉
實施例1和2證明，花粉可以在具有GUS的模式系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化。在此描
述了如何用細胞分裂誘導(dǎo)分子BabyBooffl (BBM)轉(zhuǎn)化番茄花粉(Boutilier 等人，2002，同上)。
使用了來自攜帶CaMV 35S啟動子GFP構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的 花粉。該構(gòu)建體用作可見的非破壞性標(biāo)記以區(qū)分源于有性事件的胚和胚乳 與源于本發(fā)明方法的胚。CaMV 35S啟動子在胚和胚乳中具有活性，但在胚 珠中不具有活性，因而僅標(biāo)記有性來源的胚。用作花粉供體的植物對于這 種CaMV 35S啟動子GFP構(gòu)建體來說是純合的。
輻射花粉，并且以這樣的方式選擇輻射劑量，即仍有少數(shù)花粉能夠使 卵細胞受精并在授粉后誘導(dǎo)正常的合子胚形成。這也刺激了子房長出為果 實，該果實含有少于10。/。的正常數(shù)目的種子，這表明有性繁殖過程沒有完 全被廢除，但受到嚴重影響。
轉(zhuǎn)化按實施例2中所描述的用粒子轟擊來進行，其中使用由擬南芥 Exo70基因的啟動子序列(Atg28640 )驅(qū)動的BBM基因。該構(gòu)建體含有融 合至BBM的EX070啟動子序列(pExo70)。
實施例4
用經(jīng)轉(zhuǎn)化的花粉進行授粉和胚胎發(fā)生
對番茄花去雄并用實施例3中獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的花粉授粉。授粉后，子 房膨大并形成果實樣的實體。將幼小的果實樣結(jié)構(gòu)保持在植物上2-4周。 植物在人工氣候條件下生長(白天22°C，晚上18°C)。收獲果實，并就 GFP表達(CaMV-35S:: GFP)進行成像以除去有性來源的胚。
一部分胚珠起始根椐本發(fā)明的孤雌生殖發(fā)育，并產(chǎn)生胚樣的結(jié)構(gòu)而沒 有顯示GFP熒光。將被救援的胚進一步在如Neal， CA和Topoleski， LD (/. j邁er.紋5W. 108 (3): 434-438 (1983))所描述的培養(yǎng)基上孵育。 25% - 50%的未成熟胚能夠再生成為有生活力的小植林。這些小植林都不是 轉(zhuǎn)基因的，著證明了所述胚的母體起源。
此外，還用雄性特異性分子標(biāo)記(Vos P.等人，Wuc/e/c i^e"c力,23:4407-4414 (1995))檢查了所述胚的起源。
為了區(qū)分單倍體和二倍體胚，根據(jù)De Laat， A等人，戶/a力t Aree^///^ 99:303-307 (1987)中所描述的方法，通過流式細胞術(shù)對DNA-倍性水平進 行測量。大部分所獲得的小植林顯示為雙單倍體。
實施例5
卵細胞特異性啟動子驅(qū)動的表達
如實施例1中所描述的，用pES4::ES4:GFP構(gòu)建體(圖7)轉(zhuǎn)化來自 擬南芥的花粉，所述構(gòu)建體包含處于來自玉米的pES4啟動子(Cordts， S 等人，77 e尸/a^ /. 25:103-114 (2001))控制下的報道基因GFP。在經(jīng) 轉(zhuǎn)化的花粉中沒有觀察到熒光。
在用經(jīng)轉(zhuǎn)化的花粉對擬南芥植抹進行授粉后，在卵細胞中可特異性地 檢測到熒光。該試驗證明，在卵細胞中pES4啟動子是有活性的，并且可用 于開啟細胞分裂誘導(dǎo)分子的表達。
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生單倍體植物胚的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含細胞分裂誘導(dǎo)分子的小孢子或花粉；b)對植物的胚囊細胞特別是卵細胞進行授粉，所述植物的單倍體胚待用所述小孢子或花粉來產(chǎn)生；c)讓所述小孢子或花粉將所述細胞分裂誘導(dǎo)分子釋放在胚囊細胞特別是卵細胞中或其附近，以引發(fā)其分裂從而獲得單倍體植物胚。
2. 用于產(chǎn)生雙單倍體植物胚的方法，所述方法包括以下步驟a) 提供包含細胞分裂誘導(dǎo)分子的小孢子或花粉；b) 對植物的胚嚢細胞特別是卵細胞進行授粉，所述植物的雙單倍體 胚待用所述小孢子或花粉來產(chǎn)生；c) 讓所述小孢子或花粉將所述細胞分裂誘導(dǎo)分子釋放在胚嚢細胞特 別是卵細胞中或其附近，以引發(fā)其分裂從而獲得單倍體植物胚，其中在授粉后的某一階段，特別是在細胞分裂過程中或在獲得所述胚 后，發(fā)生染色體數(shù)目的加倍。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中染色體數(shù)目的加倍自發(fā)發(fā)生。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中染色體數(shù)目的加倍借助于化學(xué)處理，特別 是借助于秋水仙素來實現(xiàn)。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述含有細胞分裂誘導(dǎo)分子的 小孢子或花粉可通過用核酸轉(zhuǎn)化小孢子或花粉而獲得。
6. 權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述含有細胞分裂誘導(dǎo)分子的
7. 權(quán)利要求5或6的方法，其中所述轉(zhuǎn)化借助于根瘤土壤桿菌或生物 射彈來進行。
8. 權(quán)利要求5、 6或7的方法，其中所述核酸是細胞分裂誘導(dǎo)分子， 或者編碼細胞分裂誘導(dǎo)分子、細胞分裂誘導(dǎo)分子的前體或產(chǎn)生細胞分裂誘 導(dǎo)分子的酶。
9. 權(quán)利要求5、 6或7的方法，其中為細胞分裂誘導(dǎo)分子的核酸是 MAi，所述MAi阻斷能夠抑制或停止細胞分裂的基因的表達。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述抑制或停止細胞分裂的基因是 成視網(wǎng)膜細胞瘤(Rb)或Kip-相關(guān)蛋白(KRP)家族的成員。
11. 權(quán)利要求5、 6或7的方法，其中所述細胞分裂誘導(dǎo)分子選自Baby Boom、 Leafy cotyledon、 WUSCHEL、細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性 激酶(CDK) 、 E2F、 DP。
12. 權(quán)利要求5、 6或7的方法，其中所述核酸在所述小孢子或花粉中 瞬時表達。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中通過讓所述核酸處于組織特異性或可誘 導(dǎo)啟動子的調(diào)控下來獲得瞬時表達。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述組織特異性啟動子是花粉或小孢子 特異性啟動子。
15. 權(quán)利要求5、 6或7的方法，其中所述核酸穩(wěn)定地整合入所述小孢 子或花粉中，但在胚嚢細胞或卵細胞中瞬時表達。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中通過讓所述核酸處于組織特異性或可誘 導(dǎo)啟動子的調(diào)控下來獲得瞬時表達，所述啟動子在所述花粉或小孢子中不 具有活性。
17. 權(quán)利要求13或16的方法，其中所述組織特異性啟動子是胚嚢或 卵細胞特異性啟動子。
18. 權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中小孢子或花粉來自屬于不同 于提供胚嚢細胞或卵細胞的受體植物的另一物種的供體植物，在所述小孢 子或花粉中穩(wěn)定地整合或瞬時表達編碼細胞分裂誘導(dǎo)分子的核酸。
19. 權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中將所述花粉或小孢子的生殖 核失活或^f皮壞。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中生殖核的失活或破壞在所述花粉或小孢子的轉(zhuǎn)化前進行。
21. 權(quán)利要求19"或20的方法，其中生殖核的失活或破壞借助于輻射 來實現(xiàn)。
22. 單倍體植物胚，其可通過權(quán)利要求l和5-21中任一項的方法獲得。
23. 雙單倍體植物胚，其可通過權(quán)利要求2-20中任一項的方法獲得。
24. 從權(quán)利要求22或23的植物胚再生的植物。
25. 權(quán)利要求24的植物的子代。
26. 權(quán)利要求24或25的植物的種子。
27. 來自權(quán)利要求24或25的植物的細胞。
28. 權(quán)利要求27的細胞，所述細胞選自花粉、小孢子、胚囊細胞和卵 細胞。
29. 來自權(quán)利要求24或25的植物的組織。
30. 權(quán)利要求29的組織，所述組織是胚嚢組織。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生單倍體植物胚的方法，該方法包括提供包含細胞分裂誘導(dǎo)分子的小孢子或花粉；對植物的胚囊細胞特別是卵細胞進行授粉，所述植物的單倍體胚待用所述小孢子或花粉來產(chǎn)生；讓所述小孢子或花粉將所述細胞分裂誘導(dǎo)分子釋放在胚囊細胞特別是卵細胞中或其附近，以引發(fā)其分裂從而獲得單倍體植物胚。當(dāng)要產(chǎn)生雙單倍體植物胚時，在授粉后的某一階段，特別是在細胞分裂過程中或在獲得所述胚后，發(fā)生染色體數(shù)目的加倍。本發(fā)明進一步涉及如此獲得的胚、從該胚再生的植物或其子代。
文檔編號A01H1/08GK101179928SQ200680017510
公開日2008年5月14日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月31日
發(fā)明者C·L·C·萊利維爾特, G·C·安格嫩特, J·B·M·卡斯特斯, R·H·G·德克斯 申請人:瑞克斯旺種苗集團公司