專利名稱：產(chǎn)生γ－谷氨酰半胱氨酸的酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有降低活性的突變型谷胱甘肽合成酶的酵母和利用酵母細(xì)胞的食品。從其中產(chǎn)生的γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸可用于食品領(lǐng)域中。
背景技術(shù)：
半胱氨酸用于增強(qiáng)食品的味道等目的。已知的半胱氨酸生產(chǎn)方法包括蛋白質(zhì)分解方法和半合成的方法。目前應(yīng)用的方法主要是蛋白酶解方法和半合成的方法。盡管為了應(yīng)用它們以增強(qiáng)食品味道的目的需要具有高半胱氨酸含量的天然食品材料，但這樣的天然食品材料已知的很少。另一方面，人們已報(bào)道對(duì)含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物的熱或酶處理可產(chǎn)生具有高半胱氨酸含量的食品材料(WO00/30474)。
γ-谷氨酰半胱氨酸是通過γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的功能從作為底物的半胱氨酸和谷氨酸合成的。另一方面，谷胱甘肽是通過谷胱甘肽合成酶的功能從作為底物的γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成的。因此，作為繁殖以高含量累積γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的方法，可以提議對(duì)編碼谷胱甘肽合成酶的基因進(jìn)行破壞。其編碼谷胱甘肽合成酶的基因已被破壞的酵母報(bào)道于WO 00/30474；Otake等人，Agri.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990；Chris等人，Molecular Biologyofthe Cell.，8，1699-1707，1997；Inoue等人，Biochimica et BiophysicaActa，1395(1998)315-320中。
然而，每一種上述酵母均具有生長(zhǎng)速率在很大程度上降低的缺點(diǎn)。進(jìn)一步地，Otake等人報(bào)道與含有谷胱甘肽的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)相比，其編碼谷胱甘肽合成酶的基因已被破壞的酵母在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)顯示不佳的生長(zhǎng)(Otake等人，Agri.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。然而，由于富含谷胱甘肽的培養(yǎng)基通常是昂貴的且谷胱甘肽本身也是昂貴的，所以這種培養(yǎng)基對(duì)于工業(yè)應(yīng)用不是優(yōu)選的。另一方面，將上述酵母以高密度培養(yǎng)于含有不足量谷胱甘肽的便宜培養(yǎng)基中以在工業(yè)水平上應(yīng)用也是不合適的。
發(fā)明公開在上述背景技術(shù)下，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種酵母和利用該酵母的含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品，該酵母帶有降低活性的突變型谷胱甘肽合成酶并產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸。
作為為了實(shí)現(xiàn)上述目的的大量研究的結(jié)果，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)具有特定突變的突變型谷胱甘肽合成酶具有適合于γ-谷氨酰半胱氨酸累積和酵母生長(zhǎng)的適度谷胱甘肽合成酶活性，且?guī)в型蛔冃兔傅慕湍咐鄯eγ-谷氨酰半胱氨酸，因此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
即本發(fā)明提供了下列各項(xiàng)。
(1)一種帶有突變型谷胱甘肽合成酶且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，所述突變型谷胱甘肽合成酶具有至少一個(gè)或兩個(gè)突變，所述突變選自在位置47由異亮氨酸殘基替代蘇氨酸殘基的突變和在位置387由天冬氨酸殘基替代甘氨酸殘基的突變。
(2)根據(jù)(1)的酵母，其中該酵母進(jìn)一步具有在位置54由亮氨酸殘基替代脯氨酸殘基的突變。
(3)根據(jù)(2)的酵母，其中突變型谷胱甘肽合成酶具有在位置47由異亮氨酸殘基替代蘇氨酸殘基的突變和在位置54由亮氨酸殘基替代脯氨酸殘基的突變。
(4)根據(jù)(2)的酵母，其中突變型谷胱甘肽合成酶具有在位置387由天冬氨酸殘基替代甘氨酸殘基的突變和在位置54由亮氨酸殘基替代脯氨酸殘基的突變。
(5)根據(jù)(1)～(4)中任何一項(xiàng)的酵母，其中無突變的谷胱甘肽合成酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
(6)根據(jù)(1)～(5)中任何一項(xiàng)的酵母，其中該酵母屬于酵母屬(Saccharomyces)。
(7)一種包含通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)根據(jù)(1)～(6)中任何一項(xiàng)的酵母獲得的培養(yǎng)物的食品或飲料，或者上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養(yǎng)物的分級(jí)分離產(chǎn)物，或者在其中已通過熱處理而產(chǎn)生半胱氨酸的培養(yǎng)物或分級(jí)分離產(chǎn)物。
(8)根據(jù)(7)的食品或飲料，其中該食品或飲料是含酒精的飲料、面包食品或發(fā)酵的食品調(diào)味品。
(9)應(yīng)用培養(yǎng)物產(chǎn)生的酵母提取物，該培養(yǎng)物是通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)根據(jù)(1)～(6)中任何一項(xiàng)的酵母獲得的。
(10)一種生產(chǎn)含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品或飲料的方法，該方法包含以下步驟在適當(dāng)條件下培養(yǎng)根據(jù)(1)～(6)中任何一項(xiàng)的酵母，將獲得的培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物或者進(jìn)行了熱處理的培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物與食品或飲料原材料混合，并將該混合物加工為食品或飲料。
在下文中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明的酵母是帶有突變型谷胱甘肽合成酶且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，該突變型谷胱甘肽合成酶具有下面的突變之一或兩者(1)在位置47由異亮氨酸殘基替代蘇氨酸殘基的突變(在下文中也稱為“T47I-型”突變)；和(2)在位置387由天冬氨酸殘基替代甘氨酸殘基的突變(在下文中也稱為“G387D-型”突變)。
在本發(fā)明中，“帶有(harboring)突變型谷胱甘肽合成酶”預(yù)示基本不帶有野生型谷胱甘肽合成酶。
同樣地，在本發(fā)明中，“產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸”指在微生物細(xì)胞中以比野生型酵母菌株更大的量累積γ-谷氨酰半胱氨酸。優(yōu)選地，當(dāng)在SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明的酵母在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期含有按重量計(jì)算為1.0％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸，更優(yōu)選地按重量計(jì)算為1.1％或更多。此外，當(dāng)在SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明的酵母在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期含有按重量計(jì)算為0.0001％～0.1％的谷胱甘肽，優(yōu)選地按重量計(jì)算為0.001％～0.006％。在此處所用的術(shù)語“對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期”指在培養(yǎng)過程中酵母細(xì)胞數(shù)目關(guān)于培養(yǎng)時(shí)間對(duì)數(shù)增加的階段。
谷胱甘肽合成酶突變和在下文描述的任選突變的上述位置是關(guān)于報(bào)道的由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)編碼的氨基酸序列確定的(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank編號(hào)Y13804)(表示于序列列表中的SEQ ID NO2中)。相同基因的核苷酸序列表示于SEQ IDNO1中。
例如，在本發(fā)明的酵母帶有的突變型谷胱甘肽合成酶與參考序列相比在N-末端部分具有1個(gè)氨基酸殘基缺失的情況下，上述位置47和387分別相應(yīng)于自突變型谷胱甘肽合成酶N-末端的第46和第386個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明的酵母除上述突變之外可進(jìn)一步具有下面的突變之一或兩者(3)在位置54由亮氨酸殘基替代脯氨酸殘基的突變(在下文中也稱為“P54L-型”突變)。
本發(fā)明的酵母帶有的突變型谷胱甘肽合成酶的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案如下(i)具有T47I-型突變和P54L-型突變的谷胱甘肽合成酶。
(ii)具有G387D-型突變和P54L-型突變的谷胱甘肽合成酶。
此外，上述突變型谷胱甘肽合成酶優(yōu)選地是其中無突變的谷胱甘肽合成酶具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的谷胱甘肽合成酶。
由于具有上述突變的突變型谷胱甘肽合成酶與野生型谷胱甘肽合成酶相比具有降低的活性，所以帶有該突變型酶的酵母產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸。此外，由于帶有上述突變型谷胱甘肽合成酶的酵母保持了降低的谷胱甘肽合成酶活性，所以它也可在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)。
本發(fā)明的酵母是不特別限制的，只要它可產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸。特定地，它包括屬于酵母屬如釀酒酵母、裂殖酵母屬(Schizosacchromyces)如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)等的酵母?？紤]到良好的生長(zhǎng)，本發(fā)明的酵母優(yōu)選地具有二倍性或更多的多倍性。具有二倍性或更多多倍性的酵母可通過如下方法獲得，即使得用于繁殖帶有上述突變型谷胱甘肽合成酶的酵母的單倍體酵母與帶有野生型谷胱甘肽合成酶的單倍體菌株進(jìn)行雜交，并從獲得的二倍體酵母中選擇帶有突變型谷胱甘肽合成酶并產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株。類似地，可獲得具有三倍性或更多多倍性的酵母。
本發(fā)明的酵母可應(yīng)用如編碼具有上述突變型谷胱甘肽合成酶的DNA進(jìn)行基因置換而生成。本發(fā)明的酵母也可通過對(duì)野生型酵母進(jìn)行普通的突變處理如紫外輻射或用誘變劑處理而獲得，該誘變劑如N-甲基-N-亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝酸或吖啶?？赏ㄟ^如PCR方法等證實(shí)獲得的突變具有目標(biāo)突變。
上述基因置換可進(jìn)行如下。即，用重組DNA對(duì)酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該重組DNA含有編碼在其中引入了目標(biāo)突變的谷胱甘肽合成酶的核苷酸序列，從而導(dǎo)致突變型谷胱甘肽合成酶基因和染色體上的谷胱甘肽合成酶基因進(jìn)行重組。在這種情況下，在重組DNA中插入的依賴于如宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷型特征的標(biāo)記基因使操作變得容易。此外，通過用限制性內(nèi)切酶等切割而使上述重組DNA線性化及此外從重組DNA中去除在酵母中發(fā)揮功能的復(fù)制控制區(qū)可有效地產(chǎn)生一個(gè)菌株，在該菌株中重組DNA整合入染色體中。
其中重組DNA以上述方式整合入染色體中的菌株進(jìn)行了與染色體上固有的谷胱甘肽合成酶基因的重組，從而將兩個(gè)融合的基因即野生型谷胱甘肽合成酶基因和突變型谷胱甘肽合成酶基因插入到染色體上，所以重組DNA的其他部分(載體區(qū)段和標(biāo)記基因)應(yīng)該存在于兩個(gè)融合基因之間。因此，野生型谷胱甘肽合成酶以這種狀態(tài)發(fā)揮功能。
下一步，為了僅將突變型谷胱甘肽合成酶基因留在染色體DNA上，通過兩個(gè)谷胱甘肽合成酶基因的重組將一個(gè)拷貝的谷胱甘肽合成酶基因連同載體區(qū)段(也包括標(biāo)記基因)一起從染色體DNA上去除。在這種情況下，有兩種情形。一種情形中，野生型谷胱甘肽合成酶基因留在染色體DNA上而突變型谷胱甘肽合成酶基因被從其上切除。相反，在另一種情形中，突變型谷胱甘肽合成酶基因留在染色體DNA上而野生型谷胱甘肽合成酶基因被切除。在兩種情形中，標(biāo)記基因均被去除，從而第二次重組的出現(xiàn)可通過相應(yīng)于標(biāo)記基因的表型進(jìn)行證實(shí)。目標(biāo)基因置換的菌株可通過用PCR方法擴(kuò)增谷胱甘肽合成酶基因并檢查其結(jié)構(gòu)而進(jìn)行選擇。
用于基因置換中的突變型谷胱甘肽合成酶可為編碼全長(zhǎng)谷胱甘肽合成酶的基因，但也可為編碼酶的部分的基因片段，只要它包括突變位點(diǎn)。同樣地，當(dāng)應(yīng)用基因片段時(shí)，以相同方式進(jìn)行的基因置換將導(dǎo)致目標(biāo)突變引入到染色體DNA上的野生型谷胱甘肽合成酶基因中。
在如下情形中，即染色體上的谷胱甘肽合成酶基因和預(yù)期要引入的突變型谷胱甘肽合成酶基因相互之間具有低到不能在那里應(yīng)用基因置換的程度的同源性，可將染色體基因上的谷胱甘肽合成酶基因破壞，隨后在質(zhì)?；蛉旧wDNA上容納突變型谷胱甘肽合成酶。
具有預(yù)期突變的突變型谷胱甘肽合成酶基因可用合成的寡核苷酸通過位點(diǎn)專一性突變獲得。已報(bào)道了釀酒酵母谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank編號(hào)Y13804，SEQ ID NO1)，且該基因可通過PCR方法從釀酒酵母的染色體DNA上獲得，其中將基于核苷酸序列制備的寡核苷酸用作引物。
對(duì)于酵母的轉(zhuǎn)化，可應(yīng)用那些常規(guī)用于酵母轉(zhuǎn)化的方法，如原生質(zhì)體方法、KU方法、KUR方法、電穿孔方法等。此外，操作程序如酵母的孢子形成和單倍體酵母的分離等描述于“Chemistry andOrganisms，Experimental Line 31，Experimental Techniques onYeasts”，第一版，Hirokawa Shoten；“Bio Manual Series 10，GeneExperimental Methods with Yeasts”，第一版，Youdosha等中。
本發(fā)明的酵母除帶有突變型谷胱甘肽合成酶之外可具有增強(qiáng)的γ-谷氨酰半胱氨酸活性。
本發(fā)明的酵母以一定的量或更多的量產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸，且在工業(yè)水平上應(yīng)用的不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，從而它具有極好的每單位時(shí)間產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的能力。
通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)如上所述獲得的產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母獲得的培養(yǎng)物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。這種培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。該培養(yǎng)物可為含有酵母細(xì)胞的液體培養(yǎng)基，或者可為從其中收集的酵母細(xì)胞、破壞的細(xì)胞或細(xì)胞提取物(酵母提取物)。同樣建議從細(xì)胞片段或酵母提取物中獲得含有γ-谷氨酰半胱氨酸的分級(jí)分離產(chǎn)物。
加熱上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物可從γ-谷氨酰半胱氨酸中釋放半胱氨酸。
用于進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基是不特別限制的，只要它使得本發(fā)明的酵母能良好生長(zhǎng)并有效產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸。對(duì)于本發(fā)明的酵母，由于其在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)的能力，所以可應(yīng)用通常在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用的培養(yǎng)基。應(yīng)注意到依賴于應(yīng)用的酵母的特征，在必要時(shí)可將必要的養(yǎng)分添加到培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)條件和酵母提取物等的制備以與進(jìn)行通常的酵母培養(yǎng)和酵母提取物等的制備相同的方式進(jìn)行。酵母提取物可為那些通過處理酵母細(xì)胞的熱水提取物獲得的或那些通過處理消化的酵母細(xì)胞獲得的。
含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的上述培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物可用于生產(chǎn)食品或飲料。該食品和飲料包括含酒精的飲料、面包食品或發(fā)酵的食品調(diào)味品。通過熱處理從γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)半胱氨酸可在生產(chǎn)食品和飲料過程中或其生產(chǎn)之后進(jìn)行。
上述食品和飲料通過將含有γ-谷氨酰半胱氨酸與半胱氨酸的培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物與食品和飲料原材料混合并將混合物加工為食品和飲料進(jìn)行生產(chǎn)。除了應(yīng)用上述的培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物之外，本發(fā)明的食品和飲料可應(yīng)用與那些用于通常的食品和飲料中的相同的原材料并通過與用于通常的食品和飲料中的相同的方法進(jìn)行生產(chǎn)。這種原材料對(duì)于含酒精的飲料包括如稻、大麥、玉米淀粉等，對(duì)于面包食品包括小麥面粉、糖、精制食鹽、黃油、發(fā)酵酵母等，對(duì)于發(fā)酵的食品調(diào)味品包括大豆和小麥等。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示K2菌株在SD培養(yǎng)基和含有1-mM谷胱甘肽的SD培養(yǎng)基(SDGSH)中生長(zhǎng)的圖解，其中每一種培養(yǎng)基均含有必需量的尿嘧啶。
圖2是表示K3菌株在SD培養(yǎng)基和含有1-mM谷胱甘肽的SD培養(yǎng)基(SDGSH)中生長(zhǎng)的圖解，其中每一種培養(yǎng)基均含有必需量的尿嘧啶。
圖3是分別表示K1、K2和K3菌株在SD培養(yǎng)基(含有必需量的尿嘧啶)中生長(zhǎng)的圖解。
優(yōu)選實(shí)施方案描述在下文中，本發(fā)明將關(guān)于實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。
用于實(shí)施例中的培養(yǎng)基組成如下。應(yīng)注意到瓊脂培養(yǎng)基含有2％的純化的瓊脂。
葡萄糖 2％蛋白胨 1％酵母提取物 0.5％(pH5.0)[SD培養(yǎng)基組成]葡萄糖 2％含氮堿基1-倍濃度(10-倍濃度的含氮堿基是1.7g不含氨基酸和硫酸銨的細(xì)菌用酵母含氮堿基(Difco Laboratories，Inc.)和5g硫酸銨溶于100ml蒸餾水中的混合物，將其調(diào)節(jié)到pH5.2并通過濾器過濾進(jìn)行滅菌)。
終濃度中含有50mg/l尿嘧啶和1g/l 5-氟乳清酸水合物的SD培養(yǎng)基。
比較例1其中編碼谷胱甘肽合成酶的基因被破壞的酵母的繁殖使得商業(yè)上可購(gòu)得的用于食品的釀酒酵母能夠形成孢子以獲得單倍體面包酵母，即S菌株(MATα)。此外，通過應(yīng)用含有尿嘧啶的SDFOA瓊脂培養(yǎng)基從S菌株獲得尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型S2菌株。從S2菌株獲得酵母K1菌株，其中谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)由描述于WO 00/30474A中的方法進(jìn)行破壞。
實(shí)施例1具有突變型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖<1>用于置換降低型谷胱甘肽合成酶基因的盒(cassette)的制備(1)用于置換G3 87D型谷胱甘肽合成酶基因的盒的制備在生產(chǎn)商所示的條件下，應(yīng)用引物F1(CATAAAACAACTGAAGCGTTAGCTC(SEQ ID NO3))和R1(CAGGCCAAAGATTTTCAGTACGAGC(SEQ ID NO4))和PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo)通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增了一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域編碼從S2菌株谷胱甘肽合成酶基因可讀框(ORF)的中游到ORF下游約40bp的區(qū)段。
將如上所述擴(kuò)增的基因片段純化，并在下面條件下于72℃進(jìn)行10分鐘的酶促反應(yīng)以向每一個(gè)末端添加核苷酸A。
(反應(yīng)混合物組成)基因片段溶液5μl10×PCR緩沖液(不含MgCl2) 5μl25mM MgCl23μl2.5mM dATP 5μlTaq DNA聚合酶(Takara Shuzo) 0.5μl純化的水31.5μl總計(jì)50μl根據(jù)生產(chǎn)商的說明書將上述反應(yīng)產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEM-T Easy(Promega Corporation)連接以獲得質(zhì)粒GSH2MS41/pGEM。
下一步，通過位點(diǎn)專一性突變，使與包含于GSH2MS41/pGEM中的谷胱甘肽合成酶基因中第387個(gè)氨基酸(Gly)相應(yīng)的密碼子(GGT)由Asp密碼子(GAT)替代。該操作是根據(jù)由生產(chǎn)商提供的規(guī)程通過應(yīng)用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)進(jìn)行的。應(yīng)用引物F2(CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG(SEQ IDNO5))和引物R2(CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG(SEQID NO6))作為引物。因而，制備了質(zhì)粒GSH2MS41dash/pGEM。
另一方面，制備了相應(yīng)于質(zhì)粒pYES2(Invitrogen)的質(zhì)粒，其中去除了2μori。用限制性內(nèi)切酶Ssp I和Nhe I切割pYES2并使切割的末端形成平端，然后再次環(huán)化以獲得質(zhì)粒pYES2dash。將pYES2dash和GSH2MS41dash/pGEM各自用限制性內(nèi)切酶Sac I和SphI切割以從pYES2dash中切除含有URA3基因的片段及從GSH2MS41dash/pGEM中切除具有突變的谷胱甘肽合成酶基因片段，并將這些相互進(jìn)行連接。從而制備了質(zhì)粒GSH2MS41dash/pYES2dash。用限制性內(nèi)切酶Mun I消化GSH2MS41dash/pYES2dash以獲得盒1。
(2)用于置換T47I-型谷胱甘肽合成酶基因的盒的制備在生產(chǎn)商所示的條件下，應(yīng)用引物F3(CTAATATGGATGTCGGCAACCCAAG(SEQ ID NO7，相應(yīng)于編碼谷胱甘肽合成酶的GSH2基因ORF上游約700堿基對(duì)的區(qū)域))和引物R3(CCACAGCTTTGGCCAATGCCTTAG(SEQ ID NO8))和Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增了一個(gè)片段，該片段包括S2菌株的谷胱甘肽合成酶基因。
將如上所述擴(kuò)增的基因片段純化，并在與上述相同的條件下于72℃進(jìn)行10分鐘的酶促反應(yīng)以向每一個(gè)末端添加核苷酸A。
根據(jù)由生產(chǎn)商提供的說明書將如上所述獲得的反應(yīng)產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEM-T Easy(Promega)連接以獲得質(zhì)粒GSH2FD63/pGEM。
下一步，使與包含于GSH2FD63/pGEM中的谷胱甘肽合成酶基因中第47個(gè)氨基酸Thr相應(yīng)的密碼子(ACT)由Ile密碼子(ATT)替代。該操作是根據(jù)由生產(chǎn)商提供的規(guī)程通過應(yīng)用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)進(jìn)行的。應(yīng)用引物F4(CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC(SEQ ID NO9))和引物R4(GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG(SEQ IDNO10))作為引物。因而，制備了質(zhì)粒GSH2FD63dash/pGEM。
將pYES2dash和GSH2FD63dash/pGEM各自用限制性內(nèi)切酶SacI和Sph I切割以從pYES2dash中切除含有URA3基因的片段及從GSH2FD63dash/pGEM中切除具有突變的谷胱甘肽合成酶基因片段，并將這些相互進(jìn)行連接。從而制備了質(zhì)粒GSH2FD63dash/pYES2dash。用限制性內(nèi)切酶切割GSH2FD63dash/pYES2dash以獲得盒2。
<2>帶有降低型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖(1)帶有G387D-型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖應(yīng)用如上所述制備的盒1，進(jìn)行了S2菌株谷胱甘肽合成酶基因的基因置換。在對(duì)S2菌株進(jìn)行預(yù)先培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)于50mlYPD培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為止。將培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮于1M山梨糖醇中，并將盒1混合以通過電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化體菌株培養(yǎng)于含有1mM谷胱甘肽的SD平板上，并對(duì)在其上生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行選擇。在通過PCR證實(shí)盒1插入到染色體的目標(biāo)位點(diǎn)后，將獲得的菌株命名為K2中間體。將K2中間體進(jìn)行培養(yǎng)并涂布在SDFOA瓊脂培養(yǎng)基上。然后從生長(zhǎng)的菌株中獲得了其中谷胱甘肽合成酶由G387D-型置換的酵母K2菌株。
與釀酒酵母谷胱甘肽合成酶基因報(bào)道的核苷酸序列(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank編號(hào)Y13804)比較的結(jié)果顯示K2菌株的突變型谷胱甘肽合成酶基因除上述G387D-型突變之外還具有在位置54由亮氨酸殘基密碼子(CCT)對(duì)脯氨酸殘基密碼子(CCT)的替代。
(2)帶有T47I-型谷胱甘肽合成酶的酵母的繁殖應(yīng)用如上所述制備的盒2，進(jìn)行了S2菌株谷胱甘肽合成酶基因的基因置換。在對(duì)S2菌株進(jìn)行預(yù)先培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)于50mlYPD培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為止。將培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮于1M山梨糖醇中，并將盒2混合以通過電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化體菌株培養(yǎng)于含有1mM谷胱甘肽的SD平板上，并對(duì)在其上生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行選擇。在通過PCR方法證實(shí)盒2插入到染色體的目標(biāo)位置后，將獲得的菌株命名為K3中間體。將K3中間體進(jìn)行培養(yǎng)并涂布在SDFOA瓊脂培養(yǎng)基上。將生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體涂布在SDFOA瓊脂培養(yǎng)基上，并對(duì)生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行選擇以獲得在其中引入了基因置換盒2的K3中間體菌株。將K3中間體菌株進(jìn)行培養(yǎng)并涂布在SDFOA瓊脂培養(yǎng)基上。然后從生長(zhǎng)的菌株中獲得了其中谷胱甘肽合成酶由T47I-型置換的酵母K3菌株。
與釀酒酵母谷胱甘肽合成酶基因報(bào)道的核苷酸序列(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320，GenBank編號(hào)Y13804)比較的結(jié)果顯示K3菌株突變型谷胱甘肽合成酶基因除上述T47I-型突變之外還具有在位置54由亮氨酸殘基密碼子(CCT)對(duì)脯氨酸殘基密碼子(CCT)的替代。
(3)二倍體酵母的制備通過常規(guī)方法使具有G387D-型突變型谷胱甘肽合成酶的單倍體酵母(MATα)(K2菌株)與單倍體酵母(MATa)交配以獲得二倍體酵母。通過常規(guī)方法使二倍體酵母形成孢子以獲得具有G387D-型突變型谷胱甘肽合成酶的單倍體酵母(MATa)。然后，使具有G387D-型突變型谷胱甘肽合成酶的單倍體酵母(MATα)和具有G387D-型突變型谷胱甘肽合成酶的單倍體酵母(MATa)相互交配以獲得二倍體酵母Z1菌株，該Z1菌株以純合子的形式具有G387D-型突變型谷胱甘肽合成酶。以相似的方式也獲得了具有T47I-型突變型谷胱甘肽合成酶的二倍體酵母Z2菌株。人們證實(shí)Z1和Z2菌株以每個(gè)干酵母細(xì)胞1％或更多的量累積γ-谷氨酰半胱氨酸。
<3>對(duì)具有突變型谷胱甘肽合成酶的酵母生長(zhǎng)及其γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的研究(1)K2和K3菌株的生長(zhǎng)將K1、K2和K3菌株培養(yǎng)于SD培養(yǎng)基(含有必需量的尿嘧啶)或含有1mM谷胱甘肽的SD培養(yǎng)基(含有必需量的尿嘧啶)中。對(duì)其生長(zhǎng)的測(cè)量開始于當(dāng)酵母生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及660nm的吸收為1.4或更大時(shí)。獲得的結(jié)果顯示于圖1～3中。
K2菌株在含有谷胱甘肽的培養(yǎng)基上的特定生長(zhǎng)速率(每1小時(shí)生長(zhǎng)的程度)為1.171，而它在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基上的特定生長(zhǎng)速率為1.161。K3菌株的特定生長(zhǎng)速率在含有谷胱甘肽的培養(yǎng)基上為1.169，而在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基上為1.156。如在圖1～3和特定生長(zhǎng)速率中顯而易見的，K2和K3菌株在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基上也生長(zhǎng)良好，因此比谷胱甘肽合成酶基因被破壞的菌株更適合于在工業(yè)水平上進(jìn)行培養(yǎng)。因此，具有G387D-型或T47I-型谷胱甘肽合成酶的酵母可有利地用于在工業(yè)水平上培養(yǎng)于不含或含有少量谷胱甘肽的培養(yǎng)基上。
(2)K2和K3菌株的γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力將K1、K2和K3菌株培養(yǎng)于SD培養(yǎng)基(含有必需量的尿嘧啶)中。對(duì)其生長(zhǎng)和γ-谷氨酰半胱氨酸累積量的測(cè)量開始于當(dāng)酵母生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及660nm的吸收為1.4或更大時(shí)。菌株的特定生長(zhǎng)速率分別為1.104、1.161和1.156。K2和K3菌株以每個(gè)干酵母細(xì)胞0.001％或更多及0.006％或更少的量累積谷胱甘肽。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中每一個(gè)菌株每個(gè)干酵母細(xì)胞的γ-谷氨酰半胱氨酸累積量如下。
表1

下一步，測(cè)量了每單位時(shí)間γ-谷氨酰半胱氨酸的生產(chǎn)力。當(dāng)將每一個(gè)菌株在坂口燒瓶(Sakaguchi flask)中培養(yǎng)于50ml SD培養(yǎng)基(含有必需量的尿嘧啶)中時(shí)，通過每單位時(shí)間包含于該坂口燒瓶中的γ-谷氨酰半胱氨酸量的增加對(duì)每單位時(shí)間的γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力進(jìn)行測(cè)量。該值受每個(gè)干細(xì)胞中γ-谷氨酰半胱氨酸累積量和酵母生長(zhǎng)速率的控制。該值對(duì)于K1菌株為0.116mg/小時(shí)，對(duì)于K2菌株為0.130mg/小時(shí)，而對(duì)于K3菌株為0.127mg/小時(shí)。
已報(bào)道以每個(gè)干酵母細(xì)胞按重量計(jì)算1％或更多的量含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其酵母提取物可用于增強(qiáng)食品的味道(WO00/30474)。因此，比K1菌株具有更大特定生長(zhǎng)速率的K2和K3菌株有利于產(chǎn)生每個(gè)干酵母細(xì)胞含有1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其酵母提取物。此外，K2和K3菌株每單位時(shí)間的γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力比K1菌株的更高。而且，由于K2和K3菌株含有0.001％或更多的谷胱甘肽，所以它們適合于在其中不含谷胱甘肽的工業(yè)水平上進(jìn)行培養(yǎng)。從上述觀點(diǎn)看，可認(rèn)為具有G387D-型或T47I-型突變型谷胱甘肽合成酶的酵母適合于產(chǎn)生含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其酵母提取物。
(3)對(duì)K2和K3菌株傳代培養(yǎng)穩(wěn)定性的研究將K2、K3、Z1和Z2菌株培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基上。將這些菌株各自傳代培養(yǎng)10次，并檢查是否發(fā)生了回復(fù)突變。傳代培養(yǎng)進(jìn)行如下。即將每一種菌株接種于含有4ml YPD液體培養(yǎng)基的試管中并于30℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。在充分生長(zhǎng)后，將一部分培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)于含有4mlYPD液體培養(yǎng)基的試管中。將該操作重復(fù)10次。
是否發(fā)生了回復(fù)突變證實(shí)如下。即從液體培養(yǎng)基中收集酵母細(xì)胞并收集其染色體DNA，隨后證實(shí)突變位點(diǎn)的核苷酸序列。此外，對(duì)當(dāng)于30℃培養(yǎng)于含有10-mM甲基乙二醛的SD瓊脂培養(yǎng)基(含有必需量的尿嘧啶)上時(shí)是否存在生長(zhǎng)進(jìn)行了證實(shí)。這些結(jié)果證明了K2、K3、Z1和Z2菌株傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定性。
(4)對(duì)P57L突變的研究研究了P54L突變對(duì)突變型谷胱甘肽合成酶的影響。
制備了含有谷胱甘肽合成酶基因的質(zhì)粒，該谷胱甘肽合成酶基因具有T47I-型或G387D-型突變。應(yīng)用pEGSH2作為含有谷胱甘肽合成酶基因的質(zhì)粒。該質(zhì)粒根據(jù)描述于文獻(xiàn)中的方法制備(Inoue等人，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)315-320)。
首先，使與質(zhì)粒pEGSH2的谷胱甘肽合成酶基因中第47個(gè)氨基酸Thr相應(yīng)的密碼子(ACT)由Ile的密碼子(ATT)替代。該操作是根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程應(yīng)用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)進(jìn)行的。應(yīng)用引物F4(CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC(SEQ ID NO9))和引物R4(GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG(SEQ IDNO10))作為引物。因而，構(gòu)建了質(zhì)粒pEGSH2-T47I。
下一步，使與質(zhì)粒pEGSH2的谷胱甘肽合成酶基因中第387個(gè)氨基酸Gly相應(yīng)的密碼子(GGT)由Asp的密碼子(GAT)替代。該操作是根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程應(yīng)用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)進(jìn)行的。應(yīng)用引物F2(CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG(SEQ ID NO5))和引物R2(CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG(SEQ IDNO6))作為引物。因而，構(gòu)建了質(zhì)粒pEGSH2-G387D。
另一方面，顯示尿嘧啶必需型的K1dash菌株可如下從K1菌株獲得。即，將K1菌株在YPD培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)80小時(shí)，并將培養(yǎng)物涂布在SDFOA平板上。從在SDFOA平板上生長(zhǎng)的酵母中選擇酵母菌株K1dash，該菌株顯示尿嘧啶必需型且其谷胱甘肽合成酶已被破壞。
將如上所述獲得的K1dash菌株分別用上述質(zhì)粒pEGSH2、pEGSH2-T47I和pEGSH2-G387D進(jìn)行轉(zhuǎn)化以獲得pEGSH2/K1dash、pEGSH2-T47I/K1dash和pEGSH2-G387D/K1dash。用每一種質(zhì)粒對(duì)K1dash菌株的轉(zhuǎn)化進(jìn)行如下。即在對(duì)K1dash菌株進(jìn)行預(yù)先培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)于50ml YPD培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為止。將培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮于1M山梨糖醇中，混合目標(biāo)質(zhì)粒，并通過電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)于含有1mM谷胱甘肽的SD瓊脂培養(yǎng)基上，并對(duì)在其上生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行選擇。
將pEGSH2/K1dash、pEGSH2-T47I/K1dash和pEGSH2-G387D/K1dash菌株在SD培養(yǎng)基上于30℃振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，并將培養(yǎng)物以2％的濃度接種于SD培養(yǎng)基中，然后于30℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。對(duì)其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(該培養(yǎng)開始后10小時(shí))中細(xì)胞中累積的谷胱甘肽的量進(jìn)行了測(cè)量。谷胱甘肽在pEGSH2/K1dash菌株的情形中以約0.80％的量累積，而在pEGSH2-T47I/K1dash和pEGSH2-G387D/K1dash菌株的情形中以0.001～0.006％的量累積。
上述結(jié)果顯示單獨(dú)具有突變T47I或G387D而不具有突變P54L的酵母可具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，且可在細(xì)胞中含有微量的谷胱甘肽，因此可對(duì)γ-谷氨酰半胱氨酸的高生產(chǎn)力有貢獻(xiàn)。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，提供了一種帶有降低活性的突變型谷胱甘肽合成酶且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母。本發(fā)明的酵母可用于生產(chǎn)含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品或含有半胱氨酸的食品。
序列表<110>味之素公司<120>產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母<130>C032MKOP1420<140>
<141>2002-11-21<150>JP 2001-359782<151>2001-11-26<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2630<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(1476)<400>1atg gca cac tat cca cct tcc aag gat caa ttg aat gaa ttg atc cag48Met Ala His Tyr Pro Pro Ser Lys Asp Gln Leu Asn Glu Leu Ile Gln1 5 10 15gaa gtt aac caa tgg gct atc act aat gga tta tcc atg tat cct cct96Glu Val Asn Gln Trp Ala Ile Thr Asn Gly Leu Ser Met Tyr Pro Pro20 25 30aaa ttc gag gag aac cca tca aat gca tcg gtg tca cca gta act atc144Lys Phe Glu Glu Asn Pro Ser Asn Ala Ser Val Ser Pro Val Thr Ile35 40 45tat cca acc cca att cct agg aaa tgt ttt gat gag gcc gtt caa ata192Tyr Pro Thr Pro Ile Pro Arg Lys Cys Phe Asp Glu Ala Val Gln Ile50 55 60caa ccg gta ttc aat gaa tta tac gcc cgt att acc caa gat atg gcc240Gln Pro Val Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Arg Ile Thr Gln Asp Met Ala65 70 75 80caa cct gat tct tat tta cat aaa aca act gaa gcg tta gct cta tca288
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tct ggc tcc aag aaa att cag caa ttg ttg aca gat gag ggc gta tta1008Ser Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln Leu Leu Thr Asp Glu Gly Val Leu325330 335ggt aaa tac atc tcc gat gct gag aaa aag agt agt ttg tta aaa act1056Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Glu Lys Lys Ser Ser Leu Leu Lys Thr340345 350ttt gtc aaa ata tat ccc ttg gat gat acg aag ctt ggc agg gaa ggc1104Phe Val Lys Ile Tyr Pro Leu Asp Asp Thr Lys Leu Gly Arg Glu Gly355360 365aag agg ctg gca tta agt gag ccc tct aaa tac gtg tta aaa cca cag1152Lys Arg Leu Ala Leu Ser Glu Pro Ser Lys Tyr Val Leu Lys Pro Gln370375 380cgg gaa ggt ggc gga aac aat gtt tat aaa gaa aat att cct aat ttt1200Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn Val Tyr Lys Glu Asn Ile Pro Asn Phe385 390395 400ttg aaa ggt atc gaa gaa cgt cac tgg gat gca tat att ctc atg gag1248Leu Lys Gly Ile Glu Glu Arg His Trp Asp Ala Tyr Ile Leu Met Glu405410 415ttg att gaa cca gag ttg aat gaa aat aat att ata tta cgt gat aac1296Leu Ile Glu Pro Glu Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ile Leu Arg Asp Asn420425 430aaa tct tac aac gaa cca atc atc agt gaa cta gga att tat ggt tgc1344Lys Ser Tyr Asn Glu Pro Ile Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly Cys435440 445gtt cta ttt aac gac gag caa gtt tta tcg aac gaa ttt agt ggc tca1392Val Leu Phe Asn Asp Glu Gln Val Leu Ser Asn Glu Phe Ser Gly Ser450455 460tta cta aga tcc aaa ttt aat act tca aat gaa ggt gga gtg gcg gca1440Leu Leu Arg Ser Lys Phe Asn Thr Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala465 470475 480gga ttc gga tgt ttg gac agt att att ctt tac tag gtgtacatgt 1486Gly Phe Gly Cys Leu Asp Ser Ile Ile Leu Tyr485490actatacaca tagatgctag gaagatgatg ctagaacttg attaacaatt agttaaggaa 1546tatataatca cacttctaca taaatttgct gttttaggct cattccttct ttctttcacc 1606ctttagtagc gaagtacacc atttagctgc accaacagtg ttgctagata tggtgactat 1666tgtgaagaag ggtattaaGt ctagtagacc ggcagacata ccgaaacata tgaaacttgc 1726gtaatgctcg tactgaaaat ctttggcctg tttcttactg aatcccttta gtaaaaagta 1786cctctgcaaa taggtaaagg ttctttttgg ggccattagt tgatttgcca agattggtcc 1846tacaatagga attagcgaca gtaatgttag tgaagtaaaa ttggagactt taaaaaacat 1906tctgaatagt aatctgggaa tcttaaaaat ccgacttccc tttattgtgt tgaaatttct 1966caccgcatca ggttcatcga tttttctatg tggcttttgt ggtttaggca ataccttcac 2026ctcgtttaga aattcatctt ggtcttgcaa caccaaagat atatcaaata tctgattcgt 2086aatatgggtc aggaccagtg ttctacaaac aaaggcagtc aagacattcg tttgtaaaat 2146
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245250 255Val Asn Asp Lys Leu Phe Ile Asp Asp Lys Thr Gly Lys Leu Phe Ile260265 270Arg Asp Thr Glu Gln Glu Ile Ala Val Val Tyr Tyr Arg Thr Gly Tyr275280 285Thr Thr Thr Asp Tyr Thr Ser Glu Lys Asp Trp Glu Ala Arg Leu Phe290295 300Leu Glu Lys Ser Phe Ala Ile Lys Ala Pro Asp Leu Leu Thr Gln Leu305 310315 320Ser Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln Leu Leu Thr Asp Glu Gly Val Leu325330 335Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Glu Lys Lys Ser Ser Leu Leu Lys Thr340345 350Phe Val Lys Ile Tyr Pro Leu Asp Asp Thr Lys Leu Gly Arg Glu Gly355360 365Lys Arg Leu Ala Leu Ser Glu Pro Ser Lys Tyr Val Leu Lys Pro Gln370375 380Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn Val Tyr Lys Glu Asn Ile Pro Asn Phe385 390395 400Leu Lys Gly Ile Glu Glu Arg His Trp Asp Ala Tyr Ile Leu Met Glu405410 415Leu Ile Glu Pro Glu Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ile Leu Arg Asp Asn420425 430Lys Ser Tyr Asn Glu Pro Ile Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly Cys435440 445Val Leu Phe Asn Asp Glu Gln Val Leu Ser Asn Glu Phe Ser Gly Ser450455 460Leu Leu Arg Ser Lys Phe Asn Thr Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala465 470475 480Gly Phe Gly Cys Leu Asp Ser Ile Ile Leu Tyr485490<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3cataaaacaa ctgaagcgtt agctc 25<210>4
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4caggccaaag attttcagta cgagc 25<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5ccacagcggg aagatggcgg aaacaatg 28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6cattgtttcc gccatcttcc cgctgtgg 28<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7ctaatatgga tgtcggcaac ccaag 25<210>8
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8ccacagcttt ggccaatgcc ttag 24<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9cggtgtcacc agtaattatc tatccaaccc c 31<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10ggggttggat agataattac tggtgacacc g 3權(quán)利要求
1.一種帶有突變型谷胱甘肽合成酶且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，所述突變型谷胱甘肽合成酶具有一個(gè)或兩個(gè)突變，所述突變選自在位置47由異亮氨酸殘基替代蘇氨酸殘基的突變和在位置387由天冬氨酸殘基替代甘氨酸殘基的突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酵母，其中該酵母進(jìn)一步具有在位置54由亮氨酸殘基替代脯氨酸殘基的突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的酵母，其中突變型谷胱甘肽合成酶具有在位置47由異亮氨酸殘基替代蘇氨酸殘基的突變和在位置54由亮氨酸殘基替代脯氨酸殘基的突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的酵母，其中突變型谷胱甘肽合成酶具有在位置387由天冬氨酸殘基替代甘氨酸殘基的突變和在位置54由亮氨酸殘基替代脯氨酸殘基的突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任何一項(xiàng)的酵母，其中無突變的谷胱甘肽合成酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任何一項(xiàng)的酵母，其中該酵母屬于酵母屬。
7.一種包含通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)的酵母獲得的培養(yǎng)物的食品或飲料，或者含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養(yǎng)物的分級(jí)分離產(chǎn)物，或者在其中已通過熱處理而產(chǎn)生半胱氨酸的培養(yǎng)物或分級(jí)分離產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的食品或飲料，其中該食品或飲料是含酒精的飲料、面包食品或發(fā)酵的食品調(diào)味品。
9.一種應(yīng)用培養(yǎng)物產(chǎn)生的酵母提取物，所述培養(yǎng)物是通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)的酵母獲得的。
10.一種生產(chǎn)含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品或飲料的方法，該方法包含以下步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)的酵母，將獲得的培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物，或者進(jìn)行了熱處理的培養(yǎng)物或其分級(jí)分離產(chǎn)物，與食品或飲料原材料混合，并將混合物加工為食品或飲料。
全文摘要
含有γ－谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品可通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)酵母進(jìn)行生產(chǎn)，該酵母帶有突變型谷胱甘肽合成酶且可產(chǎn)生γ－谷氨酰半胱氨酸，該突變型谷胱甘肽合成酶具有在47－位置由異亮氨酸殘基替代蘇氨酸殘基和在387－位置由天冬氨酸殘基替代甘氨酸殘基的突變之一或兩者，從而將這樣獲得的已任選地進(jìn)行分級(jí)分離和/或加熱的培養(yǎng)物添加到食品材料中并將該材料加工為食品產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N1/16GK1592780SQ02823509
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2002年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月26日
發(fā)明者西內(nèi)博章, 杉本玲子 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社