專利名稱：一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa2雜交后代基因型的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa2雜交后代基因型的引物及方法。
背景技術(shù)：
植酸是植物種子中磷主要的貯存形式，約占種子全磷量的65-85%左右。植酸通常與Zn2+、Ca2+、Fe3+等金屬陽(yáng)離子螯合成植酸鹽，并與蛋白進(jìn)一步形成球狀復(fù)合體，沉積在禾本科作物籽粒的糊粉層中。由于人和非反芻動(dòng)物(豬、雞、魚等)體內(nèi)不含植酸酶，難以消化利用攝入的植酸，極大降低了磷元素的生物有效性，同時(shí)植酸還影響微量元素、蛋白和淀粉的生物有效性，是一種典型的抗?fàn)I養(yǎng)因子。此外，一方面難以被利用的植酸隨動(dòng)物糞便排 泄到環(huán)境中，引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染；另一方面為了滿足動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，飼料中還需額外添加有機(jī)磷或骨粉等，提高了飼養(yǎng)成本。許多學(xué)者提出可用植酸酶降解植酸析出有效磷供動(dòng)物利用；也可將植酸酶基因轉(zhuǎn)入植物，使植酸酶在種子中得到表達(dá)，從而提高飼料中植酸磷的利用率。因此，降低作物籽粒中植酸的含量日益成為育種學(xué)家、營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和環(huán)境學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。運(yùn)用理化誘變和基因工程技術(shù)，創(chuàng)制種子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可從源頭上解決上述問(wèn)題。迄今，國(guó)內(nèi)外已從水稻、大豆、玉米、大麥、小麥等作物中獲得了一批LPA突變體，培育出了一些LPA作物新品種。大量的動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明，LPA作物極大地提高了磷的生物有效性，減少了環(huán)境中的磷污染，有效改善了動(dòng)物體內(nèi)微量營(yíng)養(yǎng)元素缺乏癥。但目前獲得LPA突變系的主要途徑是理化誘變和自然篩選，并且只能收獲作物成熟種子后才能通過(guò)微量測(cè)定方法檢測(cè)個(gè)體種子無(wú)機(jī)磷含量，初步篩選高無(wú)機(jī)磷品系，然后根據(jù)材料表型及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步通過(guò)鐵沉淀等方法測(cè)定植酸磷和全磷含量，選育周期較長(zhǎng)，成本高，且效率低。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，利用正向(圖位克隆)或反向遺傳學(xué)(RNAi，T-DNA插入突變)技術(shù)，已報(bào)道克隆了若干LPA基因(MIPS，MIK, MRP，2_PGK，IPK1)，不僅揭示了 LPA突變發(fā)生的分子機(jī)制，也為基于LPA相關(guān)基因核苷酸變異的引物在LPA作物新品種的選育方面奠定了理論基礎(chǔ)。如文獻(xiàn)(Kim, S. I.，Andaya, C. B.，Newman,J. W.，Goyal, S. S.，and Tai，T. H. 2008. Isolation and characterization of a lowphytic acid rice mutant reveals a mutation in the rice orthologue of maize MIK.Theoretical and Applied Genetics 117(8) :1291-1301.)公開的水稻材料 N15-186 中植酸含量下降則是由MIK基因的等位突變導(dǎo)致的(Shi，J. R.，Wang, H. Y.，Hazebroek, J.，Ertl，D.S.，and Harp，T.2005. The maize low-phytic acid 3encodes a myo-inositolkinase that plays a role in phytic acid biosynthesis in developing seeds. ThePlant Journal 42(5) :708-719 7 )，這為利用分子生物學(xué)技術(shù)選育LPA水稻新品種提供了一個(gè)新的方向。
水稻是我國(guó)及世界上最主要的糧食作物。作為稻米生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，我國(guó)也是鐵缺乏和缺鐵性貧血等微量元素缺乏癥發(fā)生較嚴(yán)重的國(guó)家之一，而降低水稻植酸含量可顯著提高Fe3+、Zn2+等微量元素的生物有效性。因此，若能獲得與目的基因共分離的分子標(biāo)記，有效快速鑒定含有目的基因的低植酸水稻材料，培育具有營(yíng)養(yǎng)與環(huán)保雙重功能的LPA水稻在我國(guó)就有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種引物，利用該引物可以方便地在苗期對(duì)水稻低植酸突變體zju-lpa2雜交后代的基因型進(jìn)行鑒定。一種引物，為引物ZHJ1、引物ZHJ2或它們的組合；其中，引物ZHJl的堿基序列為正向引物序列5’-TCCTTTAGTCTAGGACCGTTGG-3’ ；反向引物序列5’-AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’ 和 5，-ACCAGGGATGCCGTTGAG-3，；引物ZHJ2的堿基序列為正向引物序列5’-AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’和5， -ACCAGGGATGCCGTTGAG-3，；反向引物序列5’-AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’。突變體z ju_lpa2低植酸含量性狀受MIK等位突變基因ZJU-LPA2控制，它在序列L0C_0s03g52760的內(nèi)含子上插入了一個(gè)6. 2kb的反轉(zhuǎn)座子。據(jù)此，在TIGR V7. O網(wǎng)站(http //rice, plantbiology. msu. edu/)下載相應(yīng)的核苷酸序列，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用Primer Premier 5. O軟件在水稻低植酸基因ZJU-LPA2中的6. 2kb插入片段區(qū)域附近設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物ZHJl和ZHJ2，該引物的一條正向引物和反向引物是根據(jù)基因MIK的保守區(qū)域設(shè)計(jì)，而另一條正向引物或反向引物是根據(jù)基因ZJU-LPA2中插入的反轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)，因此引物具有較好的通用性和特異性。本發(fā)明還提供了一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa2雜交后代基因型的方法，包括(I)提取水稻樣品苗期葉片總DNA ；(2)以所述總DNA為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，染色后拍照成像；(3)根據(jù)成像結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型；當(dāng)利用引物ZHJl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果只出現(xiàn)350bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果只出現(xiàn)498bp特征帶，則該水稻樣品為不含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果同時(shí)出現(xiàn)350bp和498bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的雜合型材料；當(dāng)利用引物ZHJ2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果只出現(xiàn)754bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果只出現(xiàn)498bp特征帶，則該水稻樣品為不含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果同時(shí)出現(xiàn)754bp和498bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的雜合型材料；當(dāng)利用引物ZHJl和引物ZHJ2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果只出現(xiàn)350bp和754bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果只出現(xiàn)498bp特征帶，則該水稻樣品為不含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果同時(shí)出現(xiàn)350bp、754bp和498bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的雜合型材料；所述的低植酸基因ZJU-LPA2的堿基序列如SEQ ID NO. I所示。所述的水稻低植酸突變體zju_lpa2的制備已在文獻(xiàn)(Liu, Q. L. , Xu, X. H. , Ren,X. L. , Fu, H. ff. , ffu, D. X. , and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of lowphytic acid germplasm in rice(Oryza sativa L. ). Theoretical and Applied Genetics114(5) :803-814-)中公開，它是指控制水稻植酸含量的MIK基因突變?yōu)閆JU-LPA2基因而產(chǎn)生的LPA突變體；所述水稻突變體z ju-lpa2雜交后代是指親本為水稻突變體z ju_lpa2和MIK基因未突變的水稻品種的雜交后代。相比LPA突變基因ZJU-LPA2，所述MIK基因未突變的水稻品種是指正常植酸含量的水稻品種，如嘉禾218、日本晴、9311等。常用的植物總DNA提取方法為CTAB法。
植物的次生代謝物對(duì)核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎。植物材料最好是新鮮的。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μ L，其中，2XPCR Master Mix緩沖液10 μ L(含I. 5mM Mg2+，200 μ M dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、總 DNA I μ L、滅菌去離子水補(bǔ)至20 μ L0所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明有益效果為I、本發(fā)明所獲得的引物是依據(jù)zju_lpa2突變體與正常水稻品種在核苷酸序列上的差異設(shè)計(jì)合成的，因此不存在遺傳上的交換，也不需要表型的進(jìn)一步驗(yàn)證。2、利用本發(fā)明獲得的兩套引物可以對(duì)大量zju-lpa2雜交后代群體進(jìn)行篩選，從而準(zhǔn)確高效鑒定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA2的LPA水稻材料。3、通常LPA水稻材料的鑒定必須等到水稻種子成熟以后才能進(jìn)行，而利用和水稻低植酸基因ZJU-LPA2共分離的引物可在苗期對(duì)其葉片進(jìn)行檢測(cè)，可以大大提高LPA水稻品種的選擇效率，加快LPA水稻育種進(jìn)程。


圖I為用于低植酸突變基因ZJU-LPA2檢測(cè)的PCR引物設(shè)計(jì)策略，其中黑色方框代表基因編碼區(qū)，白色方框代表UTR，虛線代表內(nèi)含子，雙箭頭代表低植酸突變體zju-lpa2中6. 2kb的DNA片段插入，單箭頭代表引物位置。圖2為ZHJl引物對(duì)zju_lpa2X嘉禾218F2代單株的選擇效果。其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道為嘉禾218 ；2泳道為zju-lpa2 ;3_7泳道為不含ZJU-LPA2基因純合型的正常植酸含量單株；8-12泳道為ZJU-LPA2基因雜合型的正常植酸含量單株；13-17泳道為ZJU-LPA2基因純合型的低植酸單株。圖3為ZHJ2引物對(duì)zju_lpa2X嘉禾218F2代單株的選擇效果。其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道為嘉禾218 ；2泳道為zju-lpa2 ;3_7泳道為不含ZJU-LPA2基因純合型的正常植酸含量單株；8-12泳道為ZJU-LPA2基因雜合型的正常植酸含量單株；13-17泳道為ZJU-LPA2基因純合型的低植酸單株。圖4為ZHJ2引物在不同水稻品種材料中的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；I泳道為嘉禾218 ;2泳道為zju-lpa2 ;3為日本晴；4為9311 ;5為秀水110 ;6為明恢86 ；7為中9B。
具體實(shí)施例方式一、引物設(shè)計(jì)水稻低植酸突變體zju_lpa2由137Cs-Y射線誘變處理粳稻品種XSllO獲得，植酸含量下降64%，無(wú)機(jī)磷含量升高5. 6倍，遺傳分析和基因定位表明，水稻低植酸突變體zju-lpa2植酸含量由單隱性核基因控制，定位在水稻第3號(hào)染色體的短臂上(Liu, Q. L. , Xu, X. H. , Ren, X. L. , Fu, H. ff. , ffu, D. X. , and Shu, Q. Y. 2007. Generationand characterization of low phytic acid germplasm in rice (Oryza sativaL. ). Theoretical and Applied Genetics 114(5) :803-814.)。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明zju-lpa2低植酸含量性狀受MIK等位突變基因ZJU-LPA2控制，在內(nèi)含子上插入了一個(gè)6. 2kb 的反轉(zhuǎn)座子，在 TIGRV7. O (http:"rice, plantbiology. msu. edu/)下載相應(yīng)的核苷酸序列，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用Primer Premier 5. O (www. premierbiosoft. com)軟件在水稻低植酸基因ZJU-LPA2中的6. 2kb插入片段區(qū)域附近設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，并將新合成的引物命名為ZHJl和ZHJ2(圖I)，兩個(gè)引物的序列見表I。表I. ZJU-LPA2基因引物開發(fā)
權(quán)利要求
1.一種引物，其特征在于，為引物ZHJ1、引物ZHJ2或它們的組合；其中，引物ZHJl的堿基序列為 正向引物序列5’ -TCCTTTAGTCTAGGACCGITGG-3’ ； 反向引物序列5’ -AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’和 5’ -ACCAGGGATGCCGTTGAG-3’ ； 引物ZHJ2的堿基序列為 正向引物序列5’ -AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’和 5’ -ACCAGGGATGCCGTTGAG-3’ ； 反向引物序列5’ -AGCCGCTTCTTGGAGTGAT-3’。
2.一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa2雜交后代基因型的方法，包括 (1)提取水稻樣品苗期葉片總DNA； (2)以所述總DNA為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，染色后拍照成像； (3)根據(jù)成像結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型； 當(dāng)利用引物ZHJl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果只出現(xiàn)350bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果只出現(xiàn)498bp特征帶，則該水稻樣品為不含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果同時(shí)出現(xiàn)350bp和498bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的雜合型材料； 當(dāng)利用引物ZHJ2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果只出現(xiàn)754bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果只出現(xiàn)498bp特征帶，則該水稻樣品為不含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果同時(shí)出現(xiàn)754bp和498bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的雜合型材料； 當(dāng)利用引物ZHJl和引物ZHJ2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果只出現(xiàn)350bp和754bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果只出現(xiàn)498bp特征帶，則該水稻樣品為不含低植酸基因ZJU-LPA2的純合型材料，如果同時(shí)出現(xiàn)350bp、754bp和498bp特征帶，則該水稻樣品為含低植酸基因ZJU-LPA2的雜合型材料； 所述的低植酸基因ZJU-LPA2的堿基序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用CTAB法提取總DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20iiL，其中，2X PCR Master Mix緩沖液10 y L、10 y M正反向引物各0. 4 y L、總DNAl y L、無(wú)菌水補(bǔ)足至20 u L0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性 30s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa2雜交后代基因型的引物及方法，所述引物為引物ZHJ1、引物ZHJ2或它們的組合，所述方法包括(1)提取水稻樣品苗期葉片總DNA；(2)以所述總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，染色后成像；(3)根據(jù)電泳結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型。本發(fā)明利用和水稻低植酸基因ZJU-LPA2共分離的引物可在苗期對(duì)其葉片進(jìn)行檢測(cè)，可以大大提高LPA水稻品種的選擇效率，加快LPA水稻育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102808029SQ20121029752
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者舒慶堯, 趙海軍, 徐秀紅 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)