專利名稱：一種人類粒細(xì)胞抗原(hna)1-5系統(tǒng)基因分型的pcr-sbt方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因分型檢測(cè)方法，尤其涉及一種用于人類粒細(xì)胞抗原(HumanNeutrophil Alloantigens,縮寫為HNA) 1-5系統(tǒng)抗原基因分型的分子生物學(xué)檢測(cè)方法,本發(fā)明還涉及該方法所應(yīng)用的試劑。
背景技術(shù)：
人類白細(xì)胞膜上具有一系列的血型抗原，包括粒細(xì)胞特異性抗原和人類白細(xì)胞抗原，這些抗原在不同人群中表現(xiàn)出高度的多態(tài)性，輸注后由于個(gè)體抗原的差異可以刺激不 同的機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而引發(fā)某些輸血不良反應(yīng)，導(dǎo)致輸注無效或引起某些嚴(yán)重的疾病，因此研究粒細(xì)胞特異性抗原具有重要的臨床意義。目前國(guó)際輸血協(xié)會(huì)的粒細(xì)胞抗原工作組制訂了人類粒細(xì)胞特異性抗原(Human Neutrophil Alloantigens)的命名原則,粒細(xì)胞特異性抗原系統(tǒng)被稱“HNA”。命名原則中作為抗原糖蛋白的定位用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如HNA-I定位于Fe Y Receptor IIIb ;同一糖蛋白不同的多態(tài)性則根據(jù)發(fā)現(xiàn)先后順序用小寫英文字母表示(如HNA-la，HNA-lb、HNA-lc等)。目前研究發(fā)現(xiàn)的粒細(xì)胞特異性抗原系統(tǒng)(HNA)有7個(gè)抗原，歸屬于5個(gè)人類粒細(xì)胞抗原系統(tǒng)。個(gè)體粒細(xì)胞特異性抗原的差異可以導(dǎo)致輸血后產(chǎn)生粒細(xì)胞抗體，目前證實(shí)粒細(xì)胞抗原、抗體在多種臨床疾病中起重要的作用，包括新生兒同種免疫性粒細(xì)胞減少癥、自身免疫性粒細(xì)胞減少癥、發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)、輸血相關(guān)性急性肺損傷(TRALI)、骨髓移植后同種免疫性粒細(xì)胞減少癥、輸血相關(guān)性同種免疫性粒細(xì)胞減少癥、藥物誘導(dǎo)的粒細(xì)胞減少癥和粒細(xì)胞輸注無效等。其中粒細(xì)胞抗體與TRALI的關(guān)系近年來受到血液領(lǐng)域的高度關(guān)注，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞特異性抗體與TRALI的發(fā)生密切相關(guān)，大多數(shù)發(fā)生TRALI的病例均能檢測(cè)到粒細(xì)胞特異性抗體，而且存在抗原系統(tǒng)的差異性。TRALI是臨床輸血并發(fā)的急性呼吸窘迫綜合癥，是一種嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng)，患者可發(fā)生急性呼吸困難、低氧血癥、非心源性肺水腫、低血壓和發(fā)燒，其死亡率較高，是輸血反應(yīng)并發(fā)死亡的主要原因，目前已成為輸血反應(yīng)引起死亡的第二位原因?，F(xiàn)有關(guān)粒細(xì)胞特異性抗原系統(tǒng)與TRALI的關(guān)系以及TRALI的預(yù)防已成為輸血領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，近年國(guó)外部分國(guó)家已開展在獻(xiàn)血人群中系統(tǒng)檢測(cè)粒細(xì)胞特異性抗原系統(tǒng)的研究，以期預(yù)防和減少TRALI的發(fā)生。目前粒細(xì)胞特異性鑒定方法主要有血清學(xué)方法和基因分型方法。血清學(xué)鑒定粒細(xì)胞抗原或抗體方法主要有粒細(xì)胞凝集試驗(yàn)、粒細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)(GIFT)、單克隆抗體特異性粒細(xì)胞抗原捕獲試驗(yàn)(Monoclonal Antibody Immobilization of GranulocyteAntigen, MAIGA)、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等方法。粒細(xì)胞抗原系統(tǒng)的基因分型方法主要有PCR-RFLP, PCR-SSP, PCR-SSO等。Bux等的實(shí)驗(yàn)表明，基因分型法與MAIGA方法對(duì)HNA的分型具有同樣的可靠性，而GIFT有15%的分型失誤率。目前的HNA抗原基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR-序列特異性引物)，該方法需要進(jìn)行多管擴(kuò)增，并且PCR-SSP方法在設(shè)計(jì)引物時(shí)只能針對(duì)某些具有區(qū)別性的特異性位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，因此只能對(duì)常規(guī)的HNA抗原進(jìn)行基因分型，對(duì)于一些特殊的新突變位點(diǎn)則難以明確。而HNA的PCR-SBT (PCR-Sequence based typing,基于PCR測(cè)序的分型技術(shù))分型方法可以克服上述缺陷和局限性，為最準(zhǔn)確的分型的方法。但現(xiàn)階段的HNA抗原基因PCR-SBT分型方法還不夠完善，雖然也有實(shí)驗(yàn)室采用PCR-SBT的方法對(duì)HNA個(gè)別抗原進(jìn)行基因分型，但至今未對(duì)HNA五個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)分型。因此，建立HNA1-5系統(tǒng)的PCR-SBT分型方法具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于HNA1-5系統(tǒng)抗原分型的PCR-SBT方法，以克服現(xiàn)有基因分型技術(shù)中的上述缺陷。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它對(duì)五個(gè)HNA抗原系統(tǒng)的基因進(jìn)行分型，包括以下步驟(I)制備人基因組DNA ；
(2)提供擴(kuò)增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴(kuò)增人基因組DNA中HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系統(tǒng)的基因序列；(3)將步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切純化；(4)提供測(cè)序引物，將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)；(5)將步驟(4)得到的測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序;(6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。所述步驟(3)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問題是提供上述方法所用的試劑。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它由用于擴(kuò)增的引物和用于測(cè)序分析的寡核苷酸測(cè)序引物組成；所述用于擴(kuò)增的引物為(I)HNA-I抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-IF :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT GGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3，HNA-IR :5，-CAGGAAACAGCTATGACC TGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3，(2) HNA-2抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-2F:5， -TGTAAAACGACGGCCAGT CTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT-3，HNA-2R:5，-CAGGAAACAGCTATGACC TAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3J(3) HNA-3抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-3F:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT CTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3’HNA-3R:5，-CAGGAAACAGCTATGACC CATGCCCATCCTCATAGGTC-3J(4) HNA-4抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-4F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT GTTCCCACTTCTCCCCACA-3’HNA-4R:5，-CAGGAAACAGCTATGACC GGACAGATATGGGCATGGTC-3J(5) HNA-5抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-5F:5， -TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGATATTCCCCACCCTGA-3’HNA-5R:5’ -CAGGAAACAGCTATGACC ACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3J所述2條寡核苷酸測(cè)序引物序列如下
M13F:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT—3’Ml3R : 5，-CAGGAAACAGCTATGACC-3，。本發(fā)明中引物設(shè)計(jì)是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，有關(guān)引物設(shè)計(jì)的方法和軟件均可從英特網(wǎng)上免費(fèi)獲得。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物是根據(jù)GenBank中人類HNA抗原基因序列中包括多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的連續(xù)寡核苷酸序列而設(shè)計(jì)獲得的。HNA-I抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物根據(jù) GenBank 中編號(hào)為 NC_000001. 10(161592986. . 161601158)的序列設(shè)計(jì);HNA_2 抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中編號(hào)為NC_000019. 9 (43857825-43867480)的序列設(shè)計(jì)；HNA-3抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中編號(hào)為NC_000019. 9(10713121.. 10755235)的序列設(shè)計(jì)；HNA_4抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物根據(jù) GenBank 中編號(hào)為 NC_000016. 9 (31271288. · 31344213)的序列設(shè)計(jì);HNA_5 抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中編號(hào)為NC_000016. 9 (30483983. . 30534506)的序列設(shè)計(jì)。所有正向擴(kuò)增引物5’端連接有M13載體正向序列上的18個(gè)堿基序列TGTAAAACGACGGCCAGT，所有反向擴(kuò)增引物5’端連接有M13載體反向序列上的18個(gè)堿基序 列CAGGAAACAGCTATGACC，通過連接后所有正向擴(kuò)增引物、反向擴(kuò)增引物分別具有共同的接頭序列，然后選擇這些接頭序列作為測(cè)序引物。本發(fā)明以5對(duì)寡核苷酸引物分別擴(kuò)增HNA系統(tǒng)的5個(gè)基因片段(分別為HNA-1抗原系統(tǒng)擴(kuò)增 GenBank 編號(hào)為 NC_000001. 10(161592986. . 161601158)序列中 1197-1668 位的片段，HNA-2抗原系統(tǒng)擴(kuò)增GenBank編號(hào)為NC_000019. 9 (43857825-43867480)序列中的1-457 位的片段，HNA-3 抗原系統(tǒng)擴(kuò)增 GenBank 編號(hào)為 NC_000019. 9 (10713121. . 10755235)序列中的28745-29265位的片段，HNA-4抗原系統(tǒng)擴(kuò)增GenBank編號(hào)為NC_000016. 9(31271288. · 31344213)序列中的 5409-5838 位的片段，HNA-5 抗原系統(tǒng)擴(kuò)增GenBank編號(hào)為 NC_000016. 9 (30483983. . 30534506)序列中的 33996-34321 位的片段)，可保證五個(gè)抗原系統(tǒng)基因的有效擴(kuò)增。擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)避開了 HNA抗原編碼序列的多態(tài)性位點(diǎn)，避免了任何突變點(diǎn)的漏檢。測(cè)序引物的設(shè)計(jì)能保證清晰準(zhǔn)確測(cè)得所擴(kuò)增片段的序列，通過對(duì)這些序列進(jìn)行雙向測(cè)序，從而將樣本進(jìn)行精確的基因定型。本發(fā)明通過對(duì)HNA抗原5個(gè)系統(tǒng)分別進(jìn)行序列測(cè)序，獲得HNA抗原基因分型的寡核苷酸序列，精確地對(duì)其基因進(jìn)行定型。隨著DNA序列分析儀的普及，PCR-SBT技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。高通量獲得的所有HNA抗原系統(tǒng)的編碼序列信息在基因定型、基因多態(tài)性檢測(cè)、基因頻率調(diào)查分析等方面的應(yīng)用將受到廣泛重視。本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，解決了 HNA抗原5個(gè)系統(tǒng)準(zhǔn)確定型的問題，發(fā)揮PCR-SBT對(duì)HNA基因定型操作高通量，結(jié)果精確的特點(diǎn)，在臨床輸血醫(yī)學(xué)研究和遺傳學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用將受到高度重視，對(duì)于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。特別是明確獻(xiàn)血人群粒細(xì)胞抗原系統(tǒng)分布情況，避免輸注含有粒細(xì)胞抗體的血液，以預(yù)防粒細(xì)胞抗體產(chǎn)生的輸血不良反應(yīng)，將有效預(yù)防TRALI發(fā)生，從而提高血液的安全性。


圖I為本發(fā)明中檢測(cè)標(biāo)本的ΗΝΑ-1、ΗΝΑ-2、ΗΝΑ-3、ΗΝΑ-4和HNA-5抗原基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜。I為HNA-I系統(tǒng)擴(kuò)增片段，2為HNA-2系統(tǒng)擴(kuò)增片段，3為HNA-3系統(tǒng)擴(kuò)增片段，4為HNA-4系統(tǒng)擴(kuò)增片段，5為HNA-5系統(tǒng)擴(kuò)增片段。圖2為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-I系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。141、147和227表示多態(tài)性堿基位置。檢測(cè)到HNA-I抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第141、147和227位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)HNA-la+b-c-，標(biāo)本2 (圖的中部)ΗΝΑ-la+b+c-，標(biāo)本3 (圖的下部)HNA-la-b+c-為例。圖3為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-2系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。49表示多態(tài)性堿基位置。檢測(cè)到HNA-2抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第49位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)為HNA-2a+b-，標(biāo)本2 (圖的中部)HNA_2a+b+，標(biāo)本3 (圖的下部)HNA_2a_b+為例。圖4為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-3系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。306表示多態(tài)性 堿基位置。檢測(cè)到HNA-3抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第306位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)HNA-3a+b-，標(biāo)本2 (圖的中部)HNA_3a+b+，標(biāo)本3 (圖的下部)HNA_3a_b+為例。圖5為本發(fā)明檢測(cè)I個(gè)樣本HNA-4系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。檢測(cè)到HNA-4抗原系統(tǒng)一個(gè)基因型，其中第141位為多態(tài)性堿基位置。以標(biāo)本HNA-4a+b-為例。圖6為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-5系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。2466表示多態(tài)性堿基位置。檢測(cè)到HNA-5抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第2466位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)HNA-5a+b_,標(biāo)本2 (圖的中部)HNA_5a+b+,標(biāo)本3 (圖的下部)HNA_5a_b+為例。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例I :本實(shí)施具體以獻(xiàn)血者進(jìn)行HNA1-5系統(tǒng)抗原基因分型為例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容做詳細(xì)說明，本發(fā)明所采用的一種HNA 1-5系統(tǒng)抗原基因分型的PCR-SBT方法具體包括以下步驟I、制備人基因組DNA，作為后續(xù)步驟的PCR擴(kuò)增模板。取待檢全血200 μ I,按照QuickGene DNAwhole blood kit S試劑盒說明書提取基因組DNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定基因組濃度和純度。2、合成5對(duì)擴(kuò)增引物和2條測(cè)序引物，具體序列見前述發(fā)明內(nèi)容中的序列，不再贅述，將擴(kuò)增引物用純水稀釋至50μΜ ;準(zhǔn)備La-Taq 酶(Lot CK4501, TaKaRa),10X 緩沖液(Lot CK4501, TaKaRa), Mg2+(Lot AA2601A, TaKaRa),dNTP (Lot :CBG4301A，TaKaRa)、純水，與步驟 I 所制備的 PCR 擴(kuò)增模板，按表I所述體系配制PCR擴(kuò)增體系表I :步驟2中HNA 5個(gè)系統(tǒng)的PCR擴(kuò)增體系
HNA 5個(gè)系統(tǒng)PCR擴(kuò)增體系體積(μ I)~
~10XPCR 緩沖液270
dNTP (2. 5mM) Γθ
Mg2+ (25mM) Γθ
引物IοΓΤθ
引物2αΤθ La-Taq 酶(5U/μ I)θΤθ
H2O12. 32
DNA 模板(lOOng/μ I)2 0
總體系20 μ I上表中，引物I :ΗΝΑ-1 5各引物對(duì)中的正向引物，引物2 :ΗΝΑ-1 5各引物對(duì)中的反向引物。用PCR儀(ΑΒΙ9700)按以下程序擴(kuò)增95°C預(yù)變性5min，DNA雙鏈充分解開；95°C變性30s，63°C退火30s，引物結(jié)合到模板上，72°C延伸45s，延長(zhǎng)所需擴(kuò)增片段，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin，擴(kuò)增片段充分延伸；3、擴(kuò)增產(chǎn)物的雙酶切純化。檢測(cè)樣本所擴(kuò)增片段，各取2μ I PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖I所示，確定擴(kuò)增片段的特異性。在剩余的PCR產(chǎn)物中分別加入蝦堿性磷酸酶(SAP，IU/μ 1，Lot M820A, Promega)和核酸外切酶 I (Exo- I，5U/μ 1，Lot CK11011B, TaKaRa)，利用蝦堿性磷酸酶(SAP)的核苷酸Y端去磷酸化功能以及核酸外切酶I (Exo- I)的單鏈特異性Y - 核酸外切酶功能，進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物純化。在25μ1擴(kuò)增產(chǎn)物體系中加入SAP 2μ I和Exo- I I μ 1,37。。30min酶切反應(yīng)，80°C 15min酶失活。4、對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR。將步驟3中純化之后的PCR產(chǎn)物中加入20 μ I純水稀釋，混勻。將發(fā)明內(nèi)容中所述的兩條測(cè)序引物用純水稀釋至濃度為3. 2ymol/L，以BigDyeterminator v3. Isequencing kit (美國(guó)ABI公司)試劑按照表2配制反應(yīng)體系表2 :步驟4中PCR產(chǎn)物的PCR測(cè)序體系
5 X緩沖液 1.5 BigDye mix I.O 測(cè)序引物I ΓοDNA2.0
H2OTl
總體積10.0
5X緩沖液175其中測(cè)序引物I為M13F和M13R中任意一條。所測(cè)樣本以擴(kuò)增純化的片段1:1稀釋后作為模板，分別進(jìn)行2個(gè)反應(yīng)，用PCR儀(ABI9700)按以下程序擴(kuò)增預(yù)變性96°C lmin，DNA雙鏈充分解開；96°C變性10s，50°C退火5s，測(cè)序引物結(jié)合到DNA模板上，60°C延伸4min，延長(zhǎng)擴(kuò)增片段，25個(gè)循環(huán)。5、測(cè)序擴(kuò)增PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進(jìn)行純化。將步驟4中測(cè)序擴(kuò)增PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進(jìn)行純化。直接在PCR產(chǎn)物中加入I μ I EDTAC I. 25 μ Μ) 和25 μ I醋酸鈉(3Μ)/無水乙醇(I 40)混合液，混勻，3000g離心30min ;去除上清，加入50 μ I 75%乙醇，300(^離心1011^11，去除上清，酒精揮發(fā)后加入1(^1甲酰胺溶解，95°C變性3min,迅速在冰上冷卻。6、將制備好的產(chǎn)物在ABI 3730測(cè)序儀上進(jìn)行48孔毛細(xì)管高通量電泳測(cè)序，所測(cè)序結(jié)果利用SeqScape V2. 5軟件進(jìn)行序列比對(duì)，確定HNA抗原系統(tǒng)的基因型，結(jié)果顯示了檢測(cè)樣本 HNA-I (圖 1)，HNA-2 (圖 2)，HNA-3 (圖 3)，HNA-4 (圖 4)，HNA-5 (圖 5)的部分序列。其中圖I為本發(fā)明中檢測(cè)標(biāo)本的HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜。I為HNA-I系統(tǒng)擴(kuò)增片段，2為HNA-2系統(tǒng)擴(kuò)增片段，3為HNA-3系統(tǒng)擴(kuò)增片段，4為HNA-4系統(tǒng)擴(kuò)增片段，5為HNA-5系統(tǒng)擴(kuò)增片段。圖2為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-I系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。141、147和227表示多態(tài)性堿基位置。檢測(cè)到HNA-I抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第141、147和227位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)HNA-la+b-c-，標(biāo)本2 (圖的中部)HNA-la+b+c-，標(biāo)本3 (圖的下部)HNA-la-b+c-為例。圖3為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-2系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。49表示多態(tài)性堿基位置。檢測(cè)到HNA-2抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第49位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)為HNA-2a+b-，標(biāo)本2 (圖的中部)HNA_2a+b+，標(biāo)本3 (圖的下部)HNA_2a_b+為例。圖4為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-3系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。306表示多態(tài)性堿基位置。檢測(cè)到HNA-3抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第306位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)HNA-3a+b-，標(biāo)本2 (圖的中部)HNA_3a+b+，標(biāo)本3 (圖的下部)HNA_3a_b+為例。圖5為本發(fā)明檢測(cè)I個(gè)樣本HNA-4系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。檢測(cè)到HNA-4抗原系統(tǒng)一個(gè)基因型，其中第141位為多態(tài)性堿基位置。以標(biāo)本HNA-4a+b-為例。圖6為本發(fā)明檢測(cè)3個(gè)樣本HNA-5系統(tǒng)的部分測(cè)序電泳圖譜。圖中A、G、C、T分別為測(cè)序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。2466表示多態(tài)性堿基位置。檢測(cè)到HNA-5抗原系統(tǒng)三個(gè)基因型，其中第2466位為多態(tài)性堿基位置，分別以標(biāo)本I (圖的上部)HNA-5a+b_,標(biāo)本2 (圖的中部)HNA_5a+b+,標(biāo)本3 (圖的下部)HNA_5a_b+為例。所以，本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，解決了 HNA基因的準(zhǔn)確分型鑒定問題，發(fā)揮PCR-SBT對(duì)HNA基因分型結(jié)果精確、高通量操作的特點(diǎn)，在臨床輸血醫(yī)學(xué)研究和遺傳學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用將受到高度重視，對(duì)于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的意義。特別是明確獻(xiàn)血人群粒細(xì)胞抗原系統(tǒng)分布情況，避免輸注含有粒細(xì)胞抗體的血液，以預(yù)防粒細(xì)胞抗體產(chǎn)生的輸血不良反應(yīng)，將有效預(yù)防 TRALI發(fā)生，從而提高血液的安全性。
權(quán)利要求
1.一種人類粒細(xì)胞抗原(ΗΝΑ)1-5系統(tǒng)基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于它對(duì)五個(gè)HNA抗原系統(tǒng)的基因進(jìn)行分型，所述五個(gè)HNA抗原系統(tǒng)分別為HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5，所述方法包括以下步驟 Cl)制備人基因組DNA ； (2)提供擴(kuò)增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴(kuò)增人基因組DNA中HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系統(tǒng)的基因序列； (3)將步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切純化； (4)提供測(cè)序引物，將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)； (5)將步驟(4)得到的測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序； (6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。
2.如權(quán)利要求I所述的一種人類粒細(xì)胞抗原(HNA)1-5系統(tǒng)基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟(2)中的擴(kuò)增引物為5對(duì)寡核苷酸分別擴(kuò)增ΗΝΑ-1、ΗΝΑ-2、ΗΝΑ-3、HNA-4和HNA-5抗原系統(tǒng)的基因序列 (OHNA-1抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-IF :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT GGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3，HNA-IR :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC TGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3， (2)HNA-2抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-2F :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT CTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT-3，HNA-2R :5，-CAGGAAACAGCTATGACC TAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3， (3)HNA-3抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-3F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT CTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3，HNA-3R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC CATGCCCATCCTCATAGGTC-3， (4)HNA-4抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-4F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT GTTCCCACTTCTCCCCACA-3’HNA-4R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC GGACAGATATGGGCATGGTC-3， (5)HNA-5抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-5F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGATATTCCCCACCCTGA-3’HNA-5R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC ACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3’ 所述步驟(4)中的測(cè)序引物為用于測(cè)序分析的2條寡核苷酸測(cè)序引物Ml3F :5 ’ -TGTAAAACGACGGCCAGT-3，M13R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC-3’。
3.如權(quán)利要求I所述的一種人類粒細(xì)胞抗原(ΗΝΑ)1-5系統(tǒng)基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟(3)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
4.一種人類粒細(xì)胞抗原(HNA) 1-5系統(tǒng)基因分型的PCR-SBT方法所用的試劑，其特征在于它由用于擴(kuò)增的引物和用于測(cè)序分析的寡核苷酸測(cè)序引物組成； 所述用于擴(kuò)增的引物為 (OHNA-1抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-IF :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT GGGCCAAGATGCTCTAAGAC-3，HNA-IR :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC TGGCTCTTACCAAGTATTTCAGG-3，(2)HNA-2抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-2F :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT CTGSTGAAAAAGCAGAAAGAGAT3，HNA-2R :5，-CAGGAAACAGCTATGACC TAGGCTGAGAGGCTGGAAAG-3，(3)HNA-3抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-3F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT CTTTTCCCCCTGTGAATGTG-3，HNA-3R:5’ -CAGGAAACAGCTATGACC CATGCCCATCCTCATAGGTC-3J(4)HNA-4抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-4F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT GTTCCCACTTCTCCCCACA-3’HNA-4R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC GGACAGATATGGGCATGGTC-3，(5)HNA-5抗原系統(tǒng)的基因序列的擴(kuò)增引物，HNA-5F :5’ -TGTAAAACGACGGCCAGT TCTGATATTCCCCACCCTGA-3’HNA-5R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC ACCCTAAGACCCCTGTCCAC-3’所述2條寡 核苷酸測(cè)序引物序列如下Ml3F :5 ’ -TGTAAAACGACGGCCAGT-3，M13R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACC-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種HNA1-5系統(tǒng)抗原分型的PCR-SBT方法，它包括以下步驟制備人基因組DNA；提供擴(kuò)增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴(kuò)增HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5抗原系統(tǒng)的基因序列；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切純化；提供測(cè)序引物，將純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)；將測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序；將獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。本發(fā)明還提供上述方法所用的試劑。本發(fā)明通過對(duì)HNA抗原5個(gè)系統(tǒng)分別進(jìn)行序列測(cè)序，獲得HNA抗原基因分型的寡核苷酸序列，精確地對(duì)其基因進(jìn)行定型。本發(fā)明對(duì)于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102827932SQ20121029752
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者朱發(fā)明, 何俊俊, 何吉, 呂杭軍 申請(qǐng)人:浙江省血液中心