專利名稱：包含精油或其衍生物的殺微生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制微生物生長的制劑和方法。更詳細地說，本發(fā)明涉及在易腐農(nóng)產(chǎn)品、家庭和人類衛(wèi)生等方面用于抑制微生物生長的制劑和方法，所述制劑包含精油組分或其衍生物以及穩(wěn)定劑，所述的精油組分衍生物是通過將精油組分暴露在光照射之下或經(jīng)氧化而得到的。
背景技術(shù)：
易腐農(nóng)產(chǎn)品的腐爛是由微生物感染引起的。通常，這些農(nóng)產(chǎn)品要儲存足夠長的時間，在儲存期內(nèi)，存在著有利于各種微生物的繁殖的條件，因而，極為常見的是，大部分此類農(nóng)產(chǎn)品會受到感染。除了這種腐爛會造成顯而易見的大量經(jīng)濟損失之外，一些這樣的微生物還會產(chǎn)生對人類有害的毒性和致癌代謝物。
目前，主要是通過從外部施用合成殺真菌劑和/或殺細菌劑來控制易腐農(nóng)產(chǎn)品的病原體感染。但是，這些合成化學(xué)品會在農(nóng)產(chǎn)品中留下有毒殘留物。此外，也已觀察到已產(chǎn)生了微生物抗性株系。因此，管理部門正逐步停止使用多種這樣的殺真菌劑和殺細菌劑。所述的殘留毒性和停用可能性導(dǎo)致了開發(fā)現(xiàn)有防腐用合成化學(xué)品的替代品。
以下描述了幾種替代品。例如，用紫外光照射農(nóng)產(chǎn)品(Ben-Yehoshua，S.，Rodov，V.，Kim，J.J.和Carmeli，S.，1992年，Preformed and inducedantifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decayresistance by heat and ultraviolet treatments.J.Agric.Food Chem.，401217-122 1；Rodov，V.，Ben-Yehoshua，S.，Kim，J.J.，Shapiro，B.和Ittah，Y.，1992年，Ultraviolet illumination induces scoparone production in kumquatand orange fruit and improves decay resistance.J.Amer.Soc.Hortic.Sci.，117188-192)，或者使農(nóng)產(chǎn)品接觸拮抗性酵母菌(Wilson，C.L.和Chalutz，E.，1989年，Postharvest biocontrol of Penicillium rots of citrus with antagonisticyeasts and bacteria.Scientia Horticulturae，40105-112)。但是，紫外線照射有可能對植物有毒，而使用所述拮抗性酵母菌的生物控制目前在商業(yè)上還無法得到充分的接受，這有可能是因為其對病原體的控制還不夠。此外，這些方法存在著多種缺陷，一些相關(guān)的衛(wèi)生主管部門還沒有批準(zhǔn)其中的一些方法。
柑橘類水果以及其他多種植物對病原體具有某種內(nèi)源抗性，這是由于其植物組織內(nèi)能產(chǎn)生抗微生物物質(zhì){Ben-Yehoshua，S.，Rodov，V.，Kim，J.J.和Carmeli，S.，(1992)Preformed and induced antifungal materials of citrusfruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat andultraviolet treatments.J.Agric.Food Chem.，401217-1221；Ben-Yehoshua，S.，Rodov，V.，F(xiàn)ang，D.Q.和Kim，J.J.，(1995)Preformed antifungalcompounds of citrus fruiteffect of postharvest treatments with heat andgrowth regulators.J.Agric.Food Chem.431062-1066；Rodov，V.，Ben-Yehoshua，S.，F(xiàn)ang，D.Q.和Kim，J.J.，(1995)Preformed antifungalcompounds of lemon fruitcitral and its relation to disease resistance.J.Agric.Food Chem.431062-1066}。以前已經(jīng)證實這些物質(zhì)包含精油組分，這些精油組分表現(xiàn)出了抗微生物的廣譜活性。美國專利5,334,619和5,958,490描述了使用多種天然油作為防止采收后的農(nóng)產(chǎn)品腐爛的活性劑。但是僅有極少數(shù)的精油組分具有殺微生物活性。
檸檬醛[3，7-二甲基-2，6-辛二烯基醛]是一種精油組分，該精油組分是在多種柑橘類水果以及一些其他植物例如檸檬草和桉樹之中天然產(chǎn)生的。檸檬醛是屬于萜系列的一種不飽和醛，由香葉醛和橙花醛的同分異構(gòu)體混合物組成。由于檸檬醛具有強烈的檸檬香氣及味道，其已廣泛應(yīng)用于食品和化妝品工業(yè)。檸檬醛作為一種安全的食品添加劑已得到公認(rèn)，美國食品及藥物管理局已批準(zhǔn)將其用于食品。已證實檸檬醛具有非常有效而且廣譜的抗微生物及抗真菌活性。事實上，Ben Yehoshua(本耶霍舒亞)等人(1992)和Rodov等人(1995)已經(jīng)證實檸檬醛是檸檬果實中最具活性的基本的抗菌化合物。
苧烯，即1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯(也稱為1，8-萜二烯)是富含精油組分的另一個例子，該化合物可從柑橘類水果的外皮腺中提取。美國專利4,379,168和5,951,992分別描述了苧烯作為殺蟲劑和除害劑的用途。但是，純態(tài)形式的該化合物抗菌活性極低。Chalchat等人(Chalchat，J.C.，Chiron，F(xiàn).，Garry，R.Ph.和Lacoste(2000)，J.Essent.Oil Res.12，125-134)公開了氫過氧化苧烯針對人類病原體的抗微生物活性。
Aureli等人(Aureli，P.，Costantini，A.和Zolea，S.，1992，Antimicrobialactivity of some plant essential oil against Listeria monocytogenes.J.FoodProtection，55344-348)證實一些精油組分對病原菌如李斯特桿菌(Listeria)具有高抗菌活性，并建議將其用于防止李斯特桿菌對食品的感染。
已經(jīng)多次嘗試將檸檬醛用于控制各種農(nóng)產(chǎn)品的腐爛。已證實檸檬醛可減少接種了曲霉屬菌(Aspergillus)的以下農(nóng)產(chǎn)品的谷物變質(zhì)高水分大麥(Nandi，B.，Thomke S.和Fries，N.，1977年，Preservation of high moisturebarley grains with citral and allyl caproate and preliminary acceptability testswith piglets.Acta Agric.Scand.，27105-109)、稻谷(Mallick，A.K.和Nandi，B.，1982年，Deterioration of stored rough rice.IV.Preservation andpalatability of citral and propionic acid treated grains.Acta Agric.Scand.，32177-187)和小麥(Ghosh，J.和Nandi，B.，1985年，Preservation of highmoisture wheat by some antifungal volatile compounds and palatability testswith rats.Acta Agric.Scand.，35245-254)。Arora和Pandey(Arora，R.和Pandey，G.N.，1977年，The application of essential oils and their isolates forblue mold decay control in Citrus reticulata Blanco.J.Food Sci.and Tech.1414-16)報道稱檸檬醛、香葉醇和其他精油化合物減少了蘆柑(Citrusreticulata)果實的青霉病腐爛。本發(fā)明人(Ben-Yehoshua，S.，Rodov，V，Kim，J.J.和Carmeli，S.，1992年，Preformed and induced antifungal materials ofcitrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat andultraviolet treatments.J.Agric.Food Chem.，401217-1221)已證實，對接種了青霉菌的檸檬施用外源的檸檬醛可顯著抑制它們的腐爛。
在將精油組分用于農(nóng)產(chǎn)品的防腐的在先應(yīng)用中，大部分是將精油組分以水性乳劑的形式施用于農(nóng)產(chǎn)品。盡管通過使用所述物質(zhì)達到了部分防止農(nóng)產(chǎn)品腐爛的效果，但是在商業(yè)上，尚未將包括檸檬醛和香葉醇在內(nèi)的精油組分用于易腐農(nóng)產(chǎn)品的防腐處理。不使用這些物質(zhì)的一個主要原因是當(dāng)將這些物質(zhì)以對微生物有效的濃度施用于易腐農(nóng)產(chǎn)品時，會造成對農(nóng)產(chǎn)品的損壞，因而有可能導(dǎo)致以后的腐爛。例如，精油會造成水果的果皮損壞和肉類變色。這種損壞有可能是嚴(yán)重的，并導(dǎo)致處理過的農(nóng)產(chǎn)品在較短的時間后發(fā)生明顯腐爛。造成其商用性不足的另一個原因是它們的不穩(wěn)定性，因為許多精油是不穩(wěn)定的，而且在發(fā)揮其殺菌活性之前易于分解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下的事實食品級精油組分或者將它們暴露于光照射之下或經(jīng)氧化得到的衍生物可用作穩(wěn)定有效的殺微生物制劑中的活性成分，用于抑制微生物生長。在所述的制劑中，防止了所述精油組分的已知植物毒性損害，并延長了所述精油組分或其衍生物的穩(wěn)定性，從而得到了一種對環(huán)境友好的殺微生物組合物。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種新型的殺微生物水性制劑，該制劑包含(i)有效量的至少一種精油組分或其衍生物或它們的混合物，所述的精油衍生物是經(jīng)光照射處理或經(jīng)氧化得到的；以及(ii)至少一種附加的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑選自由10％～約50％的乙醇、乳化劑、抗氧化劑和膠囊劑組成的組。
乙醇的添加量為約10％～約50％。所述的精油組分選自單萜烴類、倍半萜烴類、氧化的萜衍生物、非萜衍生物，所述的非萜衍生物是例如醛類、醇類、酸類或酚類。在該水性殺微生物組合物中，所述精油的濃度是約0.1％～約1％(v/v；體積比)。所述經(jīng)光照射得到的精油衍生物的濃度是約1000μL/L～約12,000μL/L。該殺微生物組合物還可包含附加量的另一種殺生物劑，該殺生物劑的用量少到其自身不足以抑制微生物的生長。
本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制易腐農(nóng)產(chǎn)品中微生物的生長的方法，該方法通過施用以下所述的殺微生物水性制劑來抑制所述微生物的生長，所述的殺微生物水性制劑包含(i)有效量的至少一種精油組分或其衍生物或它們的混合物，所述的精油衍生物是經(jīng)光照射處理或經(jīng)氧化得到的以及(ii)至少一種附加的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑選自由10％～約50％的乙醇、乳化劑、抗氧化劑和膠囊劑組成的組。
乙醇的添加量為約10％～約50％。所述的精油組分選自由單萜烴類、倍半萜烴類、氧化的萜衍生物或非萜衍生物組成的組，所述的非萜衍生物是例如醛類、醇類、酸類或酚類。所述制劑還可包含少量的另一種除害劑，該除害劑的用量少到其自身不足以抑制微生物的生長。
本發(fā)明的另一目的是提供抑制家庭中微生物生長的方法，該方法是通過單獨施用本發(fā)明的殺微生物水性制劑或?qū)⑺鲋苿┡c常用的洗滌劑一起施用來抑制微生物的生長。
本發(fā)明的另一目的是提供所述殺微生物制劑在人類衛(wèi)生方面的應(yīng)用，其中是將所述精油或其衍生物與適用的添加劑一起加入到皂條、衛(wèi)生洗滌劑、盤碟洗滌劑、漱口劑、消毒用品或化妝用品中。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述殺微生物制劑作為用于緩解或治療由微生物引起的輕度感染的保健品以及對人體健康有利的保健品的應(yīng)用。


為了理解本發(fā)明以及了解如何在實踐中實施本發(fā)明，以下將通過非限制性實施例并參考附圖來描述優(yōu)選實施方案。在本發(fā)明的附圖中圖1表示的是通過將經(jīng)日曬的苧烯、苧烯或檸檬醛注射到成熟綠檸檬的白色內(nèi)皮中或通過釋放成熟綠檸檬的油腺的內(nèi)含物來誘使成熟綠檸檬產(chǎn)生東喘寧。
圖2表示的是檸檬的果實成熟度對成熟的綠檸檬果和黃檸檬果中產(chǎn)生植物抗毒素的影響。
圖3表示的是接種了青霉菌的葡萄柚在檸檬醛制劑和香葉醇制劑中浸漬處理后的腐爛速度。
圖4比較了接種了青霉菌的檸檬經(jīng)過不同處理后的腐爛速度，其中的一個檸檬試樣經(jīng)過以下物質(zhì)的處理用25％乙醇、amif72(丙二醇溶液，其中含20％丁羥茴醚(BHA)、6％沒食子酸丙酯和4％檸檬酸)、β-環(huán)糊精(β-CD)和聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(Tween 20；吐溫20)穩(wěn)定化的檸檬醛(Ci)水性乳劑，對另一相同種類的檸檬試樣進行處理時采用了5000ppm的吐溫20但沒有使用乙醇。
圖5表示的是接種了青霉菌的檸檬的腐爛速度，其中采用包含辛基-苯基聚醚醇(Triton X100)和丁羥茴醚(BHA)的檸檬醛水性乳劑對接種了青霉菌的檸檬進行了處理。
圖6比較了接種了青霉菌的檸檬經(jīng)過不同處理后的腐爛速度，其中將包含聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(吐溫20)和丁羥茴醚(BHA)的檸檬醛水性乳劑與加有抑霉唑(imazalil)的乳劑的處理結(jié)果進行了比較。(抑霉唑是一種殺真菌劑，常用于水果和蔬菜的采收后保護)圖7比較了接種了青霉菌的檸檬經(jīng)過不同處理后的腐爛速度，其中將包含綠檸檬外皮的二氯甲烷粗提物(CRU)的25％乙醇水性乳劑與含1000ppm抑霉唑的溶液以及25％乙醇溶液的處理效果進行了比較。
圖8表示的是接種了青霉菌的檸檬經(jīng)過不同處理后的腐爛速度，其中，這些檸檬經(jīng)過各種復(fù)合制劑的25％乙醇水性溶液的處理，所述復(fù)合制劑包含檸檬醛、1-辛醇和使用前已日曬4小時的檸檬外皮的二氯甲烷粗提物，該粗提物以25％乙醇為溶劑。
圖9表示的是接種了青霉菌的檸檬的腐爛速度，該檸檬經(jīng)過含5000ppm苧烯的25％乙醇溶液處理，該苧烯已作日曬3小時處理。該圖比較了浸漬時間長短以及浸漬次數(shù)的影響。
圖10表示的是接種了青霉菌的檸檬的腐爛速度，該檸檬經(jīng)過2500ppm苧烯的水性溶液的處理，該苧烯在使用前用紫外線照射3小時，然后溶于25％乙醇。我們比較了用該溶液作1分鐘浸漬處理(3UVL)和在同一溶液中連續(xù)三次1分鐘浸漬處理(3UVL3)的結(jié)果，其中后者每次浸漬之間相隔1小時。將這些處理結(jié)果與在水中或在25％乙醇中浸漬的結(jié)果進行比較。
圖11表示的是氫過氧化苧烯對接種了指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)的檸檬果實腐爛百分率的影響，該氫過氧化苧烯是用玫瑰紅(Rose Bengal)進行光氧化而制得的。
圖12表示的是氫過氧化苧烯對接種了指狀青霉菌的檸檬果實的腐爛情況的影響，該氫過氧化苧烯是用鉬酸鹽催化劑制得的。
圖13表示的是除去玫瑰紅催化劑以及吐溫20的劑量對由氫過氧化苧烯處理的檸檬果實的植物毒性的影響。
圖14表示的是檸檬醛制劑對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞的生長情況的影響。
圖15表示的是檸檬醛和經(jīng)日曬處理的苧烯對白色念珠菌(Candidaalbicans)細胞的生長情況的影響。
具體實施例方式
如上所述，本發(fā)明提供了一種對環(huán)境友好的殺微生物制劑，該制劑可有效地防止農(nóng)產(chǎn)品的腐爛，還可用于家庭、人類衛(wèi)生以及作為保健性組合物。所述的水性的殺微生物制劑包含以下物質(zhì)作為活性成分的至少一種精油組分或其衍生物，或這類精油和/或其衍生物的混合物，所述的精油衍生物是經(jīng)光照射處理或經(jīng)氧化得到的；以及至少一種附加的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑選自由用量為約10％～約50％的乙醇、乳化劑、抗氧化劑和膠囊劑組成的組。所述穩(wěn)定劑的作用是穩(wěn)定所述精油組分以免這些組分在發(fā)揮它們的殺微生物作用之前分解和/或防止和/或降低這些化合物的植物毒性。所述的殺微生物性精油組分選自單萜烴類、倍半萜類、氧化的萜衍生物、非萜衍生物，所述的非萜衍生物例如是醛類(檸檬醛或壬醛)、醇類(辛醇或壬醇)或酚類(香芹酚(cravacrol))。該水性殺微生物制劑可有效地用于控制和抑制微生物的生長。所有的精油組分公知是食品級組分。還應(yīng)當(dāng)強調(diào)的是，所述水性的殺微生物制劑的所有組分均為食品級，因而不會給人體造成任何危害。一個特別廣泛的潛在用途是用于保護易腐農(nóng)產(chǎn)品，從而使其不發(fā)生由微生物引起的腐爛。農(nóng)產(chǎn)品可包括例如有可能因微生物感染而腐敗的任何新鮮食品，如水果、蔬菜、肉類或魚。該制劑的其他潛在用途可以是需要提供保護以便有效防止微生物侵害的任何場合，例如家庭使用、身體衛(wèi)生或保健品。對于家庭使用，該水性殺微生物制劑可以單獨使用或與市售洗滌劑一起使用。對于將該精油組分或其衍生物用于身體衛(wèi)生，可將有效量的該精油組分或其衍生物添加到皂條、清洗制劑、用來洗餐具的洗滌劑、漱口劑或漱口組合物或除臭液或除臭組合物。有效量的本發(fā)明精油組分，特別是選自檸檬醛、紫蘇醛或苧烯的精油組分也可以用作保健性組合物的一部分。所述的保健性組合物可以達到兩種效果，即提供針對微生物感染的保護以及產(chǎn)生額外的健康好處，例如引入抗癌活性等。據(jù)發(fā)現(xiàn)包含了例如檸檬醛、苧烯、香葉醇、薄荷醇、香芹酮或紫蘇醛等精油的本發(fā)明的幾種制劑可起到抗癌劑的作用，并可降低膽固醇和LDL(低密度脂蛋白)的水平。已知檸檬醛和香茅醛具有鎮(zhèn)靜和放松情緒的作用，并有助于身體保持適當(dāng)?shù)南δ?。所述的精油組分還以植物營養(yǎng)品或功能性食品而著稱。
本領(lǐng)域公知一些精油組分可有效地抵抗特別是農(nóng)產(chǎn)品中的微生物。但是，精油組分受累于兩個固有問題，這兩個問題至今仍然限制著它們的實際應(yīng)用。一個問題與它們有限的穩(wěn)定性有關(guān)，這是由于當(dāng)精油暴露于氧氣中時，其氧化過程將導(dǎo)致該精油的快速分解。因此，盡管它們作為強力殺微生物劑的用途是公知的，但是由于使用期過短，它們的有效使用受到了限制。如果為了延長精油的殺微生物效果而大量使用精油則將最終導(dǎo)致第二個與其使用有關(guān)的缺陷當(dāng)水果與高濃度精油接觸特別是所用的混合物沒有形成真正溶液時，將導(dǎo)致對該產(chǎn)品的損害。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述精油組分作為殺微生物組合物中的活性成分與至少一種穩(wěn)定或溶解該精油組分的添加劑一起施用時，可得到不會導(dǎo)致對農(nóng)產(chǎn)品的任何損害并且穩(wěn)定有效的殺微生物組合物。所述添加劑選自乙醇、抗氧化劑、乳化劑或膠囊劑。這些添加劑以不同的機理來保護所述精油組分。添加本身具有殺生物活性的乙醇是為了溶解所述精油組分并防止植物毒性，其應(yīng)當(dāng)以約10％～約50％的用量存在。所述的乳化劑保持形成微膠態(tài)(microcollolidial)溶液，該溶液有助于預(yù)防該精油組分的植物毒性。所述的乳化劑可選自由烷基芳基聚醚醇(DX)、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(吐溫20)、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(吐溫80)、辛基-苯基聚醚醇(Triton 100)組成的組。這些乳化劑中的一些是食品級的，例如吐溫20。所述乳化劑的濃度應(yīng)當(dāng)高于0.1％(w/w；重量比)。
所述的抗氧化劑降低了導(dǎo)致所述精油分解的氧化反應(yīng)的速度。它還減少了精油固有的植物毒性。所述的抗氧化劑可選自包括但不局限于例如以下化合物的組丁羥茴醚(BHA)、抗壞血酸、異抗壞血酸、α-生育酚、丁羥甲苯(BHT)、β-胡蘿卜素或它們的各種混合物。本發(fā)明的制劑中，所述抗氧化劑的濃度優(yōu)選是約0.05％～約0.8％(w/v；重量體積比)。表1中證實了在將BHA添加到檸檬醛中的情況下，所述抗氧化劑在降低精油的植物毒性方面的效果，表1中提供了果皮瑕疵指標(biāo)(Peel Blemish Index)，此處應(yīng)當(dāng)理解的是BHA本身不會造成任何瑕疵。
所述的果皮瑕疵指標(biāo)是通過下式得到的

瑕疵分?jǐn)?shù)是0＝無瑕疵；1＝輕微瑕疵；2＝中等瑕疵；3＝嚴(yán)重瑕疵。
表1.抗氧化劑BHA的1分鐘浸漬對檸檬果實的果皮瑕疵的作用，所述檸檬果實在浸漬后置于20℃放置20天。

添加到所述制劑中的膠囊劑與精油組分一起形成復(fù)合體，從而防止所述精油組分降解并延長其有效殺滅微生物的作用期。所述的膠囊劑可以是任何種類的食品級基質(zhì)或由碳水化合物制得的聚合物或蛋白質(zhì)或其他基質(zhì)，例如非限制性地有玉米淀粉、麥芽糊精、β-環(huán)糊精、硅膠、酪蛋白、殼聚糖和它們的各種混合物。低分子量的聚乙烯和各種蠟也可用作膠囊材料。事實上，已發(fā)現(xiàn)將檸檬醛添加到不包含任何殺菌劑的各種蠟制劑中時，增強了檸檬醛在減少腐爛和降低植物毒性方面的效力。將環(huán)糊精加入到檸檬醛中也可以延長檸檬醛在被處理的橙子果實表面的有效期。本發(fā)明的制劑中，所述膠囊劑的濃度優(yōu)選是約0.1％～約0.8％(w/v)。
乳化劑的添加降低了所述精油固有的植物毒性。其效果以添加了乳化劑的精油檸檬醛的瑕疵指標(biāo)的形式示于表2。
表2.含乳化劑(與檸檬醛的比率為1∶1)的檸檬醛溶液的植物毒性的檢查評估結(jié)果匯總1。

1將該果實在所述乳劑中浸漬1分鐘，然后在20℃保持1個月。植物毒性的測定方法與表1相同。
應(yīng)當(dāng)注意的是，除了至少一種精油組分、由精油組分經(jīng)照射得到的衍生物或它們的混合物之外，所述的殺微生物組合物還可包含極低濃度的另一種殺生物劑。如此低濃度的所述殺生物劑其本身不足以防止微生物的損害，但是將其與本發(fā)明的精油或其衍生物一起使用時，可防止微生物引起的腐爛。所述殺生物劑的非限制性例子是抑霉唑、噻苯咪唑、雙胍鹽、異菌脲(rovral)、咪鮮胺(prochloraz)、鄰苯基苯酚鈉、甲菌靈(metalaxyl)、乙膦鋁、克菌丹、羥喹啉、氯硝胺、苯扎氯銨、canon(卡農(nóng))、甲基托布津、嗪氨靈、多菌靈、triademinol(三唑醇)、乙烯菌核利(vinclozolin)、乙環(huán)唑(etaconazole)或它們的各種混合物。添加的所述除害劑的濃度可以是約5ppm～約100ppm。使用包含精油組分或由其暴露在光照射下得到的衍生物和少量殺菌劑的所述組合物將帶來以下兩個重要好處1.減少殺生物劑的有毒殘留物，這一點是所有衛(wèi)生主管部門對于所有毒性殺菌劑的重要要求。
2.控制病原體對殺生物劑產(chǎn)生抗性。
這個特殊要點可通過使用包含或不包含殺生物劑組分的新型制劑而實現(xiàn)。事實上，不同的殺生物劑可能具有不同的作用模式，因此即使只是在較短的時期內(nèi)使用不同的殺生物劑，也被認(rèn)為是控制殺生物劑的抗性種群的推薦方式。
本發(fā)明的精油組分可通過合成制得，或者是包含多種精油組分的植物提取制品即精油組分的混合物。它也可以是經(jīng)純化的、富含單種精油組分或其任何組合的天然精油制品。含天然精油的制品可以由例如柑橘果實、檸檬草和桉樹等各種植物制得。精油化合物的具體非限制性例子有檸檬醛、1-辛醇、庚醇、壬醇、香葉醇、辛醛、壬醛、癸醛、紫蘇醛、紫蘇醇、香茅醇、香茅醛、香芹酮、香芹醇、芳樟醇、香草醛、肉桂醛、肉桂酸、丁香酚、薄荷醇、苧烯、香芹酚、萜品醇、百里酚、香草醛和樟腦。當(dāng)本發(fā)明中通過光照射處理對精油進行衍生作用時，所述的衍生作用可在合成制得的精油中、天然提取的精油中或包含多種精油的粗提物中完成。在后一種情況下，有可能在對一種或多種精油進行衍生的同時，不影響其他的精油。此外，光照射處理可以在從精油組分的天然來源中提取精油組分之前完成或者在提取之后完成。
根據(jù)本發(fā)明，由至少一種精油組分或其經(jīng)光照射得到的衍生物與乳化劑和抗氧化劑組成的混合物可以直接作為抗微生物組合物加入到食品、化妝用品和家庭用品中以用于殺滅微生物。而且，需要時可以通過加入適量的無毒基質(zhì)從而以液體或氣溶膠的形式制得該混合物，然后通過添加或噴灑來殺滅微生物。
在所有情況下，熟練的技術(shù)人員均可容易地確定所述的至少一種精油組分達到效果所需的濃度，該濃度依賴于精油的類型以及該制劑的施用方式。對于檸檬醛或香葉醇來說，有效量的范圍是約0.1％～1％，特別是0.2％～0.4％。
可在需要保護的農(nóng)產(chǎn)品儲存前或儲存期間多次對其施用所述制劑。當(dāng)將該制劑施用于水果時，優(yōu)選在包裝前例如采收后進行施用。本發(fā)明的制劑可通過任何方法施用于農(nóng)產(chǎn)品，其中只需使該農(nóng)產(chǎn)品與有效量的所述制劑接觸即可，所述有效量即抑制其在整個儲存期內(nèi)不受微生物感染的量。施用方法的例子是在食品加工廠對水果進行浸漬、熏蒸、噴霧及鼓泡的方法。另一方法是使這些物質(zhì)摻入蠟乳劑。事實上，如上所述，蠟乳劑是處理多種柑橘類水果的適用溶劑。
另一施用方法是利用許多活性物質(zhì)例如檸檬醛的揮發(fā)性在基本上密閉的處理室內(nèi)對水果進行熏蒸。
另一種可能的施用方法是將所述活性物質(zhì)裝載在用作干燥劑或吸收劑的硅膠材料上。這種材料在所述的活性物質(zhì)中可吸收超過其自重10％的活性物質(zhì)，然后將其固著為膠囊化的實體。但是，當(dāng)這種材料的環(huán)境濕度上升時，那么這些具有活性的殺生物劑將釋放出來，而水將取代它們。事實上，當(dāng)水果封閉在儲存室內(nèi)或在盛放不斷蒸發(fā)的易腐農(nóng)產(chǎn)品的任何容器中時就是這種情況。所述的施用方式可提供該殺菌劑的可控的緩慢釋放，從而實現(xiàn)較長時間的防腐保護。
所述制劑還可以通過可緩慢降解的聚合物進行施用，該類聚合物在其降解期間將把包含在其中的精油化合物釋放到農(nóng)產(chǎn)品上。
根據(jù)本發(fā)明，所述油制劑的pH值優(yōu)選是酸性的，但是也可以是pH值最高達9的堿性。
如上所述，所述的水性殺微生物制劑應(yīng)當(dāng)包含用于溶解所述至少一種精油組分的穩(wěn)定劑。當(dāng)所述穩(wěn)定劑是乙醇時，已證實在抑制未接種的華盛頓橙(Washington orange)果實的腐爛方面，濃度為0.2％的檸檬醛以含10％～50％乙醇的制劑的形式施用比以相同濃度的水性乳劑的形式施用更為有效(表3，也可參見實施例4)。
表3檸檬醛和50％乙醇對未接種華盛頓橙的腐爛百分率的影響(數(shù)字＝腐爛果實的百分?jǐn)?shù))

此外，與通常情況相反，此處施用精油沒有對農(nóng)產(chǎn)品造成明顯損害。在有10％～50％乙醇存在的條件下，精油沒有產(chǎn)生植物毒性損害。即使以本領(lǐng)域公知會造成很大損害的較高濃度(0.5％～1％)施用精油時，也沒有發(fā)生所述的植物毒性損害。
采用在食品加工廠測試過的所有柑橘類水果(結(jié)果示于表3和4)及芒果和青椒果實(數(shù)據(jù)未列出)，所述制劑減少腐爛的效果由此得到證實。用青椒的實驗表明該制劑良好控制了以色列胡椒的主要病原體葡萄孢灰霉菌(Botrytis cinerea)和互格鏈格孢(Alternaria alternata)。
表4.日曬3小時的苧烯對金桔果實的腐爛的影響，處理后將該金桔果實于10℃儲存11天，再進行貨架期模擬即于20℃放置6天。
處理 儲存結(jié)束時水浸漬 12.0b乙醇25％7.9ab苧烯11.6a1日曬3小時，5000μL/L，在25％乙醇+5000μL/L的吐溫20中。
定量地看，精油組分苧烯屬于單萜烴類這一族，其占柑橘中存在的精油組分的約85％。但是，所述苧烯不具有足夠的活性。盡管該化合物活性不高，但是已發(fā)現(xiàn)，通過將均質(zhì)化的果皮暴露在陽光下，然后用有機溶劑特別是二氯甲烷、己烷或乙酸乙酯提取油類，苧烯可用作高活性殺微生物劑的前體。也可在提取苧烯后，通過用UV(紫外線)照射苧烯，達到相同的效果(圖9和10)。這同樣適用于合成制得的苧烯。此外，使用常規(guī)的氧化劑也可將苧烯氧化。一個具體的非限制性例子是使用鉬酸鹽的多相催化。
因此，本發(fā)明的殺微生物劑可包含苧烯或含足夠量的經(jīng)光照射的苧烯的精油粗提物。應(yīng)當(dāng)注意的是，當(dāng)使用已作過光照射處理的所述精油衍生物時，不應(yīng)使用抗氧化劑。
對苧烯作這樣的光照射處理可導(dǎo)致快速光氧化反應(yīng)，該反應(yīng)可形成高活性的抗菌物質(zhì)。所述的物質(zhì)可作為在香草醛-硫酸測試(以下稱作“香草醛測試”)中生成紫色的組分而得到表征，或者優(yōu)選在經(jīng)UV燈照射的情況下，通過由此得到的藍色熒光對其進行表征。盡管該測試有可能與其他萜及其衍生化合物反應(yīng)，但是仍然可通過苧烯的該特定產(chǎn)物所具有的典型顏色和它在色譜圖上的保留值比Rf來對其進行表征。通過將苧烯暴露在紫外線下或白光下或通過日曬，可完成光氧化反應(yīng)。在這三種情況下，所得的物質(zhì)在HPLC(高效液相色譜)中具有相同的保留時間。這些物質(zhì)在香草醛測試中產(chǎn)生了同樣的紫色，并且在薄層色譜板上產(chǎn)生了相同的點。由此可認(rèn)為，所有這些照射方式產(chǎn)生了相同的物質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)葉綠素參與了苧烯的這一產(chǎn)生新產(chǎn)物的光氧化反應(yīng)，該新產(chǎn)物在香草醛測試中提供了呈陽性的紫色響應(yīng)。所述的物質(zhì)在抑制指狀青霉菌分生孢子伸長的生物鑒定中顯示出高度的抗真菌活性。其所產(chǎn)生的活性比作為柑橘類水果的內(nèi)源性植物抗毒素而公知的物質(zhì)即東喘寧或東莨菪亭的活性要高得多，而且也比檸檬醛的活性要高得多，而檸檬醛是檸檬果實中已知的最具活性的基本抗真菌物質(zhì)(Ben Yehoshua等，1992年)。
另一觀測結(jié)果表明所述物質(zhì)誘導(dǎo)了柑橘類水果的抗性機制，例如誘使植物抗毒素的積聚(圖1)。將5μl經(jīng)光氧化的苧烯注射到緊靠外皮下的白色內(nèi)皮組織內(nèi)以對未接種的檸檬進行處理，結(jié)果在這些檸檬中誘導(dǎo)產(chǎn)生了足夠水平的東喘寧或東莨菪亭來保護該果實免受病原體的侵襲。已證實檸檬外皮的二氯甲烷或己烷粗提物可徹底防止腐爛(圖7)，因此注射所述粗提物也能得到與以上經(jīng)光氧化的苧烯相似的結(jié)果。相似地是，損傷油腺或?qū)⑵r烯注射到成熟綠檸檬的白色內(nèi)皮組織內(nèi)產(chǎn)生了非常顯著的引出柑橘類水果的內(nèi)源抗性機制的作用，這一作用如圖1中東喘寧的積聚所示。損傷黃色果實卻只能得到低得多的響應(yīng)，這表明果實的成熟度影響這種抗性響應(yīng)，果實越成熟受到的保護越少(圖2)。事實上，許多其他實驗中也觀察到了黃色果實的這種低抗性。有趣的是，注射檸檬醛不會誘發(fā)同樣的保護性響應(yīng)(圖1)。與苧烯不同，檸檬醛的注射有可能沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生香草醛陽性的活性物質(zhì)。此外，將接種的果實浸入防腐的二氯甲烷粗提物中后(圖7)，測得了更高水平的東喘寧(超過1000μg/g鮮重)和東莨菪亭(超過200μg/g鮮重)。所測得的植物抗毒素的水平是完全控制病原體所需的量的好幾倍。因此，顯而易見的是，所形成的氫過氧化苧烯形成了反應(yīng)性氧物質(zhì)，該物質(zhì)誘出了植物的免疫系統(tǒng)。所述的反應(yīng)性氧物質(zhì)同樣也影響了病原體。這些反應(yīng)性氧物質(zhì)壽命較短，在水果配銷到市場之前很早就分解了。
本發(fā)明的一個重要方面是既通過直接抑制病原體又通過誘發(fā)植物抗性的內(nèi)源性機制來實現(xiàn)對病原體引起的腐爛的控制。因此，經(jīng)日曬或紫外線處理的苧烯或日曬處理的粗提物發(fā)揮了直接的抗真菌活性以及誘導(dǎo)內(nèi)源抗性的作用。
先前雖然報道過照射苧烯可產(chǎn)生多種過氧化物，但該報道與所述的抗真菌活性不存在任何關(guān)聯(lián)(Schieberle，P.，Maier，W.，F(xiàn)irl，J.和Grosch，W.1987年，HRGC separation of hydroperoxides formed during thephotosensitized oxidation of(R)-(+)-limonene.J.of High ResolutionChromatography & Chromatography Communications，p.588)?，F(xiàn)已證實，所形成的氫過氧化物，具體地說是1-氫過氧化[(1S，4R)-萜-2，8-二烯]；1-氫過氧化[(1R，4R)-萜-2，8-二烯]；2-氫過氧化[(2R，4R)-萜-6，8-二烯]；以及2-氫過氧化[(2S，4R)-萜-6，8-二烯]，這些氫過氧化物均可用作本發(fā)明的水溶液中有效的殺生物劑。氣相色譜-質(zhì)譜測定法和核磁共振研究(未列出數(shù)據(jù))已證實本發(fā)明的經(jīng)照射的苧烯中存在這些氫過氧化物。本發(fā)明中，開發(fā)了可提供高濃度氫過氧化物的新方法，其中采用了玫瑰紅作為將反應(yīng)中的氧提高到單態(tài)氧能量水平的催化劑或活化劑。采用這種方法可使幾乎全部的苧烯轉(zhuǎn)化為所述氫過氧化物。由這些氫過氧化物組成的混合物甚至以2500ppm的劑量就非常有效地控制了接種檸檬的腐爛(圖11)。
所完成的實驗明確地顯示，如果不對果皮的所述粗提物或所述提取的苧烯進行照射或不將其日曬處理，則所得的苧烯溶液實際上不具有充分的活性，而且在抑制腐爛方面極為不穩(wěn)定。這種情況下，腐爛將不斷蔓延，就像該水果根本沒有與殺微生物制劑接觸一樣。因此，所述的抗菌活性以及由東喘寧的積聚所證實的抗性機制的誘導(dǎo)與苧烯的這些氫過氧化物有關(guān)。
對檸檬外皮的所述二氯甲烷或己烷提取物的日曬或照射應(yīng)當(dāng)進行3～6小時。提取的氫過氧化物制劑作為殺生物組合物的功效隨果實與所述氫過氧化物溶液接觸的時間增長而增強。將接種的果實在氫過氧化物溶液(將苧烯日曬4小時)內(nèi)以每次1分鐘的方式連續(xù)浸漬四次，結(jié)果使接種檸檬在20℃下的防腐期超過三星期(圖9)。在采用未接種果實的商業(yè)式實驗中，比較將苧烯日曬3小時所產(chǎn)生的效果及其防腐功效與未處理的(浸漬在水中)或用乙醇溶液(25％)處理的效果及防腐功效，其結(jié)果匯總于表4。此外，使用由苧烯溶于25％乙醇溶液制成的、已充分轉(zhuǎn)化的5000、10000或20000ppm的水性制劑進行果園噴霧，由此誘導(dǎo)未采摘(和已采摘)的巴倫西亞果(Valencia fruit)內(nèi)產(chǎn)生東喘寧和東莨菪亭，并且減少了該水果在采收后接種指狀青霉菌時的腐爛(數(shù)據(jù)未列出)。
在一個單獨的實驗中，檸檬醛和日曬處理的苧烯(溶于25％乙醇)均表現(xiàn)出對生長于接種的玉米芯中的另一病原體多主枝孢(Cladosporiumherbarum)的顯著抑制作用。
柑橘類食品加工廠中控制腐爛的常規(guī)方法包括幾種對環(huán)境友好的化合物，但因技術(shù)原因這些化合物并不包括在本制劑中。所述的化合物是鈣鹽、赤霉酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、乙醛、殼聚糖或殼聚糖加低濃度的金屬如Zn或Cu、一些有機酸如乙酸或丙酸等。這些化合物可以作為本發(fā)明的對環(huán)境友好的新制劑的一部分。事實上，近來的數(shù)據(jù)證明了所述的活性。實際上，在接種的果實的實驗中將所述制劑的pH值降低到2或3也有助于控制病原體。
現(xiàn)在將在下列非限定性實施例中，間或參考附圖更詳細地闡述本發(fā)明。
實施例實施例1比較精油與抑霉唑在對指狀青霉菌的最低抑制濃度以及作用方式上的區(qū)別評價(體外)柑橘類水果的油腺中發(fā)現(xiàn)的50多種化合物的最低抑制濃度(MIC)，其方法是確定該化合物在培養(yǎng)皿中的病原體不再增長(體外)的情況下的最低濃度。表5顯示更具潛力(與抑霉唑相比)的化合物的MIC。在盛有15ml熔化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)(50℃)的無菌培養(yǎng)皿中(90mm)加入溶于0.5ml丙酮的所需量的每種待測化合物，以使最終濃度為1毫克/毫升。輕輕晃動該培養(yǎng)皿以確保待測化合物均勻分布，然后放置待瓊脂凝固。從未開始形成孢子的指狀青霉菌的瓊脂平板培養(yǎng)物上切離菌絲體圓盤(8mm)，并利用所述圓盤接種所述培養(yǎng)皿。將所述菌絲體圓盤放置在各個待測培養(yǎng)皿的中央，并在24℃下培養(yǎng)。7天后通過測量菌絲生長的直徑，監(jiān)測抑制真菌情況。
進一步進行實驗(體外)來研究作用方式是殺真菌的還是抑制真菌的；將取自分析板的接種物的菌絲體圓盤轉(zhuǎn)移至只含有PDA的平板上。然后在隨后5天中監(jiān)測平板上的生長情況。如果繼續(xù)生長，則將該化合物歸為抑制真菌的，如果不繼續(xù)生長，則將該化合物歸為殺真菌的。結(jié)果見表5和表6。
表5抑制指狀青霉菌的最低濃度(MIC)和作用方式待測化合物 MIC 作用方式mg/ml瓊脂抑霉唑＜0.025殺真菌癸醇 0.05 抑制真菌辛醇 0.1殺真菌壬醇 0.2抑制真菌檸檬醛0.4殺真菌肉桂醛0.4殺真菌紫蘇醛0.4殺真菌紫蘇醇0.4殺真菌香茅醛0.6抑制真菌萜品醇0.8殺真菌香芹醇1.0抑制真菌表6在體外瓊脂擴散分析中，各種化合物對三種不同的柑橘病原體的抑制效果病原體的生長抑制面積1(cm2)化合物白地霉 柑橘青霉菌柑橘鏈格孢(Geotrichum Candidum)(Penicillium italicum)(Alternaria citri)抑霉唑 8.3 完全抑制 42.8肉桂醛 24.2 完全抑制 完全抑制辛醛 3.6 2.6 5.3癸醇 0.95 完全抑制 完全抑制1-辛醇 完全抑制 完全抑制 完全抑制紫蘇醛 完全抑制 完全抑制 完全抑制檸檬醛 10.6 完全抑制 完全抑制1完全抑制為最大抑制，其為62.3cm2瓊脂擴散分析方法制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Difco)并將其滅菌。使培養(yǎng)基在水浴中冷卻至50℃，然后將指狀青霉孢子的無菌水懸浮液加入培養(yǎng)基中進行接種，培養(yǎng)基中孢子的最終濃度為104個孢子/ml。輕輕混合培養(yǎng)基以使孢子均勻分散，然后在每個直徑為90mm的培養(yǎng)皿中分配15ml培養(yǎng)基。用移液管將5mg每種待測物質(zhì)吸至無菌的13mm抗菌的沃特曼分析紙圓片上，所述的圓片被放置在接種的瓊脂平板中央。將平板在24℃培養(yǎng)3天。通過測量從紙圓片的邊緣到真菌生長的區(qū)域之間的透明區(qū)的寬度來檢測抗真菌活性。測量值為培養(yǎng)皿上抑制病原體生長的區(qū)域的半徑(mm)。完全抑制意味著生長被完全抑制。
在另外的實驗中(未顯示數(shù)據(jù))，已發(fā)現(xiàn)檸檬醛和其他精油制劑可有效控制真菌指狀青霉菌和細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)的生長，所述胡蘿卜軟腐歐文氏菌細菌為農(nóng)產(chǎn)品的主要病原體。
實施例2從果園中采收沒有瑕疵的葡萄柚，并于同一天在實驗室中再次分選以除去受損的水果。用自來水沖洗葡萄柚并使其在空氣中自然干燥。然后使用工具在每個水果的三個不同的部位共刺三針，刺入外皮組織1.5mm深而進行接種。在每次針刺前，將所述的工具浸泡在指狀青霉菌的孢子懸浮液(106個孢子/ml)中。將接種后的葡萄柚放置24小時，溫度為17℃，相對濕度為85％，然后將葡萄柚分成6組，通過在下列溶液中浸漬2分鐘處理每組的葡萄柚(a)水；(b)25％乙醇(EtOH)；(c)溶有0.2％香葉醇的25％乙醇；(d)溶有0.1％檸檬醛的25％乙醇；(e)溶有0.2％檸檬醛的25％乙醇和(f)溶有0.5％檸檬醛的25％乙醇。
在處理后每天檢查每組中腐爛果實的百分比，圖3顯示了結(jié)果。
如圖3所示，對照組果實(只在水中浸漬)迅速腐爛，在接種后八天達到100％。在25％乙醇(EtOH)中浸漬的果實腐爛變慢，但是在接種后6天乙醇處理的果實開始迅速腐爛，在接種后三周超過50％的果實腐爛了。
相反，浸漬在下列物質(zhì)中的果實腐爛速度較慢溶有0.2％香葉醇的25％乙醇和溶有0.1％～0.2％檸檬醛的25％乙醇，在接種后第18天，這些組中只有20％～40％的果實腐爛。抑制腐爛最有效的是將接種后的水果浸漬在溶有0.2％檸檬醛的25％乙醇中，直至接種后18天其仍完全抑制腐爛，一直到接種后28天才有20％的果實腐爛。
0.5％檸檬醛劑量太大，在本實驗中，由于其植物毒性，使腐爛增強。
實施例3按照實施例2中所示的方法給檸檬接種，并使用25％乙醇和不使用25％乙醇處理，以確定5000ppm的乳化劑吐溫20是否能夠穩(wěn)定檸檬醛的抗真菌活性。結(jié)果參見圖4，其顯示該濃度的吐溫20增強了檸檬醛的活性。另外，該乳化劑避免了通常由未溶于乙醇時的檸檬醛引起的植物毒性。可能是該乳化劑使得能夠形成微膠態(tài)狀的穩(wěn)定乳劑，通過使檸檬醛均勻分散避免了植物毒性，而在這些濃度下檸檬醛本身是植物毒性的。這樣，聯(lián)合使用吐溫20與抗氧化劑BHA可代替制劑中的乙醇。
實施例4將未接種的華盛頓臍橙分成四組，并對其進行下列處理(a)未處理；(b)在50％乙醇中浸漬；(c)在溶有0.2％檸檬醛的0.02％L-77乳化劑(水性乳劑)中浸漬；(d)在溶有0.2％檸檬醛的50％乙醇中浸漬；和(e)在0.2％水性抑霉唑溶液中浸漬。
然后將臍橙在15℃、50％～75％相對濕度下貯存四個月，貯存期后在不同的時間階段檢查每組中腐爛果實的百分比。結(jié)果參見表3。
如表3所示，與用溶于水性乳劑的檸檬醛或只用乙醇處理相比，利用本發(fā)明的制劑(溶有0.2％檸檬醛的50％乙醇)處理后腐爛果實的百分比顯著降低。另外，采用本發(fā)明的制劑所得到的結(jié)果與由抑霉唑獲得的結(jié)果相當(dāng)。在本實驗中觀察到在檸檬醛處理時用0.02％乳化劑的情況下腐爛水平較高，這可能是由植物毒性引起的，原因在于或者缺少乙醇或者沒有采用較高濃度的乳化劑。
實施例5將牛肉塊分成下列兩組(a)未處理的肉塊；(b)在溶有0.2％檸檬醛的20％乙醇中浸漬30秒的肉塊。然后將肉塊貯存在1℃、85％相對濕度下，并在處理2周后，對每個肉塊的細菌菌群進行總計數(shù)。結(jié)果顯示用溶于20％乙醇中的檸檬醛處理的肉塊中的細菌群體的總計數(shù)不到未處理的肉塊中發(fā)現(xiàn)的總計數(shù)的10％。
實施例6將采用實施例2所示的方法接種青霉菌的檸檬置于各種濃度的含有檸檬醛、乳化劑(Triton X100)和BHA的水溶液中浸漬2分鐘。檸檬醛的濃度為1.0％。對照溶液含有0.5％的Triton X100。結(jié)果參見圖5。圖中清晰顯示了0.1％BHA在提高檸檬醛的抑制病原體生長的活性中的作用。
實施例7將采用實施例2所示的方法接種青霉菌的檸檬用含有0.5％檸檬醛、0.3％BHA、吐溫20和抑霉唑的水溶液處理，并貯存在20℃達21天。結(jié)果參見圖6。濃度為1ppm和10ppm的抑霉唑不足以完全控制腐爛。然而，向10ppm的抑霉唑中加入0.5％檸檬醛則完全避免了腐爛，并使這種有效但是不理想的合成抗菌劑的劑量得以降低，其殘留物得以減少。向1ppm的抑霉唑中加入檸檬醛不足以完全控制腐爛，但是比單獨使用1ppm抑霉唑好很多。
實施例8在含有檸檬醛、去污劑(吐溫20)、其他精油及一些較有效的精油的組合的水溶液中，將用104個孢子/ml青霉菌接種的檸檬浸漬一天后，放置六天。表7顯示了采用所述的多種精油達到的防護微生物侵害的效果。在這些實驗中，一些精油，尤其是肉桂酸、香草醛、辛醇和多種精油的混合物，比檸檬醛更有效。此外，它們抵抗指狀青霉菌的活性持續(xù)的時間更長。
表7將接種后的果實在20℃放置6天，各種精油對該果實的腐爛百分比的影響

實施例9從檸檬外皮獲得最具活性的粗提物的通用方法收集檸檬果實的外皮(外果皮)并在二氯甲烷中提取過夜，然后日曬約18小時直至二氯甲烷提取液的顏色變?yōu)楹稚⑼馄せ旌喜⑼ㄟ^一層沃特曼濾紙過濾。將提取的溶液蒸發(fā)以除去二氯甲烷并通過二氧化硅60柱的色譜法(以二氯甲烷作為載體)進一步分離濃液。在色譜分離后獲得一種為綠色和另一種為無色的兩種二氯甲烷餾分。通過使綠色的二氯甲烷餾分蒸發(fā)分離出活性的粗提物。將用104個孢子/ml的指狀青霉菌接種的檸檬果實在接種后24小時浸漬在乙醇溶液中，所述乙醇溶液含有提取的香草醛一陽性的化合物，然后將該浸漬液保持在20℃。在貯存期每天檢測化合物對果實上病原體發(fā)展的作用。圖7比較了各種濃度(10,000、5000和2500ppm的粗提物)所獲得的效果與乙醇溶液、抑霉唑或水獲得的效果。10,000ppm的粗提物完全抑制了病原體的發(fā)展。在如此高劑量的粗提物中，一些果實顯示出一些植物毒性。然而，由于可在保持殺生物活性的同時去除植物毒性，所以顯示所述植物毒性主要由另外的組分而不是活性的抗真菌組分引起的。
苧烯的己烷提取物獲得了類似的結(jié)果。
實施例10通過以下兩種途徑以苧烯制備氫過氧化苧烯。
途徑1通過光氧化在反應(yīng)約8小時后苧烯的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)的產(chǎn)率接近100％。將純乙醇作為溶劑，玫瑰紅作為激活劑。其它光激活劑例如葉綠素也催化了該反應(yīng)。將具有WG 345濾光片的高壓汞燈用于所述光催化反應(yīng)。其它光激發(fā)方式，例如單色光(在使用玫瑰紅時發(fā)射光≈345nm)、紫外光、激光也可以得到產(chǎn)物氫過氧化苧烯。
途徑2通過多相催化途徑(無光)將鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)作為催化劑，將作為氧化劑的300ml濃縮H2O2加入溶劑即700ml乙醇中。獲得理想的產(chǎn)物的反應(yīng)條件為常壓，溫度為50℃，持續(xù)攪拌下反應(yīng)時間為5至6小時。苧烯的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)的產(chǎn)率接近100％。
比較了兩種途徑的產(chǎn)物。用氣相色譜測量顯示產(chǎn)物的分布基本相似。采用相同的方法檢測用所述兩種不同途徑制備的產(chǎn)物的抗真菌活性。將用青霉菌(104個孢子/ml)接種的檸檬浸漬在水溶液中，該水溶液含有氫過氧化苧烯、去污劑(吐溫20)和乙醇。在26天期間按特定的間隔評價腐爛情況。圖11和圖12顯示了用這些混合物獲得的防護微生物侵害的結(jié)果。
在途徑1中，在浸漬后產(chǎn)生了水果的植物毒性。在混合物中增加吐溫20的量和除去玫瑰紅消除或至少明顯減少了這種植物毒性。通過采用己烷∶乙酸乙酯為9∶1的混合物并使所述溶液在硅柱上爬柱，從而將玫瑰紅從活性的氫過氧化物中分離出來。當(dāng)去除玫瑰紅后，發(fā)現(xiàn)若仍有植物毒性危害，也是非常小的。
使用的制劑含有0.25％氫過氧化苧烯、1％吐溫20、400ppm玫瑰紅和25％乙醇。這樣的組合物完全抑制了腐爛的發(fā)展，并且不具有任何植物毒性。在接種后60天，在處理的果實上沒有發(fā)現(xiàn)腐爛，而在作為對照的樣品中，接種的果實5天后就腐爛了(圖11)。這種抗真菌效果可通過氫過氧化苧烯的直接抗真菌作用以及由氫過氧化苧烯誘導(dǎo)的東喘寧和東莨菪亭的含量水平的升高得到解釋，這種誘導(dǎo)作用已由前文有關(guān)日曬處理的苧烯的實驗結(jié)果得到證實(圖1)。
在途徑2中，使用的制劑含有0.5％和0.25％氫過氧化苧烯、2％吐溫20和25％乙醇。在12天當(dāng)中接種的檸檬沒有腐爛(圖12)。劑量為0.5％的LHPO完全控制了腐爛，而0.25％的LHPO處理還是發(fā)生了一些腐爛。對照溶液含有2％吐溫20和25％乙醇，顯示了非常低的抗真菌活性(90％腐爛)，再次表明所述活性化合物為氫過氧化苧烯。
途徑1中作為催化劑使用的玫瑰紅存在不良作用其降低了抗真菌活性，增強了植物毒性，而且在反應(yīng)結(jié)束時必須將其從活性化合物中去除，鑒于上述事實優(yōu)選使用途徑2。
實施例11在含有檸檬醛、去污劑(吐溫20)、其他精油組分及日曬過的檸檬外皮的二氯甲烷粗提物的水溶液中浸漬用青霉菌(104個孢子/ml)接種的檸檬。在20天期間按特定的間隔時間評價腐爛的情況。圖8顯示了用所述的多種精油獲得的防護微生物危害的效果。
經(jīng)日曬的粗提物、濃度分別為0.5％和0.25％的檸檬醛及1-辛醇的組合表現(xiàn)出的對腐爛發(fā)展的抑制作用超過20天(圖8)。這些處理所產(chǎn)生的腐爛低于5％，而對照樣品的腐爛超過95％。另外使用以下組合處理后發(fā)生腐爛的果實低于10％∶0.25％檸檬醛和0.25％1-辛醇的組合，或0.25％檸檬醛和0.25％經(jīng)日曬處理的粗提物的組合，或0.125％檸檬醛、0.125％經(jīng)日曬處理的粗提物和0.125％1-辛醇的組合。
實施例12將純苧烯日曬三小時。通過將所述處理過的苧烯溶解于含有25％乙醇和去污劑(吐溫20)的水溶液中制備殺微生物的組合物。用104個孢子/ml青霉菌接種檸檬；在接種后一日內(nèi)將其在所述含有經(jīng)日曬的苧烯溶液的組合物中浸漬1次或最高達4次，每次1分鐘，并在20℃貯存。在貯存期間每天檢查經(jīng)日曬處理的苧烯對果實上的病原體發(fā)展的影響。圖9顯示了浸漬的次數(shù)和每次浸漬的時間長短對降低腐爛的影響。數(shù)據(jù)顯示由病原體或果實組織所吸收的物質(zhì)的量對結(jié)果有極大的影響。該圖顯示與僅浸漬一次相比，在浸漬更多次或浸漬較長時間后經(jīng)日曬處理的苧烯控制腐爛的效果更好。
實施例13用紫外線(254nm)照射純苧烯3小時。通過將所述處理過的苧烯溶解于含有25％乙醇和去污劑(吐溫20)的水溶液中制備殺微生物的組合物。用104個孢子/ml青霉菌接種檸檬；在接種后一日內(nèi)將其在所述溶液中浸漬1次或3次，在照射后的溶液中每次浸漬1分鐘，并在20℃貯存。在多次浸漬的情況下，在兩次連續(xù)浸漬之間使水果晾干1小時。
在一個月期間，檢查紫外線照射處理過的苧烯對果實上的病原體發(fā)展的影響。圖10顯示用25％乙醇溶液和在紫外線處理過的2500ppm苧烯中浸漬處理一次(定義為3UVL)這兩種方式對腐爛的抑制相似。在所有的處理中，在紫外線處理過的苧烯中連續(xù)浸漬3次(定義為3UVL3)控制腐爛的效果要好得多。對照溶液為含有吐溫20的水溶液。
實施例14在具有50～100μl不同濃度提取物的培養(yǎng)液肉湯(cy/gp)中于37℃培養(yǎng)野生型金黃色葡萄球菌細胞(5×108，OD600＝0.219)3小時。在600nm處測定OD值。樣品1含有2000ppm檸檬醛、25％乙醇和2000ppm吐溫20。樣品2除含有與樣品1相同的物質(zhì)之外，還含有500ppm β-CD和300ppm BHA。樣品1和樣品2都顯著抑制金黃色葡萄球菌細胞的生長。不含檸檬醛的相同組合物(樣品3和4)不能抑制所述病原體的生長(圖14)。
實施例15在具有50～100μl不同濃度提取物的培養(yǎng)液肉湯中于37℃培養(yǎng)野生型白色念珠菌細胞(1×103)。在600nm處測定OD值。
在6個不同的試管中提供如下處理試管12000ppm檸檬醛+25％乙醇+2000ppm吐溫-20。
試管22000ppm檸檬醛+25％乙醇+2000ppm吐溫-20+300ppmBHA。
試管32000ppm經(jīng)日曬處理的苧烯+2000ppm吐溫-20。
試管42000ppm經(jīng)日曬處理的苧烯+25％乙醇+2000ppm吐溫-20。
試管525％乙醇+2000ppm吐溫-20。
試管625％乙醇+2000ppm吐溫-20+500ppm β-CD+300ppm BHA。
完全抑制這種生物細胞的生長的有溶有2000ppm檸檬醛的25％乙醇和2000ppm吐溫20；或含有500ppm β-CD、300ppm BHA的相同物質(zhì)；或溶于25％乙醇或2000ppm吐溫20中的經(jīng)日曬處理的苧烯。不含檸檬醛或經(jīng)日曬處理的苧烯的物質(zhì)組合物(試管5和6)不能抑制所述病原體的生長(圖15)。
盡管結(jié)合特定實施方案描述了本發(fā)明，但顯然，按照上述描述，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，許多替換或變化是顯而易見的。因此，本發(fā)明旨在包括落入所附權(quán)利要求的要旨和范圍內(nèi)的所有替換和變化。
權(quán)利要求
1.一種殺微生物水性制劑，該制劑包含(i)有效量的至少一種精油組分或其衍生物或它們的各種混合物，所述的精油衍生物是由精油組分經(jīng)光照射處理或經(jīng)氧化得到的；以及(ii)至少一種附加的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑選自由10％～約50％的乙醇、乳化劑、抗氧化劑和膠囊劑組成的組。
2.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中所述的乳化劑選自包括烷基芳基聚醚醇、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、辛基-苯基聚醚醇和它們的各種混合物的組。
3.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中所述的抗氧化劑選自包括丁羥茴醚即BHA、抗壞血酸、丁羥甲苯即BHT、異抗壞血酸、α-生育酚、β-胡蘿卜素和它們的各種混合物的組。
4.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中所述的膠囊劑選自包括玉米淀粉、麥芽糊精、硅膠、β-環(huán)糊精、酪蛋白、殼聚糖和它們的各種混合物的組。
5.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中所述的精油組分選自包括單萜烴、倍半萜烴、氧化的萜衍生物、非萜衍生物的組，所述的非萜衍生物是例如醛、醇、酸、酯或酚。
6.如權(quán)利要求5所述的殺微生物水性制劑，其中所述的精油組分選自包括以下物質(zhì)的組紫蘇醛、檸檬醛、萜品醇、萜-4-醇、紫蘇醇、香芹酮、香芹醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、C7-11CHO、C7-10OH、香葉醇、苧烯、肉桂醛、肉桂酸、香芹酚、香草醛和它們的各種混合物。
7.如權(quán)利要求5所述的殺微生物水性制劑，其中所述的精油組分選自由檸檬醛、香葉醇、香芹酚、1-辛醇、紫蘇醛、癸醇、肉桂醛、肉桂酸及其混合物組成的組。
8.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中所述的精油組分衍生物是經(jīng)氧化的苧烯，優(yōu)選是氫過氧化苧烯。
9.如權(quán)利要求8所述的殺微生物水性制劑，其中所述的氧化是在有鉬酸鹽存在的條件下進行的多相氧化。
10.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中所述的精油組分衍生物是經(jīng)日曬處理的或經(jīng)紫外線照射的苧烯。
11.如權(quán)利要求10所述的殺微生物水性制劑，其中所述的苧烯是從苧烯的天然來源中提取出來的，然后再對該苧烯進行所述的日曬處理或紫外線照射。
12.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中在從天然來源中提取精油組分混合物前，日曬處理或紫外線照射含精油組分混合物的天然來源，所述的精油組分混合物包含一定量的苧烯。
13.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中在從天然來源中提取精油組分混合物后，日曬處理或紫外線照射提取出來的精油組分混合物，所述的精油組分混合物包含一定量的苧烯。
14.如權(quán)利要求12或13所述的殺微生物水性制劑，其中所述的含精油組分混合物的天然來源是柑橘果皮。
15.如權(quán)利要求10～14中任一項所述的殺微生物水性制劑，其中所述的苧烯或精油組分混合物的日曬時間約為4小時。
16.如權(quán)利要求10～14中任一項所述的殺微生物水性制劑，其中所述的苧烯或精油組分混合物經(jīng)紫外線照射的時間約為3小時。
17.如權(quán)利要求7所述的殺微生物水性制劑，其中所述的精油的濃度是約0.1％～約1％。
18.如權(quán)利要求16所述的殺微生物水性制劑，其中所述的經(jīng)光照射的苧烯或精油組分混合物的濃度在約1000μL/L～約12,000μL/L的范圍內(nèi)。
19.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，該水性制劑包含檸檬醛、1-辛醇和精油組分混合物作為活性成分，所述的精油組分混合物含有足夠量的苧烯，所述的精油組分混合物在提取出來后已經(jīng)過日曬處理或紫外線照射。
20.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，該水性制劑包含1-辛醇和含有足夠量的苧烯的精油組分混合物作為活性成分，所述的精油組分混合物在提取出來后已經(jīng)過日曬處理或紫外線照射。
21.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，該水性制劑還包含附加的濃度為約5ppm～約100ppm的殺生物劑。
22.如權(quán)利要求21所述的殺微生物水性制劑，其中所述的殺生物劑選自包括以下物質(zhì)的組抑霉唑、噻苯咪唑、雙胍鹽、異菌脲、咪鮮胺、鄰苯基苯酚鈉、甲菌靈、乙膦鋁、克菌丹、羥喹啉、氯硝胺、苯扎氯銨、卡農(nóng)、甲基托布津、嗪氨靈、多菌靈、三唑醇、乙烯菌核利、乙環(huán)唑或它們的各種混合物。
23.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，該制劑的pH值在約1～約9的范圍內(nèi)。
24.如前述任一項權(quán)利要求所述的殺微生物水性制劑，該制劑用于保護水果和蔬菜以避免采收后發(fā)生腐爛。
25.如前述任一項權(quán)利要求所述的殺微生物水性制劑，該制劑用于保護水果和蔬菜以避免采收前發(fā)生腐爛。
26.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，所述制劑用于防止肉類或魚類的腐敗。
27.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，所述制劑用于防止金黃色葡萄球菌細胞的生長。
28.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，所述制劑用于防止白色念珠菌的生長。
29.如權(quán)利要求1所述的殺微生物水性制劑，其中所述的精油是用作保健性組合物的組分的香葉醇、紫蘇醛、苧烯或檸檬醛。
30.一種抑制微生物的生長的方法，該方法包括施用有效量的水性制劑的步驟，所述的水性制劑包含(i)有效量的至少一種精油組分或其衍生物或它們的各種混合物，所述的精油衍生物是由精油組分經(jīng)光照射處理或經(jīng)氧化得到的；以及(ii)至少一種附加的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑選自由10％～約50％的乙醇、乳化劑、抗氧化劑和膠囊劑組成的組。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的乳化劑選自包括烷基芳基聚醚醇、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯、辛基-苯基聚醚醇和它們的各種混合物的組。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的抗氧化劑選自包括丁羥茴醚即BHA、抗壞血酸、丁羥甲苯即BHT、異抗壞血酸、α-生育酚、β-胡蘿卜素或它們的各種混合物的組。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的膠囊劑選自包括玉米淀粉、麥芽糊精、β-環(huán)糊精、硅膠、酪蛋白、殼聚糖和它們的各種混合物組成的組。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的精油組分選自包括單萜烴、倍半萜、氧化的萜衍生物、非萜衍生物的組，所述的非萜衍生物是例如醛、醇、酸、酯或酚。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的精油組分選自包括以下物質(zhì)的組紫蘇醛、檸檬醛、萜品醇、萜-4-醇、紫蘇醇、香芹酮、香芹醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、C7-11CHO、C7-10OH、香葉醇、苧烯、肉桂醛、肉桂酸、香芹酚、香草醛和它們的各種混合物。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的精油組分選自由檸檬醛、香葉醇、1-辛醇、香芹酚、紫蘇醛、癸醇、肉桂醛、肉桂酸及其混合物組成的組。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的精油組分是經(jīng)氧化的苧烯，優(yōu)選是氫過氧化苧烯。
38.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的精油組分是經(jīng)日曬處理的或經(jīng)紫外線照射的苧烯。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中在從苧烯的天然來源中提取苧烯后，對該苧烯進行所述的日曬處理或紫外線照射。
40.如權(quán)利要求30所述的方法，其中在從天然來源中提取精油組分混合物前，日曬處理或紫外線照射含精油組分混合物的天然來源，所述的精油組分混合物包含一定量的苧烯。
41.如權(quán)利要求30所述的方法，其中在從天然來源中提取精油組分混合物后，日曬處理或紫外線照射提取出來的精油組分混合物，所述的精油組分混合物包含一定量的苧烯。
42.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的含精油組分混合物的天然來源是柑橘果皮。
43.如權(quán)利要求38～42中任一項所述的方法，其中所述的苧烯或精油組分混合物的日曬時間約為4小時。
44.如權(quán)利要求38～42中任一項所述的方法，其中所述的苧烯或精油組分混合物經(jīng)紫外線照射的時間約為3小時。
45.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的精油的濃度是約0.1％～約1％。
46.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的苧烯的濃度在約1000μL/L～約12,000μL/L的范圍內(nèi)。
47.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述水性制劑包含檸檬醛、1-辛醇和精油組分混合物作為活性成分，所述的精油組分混合物含有足夠量的苧烯，所述的精油組分混合物在提取出來后已經(jīng)過日曬處理或紫外線照射。
48.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述水性制劑包含1-辛醇和含有足夠量的苧烯的精油組分混合物作為活性成分，所述的精油組分混合物在提取出來后已經(jīng)過日曬處理或紫外線照射。
49.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的水性溶液還包含濃度為約5ppm～約100ppm的殺生物劑。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的殺生物劑選自包括以下物質(zhì)的組抑霉唑、噻苯咪唑、雙胍鹽、異菌脲、咪鮮胺、鄰苯基苯酚鈉、甲菌靈、乙膦鋁、克菌丹、羥喹啉、氯硝胺、苯扎氯銨、卡農(nóng)、甲基托布津、嗪氨靈、多菌靈、三唑醇、乙烯菌核利、乙環(huán)唑或它們的各種混合物。
51.如權(quán)利要求30所述的方法，該方法用于保護水果和蔬菜以避免在采收后發(fā)生腐爛。
52.如權(quán)利要求30所述的方法，該方法用于保護水果和蔬菜以避免在采收前發(fā)生腐爛。
53.如權(quán)利要求30所述的方法，該方法用于防止肉類或魚類的腐敗。
54.如權(quán)利要求30所述的方法，該方法用于防止金黃色葡萄球菌細胞的生長。
55.如權(quán)利要求30所述的方法，該方法用于防止白色念珠菌的生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺微生物水性制劑，該制劑包含(i)有效量的至少一種精油組分或其衍生物或它們的混合物，所述的精油衍生物是經(jīng)光照射處理或經(jīng)氧化得到的；以及(ii)至少一種附加的穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑選自由10％～約50％的乙醇、乳化劑、抗氧化劑和膠囊劑組成的組。本發(fā)明還涉及使用所述殺微生物水性制劑來抑制微生物生長的方法。
文檔編號A23B4/20GK1592578SQ02823465
公開日2005年3月9日 申請日期2002年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月4日
發(fā)明者希姆雄·本－耶霍舒亞 申請人:以色列國家農(nóng)業(yè)部富卡尼中心