專利名稱：產(chǎn)生γ－谷氨酰半胱氨酸的酵母及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株、篩選該酵母菌株的方法及利用該酵母菌株細胞的食品。從其中產(chǎn)生的γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸可用于食品領(lǐng)域中。
背景技術(shù)：
半胱氨酸是為了增強食品的味道等目的而應(yīng)用的。已知的半胱氨酸生產(chǎn)方法包括如蛋白質(zhì)酶解方法和半合成的方法。目前應(yīng)用的方法大體上是蛋白酶解方法和半合成的方法。盡管為了應(yīng)用它們以增強食品味道的目的而需要具有高半胱氨酸含量的天然食品材料，但很少這種天然食品材料是已知的。另一方面，人們已報道對含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物的熱-或酶-處理可導(dǎo)致具有高半胱氨酸含量的食品材料(WO 00/30474)。
γ-谷氨酰半胱氨酸通過γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的功能從作為底物的半胱氨酸和谷氨酸合成。另一方面，谷胱甘肽通過谷胱甘肽合成酶的功能從作為底物的γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成。人們已報道谷胱甘肽合成酶基因被破壞的酵母可累積γ-谷氨酰半胱氨酸(Otake，Y.等人，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。
作為篩選已喪失谷胱甘肽合成酶活性的酵母的方法，應(yīng)用甲基乙二醛敏感性作為表型的方法是已知的(Otake，Y.等人，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。根據(jù)該報道，從300個甲基乙二醛敏感性菌株中選擇了12個不能產(chǎn)生谷胱甘肽的菌株。該報道進一步陳述進一步的分析顯示8個菌株是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶突變型，而剩余的4個是谷胱甘肽合成酶突變型。在該篩選方法中，75個甲基乙二醛敏感性菌株中有1個菌株是谷胱甘肽合成酶活性的突變型。因此，粗略地看，該方法似乎是γ-谷氨酰半胱氨酸高累積性酵母的簡單篩選方法。然而，由于對從中選擇出上述300個甲基乙二醛敏感性酵母的菌株的數(shù)目未作描述，所以應(yīng)用甲基乙二醛敏感性作為表型的篩選方法不能認為是含有高γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的簡單篩選方法。此外，在將甲基乙二醛敏感性用作表型的情形中，需要困難的復(fù)制操作。從此觀點看，根本不能認為這是簡單的篩選方法。
附帶地，已知利用MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)抗性的方法是篩選谷胱甘肽缺陷型菌株的方法(Kistler，M等人，MutationResearch，173(1986)117-120；Kistler，M等人，Mutagenesis，5(1)39-44，1990)。根據(jù)該方法，所有獲得的酵母均喪失了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，但未獲得具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的菌株。已知利用硝普酸鈉的方法是篩選谷胱甘肽缺陷型菌株的另一種方法。據(jù)報道同樣在該情形中，獲得的酵母均是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶突變型(Kistler，M等人，Mutagenesis，5(1)39-44，1990)。
發(fā)明公開在上述技術(shù)背景中，本發(fā)明的一個目的是提供具有降低的谷胱甘肽合成酶活性并產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，和這種酵母的簡單篩選方法以及利用這種酵母菌株的含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品。
在這些情況下，本發(fā)明者已進行了大量研究，且作為結(jié)果，他們已發(fā)現(xiàn)對用作表型的一定濃度MNNG的抗性使得能夠?qū)哂薪档偷墓入赘孰暮铣擅富钚郧揖哂笑?谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的菌株進行選擇，因此實現(xiàn)了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下。
(1)一種對MNNG具有抗性且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株。
(2)根據(jù)(1)的酵母菌株，其中該菌株具有如下面公式計算的0.03或更大的生長程度生長程度＝當培養(yǎng)于含MNNG的培養(yǎng)基中時培養(yǎng)基的OD660/當培養(yǎng)于不含MNNG的培養(yǎng)基中時培養(yǎng)基的OD660
當收集在液體培養(yǎng)基中預(yù)先培養(yǎng)的酵母菌株并將其接種于含有30μg/ml MNNG的YPD培養(yǎng)基(含MNNG的培養(yǎng)基)和不含MNNG的YPD培養(yǎng)基(不含MNNG的培養(yǎng)基)中，使每一種培養(yǎng)基在660nm的吸收(OD660)為0.1，然后將該菌株在適當?shù)臏囟冗M行固定培養(yǎng)(standing culture)的時候。
(3)一種根據(jù)(1)或(2)的酵母菌株，其中該菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。
(4)一種根據(jù)(1)～(3)中任何一項的酵母菌株，其中當培養(yǎng)于SD培養(yǎng)基中時，對數(shù)生長期中每個干細胞的γ-谷氨酰半胱氨酸含量按重量計算為1％或更多。
(5)一種根據(jù)(1)～(4)中任何一項的酵母菌株，其中該菌株具有二倍性或更多倍性。
(6)一種根據(jù)(1)～(5)中任何一項的酵母菌株，其中該菌株屬于酵母屬(Saccharomyces)。
(7)一種篩選具有對MNNG的抗性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的酵母菌株的方法，該方法包括步驟(a)從大量酵母中選擇對一定濃度范圍的MNNG有抗性的酵母菌株；和(b)從選擇的菌株中篩選具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的菌株。
(8)一種根據(jù)(7)的方法，其中在步驟(a)中，大量酵母是通過將親代酵母菌株進行突變處理而制備的。
(9)一種根據(jù)(7)或(8)的方法，其中在步驟(a)中，對一定濃度范圍的MNNG有抗性的酵母菌株是用瓊脂培養(yǎng)基進行選擇的，在該培養(yǎng)基上已形成了MNNG的濃度梯度。
(10)一種根據(jù)(7)～(9)中任何一項的方法，其中在步驟(a)中，提供了以前分離的具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的酵母模型菌株，并選擇了與模型菌株有相同水平的對MNNG的抗性的酵母菌株。
(11)一種包括通過在適當條件下培養(yǎng)根據(jù)(1)～(6)中任何一項的酵母菌株獲得的培養(yǎng)物的食品或飲料，或者含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養(yǎng)物的分級分離產(chǎn)物，或者在其中已通過熱處理而產(chǎn)生半胱氨酸的培養(yǎng)物或分級分離產(chǎn)物。
(12)一種根據(jù)(11)的食品或飲料，其中該食品或飲料是含酒精的飲料、面包食品或發(fā)酵的食品調(diào)味品。
(13)一種應(yīng)用培養(yǎng)物產(chǎn)生的酵母提取物，所述培養(yǎng)物通過在適當條件下培養(yǎng)根據(jù)(1)～(6)中任何一項的酵母獲得。
(14)一種生產(chǎn)含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品的方法，該方法包含以下步驟培養(yǎng)根據(jù)(1)～(6)中任何一項的酵母菌株，將獲得的培養(yǎng)物或其分級分離產(chǎn)物，或者進行了熱處理的培養(yǎng)物或其分級分離產(chǎn)物，與飲料或食品原材料混合，并將該混合物加工為食品或飲料。
在下文中將對本發(fā)明進行詳細描述。
本發(fā)明的酵母菌株是對MNNG有抗性且可產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株。
在本發(fā)明中，“對MNNG有抗性”指在一定濃度MNNG存在時顯示比野生菌株更好的生長。然而，并不需要在存在和不存在MNNG時顯示相同程度的生長。換句話說，如果在存在MNNG時其生長比野生菌株的生長更好，那么盡管與不存在MNNG時相比在存在MNNG時生長不佳，都認為該菌株具有MNNG抗性。一般地，“對MNNG有抗性”指當收集在液體培養(yǎng)基中預(yù)先培養(yǎng)的酵母菌株并將其接種于含有30μg/ml MNNG的YPD培養(yǎng)基(含MNNG的培養(yǎng)基)和不含MNNG的YPD培養(yǎng)基(不含MNNG的培養(yǎng)基)中，從而每一種培養(yǎng)基在660nm的吸收(OD660)為0.1，并然后將該菌株在適當?shù)臏囟冗M行固定培養(yǎng)時，由如下公式計算的生長程度為0.03或更大，優(yōu)選地為0.04或更大，更優(yōu)選地為0.05或更大。
生長程度＝當培養(yǎng)于含MNNG的培養(yǎng)基中時培養(yǎng)基的OD660/當培養(yǎng)于不含MNNG的培養(yǎng)基中時培養(yǎng)基的OD660此外，人們認為生長程度為0.015或更大、優(yōu)選地為0.02或更大、更優(yōu)選地為0.025或更大的酵母菌株對MNNG有抗性，該酵母菌株的生長程度除應(yīng)用MNNG濃度為60μg/ml而不是30μg/ml的含MNNG的培養(yǎng)基之外是以與如上所述相同的方式計算的。
應(yīng)注意到過高的MNNG抗性顯示γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺陷的高可能性，從而優(yōu)選的是MNNG抗性不高于所必需的。特定地，例如，當MNNG濃度為30μg/ml時，生長程度預(yù)期為1.0或更小，優(yōu)選地為0.2或更小，更優(yōu)選地為0.075或更小。
用于上述預(yù)先培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括YPD培養(yǎng)基。該預(yù)先培養(yǎng)可為振蕩培養(yǎng)或固定培養(yǎng)，其中振蕩培養(yǎng)是優(yōu)選的。用于主要培養(yǎng)中的培養(yǎng)基包括YPD培養(yǎng)基。該主要培養(yǎng)可為振蕩培養(yǎng)或固定培養(yǎng)，其中固定培養(yǎng)是優(yōu)選的。
適合于培養(yǎng)的溫度可依賴于酵母或菌株的類型而變化，且可通過將酵母接種于適當培養(yǎng)基如YPD培養(yǎng)基上、在各種溫度對其進行培養(yǎng)并檢查生長良好的溫度范圍而確定。例如，對于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，通常接近30℃的溫度是優(yōu)選的。培養(yǎng)時間是不特別限制的，但優(yōu)選的是該培養(yǎng)在不超過對數(shù)生長期的培養(yǎng)階段進行，優(yōu)選地為直到對數(shù)生長期中期到對數(shù)生長期晚期。具體地，通常為約20～40小時。
在本發(fā)明中，“產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸”指在細胞中以比野生酵母菌株更大的量累積γ-谷氨酰半胱氨酸。優(yōu)選地，當酵母細胞在SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，它指在其對數(shù)生長期每個干細胞累積1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸，更優(yōu)選地為1.5％或更多，且特別優(yōu)選地是當酵母菌株在SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)時累積γ-谷氨酰半胱氨酸而同時谷胱甘肽的累積量為0.1％或更少。γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的累積量指γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽關(guān)于細胞的固體成分的含量(％)，該固體成分如在105℃加熱4小時后細胞的重量。術(shù)語“對數(shù)生長期”指在培養(yǎng)過程中酵母細胞數(shù)目關(guān)于培養(yǎng)時間對數(shù)增加的階段。
不必貫穿整個對數(shù)生長期維持上述的γ-谷氨酰半胱氨酸累積量，而僅僅需要在對數(shù)生長期時間中的至少一個任選點顯示上述值，優(yōu)選地為在對數(shù)生長期的下面狀態(tài)中。即，上述狀態(tài)是具有不小于以下液體培養(yǎng)基吸收的1/2的吸收的對數(shù)生長期，所述液體培養(yǎng)基處于培養(yǎng)從對數(shù)生長期改變?yōu)榉€(wěn)定期時的狀態(tài)。
YPD培養(yǎng)基和SD培養(yǎng)基的組成如下。
葡萄糖 2％蛋白胨 1％酵母提取物 0.5％(pH5.0)[SD培養(yǎng)基組成]葡萄糖 2％含氮堿基 1-倍濃度(10-倍濃度的含氮堿基是1.7g不含氨基酸和硫酸銨的細菌用酵母含氮堿基(Difco Laboratories，Inc.)和5g硫酸銨溶于100ml已滅菌的水中的混合物，將其調(diào)節(jié)到pH5.2并通過濾器過濾進行滅菌)。
本發(fā)明的酵母是不特別限制的，只要它可產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸。特定地，它包括屬于酵母屬如釀酒酵母的酵母、屬于裂殖酵母屬(Schizosacchromyces)如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)的酵母等。考慮到良好的生長，本發(fā)明的酵母菌株優(yōu)選地具有二倍性或更多的多倍性。
具有二倍性或更多多倍性的酵母可通過如下方法獲得，即通過對它們進行突變處理并選擇產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株，或者通過使得用于繁殖產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株的單倍體酵母與帶有野生型谷胱甘肽合成酶的單倍體菌株進行雜交，使得獲得的二倍體酵母形成孢子從而選擇具有降低的谷胱甘肽合成酶活性且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株，然后使兩個具有不同交配型的產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的單倍體酵母菌株相互進行雜交。以相似的方式可獲得具有三倍性或更多多倍性的酵母。
如上所述，本發(fā)明的酵母菌株對MNNG有抗性且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸。這種酵母菌株不喪失γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性但具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。作為結(jié)果，它可在細胞中累積γ-谷氨酰半胱氨酸。
術(shù)語“具有降低的谷胱甘肽合成酶活性”指本發(fā)明酵母菌株的谷胱甘肽合成酶活性低于野生菌株的，包括活性喪失的情形。然而，優(yōu)選的是本發(fā)明的酵母菌株保持低于野生菌株的谷胱甘肽合成酶活性而不是該菌株喪失谷胱甘肽合成酶活性。
如上所述的酵母菌株可通過如下步驟進行篩選。
(a)從大量酵母中選擇對一定濃度范圍的MNNG有抗性的酵母菌株，和(b)從選擇的菌株中選擇具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的菌株。
對一定濃度范圍的MNNG有抗性的酵母菌株可通過如將酵母培養(yǎng)于含有各種MNNG濃度的液體培養(yǎng)基中或瓊脂培養(yǎng)基上并檢查其生長而進行選擇。顯示比野生菌株更好生長的菌株對MNNG有抗性?？蛇x擇地，也可將在其上形成了MNNG濃度梯度的瓊脂培養(yǎng)基用于進行選擇。MNNG的濃度梯度可通過在瓊脂培養(yǎng)基上放置用MNNG溶液浸滲的盤而形成，該MNNG溶液如濃度為1～30mg/ml的MNNG溶液。離該盤越遠，培養(yǎng)基中MNNG的濃度越低。因此，作為本發(fā)明目的在瓊脂培養(yǎng)基中接種大量酵母并在將該盤放置于培養(yǎng)基中央后進行培養(yǎng)使得能夠檢查許多酵母對各種MNNG濃度的抗性。要在培養(yǎng)基上接種的酵母接種量優(yōu)選地為這樣的量，即出現(xiàn)的菌落不相互接觸，且特定地，每個平板約100～約200個細胞是優(yōu)選的。
術(shù)語“對一定濃度范圍的MNNG有抗性”指有關(guān)菌株在存在一定濃度的MNNG時比野生菌株生長良好，但在存在高于該濃度的MNNG濃度時不能生長。因而，對不具有過高MNNG抗性但具有中等MNNG抗性的菌株的選擇使得能夠?qū)θ缦戮赀M行有效選擇，該菌株不喪失γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶且具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。對一定濃度范圍的MNNG有抗性的酵母在瓊脂培養(yǎng)基上距離該盤一定距離的位置形成了菌落，在該培養(yǎng)基上形成了MNNG濃度梯度。不必對要選擇的酵母菌株顯示抗性的MNNG濃度進行鑒定，但該濃度可為相對值，如在瓊脂培養(yǎng)基上距離該盤的距離。
對優(yōu)選濃度范圍的MNNG有抗性的酵母菌株可通過提供以前選擇的酵母菌株作為模型菌株并選擇具有與該模型菌株相同水平的MNNG抗性的酵母菌株而獲得，該以前選擇的酵母菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力。在應(yīng)用已在其上形成了MNNG濃度梯度的瓊脂培養(yǎng)基的情形中，選擇了如下菌株，該菌株中盤和菌落之間的距離與模型菌株的為相同的水平。通過這種方式，與野生菌株相比，應(yīng)用模型菌株作為對照使得能夠?qū)Σ粏适Е?谷氨酰半胱氨酸合成酶活性且具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的酵母菌株進行有效選擇。
作為模型菌株，可提及釀酒酵母Nα3菌株，其中由染色體上的谷胱甘肽合成酶基因編碼的谷胱甘肽合成酶缺失了由位置370的精氨酸殘基及其后面部分組成的C-末端區(qū)域。該菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。
此外，一旦獲得了具有降低的谷胱甘肽合成酶活性及γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的酵母菌株，那么可應(yīng)用顯示菌株的MNNG抗性的MNNG濃度作為指數(shù)而不應(yīng)用任何模型菌株即可進行選擇。
“大量酵母(mass of yeast)”可為包括大量不同屬或物種的酵母或包括其各種突變型的相同物種的酵母。要進行選擇的酵母菌株可為進行人工突變處理的菌株或自發(fā)突變型菌株。該大量酵母優(yōu)選地通過將作為親代菌株的野生型酵母菌株或其具有適當突變的突變型進行突變處理而制備?？蛇x擇地，該大量酵母可為一種在其中已引入了谷胱甘肽合成酶基因的酵母轉(zhuǎn)化體，在該谷胱甘肽合成酶基因中引入了特定的突變或隨機突變。
本發(fā)明的酵母菌株可通過組合突變處理與篩選步驟而獲得。
突變處理包括如下方法，其中應(yīng)用紫外線輻射或通常用于突變處理中的誘變劑的處理是優(yōu)選的，該誘變劑如MNNG、甲基磺酸乙酯(EMS)或甲基甲磺酸(MMS)。
從如上所述選擇的菌株中選擇了具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的菌株。同樣地，優(yōu)選的是對選擇的菌株的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性進行測量以證實該菌株保持該酶的活性。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和谷胱甘肽合成酶活性可分別通過Jackson的方法(Jackson，R.C.，Biochem.J.，111，309(1969))和Gushima等人的方法(Gushima，T.等人，J.Appl.Biochem.，5，210(1983))進行測量。同樣地，對γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的檢查使得能夠證實保持了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性并降低了谷胱甘肽合成酶活性。此外，對在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基上的生長的檢查使得能夠證實谷胱甘肽合成酶活性是降低的還是喪失的。
通過在適當條件下培養(yǎng)如上所述獲得的產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株獲得的培養(yǎng)物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。這種培養(yǎng)物或其分級分離產(chǎn)物含有γ-谷氨酰半胱氨酸。該培養(yǎng)物可為含有酵母細胞的液體培養(yǎng)基，或者可為從其中收集的酵母細胞、破壞的細胞或細胞提取物(酵母提取物)。同樣建議從破壞的細胞或酵母提取物中獲得含有γ-谷氨酰半胱氨酸的組分。
加熱上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養(yǎng)物或其組分可從γ-谷氨酰半胱氨酸中釋放半胱氨酸。
用于進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基是不特別限制的，只要它使得本發(fā)明的酵母菌株能良好生長并有效產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸。特別地，具有降低的谷胱甘肽合成酶活性但不喪失該活性的酵母菌株可在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基上生長良好。因此，可應(yīng)用通常在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用的培養(yǎng)基。如果必要，依賴于應(yīng)用的菌株的特征可將必要的養(yǎng)分添加到培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)條件和酵母提取物等的制備以與進行通常的酵母培養(yǎng)和酵母提取物等的制備相同的方式進行。酵母提取物可為那些通過處理酵母細胞的熱水提取物獲得的或那些通過處理消化的酵母細胞獲得的。
含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的上述培養(yǎng)物或其組分可用于生產(chǎn)食品或飲料。該食品和飲料包括含酒精的飲料、面包食品或發(fā)酵的食品調(diào)味品。通過熱處理從γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)半胱氨酸可在生產(chǎn)食品和飲料過程中或其生產(chǎn)之后進行。
上述食品和飲料通過將含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的培養(yǎng)物或其組分與食品和飲料原材料混合并將混合物加工為食品和飲料進行生產(chǎn)。除了應(yīng)用上述的培養(yǎng)物或其分級分離產(chǎn)物之外，本發(fā)明的食品和飲料可應(yīng)用與那些用于通常的食品和飲料中的相同的原材料并通過與用于通常的食品和飲料中的相同的方法進行生產(chǎn)。這種原材料對于含酒精的飲料包括如稻、大麥、玉米淀粉等，對于面包食品包括小麥面粉、糖、精制食鹽、黃油、發(fā)酵酵母等，對于發(fā)酵的食品調(diào)味品包括大豆和小麥等。
附圖簡述

圖1是質(zhì)粒GSH2Mdash/pYES2dash的構(gòu)建圖解，該質(zhì)粒含有用于置換減弱型谷胱甘肽合成酶基因的盒。
圖2是闡明應(yīng)用圖1中所示的盒對谷胱甘肽合成酶基因進行基因置換的示意圖。
優(yōu)選實施方案描述在下文中，本發(fā)明將更詳細地進行描述。
實施例1應(yīng)用MNNG抗性作為表型篩選具有降低的谷胱甘肽合成酶的菌株<1>繁殖Nα3菌株作為篩選模型菌株(1)用于置換減弱型谷胱甘肽合成酶基因的盒的制備通過常規(guī)方法從自然界分離的釀酒酵母中獲得了單倍體Nα1菌株(尿嘧啶缺陷型)。通過下述方法應(yīng)用Nα1菌株獲得了帶有減弱型谷胱甘肽合成酶基因的Nα3模型菌株。
在生產(chǎn)商所示的條件下，應(yīng)用引物F1(CAGATTCCGAGTTTACTGGA(SEQ ID NO1))和R1(AGAAGGAATGAGCCTAAAACAGC(SEQ ID NO2))和PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo)通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增了一個區(qū)域，該區(qū)域編碼從釀酒酵母S2菌株谷胱甘肽合成酶基因可讀框(ORF)的中游到ORF下游的約120個堿基對。使得商業(yè)上可購得用于食品中的釀酒酵母形成孢子以獲得單倍體面包酵母S菌株(MATα)。進一步地，通過應(yīng)用含有尿嘧啶的SDFOA瓊脂培養(yǎng)基(終濃度中含有2％純化的瓊脂、50mg/l尿嘧啶和1g/l 5-氟乳清酸水合物的SD培養(yǎng)基)從S菌株獲得了S2菌株，該S2菌株是尿嘧啶必需型菌株。
將如上所述擴增的基因片段純化，并在下面條件下于72℃進行10分鐘的酶促反應(yīng)以向末端添加A。
(反應(yīng)混合物組成)
基因片段溶液 5μl10×PCR緩沖液(不含MgCl2) 5μl25mM MgCl23μl2.5mM dATP 5μlTaq DNA聚合酶(Takara Shuzo)0.5μl純化的水 31.5μl總計 50μl通過常規(guī)方法將如上所述獲得的基因片段與質(zhì)粒pGEM-T Easy(Promega Corporation)連接以獲得質(zhì)粒GSH2dash/pGEM。
下一步，使與包含于GSH2dash/pGEM中的谷胱甘肽合成酶基因中位置370的氨基酸相應(yīng)的密碼子由終止密碼子替代。該操作是根據(jù)由生產(chǎn)商提供的規(guī)程通過應(yīng)用QuikChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)進行的。應(yīng)用GSH2M-F1(GGCAGGGAAGGCAAGTAGCTGGCATTAAGTGAGCCCTC(SEQ ID NO3))和GSH2M-R1(GAGGGCTCACTTAATGCCAGCTACTT GCCTTCCCTGCC(SEQID NO4))作為引物。以這種方式制備了質(zhì)粒GSH2Mdash/pGEM。
獨立地制備了相應(yīng)于質(zhì)粒pYES2(Invitrogen)的質(zhì)粒，其中去除了2μori。用限制性內(nèi)切酶Ssp I和Nhe I切割pYES2并使切割的末端形成平端，然后進行連接以獲得質(zhì)粒pYES2dash。將pYES2dash和GSH2Mdash/pGEM各自用限制性內(nèi)切酶Sac I和Sph I切割以從pYES2dash中切除含有URA3基因的片段及從GSH2Mdash/pGEM中切除具有突變的谷胱甘肽合成酶基因片段，并將這些相互進行連接。從而制備了質(zhì)粒GSH2Mdash/pYES2dash。用限制性內(nèi)切酶Mun I消化GSH2Mdash/pYES2dash以獲得用于進行基因置換的盒(圖1)。
(2)具有減弱型谷胱甘肽合成酶基因置換的構(gòu)建通過應(yīng)用如上所述制備的盒進行了Nα1菌株谷胱甘肽合成酶基因的基因置換(圖2)。對Nα1菌株進行預(yù)先培養(yǎng)，并將培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)于50ml YPD培養(yǎng)基中，直到培養(yǎng)物達到對數(shù)生長期為止。將培養(yǎng)的細胞懸浮于1M山梨糖醇中，并與盒混合，然后通過電穿孔進行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化體菌株培養(yǎng)于含有1mM谷胱甘肽的SD平板上，并對在其上生長的菌株進行選擇。通過PCR證實盒在染色體的目標位點插入，并將獲得的菌株命名為Nα3中間體菌株。
然后，如圖2所示，進行下面的操作以僅將減弱型的谷胱甘肽合成酶基因留在染色體上。將Nα3中間體在YPD培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，并將培養(yǎng)產(chǎn)物接種于含有1mM谷胱甘肽的SDFOA平板上。確定了平板上生長的菌株的谷胱甘肽合成酶基因序列，且證實已正確置換了目標位點的序列。因而獲得了Nα3菌株。
(3)谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸由Nα3菌株的生產(chǎn)對Nα3菌株對數(shù)生長期中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽每單位時間的生產(chǎn)量進行了研究。在YPD培養(yǎng)基中對Nα3菌株進行預(yù)先培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物接種于50ml SD培養(yǎng)基(含有必需量的尿嘧啶)中，并于30℃進行振蕩培養(yǎng)。
γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的生產(chǎn)量測量如下。即，將培養(yǎng)物進行離心以獲得細胞，將該細胞用蒸餾水洗滌2次，然后于70℃進行10分鐘的熱水提取處理以獲得細胞內(nèi)容物。將該細胞內(nèi)容物進行離心，并測量獲得的上清液中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。另一方面，將在一定量培養(yǎng)基中獲得的酵母細胞置于濾紙上并于105℃加熱4小時，隨后測量剩余細胞的重量，該重量定義為干細胞重量。表1顯示每個干細胞重量中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。
表1測量前的培養(yǎng)時γ-谷氨酰半胱 谷胱甘肽間氨酸(％) (％)Nα3 No.1約1.5小時 1.101 0.0043Nα3 No.2約3.8小時 1.117 0.0045(4)Nα3菌株的MNNG抗性程度的測量將一個濾器置于YPD瓊脂平板的中央，將1mg MNNG溶于30μl二甲基亞砜(DMSO)中的溶液完全地浸滲到濾器中以制備MNNG濃度梯度瓊脂培養(yǎng)基，其中位置離中央點的距離越遠，MNNG濃度則越低。在該瓊脂培養(yǎng)基上涂布已在YPD液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的Nα1菌株和Nα3菌株。于30℃培養(yǎng)70小時后，測量了從瓊脂培養(yǎng)基中央點到酵母形成的菌落位點之間的距離。作為結(jié)果，該距離對于Nα1菌株為2.3cm，而對于Nα3菌株為1.8cm。
<2>谷胱甘肽合成酶減弱的菌株的篩選通過常規(guī)方法使得用于食品的釀酒酵母形成孢子以獲得單倍體面包酵母MS菌株，并用EMS作為誘變劑對該菌株進行突變處理。該突變處理是在死亡率為90％的條件下進行的。
突變處理進行如下。即，將MS菌株于30℃在50ml YPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1日，并收集酵母細胞。將收集的酵母細胞用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)洗滌3次。然后，將酵母細胞懸浮于含有9.2ml 0.2M的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、0.5ml 40％的D-葡萄糖和0.3ml EMS(Nakarai Tesque，Code 155-19)的溶液中，并于30℃振蕩培養(yǎng)90分鐘。將10％的硫代硫酸鈉(用濾器滅菌)(10ml)添加到培養(yǎng)物中以懸浮細胞，然后將懸浮液于室溫靜置10分鐘以中和誘變劑。收集酵母細胞并用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)進行洗滌。因而，對酵母進行了突變處理。在這種情況下，死亡率為90％。
將如上所述進行突變處理的MS菌株涂布于MNNG濃度梯度瓊脂培養(yǎng)基(通過在YPD瓊脂平板中央放置一個濾器，并用全部量的1mg MNNG溶于30μl DMSO中的溶液對濾器進行浸滲而制備)上，從而出現(xiàn)的菌落數(shù)目為200個或更少，并于30℃進行5日的固定培養(yǎng)。分離了在如下MNNG濃度范圍中生長的酵母突變型，在該MNNG濃度范圍中，產(chǎn)生普通量的谷胱甘肽的酵母(Nα1菌株)不能生長(距離瓊脂培養(yǎng)基的中央點約2.3cm)，但產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸而不產(chǎn)生或基本不產(chǎn)生谷胱甘肽的酵母(Nα3菌株)能夠生長(距離瓊脂培養(yǎng)基的中央點約1.8cm)。對93個這種突變菌株進行了γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的測量，并獲得了一個谷胱甘肽合成酶活性降低的突變菌株AJ14809。
實施例2γ-谷氨酰半胱氨酸由產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的二倍體酵母的生產(chǎn)
<1>產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的二倍體酵母的制備將單倍體酵母(MATα)AJ14809菌株用作具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的釀酒酵母，該菌株通過對單倍體酵母進行突變處理并利用MNNG濃度梯度瓊脂培養(yǎng)基進行選擇而獲得，該單倍體酵母是使得商業(yè)上可購得的面包酵母(二倍體)形成孢子而獲得的。通過如上所述應(yīng)用Nα3菌株作為對照，將該菌株選擇為與Nα3菌株具有相同水平的MNNG抗性的菌株。
AJ14809菌株自2001年10月1日以來以保藏號FERM P-18546保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(Central6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)。最初的保藏物基于2002年12月1日的Budapest條約轉(zhuǎn)變?yōu)閲H保藏物，并指定保藏號FERM BP-8228。
另一方面，應(yīng)用AJ14810菌株(MATa)作為釀酒酵母野生菌株。該菌株自2001年10月1日以來以保藏號FERM P-18547保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心。最初的保藏物基于2002年12月1日的Budapest條約轉(zhuǎn)變?yōu)閲H保藏物，并指定保藏號FERM BP-8229。
將AJ14809菌株和AJ14810菌株各自在4ml YPD試管培養(yǎng)基中于30℃進行振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在YPD試管培養(yǎng)基中混合在一起，并于30℃進行振蕩培養(yǎng)。在證實AJ14809菌株與AJ14810菌株交配之后，將液體培養(yǎng)物涂布于YPD瓊脂培養(yǎng)基上并于30℃進行培養(yǎng)。從在瓊脂培養(yǎng)基上生長的酵母中獲得了二倍體菌株。該二倍體菌株具有源自AJ14809菌株的谷胱甘肽合成酶基因和源自AJ14810菌株的谷胱甘肽合成酶基因。使得該二倍體菌株形成孢子，并通過隨機孢子方法選擇10個單倍體酵母菌株。該單倍體酵母菌株保持MATa且具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，且當培養(yǎng)于SD培養(yǎng)基中時，在對數(shù)生長期中每個干酵母細胞含有1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸且累積0.1％或更少的谷胱甘肽。將這10個菌株各自與AJ14809菌株進行交配以獲得二倍體酵母AJ14800菌株，該AJ14800菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，且當培養(yǎng)于SD培養(yǎng)基中時，在對數(shù)生長期中每個干酵母細胞累積約1.5％γ-谷氨酰半胱氨酸。
從通過使AJ14809菌株與AJ14810菌株進行交配而獲得的二倍體酵母中選擇產(chǎn)生野生型谷胱甘肽合成酶的菌株作為對照，并將其命名為L菌株。
<2>對AJ14800菌株的MNNG抗性程度的測量將具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的AJ14800菌株和產(chǎn)生野生型谷胱甘肽合成酶的二倍體釀酒酵母L菌株培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基中以獲得液體培養(yǎng)物，將該液體培養(yǎng)物接種于含有30μg/ml或60μg/mlMNNG的YPD培養(yǎng)基或YPD培養(yǎng)基中，使得在660nm的吸收為0.1。對于于30℃固定培養(yǎng)26小時的培養(yǎng)基在660nm的吸收進行測量以測量生長程度。作為結(jié)果，如表2所示，谷胱甘肽合成酶減弱的菌株AJ14800比野生型保持谷胱甘肽合成酶的菌株更具有對MNNG的抗性。
表260μg/ml MNNG時的生 60μg/ml MNNG時的生長程度 長程度L 0.0195 0.0139AJ14800 0.0540 0.0254<3>對AJ14800菌株的γ-谷氨酰半胱氨酸累積量的測量在將AJ14800菌株于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)40小時后收集細胞。將該細胞接種入SD培養(yǎng)基中從而在660nm的吸收為0.2。從培養(yǎng)開始后8小時測量的細胞內(nèi)γ-谷氨酰半胱氨酸累積量為1.50％。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，提供了一種具有降低活性的谷胱甘肽合成酶活性且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母。本發(fā)明的菌株可用于生產(chǎn)含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品或含有半胱氨酸的食品。
序列表<110>味之素公司<120>產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其篩選方法<130>C031MKOP1419<140>
<141>2002-11-21<150>JP 2001-359781<151>2001-11-26<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>1cagattccga gtttactgga 20<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>2agaaggaatg agcctaaaac agc 23<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>3ggcagggaag gcaagtagct ggcattaagt gagccctc38<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>4gagggctcac ttaatgccag ctacttgcct tccctgcc38
權(quán)利要求
1.一種對MNNG具有抗性且產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酵母菌株，其中該菌株具有如下面公式計算的0.03或更大的生長程度生長程度＝當培養(yǎng)于含MNNG的培養(yǎng)基中時培養(yǎng)基的OD660/當培養(yǎng)于不含MNNG的培養(yǎng)基中時培養(yǎng)基的OD660當收集在液體培養(yǎng)基中預(yù)先培養(yǎng)的酵母菌株并將其接種于含有30μg/ml MNNG的YPD培養(yǎng)基(含MNNG的培養(yǎng)基)和不含MNNG的YPD培養(yǎng)基(不含MNNG的培養(yǎng)基)中，使每一種培養(yǎng)基在660nm的吸收(OD660)為0.1，然后將該菌株在適當?shù)臏囟冗M行固定培養(yǎng)的時候。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的酵母菌株，其中該菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1～3中任何一項的酵母菌株，其中當培養(yǎng)于SD培養(yǎng)基中時，對數(shù)生長期中每個干細胞的γ-谷氨酰半胱氨酸含量按重量計算為1％或更多。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1～4中任何一項的酵母菌株，其中該菌株具有二倍性或更多倍性。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1～5中任何一項的酵母菌株，其中該菌株屬于酵母屬。
7.一種篩選具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的酵母菌株的方法，該方法包括步驟(a)從大量酵母中選擇對一定濃度范圍的MNNG有抗性的酵母菌株；和(b)從選擇的菌株中篩選具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的菌株。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在步驟(a)中，大量酵母是通過將親代酵母菌株進行突變處理而制備的。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中在步驟(a)中，對一定濃度范圍的MNNG有抗性的酵母菌株是用瓊脂培養(yǎng)基進行選擇的，在該培養(yǎng)基上已形成了MNNG的濃度梯度。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求7～9中任何一項的方法，其中在步驟(a)中，提供了以前分離的具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)力的酵母模型菌株，并選擇了與模型菌株有相同水平的對MNNG的抗性的酵母菌株。
11.一種包含通過在適當條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1～6中任何一項的酵母菌株獲得的培養(yǎng)物的食品或飲料，或者含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養(yǎng)物的分級分離產(chǎn)物，或者在其中已通過熱處理而產(chǎn)生半胱氨酸的培養(yǎng)物或分級分離產(chǎn)物。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的食品或飲料，其中該食品或飲料是含酒精的飲料、面包食品或發(fā)酵的食品調(diào)味品。
13.一種應(yīng)用培養(yǎng)物產(chǎn)生的酵母提取物，所述培養(yǎng)物通過在適當條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1～6中任何一項的酵母獲得。
14.一種生產(chǎn)含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品的方法，該方法包含以下步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1～6中任何一項的酵母菌株，將獲得的培養(yǎng)物或其分級分離產(chǎn)物，或者進行了熱處理的培養(yǎng)物或其分級分離產(chǎn)物，與飲料或食品原材料混合，并將該混合物加工為食品或飲料。
全文摘要
通過如下步驟對具有減弱的谷胱甘肽合成酶活性且能夠產(chǎn)生γ－谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株進行了篩選(a)從大量酵母中選擇對限定范圍濃度的MNNG耐受的酵母菌株；和(b)從這樣選擇的菌株中選擇具有減弱的谷胱甘肽合成酶活性且能夠產(chǎn)生γ－谷氨酰半胱氨酸的菌株。
文檔編號C12N1/16GK1596301SQ02823530
公開日2005年3月16日 申請日期2002年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月26日
發(fā)明者西內(nèi)博章, 末廣真理子, 杉本玲子, 西村康史, 黑田素央 申請人:味之素株式會社