專利名稱：利用人類白血球抗原(hla)篩檢預(yù)測(cè)藥物不良反應(yīng)的方法
利用人類白血球抗原(HLA)篩檢預(yù)測(cè)藥物不良反應(yīng)的方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)主張于2010年4月12日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/323，067的優(yōu)先權(quán)。在此通過(guò)整體引用該在先申請(qǐng)將其內(nèi)容結(jié)合到本申請(qǐng)中。
背景技術(shù)：
不良藥物反應(yīng)(ADR)仍為臨床上及制藥工業(yè)的主要問(wèn)題。在許多ADR類型中，以史蒂生-瓊森癥候群(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、中毒性表皮壞死溶解(TEN)及過(guò)敏癥候群(HSS)最嚴(yán)重且危及生命，其中，SJS及TEN有10-50%的死亡率。參看Roujeau等人，New Engl. J. Med. 333:1600-1607(1995)。盡管 SJS/TEN/HSS 的發(fā)病率低，但這些病狀可能會(huì)造成個(gè)死亡或?qū)е聡?yán)重殘疾。對(duì)于制藥工業(yè)而言，發(fā)生嚴(yán)重藥物過(guò)敏是非常不利的；目前有部分的新藥因?yàn)闀?huì)造成嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)，而招致藥品退市的命運(yùn)。參看畫(huà)· fda.gov/safety/recalls/default, htm。已發(fā)現(xiàn)某些I型人類白血球抗原(HLA)對(duì)偶基因(例如HLA-A及HLA-B對(duì)偶基因)及某些II型HLA對(duì)偶基因(例如HLA-DR對(duì)偶基因)與ADR有關(guān)。參看Hung等人，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102:4134-4139(2005) ;Daly 等人，Nat. Genet. 41:816-819 (2009)；Hautekeete, Gastroenterology 117 (5) : 1181-6 (1999) ^Dettling M, PharmacogenomicsJ. 7 (5) : 325-32 (2007)。所有這些ADR-HLA對(duì)偶基因的關(guān)聯(lián)性，是在測(cè)定罹患核準(zhǔn)上市藥物誘發(fā)ADR的患者后被發(fā)現(xiàn)。目前，尚沒(méi)有可用于預(yù)測(cè)開(kāi)發(fā)中的候選藥物是否會(huì)在人類中產(chǎn)生這些危及生命的病狀(諸如SJS/TEN/HSS)的方法。因?yàn)樾滤幬镩_(kāi)發(fā)可能平均耗費(fèi)10億元及10年時(shí)間，所以開(kāi)發(fā)適用于在藥物開(kāi)發(fā)早期階段預(yù)測(cè)候選藥物的安全性概況的篩選方法將具有重大價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及自HLA庫(kù)中鑒別出會(huì)與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物(若存在)的方法。此方法可依用于預(yù)測(cè)化合物是否將誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，且若誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，在哪一人類群體中誘發(fā)。本發(fā)明方法包括至少4個(gè)步驟⑴提供HLA庫(kù)(例如I型或II型HLA庫(kù))，其包括位于支撐構(gòu)件上的多個(gè)地址處的多種HLA復(fù)合物(例如可溶性HLA復(fù)合物)，各HLA復(fù)合物指定于一獨(dú)特地址，( )使化合物與HLA復(fù)合物接觸，(iii)判定該化合物是否會(huì)與庫(kù)中的HLA復(fù)合物結(jié)合，且，若結(jié)合，(iv)則基于HLA復(fù)合物的地址鑒別與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“獨(dú)特地址〃是指支撐構(gòu)件上一種且僅一種類型的HLA復(fù)合物所位于的點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，HLA庫(kù)為以微芯片為基礎(chǔ)的庫(kù)，其包括連接于支撐構(gòu)件的多種HLA復(fù)合物。在此情形中，判定步驟可通過(guò)表面等離子共振(SPR)來(lái)執(zhí)行。在另一實(shí)例中，HLA庫(kù)為以細(xì)胞為基礎(chǔ)的庫(kù)，其包括各自表達(dá)特定HLA復(fù)合物的多個(gè)細(xì)胞株。各細(xì)胞株可通過(guò)表達(dá)HLA復(fù)合物的親本細(xì)胞來(lái)制備，該親本細(xì)胞優(yōu)選地缺乏至少一種類型的HLA (例如I型HLA)。在此情形下，判定步驟可通過(guò)收集自各地址的HLA復(fù)合物，且通過(guò)質(zhì)譜法判定HLA復(fù)
4合物是否與化合物結(jié)合來(lái)執(zhí)行?；蛘?，化合物可經(jīng)同位素標(biāo)記且通過(guò)檢驗(yàn)各地址處的放射性來(lái)執(zhí)行判定步驟。以下說(shuō)明書(shū)中闡述本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其它特征或優(yōu)點(diǎn)將自以下附圖及實(shí)施方式、以及隨附權(quán)利要求書(shū)中顯而易知。


圖I為說(shuō)明獲得能夠與HLA-Β-β 2微球蛋白復(fù)合物結(jié)合的肽的方法的流程圖，其中該復(fù)合物是由穩(wěn)定表達(dá)可溶性HLA-B分子的ClR細(xì)胞中產(chǎn)生。圖2為說(shuō)明表面等離子共振檢定的流程圖。圖3為顯示在37°C過(guò)夜下未脈沖自體性B-LCL細(xì)胞(敞開(kāi)條)或以25 μ g/ml CBZ,0XC、GAB或媒劑對(duì)照脈沖的自體性B-LCL細(xì)胞(封閉框)的特異性溶解圖表。分析三名患者的資料以獲得平均值土SD。* p<0. 05 (未脈沖B-LCL細(xì)胞相對(duì)于經(jīng)脈沖B-LCL細(xì)胞)。** p<0. 001 (藥物處理組相對(duì)于媒劑處理組)。圖4顯示在固定(封閉條)及未固定(敞開(kāi)條)B-LCL存在下自體性T細(xì)胞增殖的圖表。通過(guò)習(xí)知[3H]胸苷摻入檢定測(cè)定T細(xì)胞增殖。* :p〈0.05(藥物處理組相對(duì)于媒劑處理組)。圖5為顯示各種濃度下的CBZ及其類似物(62. 5至1000 μ Μ)與涂布于CM5芯片上的可溶性HLA-B*1502結(jié)合的圖表。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DMSO溶劑校正曲線使用TlOO評(píng)估軟件自4至7個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算相對(duì)反應(yīng)(R. U.)。圖6為顯示CBZ及其類似物與各種HLA-B分子結(jié)合的圖表。圖表中顯示的數(shù)據(jù)表示4至11個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
具體實(shí)施例方式本文描述使用HLA庫(kù)篩選會(huì)與化合物(例如小分子藥物或藥物候選物)特異性相互作用的HLA復(fù)合物(若存在)的方法。此方法可用于評(píng)估化合物誘發(fā)不良藥物反應(yīng)的機(jī)率，并可用于鑒別會(huì)對(duì)測(cè)試化合物產(chǎn)生藥物過(guò)敏的高風(fēng)險(xiǎn)人類群體(亦即，帶有此方法中鑒別出的HLA復(fù)合物的人類群體)。因此，此在新藥物開(kāi)發(fā)中尤其重要，因?yàn)槠鋷椭A(yù)測(cè)藥物候選物是否可能引起不良藥物反應(yīng)，且若引起不良藥物反應(yīng)，會(huì)在哪一患者群體中引起。本發(fā)明方法中使用的HLA庫(kù)可為I型庫(kù)，其包括一個(gè)或多個(gè)HLA復(fù)合物子群(例如HLA B庫(kù))。HLA-B對(duì)偶基因?yàn)樽罹叨嘈涡缘幕蛑唬渚哂谐^(guò)800個(gè)變異體。參看Marsh, Marsh, Hum. Immunol. 71(4) :432_6;2010。必要時(shí)，HLA-B 庫(kù)可包括所有已知的 800種以上不同HLA-B復(fù)合物。HLA庫(kù)亦可為II型庫(kù)，其包括一個(gè)或多個(gè)II型HLA復(fù)合物子群(例如HLA-DR庫(kù))?；蛘撸琀LA庫(kù)可含有I型及II型HLA復(fù)合物兩者。必要時(shí)，任何上述庫(kù)均可擴(kuò)展以包括新HLA復(fù)合物。I型及II型HLA對(duì)偶基因是本領(lǐng)域公知的。舉例而言，這些對(duì)偶基因可自GenBank 或由 HUGO 基因命名委員會(huì)(HUGO Gene Nomenclature Committee)、EMBL 茵格斯頓分部(EMBL Outstation-Hinxton)、歐洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)、英國(guó)茵格斯頓劍橋 Wellcome Trust 基因體科學(xué)園 CBlO ISD (Wellcome TrustGenome Campus Hinxton Cambridge CBlO 1SD, UK)(參看http://www. genenames. org/)提供的數(shù)據(jù)庫(kù)擷取。本發(fā)明方法可使用以細(xì)胞為基礎(chǔ)或以微芯片為基礎(chǔ)的HLA庫(kù)執(zhí)行。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫(kù)以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫(kù)含有多個(gè)細(xì)胞株，其各自產(chǎn)生獨(dú)特的HLA復(fù)合物。各細(xì)胞株可經(jīng)由已知的重組技術(shù)，將親本細(xì)胞(優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞)進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)(a)I型HLAa鏈及視情況選用的β 2-微球蛋白(若親本細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源性β 2-微球蛋白)，或(b)II型HLAa鏈及II型HLAii鏈來(lái)制備。用于構(gòu)建庫(kù)的親本細(xì)胞優(yōu)選缺乏至少一種類型的HLA對(duì)偶基因，例如I型HLA、II型HLA或其子群。此種細(xì)胞株包括(但不限于)ATCCCRL-1933 (ClR)、ATCC CRL-2309 (KerTr)、ATCC CRL-1992 (T2)、ATCC CRL-2134 (LS513)、ATCC CRL-2158(LS1034)、ATCC CRL-2159 (LS411N)、ATCC CRL-2547 (Pane 10. 05)、ATCCCRL-255l(Panc 08. 13)、ATCC CRL-2553(Pane 02. 03)、ATCC CRL-2549(Pane 03. 27)、ATCCCRL-2554(Pane 02.13)、ATCC CRL-2555(Panc04. 03)及 ATCC CRL-2557(Pane 05.04)。在此清單中，前兩個(gè)細(xì)胞株缺乏I型HLA而其余細(xì)胞株缺乏II型HLA。可經(jīng)由例行程序來(lái)選擇可穩(wěn)定表達(dá)所欲HLA分子的經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？蛇x擇產(chǎn)生高含量I型HLA復(fù)合物(由I型HLA α鏈及β 2_微球蛋白構(gòu)成)或II型復(fù)合物(由II型HLAa鏈及II型HLAii鏈構(gòu)成)的穩(wěn)定細(xì)胞株作為以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫(kù)的成員。在一個(gè)實(shí)例中，所選細(xì)胞株表達(dá)全長(zhǎng)HLA分子。在另一實(shí)例中，其表達(dá)HLA分子的片段，包括其胞外域。該種細(xì)胞株產(chǎn)生可溶性HLA復(fù)合物。根據(jù)上文所述的程序，可構(gòu)建表達(dá)多種HLA復(fù)合物的細(xì)胞株，亦即每種細(xì)胞株可產(chǎn)生一種類型HLA復(fù)合物。多種HLA復(fù)合物可包括I型HLA(例如HLA-A、HLA-B, HLA-C,HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K, HLA-L 或其組合)、II 型 HLA(例如 HLA-DP、HLA-DQ, HLA-DR、HLA-DM、HLA-DO或其組合)。這些穩(wěn)定細(xì)胞株形成以細(xì)胞為基礎(chǔ)的HLA庫(kù)。各穩(wěn)定細(xì)胞株可安置于支撐構(gòu)件的孔(亦即獨(dú)特地址)中。為了執(zhí)行本文所述的篩選法，將各細(xì)胞株與測(cè)試化合物一起培養(yǎng)一適合時(shí)段。接著洗滌細(xì)胞以移除該化合物的游離分子，接著檢驗(yàn)并判定細(xì)胞所表達(dá)的HLA復(fù)合物是否與化合物結(jié)合。參看圖I。在一個(gè)實(shí)例中，化合物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記，且基于各孔相對(duì)于空白對(duì)照的放射性程度判定化合物與HLA復(fù)合物間的結(jié)合。若孔中的放射性程度大于空白對(duì)照，則表示彼孔中細(xì)胞產(chǎn)生的HLA復(fù)合物能夠與化合物結(jié)合。當(dāng)使用產(chǎn)生可溶性HLA復(fù)合物的細(xì)胞株時(shí)，可以下示方式判定其與測(cè)試化合物的結(jié)合。在細(xì)胞以測(cè)試化合物處理之后，收集各孔中的上清液且使用含有HLA特異性試劑(例如能夠結(jié)合于所有類型的I型或II型HLA的抗體)的親和力管柱純化可溶性HLA復(fù)合物。含有經(jīng)純化HLA復(fù)合物的樣品在適合溫度(例如70°C )下加熱10分鐘，以解離化合物(可連接于肽)與HLA復(fù)合物之間的結(jié)合。例如使用離心過(guò)濾器(3-1^^截?cái)?4111；[(3011Ultra-4, Millipore)收集含有低分子量組分(例如<3_kDa)的部分,且進(jìn)行液相層析聯(lián)合質(zhì)譜分析法以判定其是否含有測(cè)試化合物。已知抗原呈遞細(xì)胞(APC)對(duì)某些藥物(例如阿巴卡韋(abacavir)及青霉素(penicillin))的呈遞為加工依賴性(processing-dependent)的。亦即，在進(jìn)入細(xì)胞之后，這些化合物共價(jià)結(jié)合于載體蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)接著經(jīng)加工且由APC細(xì)胞呈遞。參看Schnyder 等人，J. Clin. Invest. 100:136—141 (1997)及 Naisbitt 等人，J. Allergy Clin.
6Immunol. 111:1393-1403(2003)。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的I型HLA庫(kù)尤其適用于篩選對(duì)HLA復(fù)合物具特異性的經(jīng)由加工依賴性路徑而由APC呈遞的化合物。以芯片為某礎(chǔ)的HLA庫(kù)以芯片為基礎(chǔ)的HLA庫(kù)可經(jīng)由常規(guī)的方法將各種HLA復(fù)合物(較佳含有HLA分子的胞外域)各自固定于微芯片的獨(dú)特點(diǎn)上來(lái)制備。參看例如Nature Reviews DrugDiscovery. 1:515-528(2002)。各種HLA復(fù)合物可自上文所述的穩(wěn)定細(xì)胞株獲得。為了篩選能夠與測(cè)試化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物，可在允許化合物與其同源(cognate)HLA復(fù)合物結(jié)合的條件下，將連接于微芯片的各種HLA復(fù)合物與化合物一起培育適合時(shí)段。接著洗滌芯片以移除未結(jié)合的化合物分子，接著進(jìn)行SPR量測(cè)以鑒別與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物。在發(fā)現(xiàn)HLA復(fù)合物與測(cè)試化合物結(jié)合之后，可基于其在芯片上的地址確定其身分。SPR為高產(chǎn)量、無(wú)標(biāo)記相互作用分析系統(tǒng)，且用于諸如藥物研發(fā)、抗體表征、蛋白質(zhì)組研究、免疫原性、生物治療劑開(kāi)發(fā)及制造、及許多生命科學(xué)研究應(yīng)用的領(lǐng)域。表面等離子共振(SPR)檢測(cè)緊鄰傳感器芯片的表面層的折射率的變化。共振角的此變化可以共振信號(hào)(與質(zhì)量變化成比例)相對(duì)于時(shí)間的曲線圖形式非侵入性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。參見(jiàn)圖2。使用以芯片為基礎(chǔ)的HLA庫(kù)可鑒別對(duì)經(jīng)由加工獨(dú)立性路徑由APC呈遞(亦即直接結(jié)合于HLA復(fù)合物)的化合物具特異性的HLA復(fù)合物(參看Wu等人，J. Allergy Clin.Tmmunol.118:233-241;2006 及 Marsh, Hum. Tmmunol. 71(4):432-6;2010)。若經(jīng)本發(fā)明方法鑒別，無(wú)HLA復(fù)合物與測(cè)試化合物結(jié)合的現(xiàn)象，則表明此化合物誘發(fā)ADR的機(jī)率較低。另一方面，若此方法中鑒別出測(cè)試化合物與HLA復(fù)合物的結(jié)合，則表明測(cè)試化合物誘發(fā)ADR的機(jī)率較高，且在表達(dá)該HLA復(fù)合物的人類中尤其如此。此項(xiàng)技術(shù)中已知某些HLA對(duì)偶基因在特定人類種族中出現(xiàn)的頻率比其它種族高。參看WWW. allelefrequencies. net?；诖酥R(shí),本發(fā)明方法獲得的結(jié)果可用于預(yù)測(cè)哪一種族將對(duì)特定藥物或藥物候選物敏感。這將關(guān)于臨床試驗(yàn)中患者的選擇及銷售決策方面引導(dǎo)藥物開(kāi)發(fā)。下表I列出高加索人(Caucasians)、亞洲人(Asians)及非裔美國(guó)人(AfricanAmericans)中的主要HLA-B對(duì)偶基因。表I.高加索人、亞洲人及非裔美國(guó)人中的主要HLA-B對(duì)偶基因
權(quán)利要求
1.一種鑒別會(huì)與化合物結(jié)合的HLA復(fù)合物的方法，其包括提供HLA庫(kù)，其包括位于支撐構(gòu)件上的多個(gè)地址處的多種HLA復(fù)合物，所述HLA復(fù)合物各自指定于一獨(dú)特地址；使化合物與所述HLA復(fù)合物接觸；判定該化合物是否與所述HLA復(fù)合物中的之一結(jié)合；及當(dāng)該化合物與一個(gè)HLA復(fù)合物結(jié)合時(shí)，基于該一個(gè)HLA復(fù)合物的地址鑒別與該化合物結(jié)合的該一個(gè)HLA復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述HLA復(fù)合物為I型HLA復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述I型HLA復(fù)合物為HLA-B復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述HLA復(fù)合物為II型HLA復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述II型HLA復(fù)合物為HLA-DR復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中該HLA-B庫(kù)為以微芯片為基礎(chǔ)的庫(kù)，其中該多種HLA復(fù)合物連接于該支撐構(gòu)件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述HLA復(fù)合物為其天然存在的對(duì)應(yīng)物的胞外域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中該判定步驟系通過(guò)表面等離子共振來(lái)執(zhí)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中該HLA庫(kù)為以細(xì)胞為基礎(chǔ)的庫(kù)，該庫(kù)包括多個(gè)表達(dá)該多種HLA復(fù)合物的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述HLA復(fù)合物為其天然存在的對(duì)應(yīng)物的胞外域。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該多個(gè)細(xì)胞各自通過(guò)在缺乏I型HLA的親本細(xì)胞中表達(dá)I型HLA復(fù)合物來(lái)制備。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該多個(gè)細(xì)胞各自通過(guò)在缺乏II型HLA的親本細(xì)胞中表達(dá)II型HLA復(fù)合物來(lái)制備。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該判定步驟通過(guò)自各地址收集該HLA復(fù)合物且通過(guò)質(zhì)譜法判定該HLA復(fù)合物是否結(jié)合于該化合物來(lái)執(zhí)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該化合物具放射性且該判定步驟通過(guò)檢驗(yàn)各地址處的放射性來(lái)執(zhí)行。
15.—種評(píng)估化合物于施用該化合物的個(gè)體中誘發(fā)不良藥物反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括提供HLA庫(kù)，其包括位于支撐構(gòu)件上的多個(gè)地址處的多種HLA復(fù)合物，所述HLA復(fù)合物各自指定于一獨(dú)特地址；使化合物與所述HLA復(fù)合物接觸；及判定該化合物是否與所述HLA復(fù)合物之一結(jié)合；其中當(dāng)該化合物與所述HLA復(fù)合物之一結(jié)合時(shí)，表示該化合物會(huì)于施用該化合物的個(gè)體中誘發(fā)不良藥物反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，當(dāng)該化合物與該一個(gè)HLA復(fù)合物結(jié)合時(shí)，其進(jìn)一步包括基于該一個(gè)HLA復(fù)合物的地址鑒別與該化合物結(jié)合的該一個(gè)HLA復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述HLA復(fù)合物為I型HLA復(fù)合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述I型HLA復(fù)合物為HLA-B復(fù)合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述HLA復(fù)合物為II型HLA復(fù)合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述II型HLA復(fù)合物為HLA-DR復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于自HLA庫(kù)鑒別出會(huì)與化合物特異性結(jié)合的HLA復(fù)合物的方法。此方法可用于評(píng)估化合物是否可能誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，且若誘發(fā)不良藥物反應(yīng)，在哪一人類群體中誘發(fā)。
文檔編號(hào)C40B40/10GK102918396SQ201180018181
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者陳垣崇, 洪舜郁, 魏淳郁 申請(qǐng)人:中央研究院