專利名稱：一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交后代基因型的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交后代基因型的引物及方法。
背景技術(shù)：
植酸，即肌醇-六磷酸，是禾谷類種子中含磷最豐富的化合物，占到種子干重的I %以上，占種子全磷量的75. O ± 10 %。植酸通常與Zn2+、Ca2+、Fe3+等金屬陽離子 螯合成植酸鹽，并與蛋白進(jìn)ー步形成球狀復(fù)合體，沉積在禾本科作物籽粒的糊粉層中。由于人和非反芻動物(豬、雞、魚等)體內(nèi)不含植酸酶，食物中的植酸難以被消化利用，即降低了磷元素的有效吸收，也影響微量元素、蛋白質(zhì)和淀粉的生物有效性。因此，植酸是ー種典型的抗?fàn)I養(yǎng)因子。此外，植酸隨動物糞便排泄到環(huán)境中，極易引起水體富營養(yǎng)化，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，特別是在飼養(yǎng)業(yè)發(fā)達(dá)的國家尤為嚴(yán)重；另ー方面為了滿足動物生長發(fā)育的需要，飼料中往往要額外添加有機(jī)磷或骨粉等，提高了飼養(yǎng)成本。因此，降低作物種子中植酸的含量日益成為育種學(xué)家、營養(yǎng)學(xué)家和環(huán)境學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。運(yùn)用理化誘變和基因工程技木，創(chuàng)制種子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可從源頭上解決上述問題。迄今，國內(nèi)外學(xué)者已從水稻、大豆、玉米、大麥、小麥等作物中獲得了ー批LPA突變體，培育出了ー些LPA作物新品種，如在大麥中已育成和推廣了 2個LPA新品種‘Herald’和‘Clearwater’。臨床和動物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),人對食物中的Zn2+的吸收與LPA玉米籽粒中植酸鹽下降的程度成正比；LPA大麥或玉米作為飼料，不但Fe3+和Zn2+的有效性增加，而且可以提高大麥和玉米用做飼料時動物對磷的利用，從而減少動物糞便造成的磷污染。目前獲得LPA突變系的主要途徑是理化誘變和自然篩選，并且只能收獲作物成熟種子后才能通過微量測定方法檢測個體種子無機(jī)磷含量，初步篩選高無機(jī)磷品系，然后根據(jù)材料表型及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)ー步通過鐵沉淀等方法測定植酸磷和全磷含量，選育周期較長，成本高，且效率低。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，利用正向(圖位克隆)或反向遺傳學(xué)(RNAi，T-DNA插入突變)技術(shù)，已報道克隆了若干LPA基因(MIPS，MIK, MRP，2_PGK，IPK1)，不僅掲示了 LPA突變發(fā)生的分子機(jī)制，也為基于LPA相關(guān)基因核苷酸變異的引物在LPA作物新品種的選育方面奠定了理論基礎(chǔ)。因此，充分利用已有的LPA基因資源選育LPA水稻新品種是今后水稻功能性成份育種的ー個重要組成部分。水稻是我國及世界上三大糧食作物之一。作為稻米生產(chǎn)和消費(fèi)的大國，我國也是鐵缺乏和缺鐵性貧血等微量元素缺乏癥發(fā)生較嚴(yán)重的國家之一，而降低水稻植酸含量可顯著提高Fe3+、Zn2+等微量元素的生物有效性。因此，若能獲得與目的基因共分離的基因功能性引物，有效快速鑒定含有目的基因的LPA水稻種質(zhì)資源，培育具有營養(yǎng)與環(huán)保雙重功能的LPA水稻在我國就有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了ー種引物，利用該引物可以方便地鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交后代的基因型。ー種引物，正向引物為ZW3F和ZW4F，反向引物為ZW3R ；ZW3F:5’ -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3’ZW4F:5，-GGTTCCCACTCGGTATGCG-3，；ZW3R 5，-ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3，。水稻低植酸突變體zju_lpa3低植酸含量性狀受2_PGK(L0C 0s02g57400)等位突變基因ZJU-LPA3控制，基因組外顯子和內(nèi)含子上缺失了ー個1475bp大片段。據(jù)此，在TIGRV7. O網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu. edu/)下載對應(yīng)的核苷酸序列，并對序列進(jìn)行·比對分析，利用Primer Premier 5. O軟件在水稻低植酸基因ZJU-LPA3突變體缺失片段區(qū)域附近設(shè)計(jì)相應(yīng)的弓I物ZHJ3，引物ZHJ3的反向引物和一個正向引物根據(jù)基因2-PGK的保守區(qū)域設(shè)計(jì)，另外一個正向引物是根據(jù)基因ZJU-LPA3缺失片段區(qū)域設(shè)計(jì)，具有較好的通用性和特異性。本發(fā)明還提供了一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交后代基因型的方法，包括如下步驟(I)提取水稻樣品苗期葉片的總DNA ；(2)以所述總DNA為模板，利用所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離、染色后拍照成像；(3)根據(jù)成像結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型；若只出現(xiàn)390bp特征帯，則該水稻樣品為不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若只出現(xiàn)746bp特征帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若同時出現(xiàn)390和746bp特征帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的雜合型材料；所述水稻低植酸基因ZJU-LPA3的堿基序列如SEQ ID NO. I所示。所述水稻低植酸突變體zju_lpa3的制備已在文獻(xiàn)(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren,X. L. , Fu, H. ff. , ffu, D. X. , and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of lowphytic acid germplasm in rice(Oryza sativa L. ). Theoretical and Applied Genetics114(5) :803-814)中公開，它是指2-PGK基因的核苷酸序列突變成與基因ZJU-LPA3的核苷酸序列相同。而所述水稻低植酸突變體zju-lpa3的雜交后代指水稻低植酸突變體zju-lpa3與2-PGK基因未突變的水稻品種雜交培育的后代，所述2-PGK基因未突變的水稻品種可以是嘉禾218、日本睛、9311、嘉興08-1等。常用的植物總DNA提取方法為CTAB法。植物的次生代謝物對核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎。植物材料最好是新鮮的。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μ L，其中，2 XPCR Master Mix緩沖液10 μ L(含
I.5mM Mg2\200yM dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、總 DNAl μ L、滅菌去離子水補(bǔ)至20 μ L0
所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。對于瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度通常在O. 5 2. 0%之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進(jìn)行小片段核酸的電泳。本發(fā)明中采用的凝膠濃度為1.0%。因所述的390bp和746bp片段大小差異較大，I. 0%的凝膠濃度已足夠?qū)⒍叻珠_，同時也節(jié)省了材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明有益效果為I、本發(fā)明所獲得的引物是依據(jù)zju_lpa3突變體與正常水稻品種在核苷酸序列上的差異設(shè)計(jì)合成的，因此不存在遺傳上的交換，也不需要表型的進(jìn)ー步驗(yàn)證。2、利用本發(fā)明獲得的引物可以對大量zju-lpa3雜交后代群體進(jìn)行篩選，從而準(zhǔn)確高效鑒定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的LPA水稻材料。 3、通常LPA水稻材料的鑒定必須等到水稻種子成熟以后才能進(jìn)行，而利用和水稻低植酸基因ZJU-LPA3共分離的引物可在苗期對其葉片進(jìn)行檢測，可大大提高LPA水稻品種的選擇效率，加快LPA水稻育種進(jìn)程。


圖I為用于水稻低植酸基因ZJU-LPA3檢測的PCR引物設(shè)計(jì)策略，其中黑色方框代表蛋白編碼區(qū)，白色方框代表UTR，折線代表內(nèi)含子，箭頭代表引物位置。圖2為引物ZHJ3對嘉興08-lXzju-lpa3F2代單株的選擇效果。其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道為嘉興08-1 ；2泳道為zju-lpa3 ；3泳道為嘉興OS-IXzju-IpaSF1代；4、
6、7、14、18泳道為不含ZJU-LPA3基因純合型的正常植酸含量單株；5、8、9、10、11、13、15泳道為ZJU-LPA3基因雜合型的正常植酸含量單株；12、16、17泳道為ZJU-LPA3基因純合型的低植酸單株。圖3為引物ZHJ3在不同水稻品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；
I泳道為嘉興08-1 ；2泳道為日本睛；3泳道為9311 ；4泳道為嘉禾218 ；5泳道為秀水110。
具體實(shí)施例方式一、引物設(shè)計(jì)水稻低植酸突變體zju_lpa3由6ciCo- Y射線誘變處理秈稻品種協(xié)青早B獲得，植酸含量下降46%，無機(jī)磷含量升高6. 4倍(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren, X. L.，F(xiàn)u, H. ff.，Wu, D. X.，and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of low phytic acidgermplasm in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 114(5)803-814)，遺傳分析和基因定位表明，水稻低植酸突變體zju-lpa3植酸含量由單隱性核基因控制，定位在水稻第2號染色體的長臂上，進(jìn)ー步的研究結(jié)果表明z ju_lpa3低植酸含量性狀受2-PGK等位突變基因ZJU-LPA3控制，在基因組序列上缺失了ー個1475bp的大片段，在TIGR V7. O (http://rice. plantbiology. msu. edu/)下載相應(yīng)的核苷酸序列，并對序列進(jìn)行比對分析。利用Primer Premier 5. O (www. premierbiosoft. com)軟件在水稻低植酸基因ZJU-LPA3缺失片段保守區(qū)域附近設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，并將新合成的標(biāo)記命名為ZHJ3(圖I)，其引物序列如下
正向引物序列ZW3F為 5 ’ -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3 ’和ZW4F 為 5，-GGTTCCCACTCGGTATGCG-3，；反向引物序列ZW3R為 5，-ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3，。引物結(jié)合部位在基因的保守區(qū)域，水稻序列數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明該引物具有較好特異性，在采用不同水稻品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，可見均能檢測出特異性的目標(biāo)條帶(圖3)。ニ、DNA提取及PCR檢測利用上述引物可以對水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交后代的基因型進(jìn)行鑒定，具體方法為(I)總DNA的提取
采用CTAB法提取水稻樣品苗期嫩葉的總DNA，具體操作方法如下將葉片剪碎后置于2. OmL離心管中，加入800μ L CTAB提取緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8. 0、20mM EDTApH8. 0、500mM NaCl,2% CTAB)，用組織碾磨儀磨碎，65°C水浴40min，期間搖動3-4次，加入等體積的氯仿異戊醇(24 :1，v/v)混合液，上下顛倒混勻，10000r/min離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至新的I. 5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷(_20°C )的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置-20°C下沉淀30min ；10000r/min離心IOmin,棄上清液,70%こ醇洗漆2次，自然風(fēng)干,溶于適量(100-200 μ L)TE 溶液中，_20°C保存。(2)對總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測PCR 反應(yīng)體系為 20 μ L，其中，2 XPCR Master Mix 緩沖液 10 μ L (含 I. 5mM Mg2+、200 μ M dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、50ng/μ L 總 DNA I μ L、滅菌去離子水補(bǔ)至20 μ L0PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，57°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化こ錠染色后拍照成像。(3)判斷是否含有目標(biāo)基因采用引物ZHJ3擴(kuò)增時，若只能擴(kuò)出390bp特征帯，則該樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若只能擴(kuò)出746bp特征帶，則該樣品為不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若能同時擴(kuò)出390和746bp特征帶，則該樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的雜合型材料。三、引物ZHJ3對基因型ZJU-LPA3雜交后代的選擇效果利用設(shè)計(jì)合成引物ZHJ3，對含Z JU-LPA3基因純合型材料z ju_lpa3和不含ZJU-LPA3基因純合型材料嘉興08-1的F2代在苗期進(jìn)行PCR基因型檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，將材料分為3種基因型具有390bp特征帶的材料，具有746bp特征帶的材料和兩者兼具的材料。收獲匕植株上的F2 : 3種子，利用化學(xué)分析法及離子交換色譜法檢測每個單株的植酸含量，結(jié)果表明，所有具有390bp特征帶的單株均是低植酸含量單株，而具有746bp特征帶和二者兼具的材料均為植酸含量正常的單株。因此，引物ZHJ3為共顯性的基因功能性標(biāo)記，檢測結(jié)果與預(yù)期完全相符，標(biāo)記選擇效率達(dá)到100%。
權(quán)利要求
1.一種引物，其特征在于，正向引物為ZW3F和ZW4F，反向引物為ZW3R ；ZW3F :5’ -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3’ZW4F :5’ -GGTTCCCACTCGGTATGCG-3’ ；ZW3R :5’ -ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3’。
2.一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交后代基因型的方法，包括如下步驟 (1)提取水稻樣品苗期葉片的總DNA； (2)以所述總DNA為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離、染色后拍照成像； (3)根據(jù)成像結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型； 若只出現(xiàn)390bp特征帶，則該水稻樣品為不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若只出現(xiàn)746bp特征帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若同時出現(xiàn)390和746bp特征帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的雜合型材料； 所述水稻低植酸基因ZJU-LPA3的堿基序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用CTAB法提取總DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μ L，其中，2 X PCR Master Mix緩沖液10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 4 μ L、總DNA I μ L、滅菌去離子水補(bǔ)至20 μ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性 30s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交后代基因型的引物及方法，該引物堿基序列如SEQ ID NO.2～4所示，該方法包括(1)提取水稻樣品苗期葉片總DNA；(2)以所述總DNA為模板，利用所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離、染色后拍照成像；(3)根據(jù)成像結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型；本發(fā)明公開的引物為基因功能性引物，因此，不存在遺傳上的交換，也不需要表型的進(jìn)一步驗(yàn)證；可以對大量zju-lpa3雜交后代群體進(jìn)行篩選，并且可在苗期對其葉片進(jìn)行檢測，從而準(zhǔn)確高效鑒定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的LPA水稻材料，加快LPA水稻育種進(jìn)程。
文檔編號C12Q1/68GK102808028SQ201210297318
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者舒慶堯, 趙海軍, 譚瑗瑗, 劉慶龍 申請人:浙江大學(xué)