專利名稱：具有增強(qiáng)的嗜熱性和嗜堿性的木聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木聚糖酶。更特別地，本發(fā)明涉及木聚糖酶及在高溫和高pH條件下具有改良性能的修飾的木聚糖酶。
背景技術(shù)：
木聚糖酶是具有廣泛商業(yè)用途的一組酶。木聚糖酶主要應(yīng)用于造紙業(yè)中紙漿的生物漂白中。另外，木聚糖酶在果汁和葡萄酒中用作澄清劑，及在精密儀器和半導(dǎo)體的洗滌中用作酶制劑(例如美國(guó)專利No.5,078,802)，而且它們還用于改良家禽和豬飼料的消化性。
在造紙業(yè)的紙漿生產(chǎn)中，將纖維性原料在存在化學(xué)制品的情況下進(jìn)行高溫和高壓處理。這種處理將纖維轉(zhuǎn)化為紙漿，稱為制漿。在制漿后，將紙漿漂白。木聚糖酶用于增強(qiáng)對(duì)紙漿的漂白作用。木聚糖酶處理使得隨后的漂白化學(xué)制品如氯，二氧化氯，過(guò)氧化氫或者這些化學(xué)制品的組合更有效地漂白紙漿。用木聚糖酶對(duì)紙漿預(yù)處理提高最終紙制品的白度和質(zhì)量，并減少必須用于漂白紙漿的基于氯的化學(xué)制品的數(shù)量。這反過(guò)來(lái)降低了通過(guò)這種方法產(chǎn)生的含氯污水。
最重要的化學(xué)制漿方法是牛皮紙漿。針對(duì)牛皮紙漿，在制漿之后及在用木聚糖酶處理紙漿之前，紙漿處于大約55-70℃及在高堿性pH下(例如Nissen等，1992)。許多可商購(gòu)的野生型木聚糖酶的缺點(diǎn)是這些酶呈現(xiàn)酸性的最佳pH及大約55℃的最佳溫度。因此，為有效利用木聚糖酶進(jìn)行漂白，紙漿必須酸化為與使用的特異性木聚糖酶的最佳pH相近的pH。另外，熱紙漿必須冷卻至接近選擇的木聚糖酶的酶活性的最佳溫度。針對(duì)木聚糖酶處理而降低紙漿溫度降低了隨后化學(xué)漂白的效力。酸化紙漿需要使用大量酸。另外，加入酸產(chǎn)生侵蝕，這使加工設(shè)備的壽命降低。因此，在接近紙漿條件的溫度和pH條件下活性最佳的木聚糖酶在紙漿生產(chǎn)中是有用及有益的。
在較高溫度呈現(xiàn)較高活性的木聚糖酶可用于在制漿之后立即處理紙漿，而不需要將紙漿冷卻。相似地，在較高pH條件下呈現(xiàn)較高活性的木聚糖酶很少或不需要酸中和紙漿。分離或遺傳處理具有這種性質(zhì)的木聚糖酶為許多工業(yè)處理提供了一些有利條件和實(shí)際的經(jīng)濟(jì)益處。
針對(duì)改良用于現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的紙漿漂白中的木聚糖酶的一些方法包括從在80-100℃生長(zhǎng)的極端嗜熱生物中分離熱穩(wěn)定的木聚糖酶，所述生物如Caldocellum saccharolyticum，Thermatoga maritima和Thermatoga sp.Strain FJSS-B.1(Luthi等1990；Winterhalter等1995；Simpson等1991)。然而，這些熱穩(wěn)定的木聚糖酶較大，分子量在35-120kDa(320-1100個(gè)殘基)，并與呈現(xiàn)較好穿透紙漿纖維的其它較小木聚糖酶相比呈現(xiàn)穿透紙漿的能力下降。另外，一些極度嗜熱的木聚糖酶，如Caldocellum saccharolyticum木聚糖酶A呈現(xiàn)木聚糖酶和纖維素酶雙重活性(Luthi等1990)。這種額外的分解纖維素活性在紙漿漂白中是不需要的，因?yàn)槠鋵?duì)造紙大批原料，纖維素具有不利作用。另外，在極高溫度具有正常功能的超耐熱木聚糖酶在最佳紙漿漂白溫度范圍具有低特異性活性(Simpson等1991)。
許多木聚糖酶通過(guò)蛋白質(zhì)工程已經(jīng)加以修飾以改良其工業(yè)應(yīng)用性質(zhì)。例如U.S.5,759,840(Sung等)和U.S.5,866,408(Sung等)揭示了里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II(TrX)的N末端區(qū)域(1-29殘基)中的突變。發(fā)現(xiàn)在TrX的第10，27和29位殘基的三個(gè)突變提高了木聚糖酶在提高的溫度和堿性pH條件下的酶活性。
U.S.5,405,769(Campbell等)揭示了使用定點(diǎn)誘變修飾環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)木聚糖酶(BcX)以改良酶的熱穩(wěn)定性。位點(diǎn)特異的誘變包括用Cys殘基置換兩個(gè)氨基酸以產(chǎn)生分子內(nèi)二硫鍵。另外，突變酶的N末端中特異的殘基，也發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步改良了酶的熱穩(wěn)定性。在體外分析中，二硫突變物顯示在62℃具有熱穩(wěn)定性，比天然BcX木聚糖酶提高7℃。然而，這些熱穩(wěn)定二硫突變物在隨后的研究的實(shí)驗(yàn)室分析中顯示未獲得嗜熱性(Wakarchuck等，1994)。在BcX木聚糖酶的N末端附近的突變T3G(即在第3位的蘇氨酸用Gly置換；BcX木聚糖酶氨基酸編號(hào))，D4Y(F)和N8Y(F)提供了在57℃的熱穩(wěn)定性，比天然BcX提高2℃(U.S.5,405,769)。然而，這些酶在工業(yè)中的應(yīng)用仍需要在預(yù)處理后和加入酶之前冷卻及酸化紙漿。因此，仍需要進(jìn)一步提高熱穩(wěn)定性，嗜熱性和pH最佳值。
Turnnen等(2001)揭示了在TrX的11，38和162位的突變(N11D，N38E，Q162H)，與二硫鍵互補(bǔ)相似(S110C/N154C)，來(lái)改良木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。然而，包括N11D的這些突變對(duì)木聚糖酶的嗜熱性和嗜堿性也具有不利作用，導(dǎo)致與天然TrX II相比在較高溫度和中性-堿性pH值下酶的活性降低。
現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域需要獲得新的適于工業(yè)應(yīng)用的木聚糖酶，其在提高的溫度和pH條件下呈現(xiàn)提高的酶活性。本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的缺點(diǎn)。
上述目的通過(guò)主權(quán)利要求的特征組合而體現(xiàn)，從屬權(quán)利要求進(jìn)一步揭示了本發(fā)明有利的實(shí)施方案。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及木聚糖酶。更特別地，本發(fā)明涉及木聚糖酶，及修飾的木聚糖酶，其在高溫及高pH條件下具有改良的性能。
本發(fā)明涉及一種木聚糖酶，其包含至少一個(gè)在選自第11，116，118，144和161位氨基酸的位置上的取代的氨基酸殘基，所述位置從修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的對(duì)比中確定。優(yōu)選地，所述木聚糖酶與相應(yīng)的天然TrX木聚糖酶相比呈現(xiàn)改良的嗜熱性，嗜堿性，更寬的有效pH范圍，表達(dá)效率或其組合。
本發(fā)明還提供了上述木聚糖酶，其中所述木聚糖酶是修飾的木聚糖酶，而且至少一個(gè)取代的氨基酸殘基在第116位。優(yōu)選地，取代的氨基酸是Gly。
本發(fā)明還包含如上述在第116位修飾的木聚糖酶，而且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本發(fā)明包括如上述在第116位修飾的木聚糖酶，而且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本發(fā)明描述了如上述在第116位修飾的木聚糖酶，并且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第11位的Asp，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在144和161位的Arg。
本發(fā)明還提供了如上述修飾的木聚糖酶，其中至少一個(gè)取代的氨基酸殘基在第144位。優(yōu)選所述取代的氨基酸是Arg。
本發(fā)明包含如上述在第144位修飾的木聚糖酶，并且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala及在第129位的Glu。
本發(fā)明還提供了如上述修飾的木聚糖酶，其中至少一個(gè)取代的氨基酸在161位。優(yōu)選所述取代的氨基酸是Arg。
本發(fā)明包含如上述在161位修飾的木聚糖酶，并且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本發(fā)明還提供了如上述修飾的木聚糖酶，其中至少一個(gè)取代的氨基酸殘基在第11位。優(yōu)選取代的氨基酸是Asp。
本發(fā)明包含如上述在第11位修飾的木聚糖酶，并且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在144和161位的Arg。
本發(fā)明還提供了如上述修飾的木聚糖酶，其中至少一個(gè)取代的氨基酸殘基在第118位。優(yōu)選所述取代的氨基酸是Cys。
本發(fā)明還包含如上述在第118位修飾的木聚糖酶，并且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本發(fā)明包括如上述在第118位修飾的木聚糖酶，并且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本發(fā)明描述了如上述在第118位修飾的木聚糖酶，并且其進(jìn)一步包含在第10和105位的His，在第11位的Asp，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在144和161位的Arg。
本發(fā)明還涉及如上述修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶，優(yōu)選里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶。
本發(fā)明涉及一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，其中所述修飾的木聚糖酶特征在于最大有效溫度(MET)在大約69℃至大約84℃之間，及其中所述修飾的木聚糖酶是得自木霉(Trichoderma sp.)的家族11木聚糖酶。優(yōu)選的，MET在大約70-大約80℃之間。
本發(fā)明還包括一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，其中所述修飾的木聚糖酶特征在于最大有效pH(MEP)在大約pH5.8至大約pH8.4之間，及其中所述修飾的木聚糖酶是得自木霉的家族11木聚糖酶。優(yōu)選的，MEP在大約pH6.0至大約pH8.0之間。
本發(fā)明涉及一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，其中所述修飾的木聚糖酶特征在于最大有效溫度(MET)在大約69℃至大約84℃之間，及最大有效pH(MEP)在大約pH5.8至大約pH8.4之間。優(yōu)選的，MET在大約70至大約80℃之間，MEP在大約pH6.0至大約pH8.0之間。
本發(fā)明還涉及一種修飾的木聚糖酶，其選自由以下組成的一組TrX-HML-75A105H-125A129E-144R；TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R；TrX-116G；TrX-118C；TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R；TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R；TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R；TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R；TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R；和TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，特征在于最大有效溫度(MET)在大約69℃至大約84℃之間，其中修飾的木聚糖酶是得自木霉的家族11木聚糖酶。另外，本發(fā)明涉及得自木霉的一種修飾的家族11木聚糖酶，特征在于具有大約70至大約80℃之間的MET。本發(fā)明還包括得自木霉的一種修飾的家族11木聚糖酶，特征在于具有大約69至大約84℃之間的MET及大約5.8至大約8.4之間的最大有效pH(MEP)。本發(fā)明還涉及如上所限定的修飾的木聚糖酶，其中MEP在大約6.0至大約8.0之間。
本發(fā)明涉及上述修飾的木聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括一種工業(yè)處理，其中所述工業(yè)處理包括紙漿漂白，精密儀器的加工或者改良家禽和豬飼料的可消化性。
本發(fā)明的概述無(wú)必要描述本發(fā)明的全部必要特征，但本發(fā)明也可以是所述特征的亞組合。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的這些及其它特征通過(guò)參考附圖的以下描述更加顯而易見(jiàn)，其中

圖1示出家族11木聚糖酶的氨基酸序列對(duì)比。氨基酸編號(hào)與里氏木霉木聚糖酶II(Tr2)相比較，如在序列上方所示。在第75和105位的殘基(相對(duì)于Tr2)以斜體字并用星號(hào)標(biāo)示。與至少75％家族11木聚糖酶共有的氨基酸以黑體字標(biāo)示。與全部家族11木聚糖酶共有的殘基以下劃線標(biāo)示。針對(duì)具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的木聚糖酶，只表示催化核心序列。
圖2示出TrX木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID NO39)，和用于在質(zhì)粒pTrX中構(gòu)建編碼里氏木霉木聚糖酶II(TrX)的序列的合成寡核苷酸。
圖3示出與TrX-HML-75A105H-125A129E相比，在pH5.5、30分鐘溫育期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)在40℃觀測(cè)到的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖4示出與天然TrX相比，在pH5.0、30分鐘溫育期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-116G和TrX-118C的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)在40℃觀測(cè)到的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖5示出與天然TrX，TrX-HML，TrX-HML-75A105H-125A129E和TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相比，在pH5.5、30分鐘溫育期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)在40℃觀測(cè)到的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖6示出與TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相比，在pH6.0、30分鐘溫育期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R，TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)在40℃觀測(cè)到的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖7示出與TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相比，在pH6.0、30分鐘溫育期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)每種酶的最大活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖8示出與TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R相比，在pH6.0、30分鐘溫育期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)在40℃觀測(cè)到的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖9示出與TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R和TrX-HML-75A105H-125A129E相比，在pH5.0-8.0、65℃、30分鐘溫育期間，修飾的木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R，TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R的pH/活性概況。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為每種酶呈現(xiàn)最佳活性的pH。
圖10示出與天然TrX相比，在pH4.5-7.0、50℃、30分鐘溫育期間，修飾的木聚糖酶TrX-116G和TrX-118C的pH/活性概況。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為每種酶呈現(xiàn)最佳活性的pH。
圖11示出本發(fā)明一些修飾的酶的最大有效溫度(MET)和最大有效pH(MEP)值。MET和MEP分別是木聚糖酶呈現(xiàn)其至少80％的最佳活性(使用可溶的樺木木聚糖作為底物；詳見(jiàn)分析方法)時(shí)的最高的溫度和pH。這些數(shù)據(jù)點(diǎn)得自在圖3-10中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及木聚糖酶。更特別地，本發(fā)明涉及木聚糖酶及修飾的木聚糖酶，其在高溫和高pH條件下具有改良的性能。
以下描述是優(yōu)選的實(shí)施方案，只是例證了本發(fā)明而不限制進(jìn)行本發(fā)明必備的特征組合。
木聚糖酶漂白紙漿的機(jī)制還未完全明了。已有觀點(diǎn)認(rèn)為有色的木質(zhì)素通過(guò)木聚糖與晶體狀纖維素相連接，木聚糖酶通過(guò)水解木聚糖而促進(jìn)紙漿漂白，釋放紙漿中的有色木質(zhì)素。在此所描述的木聚糖酶和修飾的木聚糖酶可用于漂白紙漿或者用于需要在高于野生型酶的溫度和pH之上時(shí)具有活性的其它應(yīng)用。針對(duì)生物漂白紙漿，優(yōu)選的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶(見(jiàn)表1)，然而，在此所揭示的修飾不需要僅限于家族11木聚糖酶，還可包括其它木聚糖酶。另外，在此所描述的修飾可見(jiàn)于天然木聚糖酶蛋白質(zhì)中，這些天然木聚糖酶可呈現(xiàn)如在此所述希望的特征，并包括在本發(fā)明內(nèi)。
家族11木聚糖酶是一組分子量相對(duì)較低的小型酶(大約20kDa，及大約200個(gè)氨基酸殘基)。家族11木聚糖酶的小尺寸使其可以迅速穿透紙漿。另外，家族11木聚糖酶沒(méi)有纖維素酶活性。
本發(fā)明的一方面涉及得自木霉的修飾的家族11木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，特征在于具有在大約69℃至大約84℃之間的最大有效溫度(MET，見(jiàn)以下解釋)。優(yōu)選地，所述修飾的木聚糖酶特征在于具有在大約70℃至大約80℃之間的MET。本發(fā)明還包括修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，特征在于具有在大約5.8至大約8.4之間的最大有效pH(MEP，見(jiàn)以下解釋)。優(yōu)選地，所述MEP在大約6.0至大約8.0之間。
本發(fā)明還涉及得自木霉的一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸，特征在于具有在大約69℃至大約84℃之間的最大有效溫度(MET)，及在大約5.8至大約8.4之間的最大有效pH(MEP)。優(yōu)選地，MET在大約70℃至大約80℃之間，而且MEP在大約6.0至大約8.0之間。
本發(fā)明還涉及一種天然家族11木聚糖酶，特征在于具有在大約69℃至大約84℃之間的最大有效溫度(MET)，及在大約5.8至大約8.4之間的最大有效pH(MEP)。優(yōu)選MET在大約70℃至大約80℃之間，MEP在大約6.0至大約8.0之間。
“最大有效溫度”或者“MET”是指木聚糖酶呈現(xiàn)其至少80％的最佳活性的最高溫度。這個(gè)試驗(yàn)典型地使用可溶的樺木木聚糖作為底物，在pH5.5或6.0進(jìn)行30分鐘。用于研究修飾的木聚糖酶性質(zhì)的分析結(jié)果示于圖3至圖8，其包括在pH5.5或6.0孵育30分鐘。從圖3至圖8中確定的本發(fā)明一些酶的MET概況示于圖11。實(shí)驗(yàn)證明木聚糖酶的MET針對(duì)不同的底物而不同。因此可知使用不同的底物，將獲得不同的MET值(數(shù)據(jù)未示出)。為評(píng)價(jià)本發(fā)明的木聚糖酶，使用可溶的樺木木聚糖底物(見(jiàn)實(shí)施例3)。
“最大有效pH“或”MEP”是指木聚糖酶呈現(xiàn)其至少80％的最佳活性的最高pH。這個(gè)試驗(yàn)使用可溶的樺木木聚糖作為底物，在65℃進(jìn)行30分鐘。用于研究修飾的木聚糖酶性質(zhì)的分析結(jié)果示于圖9和10，其包括在65℃進(jìn)行30分鐘孵育。本發(fā)明的一些酶的MEP概況示于圖11。實(shí)驗(yàn)證明木聚糖酶的MEP針對(duì)不同的底物而不同。例如，對(duì)從軟木或硬木中制備的牛皮紙漿，觀測(cè)到MEP為9.2(數(shù)據(jù)未示出)。因此可知用不同的底物，將獲得不同的MEP值。為評(píng)價(jià)本發(fā)明的木聚糖酶，使用可溶的樺木木聚糖底物(見(jiàn)實(shí)施例4)。
表1家族11木聚糖酶微生物木聚糖酶SEQ ID NO

家族11木聚糖酶共有廣泛的氨基酸序列相似性(圖1)。對(duì)一些家族11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)研究表明源自細(xì)菌和真菌的家族11木聚糖酶呈現(xiàn)相同的一般分子結(jié)構(gòu)(U.S.5,405,769；Arase等1993)。另外，迄今鑒別的大多數(shù)家族11木聚糖酶呈現(xiàn)三種類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括β折疊，轉(zhuǎn)角和一個(gè)單一α螺旋。里氏木霉木聚糖酶II的螺旋包含了從151位至162位氨基酸的區(qū)域(Torronen等1995)。
一種木聚糖酶如果包含與其它家族11木聚糖酶共有的氨基酸，包括可作為催化殘基的兩個(gè)谷氨酸(E)殘基，則將其分類為家族11木聚糖酶。所述谷氨酸殘基位于86和177位(見(jiàn)圖1，基于Tr2(里氏木霉木聚糖酶II)氨基酸編號(hào))。
迄今鑒別的大多數(shù)家族11木聚糖酶是嗜中溫的并具有低分子量(20kDa)。然而，這個(gè)家族還包括至少兩種較高分子量的熱穩(wěn)定木聚糖酶296個(gè)氨基酸及分子量為大約32kDa的褐色高溫單孢菌木聚糖酶A(TfX-A)(Irwin等，1994；Wilson等1994，WO95/12668)和511個(gè)氨基酸及分子量為大約56kDa的糞堆梭菌木聚糖酶A。糞堆梭菌木聚糖酶A在70℃呈現(xiàn)最大活性(Sakka等，1993)。
大型熱穩(wěn)定家族11木聚糖酶由于在酶的延伸的C末端具有一個(gè)疏水性纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)而與小型嗜中溫酶不同。TfX-A酶由與家族11木聚糖酶共有的189個(gè)殘基的催化核心序列及107個(gè)殘基的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。較大的糞堆梭菌木聚糖酶A有2個(gè)拷貝的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明中使用位點(diǎn)定向誘變以在木聚糖酶中產(chǎn)生突變，使所述酶與天然酶相比更嗜熱及嗜堿。優(yōu)選地，突變的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。更優(yōu)選地，本發(fā)明的突變的木聚糖酶包含一種突變的里氏木霉木聚糖酶II。
因此，認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)，木聚糖酶包括家族11木聚糖酶例如但不限于里氏木霉木聚糖酶II，里氏木霉木聚糖酶I，Trichodermaviride木聚糖酶，淺青紫鏈霉菌木聚糖酶B和淺青紫鏈霉菌Streptomyces lividans木聚糖酶C可以使用在此所述的一般方法和方法學(xué)進(jìn)行修飾。還認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)，非家族11木聚糖酶也可以使用在此所述的一般原理進(jìn)行修飾以獲得呈現(xiàn)嗜熱和嗜堿性的木聚糖酶。
術(shù)語(yǔ)“嗜熱性”是指一種酶當(dāng)所有其它條件均保持恒定時(shí)與另一種酶相比，在較高溫度是有活性的或者更有活性。例如，如果使用相同底物，在相同條件下，木聚糖酶1與木聚糖酶2相比在較高溫度能或者更有活性的水解木聚糖，則與木聚糖酶2相比木聚糖酶1呈現(xiàn)升高的嗜熱性。由于大多數(shù)木聚糖酶當(dāng)水解純木聚糖而不是紙漿時(shí)在較高溫度是有效的，因此應(yīng)使用相同底物進(jìn)行對(duì)比分析。在此提及的定量測(cè)定嗜熱性除非特別說(shuō)明均使用純木聚糖底物。
“熱穩(wěn)定性”是指酶在高溫，典型的在無(wú)底物時(shí)的條件下貯存或溫育，然后當(dāng)恢復(fù)到標(biāo)準(zhǔn)分析條件時(shí)呈現(xiàn)活性的能力。例如，在一定溫度(典型的為較高溫度)，例如但不限于70℃下保持24小時(shí)后，隨后在較低溫度進(jìn)行分析，如果木聚糖酶1比木聚糖酶2保留了更大的活性，則稱木聚糖酶1比木聚糖酶2展示更高的熱穩(wěn)定性。與嗜熱性相反，熱穩(wěn)定性是關(guān)于在沒(méi)有底物的情況下孵育后保留的酶活性。
這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)(嗜熱性和熱穩(wěn)定性)的這些應(yīng)用在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)經(jīng)常混用，因?yàn)樗鼈儽唤惶媸褂谩Ｈ欢?，在此所述術(shù)語(yǔ)的應(yīng)用與在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)該術(shù)語(yǔ)的用法一致(Mathrani和Ahring，1992)。
“嗜堿性”是指一種酶當(dāng)所有其它條件均保持恒定時(shí)與另一種酶相比，在較高pH時(shí)是有活性的或者更有活性。例如，如果木聚糖酶1比木聚糖酶2在較高pH下能水解木聚糖，則木聚糖酶1比比木聚糖酶2具有更高的嗜堿性。典型的嗜堿性是關(guān)于在存在木聚糖底物的情況下的酶活性。
“更寬的有效pH范圍”是指一種酶當(dāng)所有其它條件均保持恒定時(shí)，與另一種酶的活性相比，在較高pH，較低pH或較高和較低pH時(shí)均是有活性的或者更有活性的。例如，但不限于，如果木聚糖酶1在pH5.5-8.0能以接近最佳(80％)活性水解木聚糖，而木聚糖酶2只在pH5.5-7.5的較窄范圍內(nèi)保持80％最佳活性，則木聚糖酶1比木聚糖酶2呈現(xiàn)更寬的有效pH范圍。
“TrX編號(hào)”是指與基于TrX(XynII-表1；Tr2-圖1，SEQ ID NO16)氨基酸序列的氨基酸位置相關(guān)的編號(hào)。如以下所示及如圖1所示，家族11木聚糖酶呈現(xiàn)很大程度的序列相似性。因此，通過(guò)對(duì)比氨基酸以使木聚糖酶之間序列相似性最佳化及通過(guò)使用TrX的氨基酸編號(hào)作為編號(hào)基礎(chǔ)，其它木聚糖酶內(nèi)氨基酸位置可以相對(duì)于TrX而確定。
“表達(dá)效率”是指生產(chǎn)宿主產(chǎn)生活性酶或酶促活性的適宜性或便利性，其典型地計(jì)算為當(dāng)所有發(fā)酵條件保持恒定時(shí)，每單位體積的發(fā)酵培養(yǎng)物產(chǎn)生的活性酶或酶促活性的數(shù)量。例如但不限于，如果在單位體積的培養(yǎng)物中由相同宿主產(chǎn)生的木聚糖酶1是木聚糖酶2的3倍，則木聚糖酶1比木聚糖酶2具有改良的表達(dá)效率。這種宿主的一個(gè)非限制性實(shí)例是大腸桿菌。
修飾的木聚糖酶是指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)改變木聚糖酶分子。這些方法包括但不限于，位點(diǎn)定向誘變，盒式誘變，隨機(jī)誘變，合成寡核苷酸構(gòu)建，克隆及其它遺傳工程方法。
如在此更詳細(xì)的描述，已經(jīng)制備了一些突變木聚糖酶，當(dāng)與天然木聚糖酶對(duì)比時(shí)，它們呈現(xiàn)更高的嗜熱性，嗜堿性和熱穩(wěn)定性。表2列出了一些突變體，但這些突變體是非限制性的。
另外，本發(fā)明涉及一種修飾的家族11木聚糖酶，例如但不限于得自木霉的一種木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，特征在于具有在大約69℃至大約84℃之間的最大有效溫度(MET)。優(yōu)選地，所述修飾的木聚糖酶特征在于具有大約70℃至大約80℃的MET。本發(fā)明還涉及一種修飾的木聚糖酶，例如但不限于得自木霉的一種木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸，特征在于具有在大約5.8至大約8.4之間的最大有效pH(MEP)。優(yōu)選地，MEP在大約6.0至大約8.0之間。本發(fā)明還涉及一種修飾的木聚糖酶，例如但不限于得自木霉的一種木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸，特征在于具有在大約69℃至大約84℃之間的最大有效溫度(MET)，，及在大約5.8至大約8.4之間的最大有效pH(MEP)。優(yōu)選地，MET在大約70℃至大約84℃之間，MEP在大約6.0至大約8.0之間。
另外，本發(fā)明還涉及一種天然家族11木聚糖酶，特征在于具有在大約69℃至大約84℃之間的最大有效溫度(MET)，及在大約5.8至大約8.4之間的最大有效pH(MEP)。優(yōu)選地，MET在大約70℃至大約80℃之間，MEP在大約6.0至大約8.0之間。
測(cè)定木聚糖酶的MET和MEP可如下進(jìn)行i)如實(shí)施例3所述測(cè)定木聚糖酶的溫度分布圖。測(cè)定發(fā)揮至少80％最佳(最大)活性的溫度，最高溫度為MET；ii)如實(shí)施例4所述測(cè)定木聚糖酶的pH分布圖。測(cè)定發(fā)揮至少80％最佳(最大)活性的pH，最高pH為MEP。
然后將這些數(shù)據(jù)繪圖，如圖11所示。
表2修飾的木聚糖酶木聚糖酶描述

與天然木聚糖酶相比，在第11，116，118，144或161位的取代不明顯改變木聚糖酶的比活性(見(jiàn)表4，實(shí)施例2-3)。
改良木聚糖酶的表達(dá)效率均攜帶N11D突變的突變體木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-125A 129E-144R161R，(TrX-H-11D-ML-AHAE-RR)；TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX H11D-ML-AHCAE-RR)，已經(jīng)被持續(xù)表達(dá)，而且與其不具有這種突變的前體相比產(chǎn)生出大約2.5到4.3倍的蛋白質(zhì)(見(jiàn)表5，實(shí)施例2-4)。這些結(jié)果提示這種突變改良了木聚糖酶的生產(chǎn)產(chǎn)量，這在工業(yè)規(guī)模的任何生產(chǎn)中均是一個(gè)重要因素。木聚糖酶表達(dá)效率的這種改良不用降低木聚糖酶的嗜熱性和嗜堿性就可達(dá)到。
提高木聚糖酶的嗜熱性與沒(méi)有這種突變的前體木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E相比，在第144位突變?yōu)锳rg改良了突變的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)在較高溫度水解木聚糖的酶活性(圖3)。因此，本發(fā)明提供了一種天然或修飾的木聚糖酶，其包含一個(gè)堿性氨基酸，例如但不限于在第144位的Arg。優(yōu)選地，在第144位具有堿性氨基酸的天然或修飾的木聚糖酶具有在大約69℃至大約84℃之間的MET。
分別在第116和第118位突變?yōu)镚ly和Cys的兩種突變也表明木聚糖酶在高溫下的改良活性。與天然TrX相比，單一點(diǎn)突變體TrX-116G和TrX-118C在較高的溫度呈現(xiàn)更高的活性(圖4)，最佳溫度為55℃，而天然TrX為50℃。
當(dāng)與前體木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)在pH5.5(見(jiàn)圖5，116G突變體)和pH6.0(圖6和7)相比時(shí)，在TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)，和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R)中也觀測(cè)到通過(guò)這兩種突變(第116和118位分別突變?yōu)镚ly和Cys)嗜熱性同樣增強(qiáng)。
未曾期望在第116位突變?yōu)樾〉姆菢O性殘基可以改良嗜熱性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)天然木聚糖酶包括嗜熱木聚糖酶(例如Tf，Tl，Cs，圖1)在該位置具有荷負(fù)電的氨基酸，天冬氨酸(D，66％，圖1)和谷氨酸(E，10％，圖1)，或者極性無(wú)電荷的氨基酸谷氨酰胺(Q，15％，圖1)。未知木聚糖酶在第116位具有Gly。因此，本發(fā)明還涉及一種天然或修飾的木聚糖酶，其在第116位包含一個(gè)非極性氨基酸，例如但不限于Gly。優(yōu)選地，在第116位具有非極性氨基酸的天然或修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)在大約69℃至大約84℃之間的MET。
基于在第118位突變?yōu)榘腚装彼岫牧际葻嵝砸彩俏丛谕模驗(yàn)榇蠖鄶?shù)木聚糖酶包括嗜熱木聚糖酶(Tf，Tl，Cs，圖1)具有酪氨酸(Y，60％，圖1)和色氨酸(W，10％，圖1)。在第118位具有半胱氨酸的唯一木聚糖酶是嗜中溫黑曲霉，Aspergillus kawakii和Aspergillustubigensis其中之一(圖1)，這些木聚糖酶的最佳溫度是大約45-55℃(Sunna和Antranikian，1997)。因此，本發(fā)明還涉及一種修飾的木聚糖酶，其在第118位包含一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，例如但不限于Cys，本發(fā)明還涉及一種天然木聚糖酶，其在第118位包含一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，提供了該天然木聚糖酶呈現(xiàn)在大約69℃至大約84℃之間的MET。
在第11位突變?yōu)锳sp的另一種突變對(duì)木聚糖酶的嗜熱性也有益。與前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144(TrX-HML-AHAE；圖8)相比，突變體TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(Trx-H11D-ML-AHAE-RR)在較高溫度呈現(xiàn)更高的活性。這個(gè)結(jié)果也是未曾期望的，因?yàn)?Turenen等(2001))報(bào)道相同的N11D突變使含有分子內(nèi)二硫鍵的TrX突變體的溫度最佳值和范圍降低。另外，US 5,759,840揭示了11D突變對(duì)TrX-H-11D-ML(稱為NI-TX12的突變體)的嗜熱性沒(méi)有作用。因此，本發(fā)明還涉及一種天然的或修飾的木聚糖酶，其在第118位包含一個(gè)酸性氨基酸，例如但不限于Asp，提供了天然或修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)在大約69℃至大約84℃之間的MET。
另外，可以組合上述鑒別的突變以產(chǎn)生甚至在更高pH范圍具有更高嗜熱性的突變體木聚糖酶?；谌蛔僋11 D/D 116G/144R或N11D/Y118C/144R的組合突變木聚糖酶即TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(Trx-H11D-ML-AHCAE RR)，在pH5.5(圖5，只有116G突變體)和pH6.0(圖6和7)，在70-75℃的較高溫度呈現(xiàn)最大酶活性，而且進(jìn)一步示出在80℃呈現(xiàn)明顯的酶活性。這些結(jié)果提示具有N11D和H144R的D116G或Y118C突變對(duì)突變體木聚糖酶的嗜熱性作用是互補(bǔ)的。因此，本發(fā)明涉及一種天然或修飾的木聚糖酶，其在第11位包含一個(gè)酸性氨基酸，在第116位包含一個(gè)非極性氨基酸，及在第144位包含一個(gè)堿性氨基酸，例如但不限于N11D/D116G/144R，或者在第11位包含一個(gè)酸性氨基酸，在第118位包含一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，和在第114位包含一個(gè)堿性氨基酸，例如但不限于N11D/Y118C/144R。優(yōu)選所述天然或修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)大約69℃至大約84℃的MET，所述天然或修飾的木聚糖酶包含在第11位的一個(gè)酸性氨基酸，在第116位的一個(gè)非極性氨基酸，和在第144位的一個(gè)堿性氨基酸，或者所述木聚糖酶包含在第11位的一個(gè)酸性氨基酸，在第118位的一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，和在第114位的一個(gè)堿性氨基酸。
除了實(shí)現(xiàn)在較高溫度下最佳活性，基于本發(fā)明的突變體木聚糖酶，例如TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR)，(圖5和6)，也證明了在它們溫度最佳值時(shí)具有更高的酶活性(檢測(cè)到更多的木糖釋放)。TrX-H11D-ML-AHGAE-RR和TrX-H11D-ML-AHCAE-RR在它們的溫度最佳值時(shí)的活性是在40℃觀測(cè)到的活性的600％。這與前體比較，修飾的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E其在溫度最佳值時(shí)呈現(xiàn)相對(duì)于40℃的活性的大約400％的活性，和天然TrX(在最佳溫度時(shí)，它的活性是40℃的活性的150％)。
本發(fā)明因此包括修飾的木聚糖酶，其包含在第第10和105位的His，第27位的Met，第29位的Leu，第75和125位的Ala，第129位的Glu，和至少一個(gè)第11位的酸性氨基酸；第16位的小的非極性氨基酸；第18位的中等大小的非芳香族的疏水氨基酸；和第144位的堿性氨基酸優(yōu)選地，在第11位的氨基酸是Asp(D)，在第116位的氨基酸是Gly(G)，在第118位的氨基酸是Cys(C)，在第144位的氨基酸選自Lys(L)和Arg(R)組成的組中。
提高木聚糖酶的嗜堿性在Q161R突變形成的突變體木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)中，pH條件對(duì)酶活性的作用示于圖9。與其前體TrX-HML-75A105H-125A129E和TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(未示出)相對(duì)比。后者這些酶具有相同pH/活性分布圖，然而突變體木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)在大約6.5至大約8.0的更高pH范圍內(nèi)呈現(xiàn)更大的活性。當(dāng)與沒(méi)有這個(gè)突變的前體對(duì)比時(shí)，TrX-HML-AHAE-RR在大約5.0至大約6.0的較低pH值時(shí)呈現(xiàn)較低的活性。因此，本發(fā)明涉及一種天然或修飾的木聚糖酶，其包含在161位的一個(gè)堿性氨基酸，例如但不限于Arg。優(yōu)選地，在161位具有堿性氨基酸的天然或修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)在大約5.8至大約8.4之間的MEP。
第116和118位分別突變?yōu)镚ly和Cys的突變還改良了在較高pH范圍時(shí)酶的活性。與天然TrX相比，單突變體TrX-116G和TrX-118C在較高pH時(shí)具有更高的活性，如圖10所示。
未曾期望第116位突變?yōu)樾⌒头菢O性殘基可以改良嗜堿性，因?yàn)闆](méi)有天然的木聚糖酶在第116位具有Gly。因此，本發(fā)明提供了一種天然或修飾的木聚糖酶，其在第116位包含一個(gè)非極性氨基酸，例如但不限于Gly。優(yōu)選地，在第116位具有非極性氨基酸的天然或修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)在大約5.8至大約8.4之間的MEP。
基于在第118位突變?yōu)榘腚装彼岫牧际葻嵝砸彩俏丛谕模驗(yàn)榇蠖鄶?shù)木聚糖酶包括嗜堿性木聚糖酶(例如Tf，Bp，見(jiàn)圖1)具有一個(gè)酪氨酸(Y，60％，圖1)和色氨酸(W，10％，圖1)。在第118位具有半胱氨酸的唯一木聚糖酶是嗜酸性黑曲霉，Aspergillus kawakii和Aspergillus tubigensis其中之一(圖1)，這些木聚糖酶的最佳pH為大約2-4(Sunna和Antranikian，1997；Kinoshita等1995)。因此，本發(fā)明包含一種天然或修飾的木聚糖酶，其在第118位包含一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，例如但不限于Cys。優(yōu)選地，在第118位具有非芳香族的疏水性氨基酸的天然或修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)在大約5.8至大約8.4之間的MEP。
當(dāng)與前體木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-125A129E相比時(shí)，在以下通過(guò)D116G和Y118C突變產(chǎn)生的突變體中也觀測(cè)到木聚糖酶嗜堿性的增強(qiáng)作用TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R)(圖9)。盡管這兩種突變體在大約6.5至大約8.0的pH范圍均表現(xiàn)較高活性，只有突變體TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)在大約5.0至大約6.0的較低pH范圍基本保持最佳活性。在大約5.0至大約8.0的pH范圍保持高活性表明在第116位的這個(gè)突變使最佳pH范圍擴(kuò)大。
已經(jīng)將上述鑒別的突變組合以產(chǎn)生具有更高嗜堿性和嗜熱性的突變體木聚糖酶?；谒闹赝蛔僋11D/D116G/H144R/Q161R或N11D/Y118C/144R/Q161R的組合突變體木聚糖酶，即TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR；圖9)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR；未示出)，與其前體相比，在大約5.0至大約7.0的pH下呈現(xiàn)接近最大酶活性的活性。另外，存在D116G突變有助于在大約5.0至大約6.0的較低pH范圍基本保持最大活性，因此避免在前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R中觀測(cè)到的在低pH時(shí)明顯喪失活性(圖9)。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在第116位的這個(gè)突變使最佳pH范圍加大。因此，本發(fā)明涉及一種天然或修飾的木聚糖酶，其在第11位包含一個(gè)酸性氨基酸，在第116位包含一個(gè)非極性氨基酸，及在第114位包含一個(gè)堿性氨基酸，例如但不限于N11D/D116G/144R，或者在第11位包含一個(gè)酸性氨基酸，在第118位包含一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，及在第114位包含一個(gè)堿性氨基酸，例如但不限于N11D/Y118C/144R。優(yōu)選地，天然或修飾的木聚糖酶具有在大約5.8至大約8.4之間的MEP，所述木聚糖酶在第11位包含一個(gè)酸性氨基酸，在第116位包含一個(gè)非極性氨基酸，及在第114位包含一個(gè)堿性氨基酸，或者木聚糖酶在第11位包含一個(gè)酸性氨基酸，在第118位包含一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，及在第114位包含一個(gè)堿性氨基酸。
本發(fā)明還提供了一種修飾的木聚糖酶，其包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu，及至少一個(gè)·在第11位的一個(gè)酸性氨基酸；·在第116位的一個(gè)小型非極性氨基酸；·在第118位的一個(gè)中等大小的非芳香族的疏水性氨基酸；·在第161位的一個(gè)堿性氨基酸。
優(yōu)選地，在第11位的氨基酸是Asp，在第116位的氨基酸是Gly，在第118位的氨基酸是Cys，在161位的氨基酸選自Lys和Arg。
總而言之，改良的嗜堿性突變體TrX木聚糖酶可如下構(gòu)建i)將第116位的Asp突變?yōu)樾⌒头菢O性殘基，例如但不限于Gly；ii)將第118位的Tyr突變?yōu)橹械却笮〉姆欠枷阕宓氖杷詺埢?，例如但不限于Cys；iii)將第161位的Gln突變?yōu)閴A性氨基酸Arg或Lys；iv)將i)中所描述的突變與ii)至iii)中所述突變組合，以改良嗜熱性和嗜堿性；或者v)將i)至iv)所述突變與上述HML系列突變(見(jiàn)U.S.5,759,840所述，在此針對(duì)HML突變并入?yún)⒖?組合。
以上描述不以任何形式限制要求保護(hù)的本發(fā)明，另外所論述的特征組合不是發(fā)明方案所絕對(duì)必需的。
實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例得以進(jìn)一步闡明。然而，應(yīng)理解這些實(shí)施例只是為了闡明本發(fā)明，而無(wú)以任何方式限制本發(fā)明范圍之意。
實(shí)施例1構(gòu)建里氏木霉突變體木聚糖酶根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的充分建立的方案進(jìn)行基本重組DNA方法，如質(zhì)粒制備，限制酶消化，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，寡核苷酸磷酸化，連接，轉(zhuǎn)化和DNA雜交(例如Sung等，1986)，或者如酶或試劑盒的生產(chǎn)者所推薦的方法進(jìn)行。針對(duì)許多酶的緩沖液已經(jīng)作為試劑盒的一部分而提供或者根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)而生產(chǎn)。限制酶，T4多核苷酸激酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自New England BioLabs Ltd，Mississauga，Ont。GeneAmp PCR試劑試劑盒購(gòu)自Perkin-Elmer。前體質(zhì)粒pXYbc，其是具有插入的Bacillus circulans木聚糖酶基因的一種pUC類型質(zhì)粒，已經(jīng)預(yù)先制備及公布(Sung等，1993；Campbell等，U.S.專利號(hào)5,405,769)。一種常用的大腸桿菌菌株HB101(Clonetech Lab，Palo Alto，CA)用作所有基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化和表達(dá)宿主。樺木木聚糖和RemazolBrilliant Blue R-D-木聚糖購(gòu)自Sigma(St.Louis，Mo)。羥基苯甲酸酰肼(HBAH)購(gòu)自Aldrich。寡核苷酸用APPLIED BIOSYSTEM DNA合成儀(380B型)制備。所有木聚糖酶分析均在有蓋的循環(huán)水浴中進(jìn)行(Haake型F 4391)并保持在±0.1℃的溫度范圍內(nèi)。
1-1構(gòu)建攜帶合成的TrX(SEQ ID NO39)的前體質(zhì)粒pTrX以下揭示的用于突變的前體質(zhì)粒pTrX已經(jīng)被預(yù)先公布(Sung等，1995)。這個(gè)質(zhì)粒衍生自具有編碼里氏木霉木聚糖酶(TrX，圖2)的合成核苷酸序列的pUC119質(zhì)粒。這個(gè)木聚糖酶及隨后所述的其它突變木聚糖酶的表達(dá)均在pUC質(zhì)粒的lacZ啟動(dòng)子的控制之下。木霉木聚糖酶基因的完全裝配需要兩個(gè)階段，初始為(92-190；Tr2編號(hào))區(qū)域，隨后為(1-92；Tr2編號(hào))區(qū)域。構(gòu)建這個(gè)基因的方案是常規(guī)進(jìn)行的，與針對(duì)許多其它基因公布的標(biāo)準(zhǔn)方法相同。所述方案需要酶促磷酸化編碼木聚糖酶的重疊的合成的寡核苷酸。然后連接入適當(dāng)切割的質(zhì)粒中。
為構(gòu)建TrX(92-190)，模擬大腸桿菌密碼子使用頻率設(shè)計(jì)以下10個(gè)重疊的寡核苷酸(見(jiàn)圖2)XyTv-101，SEQ ID NO29；
XyTv-102，SEQ ID NO30；TrX-103，SEQ ID NO31；XyTv-104，SEQ ID NO32；XyTv-105，-SEQ ID NO33；XyTv-106，SEQ ID NO38；XyTv-107，SEQ ID NO37；TrX-108，SEQ ID NO36；XyTv-109，SEQ ID NO35；和XyTv-110，SEQ ID NO34。
兩個(gè)末端寡核苷酸的SalI和BglII粘性末端使得所述10個(gè)片段能酶促連接入線性化的質(zhì)粒pXYbc中。將編碼木霉木聚糖酶的TrX(92-190)區(qū)域的10個(gè)寡核苷酸(每種50pmol，1μL)在混合物中磷酸化，所述混合物含有10×標(biāo)準(zhǔn)激酶緩沖液(0.4μL)，1mM ATP(4μL)，T4 DNA激酶(5單位)和水(3μL)。磷酸化反應(yīng)在37℃進(jìn)行1小時(shí)。然后將溶液組合并加熱至70℃進(jìn)行10分鐘。在緩慢冷卻至室溫后，將組合的溶液加入混合物中，在12℃孵育20小時(shí)，所述混合物含有4mM ATP(3.5μL)，EcoR1-HindIII線性化質(zhì)粒pUC119(0.1pmol)和T4 DNA連接酶(3.5μL)。將連接混合物的等份的用于轉(zhuǎn)化在含有氨芐青霉素(100mg/L)的YT平板(于1L水中含有8g酵母提取物，5g細(xì)菌用胰蛋白胨，5g NaCl，15g瓊脂)上的大腸桿菌HB101。
為制備雜交探針，將寡核苷酸之一，例如XyTv-110(10pmol，1μL)使用T4 DNA激酶(1μL)，10×激酶緩沖液(1μL)和水(4μL)在37℃用32P-ATP(10pmol，3μL)磷酸化1小時(shí)。
隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)化體以進(jìn)行雜交分析。將菌落在具有氨芐青霉素的YT平板上生長(zhǎng)過(guò)夜，并移至尼龍濾膜上。然后將它們用0.5N NaOH-1.5M NaCl變性(10分鐘)，并用0.5N Tris-HCl(pH7.0)-1.5M NaCl中和(10分鐘)。在254nm紫外線照射8分鐘后，將該濾膜用6×SSC-0.05％ Triton X-100洗滌30分鐘。完全刮去細(xì)胞碎片。在新鮮溶液中30分鐘后，將雙份濾膜單獨(dú)移至單獨(dú)的混合物中，所述混合物為6×SSC-1％硫酸葡聚糖-0.05％ TritonX-100-1×Denhardt′s雜交液混合物。將32P-標(biāo)記的探針加入濾膜。在45℃16小時(shí)后，將該濾膜用6×SSC-0.05％TritonX-100在室溫洗滌5分鐘，然后在65℃洗滌30分鐘。具有中間質(zhì)粒pBcX-TrX的陽(yáng)性雜交克隆通過(guò)自動(dòng)X線照相分析鑒別。
上述方案，包括合成的重疊寡核苷酸的酶促磷酸化和連接入線性化的質(zhì)粒中，用于TrX(1-92)區(qū)域的裝配中及隨后產(chǎn)生本發(fā)明所述的其它突變木聚糖酶的盒式誘變中。
為將TrX(1-92；Tr2編號(hào))區(qū)域裝配成完全的全長(zhǎng)里氏木霉木聚糖酶II基因(TrX)，將中間質(zhì)粒pBcX-TrX通過(guò)NheI和KpnI內(nèi)切核酸酶線性化以釋放針對(duì)BcX(1-83)的插入DNA。用NheI和KpnI的粘性末端，通過(guò)上述方案將編碼TrX(1-91)序列的8個(gè)重疊寡核苷酸連接入線性化質(zhì)粒pBcX-TrX(圖2)中，所述8個(gè)重疊寡核苷酸是TrX-1，SEQ ID NO21；XyTv-2，SEQ ID NO22；TrX-3，SEQ ID NO23；XyTv-4，SEQ ID NO24；XyTv-5，SEQ ID NO28；TrX-6，SEQ ID NO27；XyTv-7，SEQ ID NO26；和TrX-8 SEQ ID NO25。
新質(zhì)粒pTrX因此攜帶合成的TrX基因(SEQ ID NO39)。
下述所有突變木聚糖酶基因均已經(jīng)通過(guò)盒式誘變方法構(gòu)建。盒式誘變方法與針對(duì)上述基因裝配所描述的方法相同。一般地，盒式誘變包括(i)酶促磷酸化重疊的合成寡核苷酸，(ii)將合成的寡核苷酸與線性化質(zhì)粒連接，(iii)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞中，(iv)通過(guò)與標(biāo)記的寡核苷酸雜交而鑒別突變轉(zhuǎn)化體，(v)通過(guò)雙脫氧核苷酸測(cè)序證實(shí)突變。
1-2構(gòu)建前體質(zhì)粒pTrX-HML這個(gè)前體質(zhì)粒pTrX-HML的構(gòu)建詳見(jiàn)于U.S.專利號(hào)5,759,840所述(見(jiàn)實(shí)施例1N，在此并入?yún)⒖?；質(zhì)粒稱為pNI-TX13)。TrX-HML包含天然TrX木聚糖酶，伴隨N10H(在10位的Asn由His取代)，Y27M和N29L三個(gè)突變。以下示出了包含N10H，Y27M和N29L的序列的前30個(gè)氨基酸。
TrX 1 2 3 4 5 6 7 8氨基酸 Q T I Q P G T G5′-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA ACC GGT3′-GATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCTTGG CCANheI PinAI9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Y H N G Y F Y S Y W N D G H G GTAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAT GGC CAT GGA GGCATG GTG TTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTA CCG GTA CCT CCG25 26 27 28 29 30V T M T L GGTC ACA ATG ACT CTG GGGCAG TGT TAC TGA GAC CCC1-3構(gòu)建缺失質(zhì)粒pTrX-HML-(1-113)質(zhì)粒pTrX-HML-(1-113)包含TrX(SEQ ID NO39)的1-113位氨基酸序列但是不能表達(dá)有活性的木聚糖酶。這種轉(zhuǎn)化體通過(guò)在藍(lán)色木聚糖平板上轉(zhuǎn)化體菌落周圍沒(méi)有透明區(qū)或暈輪而證實(shí)。
如下構(gòu)建新質(zhì)粒(i)通過(guò)用限制酶BamHI和BglII切割除去pTrX-HML的TrX(114-190)編碼序列，(ii)連接線性化質(zhì)粒的相同粘端，(iii)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞中，隨后鋪板于含有氨芐青霉素(100mg/L)的YT平板(在1L水中含有5g酵母提取物，3g細(xì)菌用胰蛋白胨，5g NaCl，15g瓊脂，及1g Remazol Brilliant Blue R-D-木聚糖)，(iv)通過(guò)木聚糖酶活性的喪失鑒別突變的轉(zhuǎn)化體(在40℃過(guò)夜的藍(lán)色木聚糖平板上菌落周圍沒(méi)有透明區(qū)或暈輪)，(v)通過(guò)雙脫氧核苷酸測(cè)序證實(shí)突變。這些步驟的每一個(gè)均與上述基因裝配的方案相似。
1-4構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-HML-105R突變木聚糖酶pTrX-HML-105R與TrX-HML相似，除了在105位的Leu由Arg替代(L105R)。
使用PCR產(chǎn)生編碼具有L105R突變的(100-190)區(qū)域的一個(gè)DNA片段。在構(gòu)建pTrX-HML-105R中具有突變(黑體字)的PCR引物如下所示TX-105R-1(SEQ ID NO44)100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113T G A T K R G E V T S D G S5′-ACCGGC GCCACA AAA AGA GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCCKasI反向PCR引物TX-C1包含TX-C1(SEQ ID NO42)183 184 185 186 187 188 189 190 terG S A S I T V SCCA AGG CGA TCA TAA TGT CAC TCG ATTTCT AGAACT TCG AACCC-5′BglI HindIII以下列出了合適的PCR模板和引物，及切割PCR產(chǎn)物末端的限制酶(表3-1)
表3-1

將切割的PCR產(chǎn)物(a)(表3-1)連接入KasI/HindIII線性化的質(zhì)粒pTrX-HML(1-113)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pTrX-HML-105R。
1-5構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-HML-75A105R和pTrX-HML-75G105R木聚糖酶突變體TrX-HML-75A-105R和TrX-HML-75G-105R與TrX-HML-105R相似，除了分別具有額外單突變S75A或S75G之外。
以下示出了具有突變S75A(TX-75A-1；SEQ ID NO40)和S75G(TX75-G-1；SEQ ID N046)的PCR引物。
TX-75A-1(SEQ ID NO40)69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81NG NS Y L A V Y G W S R5′-T GGG AAT TCA TAC TTA GCC GTC TAT GGC TGG TCT AGEcoRITX-75G-1(SEQ ID NO46)69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81NG NS Y L G V Y G W S R5′-T GGG AAT TCA TAC TTA GGC GTC TAT GGC TGG TCT AGEcoRI以下示出了合適的PCR模板和引物，及切割PCR產(chǎn)物末端的限制酶(表3-2)。
表3-2

制備EcoRI/HindIII切割PCR產(chǎn)物(b)和(c)(見(jiàn)表3-2)，并與EcoRI/HindIII線性化的pTrX-HML(1-113)質(zhì)粒連接以分別產(chǎn)生質(zhì)粒pTrX-HML-75A-105R和pTrX-HML-75G-105R。
1-6構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-HML-75G105R-125A129E突變體TrX-HML-75G-105R-125A129E與TrX-HML-75G-105R相同，除了額外的突變Q125A和I129E之外。
完整的突變木聚糖酶基因通過(guò)連接編碼1-121和122-190區(qū)域的兩個(gè)DNA序列而裝配。編碼1-121區(qū)域的DNA序列通過(guò)以下限制性核酸酶缺失質(zhì)粒pTrX-HML-75G-105R而分離(表3-3)。
表3-3

編碼122-190區(qū)域的DNA序列是通過(guò)如下編碼突變的引物而產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物(d)。
TX-125A129E-1(SEQ ID NO49)120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133Q RV N A P S I E G T A T5′-C CAA CGC GTT AAT GCG CCA TCG ATC GAG GGA ACC GCC ACCMluI以下列出了合適的PCR模板和引物，及切割PCR產(chǎn)物末端的限制性酶(表3-4)。
表3-4

將切割的PCR產(chǎn)物(d)和缺失序列(A)與NheI/HindIII-線性化的質(zhì)粒pTrX-(1-113)連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pTrX-HML-75G-105R-125A129E。
1-7構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-HML-75A105H-125A129E完整的突變體基因通過(guò)連接編碼1-101和102-190區(qū)域的兩個(gè)DNA序列而裝配。
為制備編碼1-101區(qū)域的DNA序列，缺失合適質(zhì)粒的限制性核酸酶如下所列(表3-5)。
表3-5

為制備編碼102-190區(qū)域的DNA序列，使用引物TX-105H-1進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
TX-105H-1(SEQ ID NO41)100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113TG AT K H G E V T S D G S5′-ACCGGC GCCACA AAA CAC GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCCKasI以下列出了在105位具有突變的合適的PCR引物及切割PCR產(chǎn)物末端的限制性酶(表3-6)。
表3-6質(zhì)粒pTrX-HML-75G-105R-125A129E作為PCR模板

將切割的PCR產(chǎn)物(e)和缺失序列(B)連接入NheI/HindIII線性化的質(zhì)粒pTrX-(1-113)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pTrX-HML-75A-105H-125A129E。
1-8構(gòu)建缺失質(zhì)粒pTrX-del(43-53)編碼(43-53)區(qū)域缺失的非活性木聚糖酶的質(zhì)粒pTrX-del(43-53)如下構(gòu)建限制性切割質(zhì)粒pTrX在43位殘基的BspEI位點(diǎn)和在53殘基的Xmal位點(diǎn)，并將相同末端自身連接。在轉(zhuǎn)化后，通過(guò)在藍(lán)色含有木聚糖的YT平板上無(wú)木聚糖酶表達(dá)或者沒(méi)有暈輪或透明區(qū)而鑒別正確的克隆。
1-9構(gòu)建缺失質(zhì)粒pTrX-del(123-144)和pTrX-HML-75A105H-del(123-144)使用編碼(123-144)區(qū)域缺失的新引物通過(guò)PCR反應(yīng)，構(gòu)建含有部分缺失的木聚糖酶基因的兩個(gè)質(zhì)粒。
PCR寡核苷酸引物TX-del(123-144)-1r(SEQ ID NO43)148 147 146 145 122 121 120 119 118 117 116 115GS SR RQ T R Y I D Y5′-C GGA GCT CCGAC GCG TTG GGT ACG GTA GAT ATC ATASacI MluITX-N1(SEQ ID NO45)1 2 3 4 5 6 7Q T I Q P G T5′-CT AGC TAA GGA GGCTG CAGATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA ANheI PstI表3-7用TX-del(123-144)-1r和TX-N1作為引物的PCR模板

將切割的PCR片段(f)和(g)與PstI/SacI線性化的質(zhì)粒pTrX連接并轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生分別攜帶缺失質(zhì)粒pTrX-del(123-144)和pTrX-HML-75A105H-del(123-144)的正確克隆，這些克隆通過(guò)在藍(lán)色含有木聚糖的YT平板中無(wú)木聚糖酶表達(dá)及沒(méi)有暈輪或透明區(qū)而鑒別。
1-10構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R新突變體pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R與前體pTrX-HML-75A105H-125A129E不同之處在于一個(gè)額外的突變H144R。使用一種新的PCR反向引物產(chǎn)生這個(gè)突變。
TX-144R-1r(SEQ NO47)159 158 157 156 155 154 153 152 151 150 149 148 147 146 145 144 143 142W A NF H N A T N V S G S S R R N R5′-CCA TGC ATT AAA GTG ATT CGC AGT ATT AAC CGA ACC GGA GCT CCG ACG ATT ACGNsiI141 140 139 138R V S WTCT AAC ACT CCA以下列出了合適的PCR模板和引物，及切割PCR產(chǎn)物末端即1-146序列的限制性酶(表3-8)。
表3-8

將PstI/NsiI切割的PCR片段(h)與PstI/NsiI線性化的質(zhì)粒pTrX-del(43-53)連接，以在新質(zhì)粒 pTrX-HML-75A-105H-125A-129E-144R中恢復(fù)功能性木聚糖酶基因。
1-11構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R新的突變體pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161與前體pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R的不同之處在于一個(gè)額外的突變Q161R。使用新的PCR反向引物產(chǎn)生這個(gè)突變。
TX-161R-1r(SEQ ID NO48)168 167 166 165 164 163 162 161 160 159 158 157 156 155 154TG LT L G Q R A W A N F H N5′-GT ACC TAG GGT TAA CCC TTG CCG TGC CCA TGC ATT AAA GTG ATTAvrII如表3-9所述制備編碼TrX(1-165)區(qū)域的PCR產(chǎn)物。
表3-9質(zhì)粒pTrX-HML-75A-105H-125A129E-144R作為PCR模板

將PstI/AvrII切割的PCR片段(i)與PstI/AvrII線性化的質(zhì)粒pTrX-del(43-53)連接，以在新的質(zhì)粒pTrX-HML-75A-105H-125A-129E-144R161R中恢復(fù)功能性木聚糖酶基因。
1-12構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-116G和pTrX-118C這兩個(gè)新的突變體與TrX相同，主要不同之處在于一個(gè)額外的突變，即Asp-116突變?yōu)镚ly(D116G)或者Tyr-118突變?yōu)镃ys(Y118C)。
制備具有突變(黑體字)的兩個(gè)PCR引物。
TX-116G-1(SEQ ID NO50)111 112 113 114 115 116 117 118 119DG SV Y G I Y R5′-GACGGA TCCGTA TAT GGT ATC TAC CGBamHITX-118C-1(SEQ ID NO51)111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122DG SV Y D I C R T Q R5′-GACGGA TCCGTA TAT GAT ATC TGC CGT ACC CAA CGCBamHI
以下質(zhì)粒模板和引物是所述兩個(gè)PCR所需的。
表3-10質(zhì)粒pTrX作為模板的PCR

將切割的PCR產(chǎn)物(j)和(k)與BamHI/HindIII線性化的質(zhì)粒pTrX-del(123-144)連接，以在攜帶各自質(zhì)粒pTrX-116G和pTrX-118C的轉(zhuǎn)化體中恢復(fù)功能性木聚糖酶基因。
1-13構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和pTrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R兩個(gè)新的突變體與前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相同，主要不同之處在于一個(gè)額外的突變，即Asp-116突變?yōu)镚ly(D116G)或者Tyr-118突變?yōu)镃ys(Y118C)。
以下質(zhì)粒模板和引物是進(jìn)行所述兩個(gè)PCR所需的。
表3-11質(zhì)粒pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R作為模板的PCR

將切割的PCR產(chǎn)物(1)和(m)與BamHI/HindIII線性化的質(zhì)粒pTrX-HML-75A105H-del(123-144)連接，以在攜帶各自質(zhì)粒pTrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和pTrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R的轉(zhuǎn)化體中恢復(fù)功能性木聚糖酶基因。
1-14構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R，pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和pTrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R新的突變體TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R，TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R與其各自的前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R相同，主要不同之處在于額外的突變，即Asn-11突變?yōu)锳sp(N11D)及Gln-161突變?yōu)锳rg(Q161R)。制備具有突變N11D(黑體字)的一個(gè)新的PCR引物。
TX-10H11D-1(SEQ NO52)67 89 10 11 12 13 14 15 16 17 18GT GY H D G Y F Y S Y W5′-GGAACC GGTTAC CAC GAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGGAgeI表3-13

將切割的PCR產(chǎn)物(n)，(o)和(p)與AgeI/AvrII切割的質(zhì)粒pTrX-del(43-53)連接，以在分別攜帶新質(zhì)粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R，pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和pTrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R的轉(zhuǎn)化體中恢復(fù)功能性木聚糖酶基因。
1-15構(gòu)建缺失質(zhì)粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-del(123-144)含有部分缺失的木聚糖酶基因的質(zhì)粒通過(guò)與實(shí)施例1-9相同的方法，使用編碼缺失(123-144)區(qū)域的新引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)構(gòu)建。
表3-14用TX-del(123-144)-1r和TX-N1作為引物的PCR模板

將切割的PCR片段(q)連接入PstI/SacI線性化的質(zhì)粒pTrX中并轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生攜帶缺失質(zhì)粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-del(123-144)的正確克隆，這些克隆通過(guò)在藍(lán)色含有木聚糖的YT平板中無(wú)木聚糖酶表達(dá)及沒(méi)有暈輪或透明區(qū)而鑒別。
1-16構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R新的突變體TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R與其前體TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R相同，不同之處在于具有組合突變，Tyr-118突變?yōu)镃ys(Y118C)及Asp-116突變?yōu)镚ly(D116G)。制備具有組合突變D116G/Y118C(黑體字)的一個(gè)新的PCR引物。
TX-116G118C-1(SEQ ID NO53)111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122DG SV Y G I C R T Q R5′-GACGGA TCCGTA TAT GGT ATC TGC CGT ACC CAA CGCBamHI表3-15產(chǎn)生含有組合突變的(112-167)片段的PCR

將切割的PCR產(chǎn)物(r)與BamHI/AvrII切割的質(zhì)粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-del(123-144)連接，以在攜帶新質(zhì)粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R的轉(zhuǎn)化體中恢復(fù)功能性木聚糖酶基因。
實(shí)施例2定性突變體木聚糖酶2-1生產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)條件包括將于含有氨芐青霉素(100mg/L)的2YT培養(yǎng)基(16g細(xì)菌用胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，1L水)中接種過(guò)夜的5ml培養(yǎng)物加入具有氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基(1L)中。將培養(yǎng)物在37℃搖動(dòng)(200rpm)生長(zhǎng)。16小時(shí)后，收獲細(xì)胞。
2-2純化突變體木聚糖酶首先產(chǎn)生細(xì)胞提取物而從細(xì)胞中制備蛋白質(zhì)樣品，所述細(xì)胞提取物通過(guò)用25g氧化鋁粉末研磨10g細(xì)胞糊狀物而制備。在研磨為平滑的混合物之后，加入少量(5mL)冰凍的緩沖液A(10mM乙酸鈉，pH5.5，針對(duì)BcX突變體)或者緩沖液B(10mM乙酸鈉，pH4.6，針對(duì)TX突變體)，并在加入緩沖液期間將混合物用力研磨。將該混合物以8000×g離心30分鐘除去氧化鋁和細(xì)胞碎片。
在進(jìn)行柱層析之前，將上清用乙酸調(diào)節(jié)為pH4.6，離心除去沉淀物。隨后針對(duì)所有突變體木聚糖酶的柱層析方法均相同。
在酸化和離心后，抽取木聚糖酶樣品到在10mM乙酸鈉(pH4.6)中平衡的50ml床體積的，CM-瓊脂糖快速流動(dòng)的陽(yáng)離子交換柱(Pharmacia Biotech，Uppsala)。將木聚糖酶用250ml線性梯度(于10mM乙酸鈉中的0-0.6M Nacl，pH 4.6)以1ml/分鐘流速洗脫。木聚糖酶在150至200ml梯度時(shí)被洗脫出來(lái)。通過(guò)SDS-PAE檢測(cè)收集的組分，并集合具有大多數(shù)木聚糖酶的那些組分。純化的木聚糖酶通過(guò)分光光度測(cè)定法，對(duì)大多數(shù)突變TrX木聚糖酶在280nm使用54,600-53,400M-1之間的消光系數(shù)進(jìn)行量化。從10g細(xì)胞中典型地純化產(chǎn)生25mg木聚糖酶。
2-3測(cè)定酶活性的標(biāo)準(zhǔn)分析量化分析測(cè)定了從可溶木聚糖中產(chǎn)生的還原糖末端的數(shù)量。這個(gè)分析的底物是來(lái)自樺木木聚糖的5％懸浮液(Sigma Chemical Co.)的溶解于水中的樺木木聚糖的組分。在除去不溶的組分后，將上清凍干并貯存于干燥器中。如下測(cè)定比活性將含有預(yù)先在分析緩沖液(50mM檸檬酸鈉，pH5.5或者測(cè)試的木聚糖酶的最佳pH)中稀釋的100μL的30mg/mL木聚糖的反應(yīng)混合物，150μL分析緩沖液，和在分析緩沖液中稀釋的50μL酶在40℃孵育。在不同時(shí)間間隔取50μL的部分，稀釋在1ml的5mMNaOH中終止反應(yīng)。還原糖的數(shù)量用對(duì)羥基苯甲酸酰肼試劑(HBAH)(Lever，1972，Analytical Biochem 47273-279)測(cè)定。一單位的酶活性定義為在40℃1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol還原糖的酶量。
為比較突變的和天然木聚糖酶之間的比活性，將突變木聚糖酶的比活性轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬?duì)活性。相對(duì)活性以突變酶的比活性除以天然木聚糖酶的比活性的百分比計(jì)算。
表4在40℃和pH5.5時(shí)突變和天然木聚糖酶的相對(duì)活性

*天然TrX木聚糖酶的比活性經(jīng)測(cè)定為770U/mg。
表4所示結(jié)果表明突變木聚糖酶在40℃的特異性酶活性與天然木聚糖酶相比無(wú)明顯改變。但是，當(dāng)與天然木聚糖酶相比時(shí)(比活性提高13-21％)，觀測(cè)到118C突變木聚糖酶(TrX-HML-AHCAE-R和TrX-H11D-ML-AHCAE-R)的活性增高比活性。
2-4確定大腸桿菌表達(dá)突變木聚糖酶的表達(dá)效率通過(guò)2-3所述的標(biāo)準(zhǔn)分析，確定了每種突變木聚糖酶的相對(duì)表達(dá)效率，其通過(guò)估計(jì)在單位體積細(xì)菌培養(yǎng)物中木聚糖酶產(chǎn)生的木糖釋放而確定。與沒(méi)有這種突變的各自前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R相比，大腸桿菌表達(dá)的編碼突變N11D的三種突變木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHAE-RR)；TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAERR)的表達(dá)效率高2.4-4.3倍。
表5突變木聚糖酶的表達(dá)效率

*相對(duì)于在上文中規(guī)定的各自的前體。
這表明突變N11D的一個(gè)益處是增強(qiáng)在微生物中的表達(dá)，這是工業(yè)生產(chǎn)酶的一個(gè)重要特征。
實(shí)施例3突變木聚糖酶的嗜熱性檢測(cè)嗜熱性是測(cè)試不同溫度對(duì)不同突變木聚糖酶酶促水解可溶木聚糖的作用。
分析步驟與標(biāo)準(zhǔn)分析相似，不同之處是孵育溫度和時(shí)間。將pH5.5的50mM檸檬酸鈉緩沖液中的木聚糖酶(15μg/mL)和可溶的樺木木聚糖底物混合，并在不同的溫度在循環(huán)水浴中孵育。孵育30分鐘后，通過(guò)HBAH分析測(cè)定木聚糖釋放的還原糖的量，并計(jì)算為相對(duì)活性，在40℃的數(shù)值代表100％。
圖3示出溫度對(duì)TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)水解木聚糖的作用。與沒(méi)有H144R突變的前體(TrX-HML-AHAE)相比，這個(gè)突變木聚糖酶顯示在較高溫度時(shí)中等程度改良的酶活性。這些結(jié)果提示H144R突變改良了木聚糖酶的嗜熱性。
與TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)相比，另一種突變體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)在較高溫度不明顯增強(qiáng)酶活性(未示出)。這些結(jié)果提示Q161R突變對(duì)木聚糖酶的嗜熱性沒(méi)有益處。
已經(jīng)測(cè)試了基于D116G和Y118C突變的兩個(gè)系列的突變體。與天然TrX相對(duì)比，單一突變TrX-116G和TrX-118C在較高溫度呈現(xiàn)較高活性(圖4)。
與前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(Trx-HML-AHAE-R)在pH5.5(圖5，只示出116G突變體)和pH6.0(圖6和7，這些圖包括相同數(shù)據(jù)但相對(duì)活性表示不同)相比，在下對(duì)突變中也觀測(cè)到嗜熱性的相同增強(qiáng)作用TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R)。
基于N11D突變的另一系列突變木聚糖酶對(duì)嗜熱性也有益處。與前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R，圖8)相比，突變體TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHAE-RR)在較高溫度呈現(xiàn)較高活性。這是個(gè)未曾期望的結(jié)果，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)的報(bào)道表明觀測(cè)到了相同的N11D突變或者在含有分子內(nèi)二硫鍵的TrX突變體中降低溫度最佳值和溫度范圍(Turenen等，2001)，或者對(duì)TrX-H-11D-ML的嗜熱性無(wú)作用(US 5,759，840，突變體稱為NI-TX12)。本發(fā)明的這些數(shù)據(jù)表明11D突變對(duì)適當(dāng)修飾的木聚糖酶有益處。
以上鑒別的突變可以組合以產(chǎn)生甚至在較高pH范圍具有較高嗜熱性的突變木聚糖酶。組合突變木聚糖酶，包括三重突變N11D/D116G/144R或N11D/Y118C/144R的突變體TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR)，在大約70℃至大約75℃的較高溫度呈現(xiàn)最大酶活性，及在pH5.5(圖5，只示出116G突變體)和pH6.0(圖6和7)在80℃示出明顯酶活性。這些結(jié)果提示突變D116G或Y118C補(bǔ)充了突變N11D和H144R，與木聚糖酶的嗜熱性相關(guān)。
實(shí)施例4突變木聚糖酶的嗜堿性檢測(cè)遺傳修飾的木聚糖酶的嗜堿性以測(cè)試不同pH條件對(duì)突變木聚糖酶酶促水解可溶的樺木木聚糖的作用。該分析方法與標(biāo)準(zhǔn)分析相似，不同之處在于孵育溫度和時(shí)間不同。將遺傳修飾的木聚糖酶等份(15μg/mL)和在50mMpH4-7之間的檸檬酸鈉緩沖液中的可溶木聚糖底物一起在65℃孵育。溫育30分鐘后，通過(guò)HBAH分析測(cè)定木聚糖底物釋放的還原糖的數(shù)量，并計(jì)算各種突變木聚糖酶對(duì)pH的函數(shù)，最大活性定為100％。
突變H144R在較高pH不影響活性。突變體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R及其前體TrX-HML-75A105H-125A129E具有相同pH/活性分布圖(未示出)。然而，如實(shí)施例3所述，這個(gè)突變(H144R)有益于木聚糖酶的嗜熱性。
圖9示出在突變Q161R所產(chǎn)生的突變木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)中pH對(duì)酶活性的作用。與具有相同pH/活性分布圖的其前體TrX-HML-75A105H-125A129E和TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(未示出)相對(duì)比，突變木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)在6.5，7.0，7.5和8.0的較高pH范圍呈現(xiàn)較高活性。當(dāng)與無(wú)此突變的前體相比時(shí)，TrX-HML-AHAE-RR在5.0，5.5和6.0的較低pH也呈現(xiàn)較低活性。
已經(jīng)測(cè)試了突變D116G和Y118C對(duì)木聚糖酶活性的直接作用。與天然TrX相比，單一突變TrX-116G和TrX-118C在較高的pH表現(xiàn)了更高的活性(圖10)。
當(dāng)與前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-125A129E相比時(shí)，在以下突變體中也觀測(cè)到突變D116G和Y118C對(duì)嗜堿性的相同增強(qiáng)作用TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R，圖9)。盡管這兩種突變體在pH6.5，7.0，7.5和8.0均呈現(xiàn)了較高活性，突變體TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R在5.0，5.5和6.0的較低pH保持最佳活性。這兩種突變體在pH5.0-8.0保持高活性表明最佳pH范圍擴(kuò)大。
N11D突變未顯示出有助于TrX的嗜堿性。突變體TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-H11DML-AHAE-RR)與其前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R具有相同的pH/活性分布圖(未示出)。11D對(duì)pH/活性分布圖無(wú)作用的結(jié)果與Turenen等(2001)所述結(jié)果相矛盾，其指出N11D突變?cè)诤蟹肿觾?nèi)二硫鍵的TrX突變體中降低pH最佳值和pH范圍。然而，上述結(jié)果與US 5,759,840的結(jié)論一致，其中未觀測(cè)到對(duì)TrX-H-11D-ML(稱為NI-TX12的突變體)嗜堿性的陰性作用。
組合以上鑒別的突變產(chǎn)生具有較高嗜堿性和嗜熱性的突變木聚糖酶?；谒闹赝蛔僋11D/D116G/H144R/Q161R或N11D/Y118C/144R/Q161R的組合突變木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR，圖9)和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR，未示出)與其前體木聚糖酶相比，在大約pH5.5至大約pH7呈現(xiàn)最大酶活性。另外，存在突變D116G有助于在5.0，5.5和6.0的較低pH范圍充分保持最大活性，因此避免在低pH明顯喪失活性，如在前體TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(圖9)中所觀測(cè)到的。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)最佳pH范圍擴(kuò)大。
概括而言，嗜堿性木聚糖酶可以通過(guò)組合突變D116G或Y118C與Q161R而構(gòu)建。加入其它新的突變N11D和H144R可進(jìn)一步增強(qiáng)突變體TrX的嗜熱性。N11D突變可有益于突變體的表達(dá)。
本發(fā)明描述了突變木聚糖酶，其呈現(xiàn)改良的嗜熱性和嗜堿性及與紙漿生產(chǎn)中這些酶相關(guān)的益處，這些突變木聚糖酶還可以用于其它工業(yè)過(guò)程中，例如但不限于清洗精密儀器和半導(dǎo)體。另外，由于其提高的嗜熱性和熱穩(wěn)定性，突變木聚糖酶可用于化學(xué)處理中，即使用少量的變性劑或去污劑或者存在溶劑，例如但不限于少量非極性溶劑例如但不限于己烷，二氧雜環(huán)乙烷，四氯化碳，苯，醚，氯仿，乙酸和二氯甲烷，及極性溶劑例如但不限于丙酮，乙醇，二甲基甲酰胺，乙腈，噻吩烷砜，二甲亞砜和水。
本發(fā)明針對(duì)優(yōu)選的實(shí)施例已經(jīng)進(jìn)行了描述。然而，顯而易見(jiàn)在不偏離本發(fā)明在此所述范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明加以各種變化和修改。
所有參考和引用的資料在此并入?yún)⒖肌?br> 參考文獻(xiàn)Arase，A.，Yomo，T.，Urabe，I.，Hata，Y.，Katsube，Y.and Okada，H.(1993)FEBS Lett.316123-127。
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85 90 95Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys100 105 110Thr Asp Thr Arg Ile Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe115 120 125Thr Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val130 135 140Thr Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala His His Gly Phe His Asn145 150 155 160Ser Asp Phe Asn Tyr Gln Val Val Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala165 170 175Gly Ser Ala Ala Val Thr Ile Ser Ser180 185<210>3<211>185<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>3Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val1 5 10 15Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn20 25 30Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe35 40 45Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly50 55 60Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr65 70 75 80Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly85 90 95Thr Val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg
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115 120 125Asn Gln Pro Ser Ile Ile Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser130 135 140Val Arg Gln Thr Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Ala His145 150 155 160Phe Arg Lys Trp Glu Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu165 170 175Thr Ala Phe Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val180 185 190Met Thr Asn Gln Leu Phe Ile Gly Asn195 200<210>5<211>185<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌<400>5Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val1 5 10 15Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn20 25 30Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe35 40 45Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly50 55 60Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr65 70 75 80Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly85 90 95Thr Val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg100 105 110Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr
115 120 125Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile130 135 140Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu145 150 155 160Gly Ser Asn Trp Ala Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser165 170 175Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp180 185<210>6<211>211<212>PRT<213>丙酮丁醇梭菌<400>6Ser Ala Phe Asn Thr Gln Ala Ala Pro Lys Thr Ile Thr Ser Asn Glu1 5 10 15Ile Gly Val Asn Gly Gly Tyr Asp Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly20 25 30Asn Thr Ser Met Thr Leu Lys Asn Gly Gly Ala Phe Ser Cys Gln Trp35 40 45Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Asp50 55 60Thr Gln Thr Tyr Lys Gln Leu Gly Asn Ile Ser Val Asn Tyr Asn Cys65 70 75 80Asn Tyr Gln Pro Tyr Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr85 90 95Ser Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly Ser Trp100 105 110Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Lys Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly115 120 125Ile Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Ile Asn Gln Pro Ser Ile Gln
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115 120 125Thr Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Asp Gly Thr Ala Thr Phe Gln GLn130 135 140Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val145 150 155 160Thr Glu His Phe Lys Gln Trp Glu Arg Met Gly Met Arg Met Gly Lys165 170 175Met Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr180 185 190Ala Asn Val Tyr Lys Asn Glu Ile Arg Ile Gly Ala Asn Pro195 200 205<210>8<211>211<212>PRT<213>生黃瘤胃球菌<400>8Ser Ala Ala Asp Gln Gln Thr Arg Gly Asn Val Gly Gly Tyr Asp Tyr1 5 10 15Glu Met Trp Asn Gln Asn Gly Gln Gly Gln Ala Ser Met Asn Pro Gly20 25 30Ala Gly Ser Phe Thr Cys Ser Trp Ser Asn Ile Glu Asn Phe Leu Ala35 40 45Arg Met Gly Lys Asn Tyr Asp Ser Gln Lys Lys Asn Tyr Lys Ala Phe50 55 60Gly Asn Ile Val Leu Thr Tyr Asp Val Glu Tyr Thr Pro Arg Gly Asn65 70 75 80Ser Tyr Met Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Met Glu Tyr85 90 95Tyr Ile Val Glu Gly Trp Gly Asp Trp Arg Pro Pro Gly Asn Asp Gly100 105 110Glu Val Lys Gly Thr Val Ser Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Asp Ile Arg115 120 125
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Lys Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser130 135 140Gly Ser Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg145 150 155 160Ala Gly Met Asn Met Gly Gln Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr165 170 175Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Thr Val Ser Gly180 185 190<210>12<211>189<212>PRT<213>鏈霉菌36a<400>12Ala Thr Thr Ile Thr Asn Glu Thr Gly Tyr Asp Gly Met Tyr Tyr Ser1 5 10 15Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn Gly Gly20 25 30Gly Ser Tyr Ser Thr Arg Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala Gly35 40 45Lys Gly Trp Ala Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Arg Tyr Thr Gly Trp50 55 60Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Ser65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser Tyr Arg85 90 95Pro Thr Gly Glu Thr Arg Gly Thr Val His Ser Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu Ala Pro115 120 125Ala Ala Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser130 135 140
Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly145 150 155 160Met Asn Met Gly Asn Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr Glu Gly165 170 175Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr Val Ser Gly180 185<210>13<211>189<212>PRT<213>褐色高溫單孢菌<400>13Ala Val Thr Ser Asn Glu Thr Gly Tyr His Asp Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Phe Trp Thr Asp Ala Pro Gly Thr Val Ser Met Glu Leu Gly Pro Gly20 25 30Gly Asn Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly35 40 45Lys Gly Trp Ala Thr Gly Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Ala Ser50 55 60Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg85 90 95Pro Thr Gly Thr Tyr Met Gly Thr Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr115 120 125Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Thr Ser130 135 140Gly Thr Ile Thr Ala Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg His Gly145 150 155 160
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Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190<210>15<211>178<212>PRT<213>里氏木霉Xy1 I<400>15Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gln Asn Tyr Gln Thr Gly Gly Gln Val Ser1 5 10 15Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Val Asn Trp Asn Thr Gln Asp20 25 30Asp Phe Val Val Gly Val Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Ala Pro Ile35 40 45Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Ser Gly Thr Gly Leu Leu Ser50 55 60Val Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Met Glu65 70 75 80Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gln Gly Thr Val Lys Gly Thr Val Thr85 90 95Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg Val Asn Glu100 105 110Pro Ser Ile Gln Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gln Tyr Ile Ser Val Arg115 120 125Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Gln Asn His Phe Asn130 135 140Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gln Met Met Asn Tyr Gln Val145 150 155 160Val Ala Val Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Gln Ser Val165 170 175Ser Asn
<210>16<211>190<212>PRT<213>里氏木霉Xyl II<400>16Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190<210>17<211>190
<212>PRT<213>Trichoderma viride<400>17Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Phe Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190<210>18<211>202<212>PRT<213>產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌
<400>18Asn Ser Ser Val Thr Gly Asn Val Gly Ser Ser Pro Tyr His Tyr Glu1 5 10 15Ile Trp Tyr Gln Gly Gly Asn Asn Ser Met Thr Phe Tyr Asp Asn Gly20 25 30Thr Tyr Lys Ala Ser Trp Asn Gly Thr Asn Asp Phe Leu Ala Arg Val35 40 45Gly Phe Lys Tyr Asp Glu Lys His Thr Tyr Glu Glu Leu Gly Pro Ile50 55 60Asp Ala Tyr Tyr Lys Trp Ser Lys Gln Gly Ser Ala Gly Gly Tyr Asn65 70 75 80Tyr Ile Gly Ile Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr85 90 95Ile Val Asp Asp Trp Phe Asn Lys Pro Gly Ala Asn Leu Leu Gly Gln100 105 110Arg Lys Gly Glu Phe Thr Val Asp Gly Asp Thr Tyr Glu Ile Trp Gln115 120 125Asn Thr Arg Val Gln Gln Pro Ser Ile Lys Gly Thr Gln Thr Phe Pro130 135 140Gln Tyr Phe Ser Val Arg Lys Ser Ala Arg Ser Cys Gly His Ile Asp145 150 155 160Ile Thr Ala His Met Lys Lys Trp Glu Glu Leu Gly Met Lys Met Gly165 170 175Lys Met Tyr Glu Ala Lys Val Leu Val Glu Ala Gly Gly Gly Ser Gly180 185 190Ser Phe Asp Val Thr Tyr Phe Lys Met Thr195 200<210>19<211>189<212>PRT<213>Asparigillus awamori var.kawachi
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Gln Thr Thr Pro Asn Ser Glu Gly Trp His Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ser1 5 10 15Trp Trp Ser Asp Gly Gly Ala Gln Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Glu Gly20 25 30Gly Thr Tyr Glu Ile Ser Trp Gly Asp Gly Gly Asn Leu Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Asn Pro Gly Leu Asn Ala Arg Ala Ile His Phe Glu Gly50 55 60Val Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asp Pro Ser Ser Gly Ala Thr Asp Leu Gly Thr Val Glu Cys Asp Gly100 105 110Ser Ile Tyr Arg Leu Gly Lys Thr Thr Arg Val Asn Ala Pro Ser Ile115 120 125Asp Gly Thr Gln Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asp Lys130 135 140Arg Thr Ser Gly Thr Val Gln Thr Gly Cys His Phe Asp Ala Trp Ala145 150 155 160Arg Ala Gly Leu Asn Val Asn Gly Asp His Tyr Tyr Gln Ile Val Ala165 170 175Thr Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Ile Thr Val Ala Asp180 185 190Val Gly<210>21<211>76<212>DNA<213>Trx-1<400>21ctagctaagg aggctgcaga tgcaaacaat acaaccagga accggttaca acaacggtta60
cttttacagc tattgg 76<210>22<211>78<212>DNA<213>XyTv-2<400>22aacgatggcc atggtggtgt tacctataca aacgggcccg gaggccaatt tagcgtcaat 60tggtctaact ccggaaac 78<210>23<211>78<212>DNA<213>Trx-3<400>23ttcgtaggtg gaaaaggttg gcaacccggg accaaaaata aggtgatcaa cttctctgga 60tcttataatc cgaatggg 78<210>24<211>74<212>DNA<213>XyTv-4<400>24aattcatact taagcgtcta tggctggtct agaaacccac tgattgaata ttacattgtc 60gaaaatttcg gtac 74
<210>25<211>51<212>DNA<213>Trx-8<400>25gattcctccg acgtctacgt ttgttatgtt ggtccttggc caatgttgtt g 51<210>26<211>84<212>DNA<213>XyTv-7<400>26ccaatgaaaa tgtcgataac cttgctaccg gtaccaccac aatggatatg tttgcccggg 60cctccggtta aatcgcagtt aacc84<210>27<211>78<212>DNA<213>Trx-6<400>27agattgaggc ctttgaagca tccacctttt ccaaccgttg ggccctggtt tttattccac 60tagttgaaga gacctaga 78<210>28<211>85<212>DNA
<213>XyTv-5<400>28atattaggct tacccttaag tatgaattcg cagataccga ccagatcttt gggtgactaa60cttataatgt aacagctttt aaagc 85<210>29<211>58<212>DNA<213>XyTv-101<400>29tcgacaattt cggtacctac aatccgagta ccggcgccac aaaattaggc gaagtcac 58<210>30<211>53<212>DNA<213>XyTv-102<400>30tagtgatgga tccgtatatg atatctaccg tacccaacgc gttaatcagc cat 53<210>31<211>59<212>DNA<213>Trx-103<400>31cgatcattgg aaccgccacc ttttatcagt actggagtgt tagacgtaat catcggagc 59
<210>32<211>69<212>DNA<213>XyTv-104<400>32tccggttcgg ttaatactgc gaatcacttt aatgcatggg cacagcaagg gttaacccta 60ggtacaatg 69<210>33<211>67<212>DNA<213>XyTv-105<400>33gattatcaaa tcgtagcggt ggaaggctac ttctcgagtg gttccgctag tattacagtg 60agctaaa 67<210>34<211>73<212>DNA<213>XyTv-110<400>34gttaaagcca tggatgttag gctcatggcc gcggtgtttt aatccgcttc agtgatcact 60acctaggcat ata73<210>35<211>54
<212>DNA<213>XyTv-109<400>35ctatagatgg catgggttgc gcaattagtc ggtagctagt aaccttggcg gtgg 54<210>36<211>60<212>DNA<213>XyTv-108<400>36aaaatagtca tgacctcaca atctgcatta gtagcctcga ggccaagcca attatgacgc60<210>37<211>66<212>DNA<213>XyTv-107<400>37ttagtgaaat tacgtacccg tgtcgttccc aattgggatc catgttacct aatagtttag 60catcgc 66<210>38<211>53<212>DNA<213>XyTv-106<400>38
caccttccga tgaagagctc accaaggcga tcataatgtc actcgatttc tag 53<210>39<211>596<212>DNA<213>TrX<400>39ctagctaagg aggctgcaga tgcaaacaat acaaccagga accggttaca acaacggtta 60cttttacagc tattggaacg atggccatgg tggtgttacc tatacaaacg ggcccggagg120ccaatttagc gtcaattggt ctaactccgg aaacttcgta ggtggaaaag gttggcaacc180cgggaccaaa aataaggtga tcaacttctc tggatcttat aatccgaatg ggaattcata240cttaagcgtc tatggctggt ctagaaaccc actgattgaa tattacattg tcgaaaattt300cggtacctac aatccgagta ccggcgccac aaaattaggc gaagtcacta gtgatggatc360cgtatatgat atctaccgta cccaacgcgt taatcagcca tcgatcattg gaaccgccac420cttttatcag tactggagtg ttagacgtaa tcatcggagc tccggttcgg ttaatactgc480gaatcacttt aatgcatggg cacagcaagg gttaacccta ggtacaatgg attatcaaat540cgtagcggtg gaaggctact tctcgagtgg ttccgctagt attacagtga gctaaa596<210>40<211>36<212>DNA<213>Tx-75A-1<400>40tgggaattca tacttagccg tctatggctg gtctag 36<210>41
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<211>39<212>DNA<213>Tx-10H11D-1<400>52ggaaccggtt accacgacgg ttacttttac agctattgg39<210>53<211>36<212>DNA<213>Tx-116G118C-1<400>53gacggatccg tatatggtat ctgccgtacc caacgc 36<210>54<211>184<212>PRT<213>白曲霉<400>54Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Ala Asp1 5 10 15Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp20 25 30Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser35 40 45Ser Asn Ala Ile Ser Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser50 55 60Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gln Ala Glu Tyr
65 70 75 80Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr85 90 95Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys Thr100 105 110Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr115 120 125Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr130 135 140Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gln His Gly Phe Gly Asn Ser145 150 155 160Asp Phe Asn Tyr Gln Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly165 170 175Ser Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser180
權(quán)利要求
1.一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)在選自第11，116，118，144或161位氨基酸的位置上的取代的氨基酸殘基，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II氨基酸序列的序列對(duì)比中確定。
2.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶與相應(yīng)的天然木聚糖酶相比呈現(xiàn)改良的嗜熱性，嗜堿性，表達(dá)效率，或其組合。
3.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第144位，而且選自于堿性氨基酸組成的一組。
4.權(quán)利要求3的修飾的木聚糖酶，其中所述至少一個(gè)取代的氨基酸選自Arg和Lys組成的一組。
5.權(quán)利要求4的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
6.權(quán)利要求5的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
7.權(quán)利要求4的修飾的木聚糖酶，還包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala及在第129位的Glu(HML-AHAE)。
8.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第161位，而且選自于堿性氨基酸組成的一組。
9.權(quán)利要求8的修飾的木聚糖酶，其中所述至少一個(gè)取代的氨基酸選自于Arg，Lys和His組成的一組。
10.權(quán)利要求9的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
11.權(quán)利要求10的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
12.權(quán)利要求9的修飾的木聚糖酶，還包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
13.權(quán)利要求12的修飾的木聚糖酶，還包含在第144位的第二個(gè)取代的氨基酸，而且選自于堿性氨基酸組成的一組。
14.權(quán)利要求13的修飾的木聚糖酶，其中所述第二個(gè)取代的氨基酸選自于Arg和Lys組成的一組。
15.權(quán)利要求14的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
16.權(quán)利要求15的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
17.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第11位，而且選自于酸性氨基酸組成的一組。
18.權(quán)利要求17的修飾的木聚糖酶，其中所述至少一個(gè)取代的氨基酸是Asp。
19.權(quán)利要求18的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
20.權(quán)利要求19的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
21.權(quán)利要求18的修飾的木聚糖酶，還包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
22.權(quán)利要求21的修飾的木聚糖酶，還包含在第144位和161位的第二個(gè)和第三個(gè)取代的氨基酸，而且選自于堿性氨基酸組成的一組。
23.權(quán)利要求22的修飾的木聚糖酶，其中所述在第144位的第二個(gè)取代的氨基酸選自于Arg和Lys組成的一組，所述在第161位的第三個(gè)取代的氨基酸選自于Arg，Lys和His組成的一組。
24.權(quán)利要求23的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
25.權(quán)利要求24的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
26.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第116位而且選自于小型疏水性氨基酸組成的一組。
27.權(quán)利要求26的修飾的木聚糖酶，其中所述至少一個(gè)取代的氨基酸是Gly。
28.權(quán)利要求27的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
29.權(quán)利要求28的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
30.權(quán)利要求27的修飾的木聚糖酶，還包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
31.權(quán)利要求30的修飾的木聚糖酶，還包含在第11位的第二個(gè)取代的氨基酸而且選自于酸性氨基酸組成的一組，及在第144和161位的第三個(gè)和第四個(gè)取代的氨基酸而且選自于堿性氨基酸組成的一組。
32.權(quán)利要求31的修飾的木聚糖酶，其中在第11位的所述第二個(gè)取代的氨基酸是Asp，在第144位的所述第三個(gè)取代的氨基酸選自于Arg和Lys組成的一組，在第161位的第四個(gè)取代的氨基酸選自于Arg，Lys和His組成的一組。
33.權(quán)利要求32的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
34.權(quán)利要求33的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
35.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第118位，而且選自于中等大小的非芳香族的疏水性氨基酸組成的一組。
36.權(quán)利要求35的修飾的木聚糖酶，其中所述至少一個(gè)取代的氨基酸是Cys。
37.權(quán)利要求36的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
38.權(quán)利要求37的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
39.權(quán)利要求36的修飾的木聚糖酶，還包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
40.權(quán)利要求39的修飾的木聚糖酶，還包含在第11位的第二個(gè)取代的氨基酸并選自于酸性氨基酸組成的一組，及在第144和161位的第三個(gè)和第四個(gè)取代的氨基酸，其選自于堿性氨基酸組成的一組。
41.權(quán)利要求40的修飾的木聚糖酶，其中在第11位的所述第二個(gè)取代的氨基酸是Asp，在第144位的所述第三個(gè)取代的氨基酸選自于Arg和Lys組成的一組，在第161位的第四個(gè)取代的氨基酸選自于Arg，Lys和His組成的一組。
42.權(quán)利要求41的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
43.權(quán)利要求42的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
44.權(quán)利要求40的修飾的木聚糖酶，其中在第11位的所述第二個(gè)取代的氨基酸是Asp，在第116位的所述第三個(gè)取代的氨基酸是Gly，在第144位的所述第四個(gè)取代的氨基酸選自于Arg和Lys組成的一組，及在第161位的所述第五個(gè)取代的氨基酸選自于Arg，Lys和His組成的一組。
45.權(quán)利要求44的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
46.權(quán)利要求45的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
47.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶在工業(yè)處理中的應(yīng)用。
48.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中所述工業(yè)處理是紙漿制造。
49.一種修飾的木聚糖酶，其選自由以下組成的一組(如表2所述)TrX-HML-75A105H-125A129E-144RTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161RTrX-116GTrX-118CTrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144RTrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144RTrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161RTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161RTrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161RTrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R
50.一種木聚糖酶，其包含在選自第11，116，118，144和161位氨基酸的位置的一個(gè)氨基酸殘基，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列對(duì)比中確定，所述氨基酸在所述SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列中的所述位置未發(fā)現(xiàn)。
51.一種木聚糖酶，其在第116位包含非極性氨基酸，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列對(duì)比中確定。
52.權(quán)利要求51的木聚糖酶，其中所述非極性氨基酸是Gly。
53.一種木聚糖酶，其在第118位包含一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的對(duì)比中確定。
54.權(quán)利要求53的木聚糖酶，其中所述非芳香族的疏水性氨基酸是Cys。
55.一種木聚糖酶，其在第144位包含一個(gè)堿性氨基酸，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的對(duì)比中確定。
56.權(quán)利要求55的木聚糖酶，其中所述堿性氨基酸是Arg。
57.一種木聚糖酶，其包含在第11位的一個(gè)酸性氨基酸，在第116位的一個(gè)非極性氨基酸，及在第144位的一個(gè)堿性氨基酸，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的對(duì)比中確定。
58.權(quán)利要求57的木聚糖酶，其中所述酸性氨基酸是Asp，所述非極性氨基酸是Gly，及所述堿性氨基酸是Arg。
59.一種木聚糖酶，其包含在第11位的一個(gè)酸性氨基酸，在第118位的一個(gè)非芳香族的疏水性氨基酸，及在第144位的一個(gè)堿性氨基酸，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的對(duì)比中確定。
60.權(quán)利要求59的木聚糖酶，其中所述酸性氨基酸是Asp，所述非芳香族的疏水性氨基酸是Cys，及所述堿性氨基酸是Arg。
61.一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，其中所述修飾的木聚糖酶的特征在于具有在大約69℃至大約84℃之間的最大有效溫度(MET)，其中所述修飾的木聚糖酶是得自木霉(Trichoderma sp.)的家族11木聚糖酶。
62.權(quán)利要求61的修飾的木聚糖酶，其中所述MET在大約70℃至大約84℃之間。
63.一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)取代的氨基酸殘基，其中所述修飾的木聚糖酶特征在于具有在大約pH5.8至大約pH8.4之間的最大有效pH值(MEP)，其中所述修飾的木聚糖酶是得自木霉的家族11木聚糖酶。
64.權(quán)利要求63的修飾的木聚糖酶，其中所述MEP在大約pH6.0至大約pH8.0之間。
65.權(quán)利要求61的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶的特征還在于具有在大約pH5.8至大約pH7.6之間的最大有效pH(MEP)。
66.權(quán)利要求62的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶的特征還在于具有在大約pH6.5至大約pH7.4之間的最大有效pH(MEP)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種木聚糖酶或者一種修飾的木聚糖酶，其包含至少一個(gè)選自第11，116，118，144和161位氨基酸的位置上的取代的氨基酸殘基，所述位置從所述修飾的木聚糖酶與里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II氨基酸序列對(duì)比中確定。本發(fā)明所述木聚糖酶與相應(yīng)的天然木聚糖酶相比呈現(xiàn)改良的嗜熱性，嗜堿性，表達(dá)效率或其組合。
文檔編號(hào)C12N9/24GK1697877SQ02823195
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日
發(fā)明者宋永霖 申請(qǐng)人:加拿大國(guó)立研究院