專利名稱：利用基質(zhì)細胞支持胚胎干細胞和成體干細胞的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了利用來源于脂肪組織、骨、骨髓、軟骨、結締組織、包皮、韌帶、外周血、胎盤、平滑肌、骨骼肌、腱、臍帶或其它部位的基質(zhì)細胞分離、培養(yǎng)及維持胚胎干細胞或成體干細胞的方法和組合物及其用途。
背景技術：
胚胎干細胞來自于胚泡期胚胎的內(nèi)細胞團[Odorico等2001，StemCells 19193-204；Thomson等1995.Proc Natl Acad Sci USA.927844-7848；Thomson等1998.Science 2821145-1147]。這些細胞被不同地描述為多能和全能干細胞。它們的區(qū)別特點在于它們產(chǎn)生分化的子細胞的能力，所述子細胞代表了胚胎所有三個胚層以及支持發(fā)育的胚胎外細胞。已從胚胎其它部位和成體組織中分離到干細胞。能夠分化為反映胚胎所有三個胚層的細胞的多能或全能干細胞可從發(fā)育胚胎的原生殖嵴中分離、從畸胎癌中分離以及從非胚胎組織中分離，所述非胚胎組織包括但不限于骨髓、腦、肝、胰腺、外周血、胎盤、骨骼肌和臍帶血。這些細胞表現(xiàn)出許多共性。它們表現(xiàn)出高水平的堿性磷酸酶活性[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 9513726-13731]。它們也表達高水平的端粒酶-一種催化向染色體末端添加端粒重復單位的核糖核蛋白。這種活性維持染色體的長度并與細胞的永生有關[Odorico等2001，Stem Cells 19193-204]。
人類來源的胚胎干細胞表達細胞表面標志，包括但不限于階段特異性胚胎抗原3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子量糖蛋白TRA-1-60和RA-1-81以及堿性磷酸酶[Amit M等2000，Dev Biol 227271-278；Odorico等，Stem Cells 19193-204]。在它們的未分化狀態(tài)，胚胎干細胞保留其表達轉(zhuǎn)錄因子Oct 4的能力；隨著分化定型，Oct 4的水平下降[Reubinoff等，2000，Nature Biotechnology 18399-404.；Schuldiner等2000，Proc Natl Acad Sci USA 9711307-11312]。
胚胎干細胞響應一組細胞因子而經(jīng)歷細胞系特異性分化。來自文獻的代表性的實例引用如下，但這種列舉并非全面或窮盡的。轉(zhuǎn)化生長因子β1和活化素A抑制內(nèi)胚層和外胚層分化而促進中胚層細胞系例如骨骼肌和心肌[Schuldiner等2000，Proc Natl Acad Sci USA 9711307-11312]。視黃酸、堿性成纖維細胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4以及表皮生長因子誘導外胚層(皮膚、腦)和中胚層(軟骨細胞、造血)細胞系[Schuldiner等2000]。其它因子，例如神經(jīng)生長因子和肝生長因子，促進沿所有三個胚胎細胞系(外胚層、內(nèi)胚層、中胚層)的分化。還有其它因子例如血小板衍生生長因子促進膠質(zhì)細胞分化[Brustle等1999，Science 285(5428)754-6]。將胚胎干細胞移植到免疫缺陷小鼠的骨骼肌組織或其它組織部位引起畸胎癌的形成，呈現(xiàn)出腸樣結構、神經(jīng)上皮、軟骨、橫紋肌、腎小球及其它組織類型的分化[Thomson等1998，Curr Top Dev Biol 38133-165；Amit等2000，DevBiol 227271-278；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18399-404]。備選地，胚胎干細胞在體外作為胚狀體培養(yǎng)時分化成為來自所有三個胚層的細胞[Itskovitz-Eldor J等2000，Mol Med 688-95；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18399-404]。
目前分離和維持胚胎干細胞和其它干細胞細胞系的方法依賴于鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的應用。在共培養(yǎng)之前，MEF被輻照(輻照水平在35-50戈瑞之間)以減少細胞增殖而不損害代謝功能[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 9513726-13731；Amit等2000，DevBiol 227271-278]。胚胎干細胞通過免疫切除法分離自胚泡期胚胎的內(nèi)細胞團[Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18399-404；Thomson等1998，Science 2821145-1147；Odorico等2001，Stem Cells19193-204]。用鏈霉蛋白酶消化透明帶，利用抗-人血清抗體接著暴露于豚鼠補體通過免疫切除術分離內(nèi)細胞團，并將所得的細胞涂布到輻照的MEF飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上[Reubinoff等2000，NatureBiotechnology 18399-404；Thomson等1998，Science 2821145-1147]。備選地，機械解聚以及胰蛋白酶/EDTA消化或者透明質(zhì)酸酶/膠原酶IV/DNA酶消化后，從5到9周的受精后人胚胎的生殖嵴和腸系膜中分離細胞，隨后涂布到MEF飼養(yǎng)層上[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 9513726-13731]。培養(yǎng)物在Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(無丙酮酸，高葡萄糖配方)、敲除Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基或補充有15-20％胎牛血清或15-20％敲除SR(Gibco/BRL，Gaithersburg MD)、對胚胎干細胞生長優(yōu)化的血清替代品[Price等WO98/30679]、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、抗生素并添加高達2,000單位/ml的人重組白血病抑制因子(LIF)、高達4ng/ml的人重組堿性成纖維細胞生長因子和高達10μM的毛喉素的等價培養(yǎng)基的存在下維持[Amit等2000，Dev Biol 227271-278；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology18399-404；Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 9513726-13731；Thomson等1998，Science 2821145-1147]。
注意到用血清替代品時胚胎干細胞克隆的頻率升高數(shù)倍[Amit等2000，Dev Biol 227271-278]。堿性成纖維細胞生長因子的存在對于克隆胚胎干細胞的持續(xù)非分化增殖是必需的。bFGF、LIF和毛喉素的組合存在與形成緊湊致密的多細胞人胚胎干細胞集落有關，這與其它靈長類動物(恒河猴)中觀察到的平展松散的集落相反[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 9513726-13731]。9到15天后，通過暴露于具有1mM EDTA或其它二價陽離子螯合劑的無鈣無鎂磷酸緩沖鹽溶液、通過暴露于分散酶(10mg/ml)、或者通過用微量移液器機械分離而將單個集落分離成塊[Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，等1998.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science 2821145-1147]。所得的細胞或細胞塊序貫涂布到新鮮培養(yǎng)基中輻照的小鼠胚胎成纖維細胞上[Thomson JA等1998，Science 2821145-1147；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18399-404]。克隆按每7天的數(shù)量級擴增，并表現(xiàn)出大約36小時的倍增時間[Amit等2000，Dev Biol 227271-278]。克隆隨后的傳代通過重復細胞解體操作(消化、微量移液器處理)以及通過將所得的細胞涂布到輻照的MEF上來進行[Amit等2000，Dev Biol 227271-278]。
目前分離、培養(yǎng)和擴增人胚胎干細胞的方法受到它們對鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層的依賴性的限制。這種鼠MEF被用來分離現(xiàn)有的60種人干細胞克隆的事實對于在臨床治療中利用這些細胞構成障礙[Gillis J，Connolly C.August 24，2001.″Taint of mouse cells mighthinder stem researchers″.Washington Post]。雖然研究者或許已經(jīng)開始探索利用細胞因子和胞外基質(zhì)補充物來避免在人胚胎干細胞以及來自其它組織和供體部位的干細胞的生長中利用鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層，這種研究還處于初期[Carpenter等，Exp Neurol 158265-278；Odorico 2001，Stem Cells 19193-204]。不過，Schiff的國際專利WO01/51616公開了在缺乏飼養(yǎng)細胞例如MEF時培養(yǎng)人多能干細胞的方法。全能干細胞能在缺乏飼養(yǎng)細胞時無限地維持于未分化的狀態(tài)仍待證明[Odorico 2001，Stem Cells 19193-204]。
因此，本發(fā)明的目的在于提供協(xié)助分離、培養(yǎng)和維持干細胞的方法及組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包括利用組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)作為飼養(yǎng)層以分離、培養(yǎng)和維持成體干細胞、胚胎干細胞和其它干細胞的方法和組合物。提供了通過輻照的脂肪來源的基質(zhì)細胞而穩(wěn)定可靠地支持干細胞的方法和組合物。
在本發(fā)明的一個方面，向分離的組織來源的細胞補充額外的生長因子、細胞因子和趨化因子以分離、培養(yǎng)和維持干細胞。
在本發(fā)明的另一個方面，分離的組織來源的細胞(包括脂肪來源的組織細胞)在培養(yǎng)基補充額外的生長因子、細胞因子和/或趨化因子之前被輻照?；蛘?，分離的組織來源的細胞在培養(yǎng)基補充額外的生長因子、細胞因子和/或趨化因子之后被輻照。
又在本發(fā)明的另一個方面，組織來源的基質(zhì)細胞被基因工程化以表達能夠促進培養(yǎng)和維持干細胞的一種或多種蛋白或者生長因子。備選地，組織來源的基質(zhì)細胞在被基因工程化表達此類蛋白或生長因子之后被輻照。這種因子用于維持干細胞處于未分化狀態(tài)或者備選地指導它們的分化。
根據(jù)本文描述的本發(fā)明細節(jié)，組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)被用來培養(yǎng)和維持胚胎干細胞。輻照的組織來源的基質(zhì)細胞也被用來培養(yǎng)和維持胚胎干細胞。
又在本發(fā)明的另一方面，組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)被用來培養(yǎng)和維持各種類型的干細胞，所述干細胞包括但不限于，神經(jīng)元干細胞、肝干細胞、造血干細胞、臍帶血干細胞、表皮干細胞、胃腸干細胞、內(nèi)皮干細胞、肌肉干細胞、間充質(zhì)干細胞和胰腺干細胞。輻照的組織來源的基質(zhì)細胞也被用來培養(yǎng)和維持此類干細胞。
在本發(fā)明的另一個方面，分離的組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)補充有交替地用來增強增殖、維持以及促進共培養(yǎng)的干細胞定向分化的生長因子、細胞因子和趨化因子。備選地，分離的組織來源的基質(zhì)細胞首先被輻照，然后補充交替地用來增強增殖、維持以及促進共培養(yǎng)的干細胞定向分化的生長因子、細胞因子和趨化因子。
本發(fā)明的其它目的和特點由于下述公開及所依附的權利要求將會更加充分明顯。
附圖的簡要說明

圖1為代表性的人類脂肪來源的基質(zhì)細胞的流式細胞儀分析。分離自單個供體的未分化的基質(zhì)細胞用針對所示抗原的單克隆抗體(實線，每個圖表的右側)或同種型單克隆對照抗體(虛線，每個圖表的左側)染色。代表n＝5個供體。條柱表示熒光強度＞99％對照。脂肪來源的基質(zhì)細胞表達多種粘附蛋白和表面蛋白。許多這些蛋白具有行使造血支持功能的潛力，并且它們?nèi)紴楣撬杌|(zhì)細胞共同享有。
圖2顯示了脂多糖(LPS)誘導細胞因子mRNA的PCR分析。脂肪來源的基質(zhì)細胞用100ng/ml LPS誘導0或4小時并收集總RNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA用對白介素6和8、粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子及粒細胞/巨噬細胞-集落刺激因子、flt-3配體和白血病抑制因子特異性的引物對進行擴增。肌動蛋白信號在每個反應中作為相等cDNA水平的對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)序列確認。與鼠和人骨髓來源的基質(zhì)細胞共同的是，脂肪來源的基質(zhì)細胞表達下列細胞因子mRNA白介素6、7、8和11(IL-6，-7，-8，-11)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、flt-3配體、干細胞因子、腫瘤壞死因子α(TNFα)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和4t(BMP-2，-4)。
圖3顯示了各種共培養(yǎng)物的總細胞擴增數(shù)據(jù)。對來自12天脂肪基質(zhì)共培養(yǎng)物的造血細胞檢查總細胞擴增(左表)、CD34+細胞擴增(中表)或者將其種植在MS5細胞上5周并檢查髓樣長期培養(yǎng)引發(fā)(LTC)細胞的擴增。在缺乏外源細胞因子時，脂肪來源的基質(zhì)細胞支持總造血細胞數(shù)目的5.1-倍擴增(平均，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體；范圍2-9.4)。這相應于CD34+UCB細胞群的2.4-倍擴增(平均，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體；范圍1.4-3.3)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包括利用組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)作為飼養(yǎng)層以分離、培養(yǎng)和維持成體干細胞、胚胎干細胞和其它干細胞的方法和組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了通過輻照的來源于皮下、乳腺、性腺、網(wǎng)膜或其它脂肪組織部位的基質(zhì)細胞而穩(wěn)定可靠地支持干細胞的方法和組合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，分離的組織來源的細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)補充有額外的生長因子、細胞因子和趨化因子，所述因子包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3配體、BAFF(B細胞活化因子的TNF家族的新配體)、artemin(屬于GDNF家族的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、lymphotactin、巨噬細胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被稱為生長分化因子-8)、neurturin、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、多效蛋白、干細胞因子、干細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子以及成纖維細胞生長因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性和堿性成纖維細胞生長因子)，以分離、培養(yǎng)和維持干細胞。在本發(fā)明的另一個實施方案中，分離的組織來源的細胞在培養(yǎng)基補充這種額外的生長因子、細胞因子和/或趨化因子之前被輻照。或者，分離的組織來源的細胞在培養(yǎng)基補充額外的生長因子、細胞因子和/或趨化因子之后被輻照。
在本發(fā)明另一個實施方案中，組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)被基因工程化以表達蛋白，所述蛋白包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3配體、BAFF(B細胞活化因子的TNF家族的新配體)、artemin(屬于GDNF家族的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、lymphotactin、巨噬細胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被稱為生長分化因子-8)、neurturin、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、多效蛋白、干細胞因子、干細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子以及成纖維細胞生長因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性和堿性成纖維細胞生長因子)，以分離、培養(yǎng)和維持干細胞。在備選的實施方案中，組織來源的細胞在被如此基因工程化之后被輻照。又在該實施方案的另一種修飾中，此工程化的細胞被用來指導干細胞的分化。或者，工程化的細胞被用來維持干細胞處于未分化狀態(tài)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)被用于培養(yǎng)和維持胚胎干細胞。在備選的實施方案中，輻照的組織來源的基質(zhì)細胞被用于培養(yǎng)和維持胚胎干細胞。
又在本發(fā)明的另一實施方案中，組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)被用來分離、培養(yǎng)和維持源自成體組織的干細胞，所述干細胞包括但不限于，神經(jīng)元干細胞、肝干細胞、造血干細胞、表皮干細胞、胃腸干細胞、內(nèi)皮干細胞、肌肉干細胞、間充質(zhì)干細胞和胰腺干細胞。在備選的實施方案中，組織來源的基質(zhì)細胞被輻照。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，分離的組織來源的基質(zhì)細胞(包括脂肪來源的基質(zhì)細胞)補充有交替地用來增強增殖、維持以及促進共培養(yǎng)的干細胞定向分化的生長因子、細胞因子和趨化因子。備選地，分離的組織來源的基質(zhì)細胞首先被輻照，然后補充此類生長因子、細胞因子和趨化因子。
具有與脂肪組織來源的基質(zhì)細胞相似特點的細胞得自于其它組織部位。這些組織包括但不限于，骨、骨髓、軟骨、結締組織、包皮、韌帶、外周血、胎盤、骨骼肌、平滑肌、腱以及臍帶血[見Caplan和Haynesworth的專利US 5,226914；Erices等2000，Br.J.Haematol.109235-242；Gimble 1990，New Biologist 2304-312；Gimble等1996，Bone 19421-428]。雖然來自任何或所有這些組織的基質(zhì)細胞沒有一個是相同的，有可能它們共同享有足夠的特點以允許它們在體外行使相似的功能。尤其是，得自這些不同組織部位的基質(zhì)細胞可作為飼養(yǎng)層支持胚胎干細胞或成體干細胞的增殖并維持在未分化的狀態(tài)。而且，根據(jù)這些類型的基質(zhì)細胞中每一種的獨特特征，它們可能各自對于特定類型干細胞的生長和維持是最佳的。
I.定義“胚胎干細胞”是指來源于胚胎(胚泡內(nèi)細胞團)具有變成廣泛種類的特化細胞的潛能的任何原始(未分化的)細胞。胚胎干細胞能夠進行無限次的對稱分裂而不分化(長期自我更新)。它們還呈現(xiàn)并維持穩(wěn)定、完整(二倍體)、正常互補的染色體。該細胞表達高水平的端粒酶活性，并以特定的細胞表面蛋白和轉(zhuǎn)錄因子為區(qū)別。
“成體干細胞”是指見于分化的胚后期組織的任何未分化細胞，它能夠自我更新并(具有某些局限)分化產(chǎn)生其所源自的組織的所有特化細胞類型以及分化成為廣泛種類的其它細胞類型。
“白血病抑制因子”(LIF)是指具有眾多生物學功能的白介素-6細胞因子家族中的22kDa蛋白成員。LIF具有誘導白血病細胞終末分化、誘導正常和髓樣白血病細胞造血分化、誘導神經(jīng)元細胞分化、并刺激肝細胞中急性期蛋白合成的能力。LIF也已經(jīng)被證明對于維持胚胎干細胞處于增殖未分化狀態(tài)是必需的。
“飼養(yǎng)層”是指通過化學或放射手段失活的細胞，從而它們不能分裂但依然產(chǎn)生生長因子、細胞因子以及共培養(yǎng)中所必需的其它細胞來源的產(chǎn)物，以維持未分化的多能干細胞。歷史上，小鼠胚胎成纖維細胞被用作為飼養(yǎng)層支持胚胎干細胞。
“成纖維細胞生長因子-堿性”(FGF-b)是17.2kDa的蛋白，它是肝素結合生長因子，刺激廣泛種類的細胞增殖，包括間充質(zhì)細胞、神經(jīng)外胚層細胞和內(nèi)皮細胞。人類FGF-b是有力的造血細胞因子并在體內(nèi)發(fā)揮強大的血管生成活性。FGF-b也拮抗細胞因子介導的人類白血病細胞系的分化。因此，bFGF能夠通過拮抗先祖細胞的分化促進它們的增殖。
“多能胚胎干細胞”是能夠產(chǎn)生許多分化的胚胎或成體細胞類型的細胞，包括生殖細胞(精子和卵子)。多能胚胎干細胞也能夠自我更新。從而，這些細胞不僅繁殖種系并產(chǎn)生多數(shù)構成成體特化器官的終末分化細胞，而且自身能夠再生。
術語“轉(zhuǎn)基因的”用于描述任何動物或其任何部分，包括但不限于在其細胞內(nèi)包括外源遺傳材料的細胞、培養(yǎng)物或組織。本發(fā)明的細胞可以向其添加DNA，然后這些細胞能夠用于移植或者用于體外產(chǎn)生激素、細胞或組織。
“轉(zhuǎn)基因”是指通過技術手段插入到細胞中的任何DNA片段，其成為由該細胞發(fā)育而來的細胞、細胞系、組織或生物體基因組的一部分(即穩(wěn)定地整合或作為穩(wěn)定的染色體外元件)。這種轉(zhuǎn)基因可包括對于引入異源基因的細胞或生物體來說部分或完全異源或者外來的基因，或者可代表與該生物體內(nèi)源基因同源的基因。包括在該定義中的是通過提供RNA序列，轉(zhuǎn)錄成為DNA，然后摻入基因組中所創(chuàng)建的轉(zhuǎn)基因。術語“轉(zhuǎn)基因的”還另外包括任何生物體或其部分，包括但不限于細胞、細胞系、細胞培養(yǎng)物或組織，通過體外操作或通過任何轉(zhuǎn)基因技術改變了其基因組。
“轉(zhuǎn)化生長因子β”(TGFβ)是55kDa、391個氨基酸(aa)的前蛋白原，其由23個aa的信號序列，256個aa的蛋白原(pro)-區(qū)域以及112個aa的成熟區(qū)段組成。分泌前，蛋白原-區(qū)域由弗林蛋白酶樣蛋白酶在RxxR位點處切割。這產(chǎn)生非糖基化的25kDa二硫鍵交聯(lián)的成熟二聚體，其與它先前連接的二硫鍵交聯(lián)的蛋白原-區(qū)域非共價結合，形成“隱性復合物”。該復合物被分泌?；罨诎庠诟鞣N條件下發(fā)生，極有可能是通過跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶引發(fā)由轉(zhuǎn)錄因子Smad家族介導的胞內(nèi)信號級聯(lián)反應。
“堿性成纖維細胞生長因子”(bFGF)，也被稱為FGF-2，為18kDa非糖基化的多肽，其既表現(xiàn)出胞內(nèi)活性又表現(xiàn)出胞外活性。BFGF作為單體分泌。分泌后，bFGF被隔絕到細胞表面硫酸肝素(HS)或基質(zhì)糖胺聚糖上。雖然bFGF作為單體分泌，細胞表面HS似乎使單體bFGF以非共價側對側的構型二聚化，其隨后能夠二聚化并活化FGF受體。
“血小板衍生生長因子”(PDGF)為30kDa的命名為A和B的兩個基因上不同而結構上相關的多肽鏈的同二聚體或異二聚體組合。它最初在血清中被鑒定為血小板衍生的成纖維細胞有絲分裂原。后來的研究證明許多細胞類型分泌PDGF，并且該細胞因子是中胚層細胞系(肌肉、骨、結締組織)細胞的有絲分裂原。
II.分離脂肪來源的干細胞脂肪組織提供了多能基質(zhì)細胞的來源。脂肪組織容易得到并且許多個體富含脂肪組織。肥胖在美國為流行病比例的狀況，其中大于50％的成人超過了推薦的基于他們身高的BMI。脂肪細胞可以通過基于門診病人的吸脂術收獲。這是一個具有美容效果的相對非侵入性的操作，為大多數(shù)患者所接受。已經(jīng)充分證明脂肪細胞是可補充的細胞群。即使是通過吸脂術或其它操作在外科手術除去后，常見個體中脂肪細胞隨著時間的重現(xiàn)。這提示脂肪組織含有能夠自我更新的基質(zhì)干細胞。
“脂肪組織來源的基質(zhì)細胞”通過膠原酶消化和差速離心從切碎的人脂肪組織中獲得[Halvorsen等2001，Tissue Eng.7(6)729-41；Hauner等1989，J Clin Invest 841663-1670；Rodbell 1966，.J BiolChem 241130-139]。已經(jīng)證明人類脂肪組織來源的基質(zhì)細胞能夠沿著脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞細胞系途徑分化[Erickson等2002，Biochem Biophys Res Commun.290(2)763-9；Gronthos等2001，Journal of Cellular Physiology，89(1)54-63；Halvorsen等2001，Metabolism 50407-413；Harp等2001，Biochem Biophys ResCommun 281907-912；Saladin等1999，Cell Growth & Diff 1043-48；Sen等2001，Journal of Cenular Biochemistry 81312-319；Zhou等1999，Biotechnol.Techniques 13513-517；Zuk等2001，Tissue Eng.7211-228]。
脂肪組織為組織工程應用提供了許多實用的優(yōu)勢。首先，它很豐富。其次，它能以對患者最小風險的方法獲得。第三，它是可補充的。雖然基質(zhì)細胞代表小于0.01％的骨髓有核細胞群，但每克脂肪組織存在高達8.6×104個基質(zhì)細胞[Sen等2001，Journal of CellularBiochemistry 81312-319]。0.5千克脂肪組織離體擴增2到4周可產(chǎn)生高達500,000,000個基質(zhì)細胞。這些細胞可即刻使用，或者冷藏以備將來的自體或同種異體應用。
脂肪來源的基質(zhì)細胞表達許多粘附蛋白和表面蛋白，包括但不限于下列細胞表面標志CD29(β1整聯(lián)蛋白)、CD44(透明質(zhì)酸受體)、CD49d(α4整聯(lián)蛋白)、CD54-ICAM1 CD105-endoglin；CD106-VCAM-1CD166-ALCAM；以及下列細胞因子白介素6、7、8、11、巨噬細胞集落刺激因子、GM集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、白血病抑制因子(LIF)、干細胞因子以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白。許多這些蛋白具有行使造血支持功能的潛能，并且它們共同為骨髓基質(zhì)細胞所享有。
具有與脂肪組織來源的基質(zhì)細胞相似特點的細胞可得自于其它組織部位。這些組織包括但不限于，骨、骨髓、軟骨、結締組織、包皮、韌帶、外周血、胎盤、骨骼肌、平滑肌、腱以及臍帶血[見Caplan和Haynesworth的專利US 5,226,914；Erices等2000，Br.J.Haematol.109235-242；Gimble JM 1990，The New Biologist 2304-3 12；Gimble等1996，Bone 19421-428]。雖然來自任何或所有這些組織的基質(zhì)細胞沒有一個是相同的，有可能它們共同享有足夠的特點以允許它們在體外行使相似的功能。尤其是，得自這些不同組織部位的基質(zhì)細胞也可作為飼養(yǎng)層支持胚胎干細胞或成體干細胞的增殖并維持在未分化的狀態(tài)。
匹茲堡大學(University of Pittsburgh)和加州大學董事會(TheRegents of the University of California)的WO 00/53795公開了脂肪來源的干細胞，它能夠生長并擴增以提供支持其它細胞群生長和擴增的激素和條件培養(yǎng)基，其能夠進一步被基因改造以阻遏或表達某些基因。在一個實例中，人類脂肪來源的干細胞與來自臍帶血的造血干細胞共培養(yǎng)。在2周的周期內(nèi)，人類脂肪來源的基質(zhì)細胞維持人類造血干細胞的存活并支持其生長，由此闡明了此類系統(tǒng)在維持干細胞生長中的用途。
Verfaillie的美國專利US 5,922,597公開了涉及利用基質(zhì)細胞提供條件培養(yǎng)基以支持干細胞的生長和維持的方法。教導了基質(zhì)細胞和干細胞可以組合在共培養(yǎng)物中。
可用于本發(fā)明的方法的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞是通過本領域技術人員公知的各種方法分離的，例如象匹茲堡大學等的WO 00/53795中所描述的。在優(yōu)選的方法中，脂肪組織分離自哺乳動物受試者，優(yōu)選為人類受試者。優(yōu)選的脂肪組織來源是網(wǎng)膜脂肪。在人類中，脂肪典型地通過吸脂術分離。如果本發(fā)明的細胞要移植到人類受試者中，優(yōu)選脂肪組織分離自同一個受試者，以便提供自體移植。或者，移植的組織可以是同種異體的。
作為非限制性實例，在分離脂肪組織來源的基質(zhì)細胞的一個方法中，脂肪組織用0.01到0.5％之間，優(yōu)選0.04到0.2％，最優(yōu)選0.1％濃度的膠原酶、用0.01到0.5％之間，優(yōu)選0.04到0.04％，最優(yōu)選0.2％濃度的胰蛋白酶在25°到50℃之間，優(yōu)選在33°到40℃之間，最優(yōu)選在37℃的溫度下處理10分鐘到3小時，優(yōu)選30分鐘到1小時，最優(yōu)選45分鐘。細胞通過20微米到800微米之間，更優(yōu)選40微米到400微米之間，最優(yōu)選70微米的尼龍或粗棉布網(wǎng)孔過濾器。然后將細胞直接在培養(yǎng)基中或在Ficoll或Percoll或其它粒子梯度中進行差速離心。細胞在4到50℃之間，優(yōu)選在20到40℃之間，最優(yōu)選在25℃的溫度下以100到3000Xg之間，更優(yōu)選200到1500Xg，最優(yōu)選以500Xg的速度離心1分鐘到1小時，更優(yōu)選2到15分鐘，最優(yōu)選5分鐘。
又在另一種分離脂肪組織來源的基質(zhì)細胞的方法中，利用了諸如在Katz等的US 5,786,207中所描述的機械系統(tǒng)。使用系統(tǒng)將脂肪組織樣品引入到自動化裝置中，使其進入洗滌階段和分離階段，其中組織被攪拌并旋轉(zhuǎn)，從而在離心預備狀態(tài)的容器中收集所得的細胞懸液。以這種方式，從組織樣品中分離脂肪來源的細胞，保持目的細胞的細胞完整性。
脂肪來源的細胞可以通過美國專利No.6,153,432(特此引用作為參考)中公開的方法培養(yǎng)。從其它組織分離基質(zhì)細胞的類似技術對本領域技術人員將會是顯而易見的，包括但不限于來源于骨、骨髓、軟骨、結締組織、包皮、韌帶、外周血、胎盤、平滑肌、骨骼肌、腱、臍帶血和其它部位的基質(zhì)細胞。
III.輻照脂肪來源的基質(zhì)細胞脂肪組織來源的基質(zhì)細胞可以被輻照。細胞必須以抑制增殖但允許合成支持胚胎干細胞的重要因子的劑量輻照。此類方案的細節(jié)是本領域技術人員所熟知的。
IV.培養(yǎng)基增強已進一步確認可以向培養(yǎng)基中添加額外的組分。此類組分包括抗生素、白蛋白、氨基酸及本領公知的用于培養(yǎng)細胞的其它組分。
培養(yǎng)基中的其它添加物可以包括IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3配體、BAFF(B細胞活化因子的TNF家族的新配體)、artemin(屬于GDNF家族的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、lymphotactin、巨噬細胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被稱為生長分化因子-8)、neurturin、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、多效蛋白、干細胞因子、干細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子以及成纖維細胞生長因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性、FGF-堿性)、LIF及細胞培養(yǎng)領域公知的并且交替地用于增強增殖、維持和促進干細胞定向分化的其它生長因子、細胞因子和趨化因子。生長和增殖增強量可根據(jù)細胞的種或株以及因子的類型或純度而變化。一般而言，培養(yǎng)液內(nèi)每種因子0.5到500ng/ml足夠了。在更窄的范圍內(nèi)，F(xiàn)GFb和LIF含量為10到20ng/ml。不論實際的含量是否已知，每種因子的最佳濃度可以由本領域技術人員常規(guī)地確定。這種確定通過個別地以及組合地滴定各因子直到獲得最佳生長而進行。另外，也可以測試其它因子以確定它們增強FGFb和LIF對ES細胞增殖的效果的能力。如下文所述，用于增強ES細胞增殖的這種其它因子或因子組合包括在上述組合物中。并且，模擬這些因子功能的化合物及FGFb和LIF的片段被用于增強細胞生長和增殖變?yōu)镋S細胞，并且包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
備選地，F(xiàn)GFb和LIF被用于維持ES細胞。維持ES細胞必需的FGFb和LIF的量比增強生長或增殖變成ES細胞所需的量要小得多。不過，細胞可以維持在飼養(yǎng)層上而不添加生長因子。最佳地，添加LIF以增強維持。
一般而言，利用來自不同于ES、原生殖細胞、生殖細胞或胚胎外胚層細胞的來源的物種的FGFb或LIF。然而，所用的所有因子特別是所用的SF優(yōu)選來自與所用的細胞類型相同的物種。不過，來自各物種的FGFb或LIF常規(guī)地用來自不同物種的細胞進行功效篩選和選擇。FGFb或LIF的重組片段也可以象來自如化學文庫的有機化合物一樣進行功效篩選。
本發(fā)明也提供了制備多能ES細胞的方法，包括在細胞生長條件下施加生長增強量的FGFb、LIF和/或胚胎外胚層細胞，由此制備多能ES細胞。因此，原生殖細胞以及胚胎外胚層細胞作為組合物在這些因子存在下培養(yǎng)，以產(chǎn)生多能ES細胞。如上文所指出的那樣，典型地該組合物包括脂肪組織來源的基質(zhì)細胞飼養(yǎng)層。
V.基因修飾組織來源的基質(zhì)細胞本發(fā)明的另一方面涉及將外來基因引入到組織來源的基質(zhì)細胞中，從而所述組織來源的基質(zhì)細胞攜帶該新的遺傳材料，并可表達目的基因產(chǎn)物。用于轉(zhuǎn)導到脂肪組織來源的基質(zhì)細胞中的遺傳材料的實例包括那些表達在該飼養(yǎng)層支持的特定干細胞的生長和增殖中具有作用的任何基因產(chǎn)物的遺傳材料。
從而組織來源的基質(zhì)細胞由感興趣的遺傳材料修飾(被轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)。這些修飾的細胞接著可以與胚胎干細胞或成體干細胞共培養(yǎng)以使之增殖。
組織來源的基質(zhì)細胞可以通過向細胞摻入遺傳材料，例如利用重組表達載體來進行基因修飾。
如本文所用，“重組表達載體”是指包含以下裝配組件的轉(zhuǎn)錄單位(1)在基因表達中具有調(diào)控作用的遺傳元件，例如啟動子或增強子，(2)被轉(zhuǎn)錄為mRNA并被翻譯成蛋白的結構或編碼序列，和(3)合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。用于真核表達系統(tǒng)的結構單位優(yōu)選包括能夠使宿主細胞胞外分泌翻譯蛋白的前導序列。備選地，當表達的重組蛋白沒有前導或轉(zhuǎn)運序列時，它可以包括N-端甲硫氨酸殘基。該殘基可以或可以不隨后從表達的重組蛋白中切除以提供終產(chǎn)物。
組織來源的基質(zhì)細胞因而可以在染色體DNA中整合了重組轉(zhuǎn)錄單位，或者攜帶該重組轉(zhuǎn)錄單位作為定居質(zhì)粒組分。例如，細胞可以離體用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進行改造。細胞可以利用含有編碼多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒通過本領域公知的操作進行改造。
本文所述的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體所來自的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒例如羅斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、髓增殖肉瘤病毒以及哺乳動物腫瘤病毒。在一個實施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體為來自于鼠胚胎干細胞的MGIN。
編碼多肽的核酸序列處于合適的啟動子的控制之下?？梢允褂玫暮线m的啟動子包括但不限于TRAP啟動子，腺病毒啟動子，例如腺病毒主要晚期啟動子；巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；羅斯肉瘤啟動子；誘導型啟動子例如MMT啟動子，金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，例如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；反轉(zhuǎn)錄病毒LTR；ITR；β-肌動蛋白啟動子以及人類生長激素啟動子。啟動子也可以是調(diào)控編碼多肽的基因的天然啟動子。這些載體也使得調(diào)節(jié)經(jīng)工程化的先祖細胞產(chǎn)生多肽成為可能。合適啟動子的選擇對于本領域技術人員將是顯而易見的。
除反轉(zhuǎn)錄病毒以外的載體可以用來基因工程化或者修飾組織來源的基質(zhì)細胞。感興趣的遺傳信息通過任何可在這種細胞中表達新遺傳材料的任何病毒引入。例如，SV40、皰疹病毒、腺病毒、腺伴隨病毒以及人乳頭瘤狀病毒被用于此目的。也可以利用其它方法將克隆的真核DNA引入到培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，例如，待轉(zhuǎn)移到干細胞中的遺傳材料可以是病毒核酸的形式。
另外，表達載體可以含有一個或多個可選擇的標記基因，以提供篩選轉(zhuǎn)化細胞的表型特征，例如二氫葉酸還原酶或新霉素抗性。
組織來源的基質(zhì)細胞可以通過本領域公知的其它方法轉(zhuǎn)移。這樣的方法包括但不限于磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染；聚陽離子Polybrene介導的轉(zhuǎn)染；原生質(zhì)體融合；電穿孔；脂質(zhì)體，或者通過將DNA或RNA包囊在脂質(zhì)體里面，接著使脂質(zhì)體與細胞膜融合，或者將包被有合成的陽離子脂質(zhì)的DNA通過融合引入到細胞中。
本發(fā)明進一步使得以這樣的方式基因改造組織來源的基質(zhì)細胞，以便它們可在體外或體內(nèi)產(chǎn)生在天然組織來源的基質(zhì)細胞中通常不以生物學有意義量產(chǎn)生或者小量產(chǎn)生的多肽、激素和蛋白成為可能。然后這些產(chǎn)物將分泌到周圍培養(yǎng)基中或者從細胞中純化。以這種方式形成的組織來源的基質(zhì)細胞可以作為表達的物質(zhì)的持續(xù)的短期或長期產(chǎn)生系統(tǒng)。這些基因可以表達如激素、生長因子、基質(zhì)蛋白、細胞膜蛋白、細胞因子和/或粘附分子。
現(xiàn)在將通過下列實施例更加充分地描述本發(fā)明。不過，本發(fā)明可具體體現(xiàn)為許多不同的形式，而不應當理解為限于本文所列的實施方案；確切地講，提供這些實施方案，從而使公開更加徹底和完整，并將充分地向本領域技術人員傳達本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1輻照的人類脂肪來源的基質(zhì)細胞對胚胎干細胞的體外支持輻照脂肪組織來源的基質(zhì)細胞使得它們可用來在體外支持人類胚胎干細胞的增殖。在外源生長因子不存在或存在時進行研究，所述生長因子包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配體、BAFF(B細胞活化因子的TNF家族的新配體)、artemin(屬于GDNF家族的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、lymphotactin、巨噬細胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被稱為生長分化因子-8)、neurturin、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、多效蛋白、干細胞因子、干細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子以及成纖維細胞生長因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性和堿性成纖維細胞生長因子)。還對胚胎干細胞的功能進行檢測。
在任何實驗之前，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞以103到105細胞/cm2之間的密度平板接種在基質(zhì)培養(yǎng)基中[Halvorsen等，2001，Metabolism50407-413]。細胞在培養(yǎng)物中維持直至鋪滿，這時候用3500到5000拉德(1拉德＝0.01戈瑞)的γ輻射進行有絲分裂滅活。胚胎干細胞根據(jù)已經(jīng)建立的方法通過免疫切除術分離自胚泡期胚胎的內(nèi)細胞團[Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18399-404；Thomson等1998，Science 2821145-1147；Odorico等2001，Stem Cells 19193-204]。用鏈霉蛋白酶消化透明帶，并利用合適的抗-物種特異性血清抗體接著暴露于豚鼠補體通過免疫切除術分離內(nèi)細胞團。將所得的ICM細胞涂布到輻照的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞層上。
培養(yǎng)物在Dulbecco′S改良Eagle′s培養(yǎng)基(無丙酮酸，高葡萄糖配制)、敲除Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基或補充有15-20％胎牛血清或15-20％敲除SR(Gibco/BRL，Gaithersburg MD)、對胚胎干細胞生長優(yōu)化的血清替代品[Price等1998，WO98/30679]、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、抗生素并添加高達2,000單位/ml的人重組白血病抑制因子(LIF)、高達4ng/ml的人重組堿性成纖維細胞生長因子和高達10μM的毛喉素的等價培養(yǎng)基的存在下維持[Amit等2000，Dev Biol 227271-278；Reubinoff等2000，NatureBiotechnology 18399-404；Shamblott等1998，Proc Natl Acad SciUSA 9513726-13731；Thomson等1998，Science 2821145-1147]。
9到15天后，通過暴露于具有1mM EDTA或其它二價陽離子螯合劑的無鈣無鎂磷酸緩沖鹽溶液、通過暴露于分散酶(10mg/ml)、或者通過微量移液器機械分離將單個集落分離而成塊[Thomson等1998，Science 2821145-1147]。
所得的細胞或細胞塊序貫平板接種到新鮮培養(yǎng)基中輻照的人類脂肪組織來源的基質(zhì)細胞上?？寺“疵?天的數(shù)量級擴增并傳代，并表現(xiàn)出大約36小時的倍增時間。克隆隨后的傳代通過重復細胞解體操作(消化、微量移液器處理)以及通過將所得的細胞涂布到輻照的MEF上進行。
胚胎干細胞的維持通過將假定的細胞植入到免疫缺陷小鼠的骨骼肌中進行評估。隨后畸胎癌的生長(顯示了衍生自所有三個胚層的組織的存在)提供了脂肪組織來源的基質(zhì)層增殖多能干細胞的功能證據(jù)。
實施例2輻照的人類脂肪來源的基質(zhì)細胞對人類胚胎干細胞細胞系的體外支持如實施例1中那樣，在任何實驗之前，將人類脂肪組織來源的基質(zhì)細胞以103到105細胞/cm2之間的密度平板接種在基質(zhì)培養(yǎng)基中[Halvorsen等，2001，Tissue Eng.7(6)729-41]。細胞在培養(yǎng)物中維持直至鋪滿，這時候用3500到5000拉德(1拉德＝0.01戈瑞)的γ輻射進行有絲分裂滅活。現(xiàn)有的人胚胎干細胞細胞系通過暴露于具有1mM EDTA或其它二價陽離子螯合劑的無鈣無鎂磷酸緩沖鹽溶液、通過暴露于分散酶(10mg/ml)、或者通過微量移液器機械分離而從鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層中解離[Thomson等1998，Science 2821145-1147]。將所得的單個細胞和細胞塊涂布到已建立的輻照的人脂肪組織來源的基質(zhì)細胞飼養(yǎng)層上。培養(yǎng)物在Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(無丙酮酸，高葡萄糖配制)、敲除Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基或補充有15-20％胎牛血清或15-20％敲除SR(Gibco/BRL，Gaithersburg MD)、對胚胎干細胞生長優(yōu)化的血清替代品[Price等，WO98/30679]、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、抗生素并添加高達2,000單位/ml的人重組白血病抑制因子(LIF)、高達4ng/ml的人重組堿性成纖維細胞生長因子和高達10μM的毛喉素的等價培養(yǎng)基的存在下維持[Amit等2000，Dev Biol 227271-278；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18399-404；Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 9513726-13731；Thomson等1998，Curr Top Dev Biol 38133-165]。
克隆按大約每7天擴增并傳代，并表現(xiàn)出大約36小時的倍增時間[Amit等2000，Dev Biol 227271-278]?？寺‰S后的傳代通過重復細胞解體操作(消化、微量移液器處理)以及通過將所得的細胞涂布到輻照的MEF上進行。
胚胎干細胞的維持通過將假定的細胞植入到免疫缺陷小鼠的骨骼肌中進行評估。隨后畸胎癌的生長(顯示了衍生自所有三個胚層的組織的存在)提供了脂肪組織來源的基質(zhì)層增殖多能干細胞的功能證據(jù)。
實施例3基因治療修飾以下實驗概要描述了將脂肪組織來源的基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_因子的細胞的方法，所述因子包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配體、BAFF(B細胞活化因子的TNF家族的新配體)、artemin(屬于GDNF家族的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、lymphotactin、巨噬細胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被稱為生長分化因子-8)、neurturin、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、多效蛋白、干細胞因子、干細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子以及成纖維細胞生長因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性或堿性成纖維細胞生長因子)，以提高它們在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的胚胎干細胞支持能力。也包括對胚胎干細胞的功能進行檢測。
人類脂肪組織來源的基質(zhì)細胞被基因工程化以表達外源基因，增強它們支持人類胚胎干細胞在體外增殖和維持的能力。人類脂肪組織來源的基質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)物用合適的載體轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染，所述載體編碼人類白血病抑制因子(LIF)、人類堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)或鑒定為支持胚胎干細胞增殖的相關細胞因子或生長因子的cDNA。
轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染的人類脂肪來源的基質(zhì)細胞如上文實施例1和2中所示用于制備飼養(yǎng)層?；蛐揎楋曫B(yǎng)層的存在預期可減少在體外共培養(yǎng)維持胚胎干細胞中添加外源生長因子的需要。
實施例4人類脂肪來源的基質(zhì)細胞的流式細胞儀分析脂肪來源的基質(zhì)細胞表達許多粘附蛋白和表面蛋白；這些蛋白總結于表1。許多這些蛋白具有行使造血支持功能的潛力，并且它們?nèi)紴楣撬杌|(zhì)細胞共同享有。還顯示了對CD9、CD29(β1整聯(lián)蛋白)、CD44(透明質(zhì)酸受體)、CD49d(α4整聯(lián)蛋白)、CD55(衰變加速因子)和HLA-ABC(I類組織相容性抗原)的代表性的流式細胞分析柱狀圖(圖1)。
分離自單個供體的未分化的人類脂肪來源的基質(zhì)細胞用針對所示抗原的單克隆抗體(實線，每個圖表的右側)或同種型單克隆對照抗體(虛線，每個圖表的左側)染色。代表n＝5個供體。條柱表示熒光強度＞99％對照。
表1脂肪來源的基質(zhì)細胞表面標志和細胞因子
實施例5脂多糖(LPS)誘導細胞因子mRNA的PCR分析脂肪來源的基質(zhì)細胞用100ng/ml LPS誘導0或4小時并收集總RNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA用對白介素6和8、粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子及粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、flt-3配體和白血病抑制因子特異性的引物對進行擴增(圖2)。肌動蛋白信號在每個反應中作為相等cDNA水平的對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)序列確認。
PCR結果通過ELISA分析在蛋白質(zhì)水平得到了證實(表2)。如表中所示，基質(zhì)細胞在LPS誘導后的24小時之內(nèi)顯著增加它們分泌IL-6、IL-7、IL-8、M-CSF、GM-CSF和TNFα。
測定了來自多個供體的人類脂肪來源的基質(zhì)細胞的細胞因子表達特征(表2)。在這些實驗中，用脂多糖(LPS，100ng/ml)和條件培養(yǎng)基誘導鋪滿的靜止的脂肪來源的基質(zhì)細胞培養(yǎng)物，并在1到24小時的周期之后收集總RNA。與鼠和人骨髓來源的基質(zhì)細胞共同的是，脂肪來源的基質(zhì)細胞表達下列細胞因子mRNA白介素6、7、8和11(IL-6，-7，-8，-11)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、flt-3配體、干細胞因子、腫瘤壞死因子α(TNFα)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和4t(BMP-2，-4)(圖2)。
表2.脂多糖誘導分泌的細胞因子(ELISA，pg/ml)
(表2中的數(shù)值為來自n＝5到8個基質(zhì)細胞供體的平均值±S.E.M.。在向100ng脂多糖/ml培養(yǎng)基暴露所示的時間后用未稀釋的、1∶25或1∶125稀釋的條件培養(yǎng)基進行ELISA。IL-7 ELISA在0.16到10pg/ml之間是線性的。星號表示根據(jù)單向ANOVA，在8或24小時與0小時時間點之間的*p＜0.05?？s略語N.D.，不可檢測。)實施例6倍數(shù)擴增檢查了人類脂肪來源的基質(zhì)細胞在體外支持人類臍帶血CD34+造血先祖細胞增殖和分化的能力。在24孔板上建立鋪滿的脂肪來源的基質(zhì)細胞的培養(yǎng)物(6×104細胞/孔)。臍帶血標本通過用羥乙基淀粉(hetastarch)處理排除污染的紅細胞，并通過Ficoll密度離心排除污染的粒細胞。余下的UCB單核的細胞根據(jù)StemSepTM(StemCells，Vancouver，BC)方案進行細胞系耗竭(lineage depleted)；這有賴于利用針對CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b以及血型糖蛋白A的抗體的混合物的免疫磁性陰性細胞選擇。在最后的純化步驟中，lin-UCB細胞用CD34抗體染色，并通過流式細胞儀分類。多達10,000個終末CD34+UCB細胞在單孔中與鋪滿的脂肪來源的基質(zhì)細胞層共培養(yǎng)。培養(yǎng)物在缺乏外源細胞因子下維持12天、3周或6周。在這些周期結束時，通過胰蛋白酶/EDTA消化收集單孔，并利用下列抗體組合的組合(熒光標記顯示在括號中)通過流式細胞儀進行分析CD45(FITC)、CD34(APC)以及CD7、CD10或者CD38(PE)。圖3顯示對來自12天脂肪基質(zhì)共培養(yǎng)物的造血細胞檢查總細胞擴增(左表)、CD34+細胞擴增(中表)或者將其種植在MS5細胞上5周并檢查髓樣長期培養(yǎng)引發(fā)(LTC)細胞的擴增。
在缺乏外源細胞因子的情況下，脂肪來源的基質(zhì)細胞支持總造血細胞數(shù)目的5.1-倍擴增(平均，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體；范圍2-9.4)(圖3)。這相應于CD34+UCB細胞群的2.4-倍擴增(平均，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體；范圍1.4-3.3)(圖3)。
對于得益于前述說明書和相關附圖中呈現(xiàn)的教導的本發(fā)明所屬技術領域的技術人員來說，本發(fā)明的修飾和其它實施方案將是顯而易見的。因而，應當理解本發(fā)明不局限于所公開的具體實施方案，并且修飾和其它實施方案旨在包括在所附的權利要求書的范圍之內(nèi)。雖然本文使用了具體術語，它們僅僅是以通稱和描述性的意義使用的，而并非用于限制目的。
權利要求
1.組合物，包括能夠支持干細胞在體外增殖和維持的分離的基質(zhì)細胞，與干細胞組合。
2.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞是人類的。
3.權利要求1的組合物，其中向基質(zhì)細胞中引入了外源遺傳材料。
4.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞分泌蛋白。
5.權利要求1的組合物，其中分泌的蛋白是生長因子、細胞因子或促進干細胞增殖的任何蛋白。
6.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞被輻照。
7.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于脂肪組織。
8.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于骨髓。
9.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于韌帶組織或腱。
10.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于骨骼肌。
11.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于平滑肌。
12.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于骨。
13.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于軟骨。
14.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于結締組織。
15.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于外周血。
16.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于皮膚。
17.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于臍帶血。
18.權利要求1的組合物，其中基質(zhì)細胞來源于胎盤。
19.權利要求1的組合物，其中干細胞是胚胎來源的。
20.權利要求1的組合物，其中干細胞是成體來源的。
21.權利要求1的組合物，其中干細胞表達端粒酶。
22.權利要求1的組合物，其中干細胞選自包括神經(jīng)元干細胞、肝干細胞、造血干細胞、臍帶血干細胞、表皮干細胞、胃腸干細胞、內(nèi)皮干細胞、肌肉干細胞、間充質(zhì)干細胞和胰腺干細胞的組。
23.權利要求1的組合物，其中干細胞保持未分化。
24.生長和維持培養(yǎng)的干細胞的方法，包括i)分離組織來源的基質(zhì)細胞；和ii)在培養(yǎng)基中與干細胞一起培養(yǎng)該基質(zhì)細胞。
25.權利要求24的方法，進一步包括補充生長因子、細胞因子和趨化因子培養(yǎng)。
26.權利要求26的方法，其中生長因子、細胞因子和趨化因子選自白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配體、B細胞活化因子、artemin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、lymphotactin、巨噬細胞炎性蛋白、肌抑制素、neurturin、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、多效蛋白、干細胞因子、干細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子以及成纖維細胞生長因子，F(xiàn)GF-酸性和堿性成纖維細胞生長因子。
27.權利要求25的方法，其中生長因子、細胞因子和趨化因子促進干細胞的分化。
28.權利要求25的方法，其中生長因子、細胞因子和趨化因子抑制干細胞的分化。
29.權利要求24-28中任一項的方法，其中分離的基質(zhì)細胞在與干細胞一起培養(yǎng)前被輻照。
30.權利要求24-29中任一項的方法，其中干細胞是胚胎來源的。
31.權利要求24-29中任一項的方法，其中干細胞是成體來源的。
32.權利要求24-29中任一項的方法，其中干細胞選自包括神經(jīng)元干細胞、肝干細胞、造血干細胞、臍帶血干細胞、表皮干細胞、胃腸干細胞、內(nèi)皮干細胞、肌肉干細胞、間充質(zhì)干細胞和胰腺干細胞的組。
33.權利要求24-29的方法，其中基質(zhì)細胞分離自包括脂肪組織、骨髓、韌帶組織或腱、骨骼肌、平滑肌、骨、軟骨、結締組織、外周血、皮膚、臍帶血和胎盤的來源。
34.權利要求24-33中任一項的方法，其中分離的基質(zhì)細胞被基因工程化以表達生長因子、細胞因子或趨化因子。
35.權利要求34的方法，其中生長因子、細胞因子和趨化因子選自白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配體、B細胞活化因子、artemin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、lymphotactin、巨噬細胞炎性蛋白、肌抑制素、neurturin、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、胎盤生長因子、多效蛋白、干細胞因子、干細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子以及成纖維細胞生長因子，F(xiàn)GF-酸性和堿性成纖維細胞生長因子。
36.權利要求32的方法，其中干細胞維持在未分化的狀態(tài)。
37.權利要求32的方法，其中干細胞在培養(yǎng)中分化。
全文摘要
本發(fā)明提供了基于利用基質(zhì)細胞支持體外未分化的胚胎干細胞或成體干細胞增殖的細胞、組合物和方法。該方法產(chǎn)生的干細胞可用于提供未定型的或分化的和有功能的細胞的來源用于研究、移植和形成組織工程產(chǎn)品，用來治療人類疾病以及體內(nèi)任何組織或器官部位的創(chuàng)傷性組織損傷修復。
文檔編號C12N5/0789GK1596303SQ02823582
公開日2005年3月16日 申請日期2002年11月12日 優(yōu)先權日2001年11月9日
發(fā)明者C·勒夫特, W·O·威爾金森, B·奇塔姆, J·M·金貝爾, Y－D·C·霍爾沃森 申請人:阿特塞爾科學公司