專利名稱：一個番茄果實成熟基因SlNAC3及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，具體是從番茄{SolmutnIycopersicum )中獲得一個新的果實成熟基因57傾61 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物轉(zhuǎn)錄因子的研究是功能基因組學(xué)研究中的一個重要內(nèi)容。在植物特異蛋白中，轉(zhuǎn)錄因子占到 13% (Bapat VA, Trivedi PK, Ghosh A, Sane VA, Ganapathi TR,Nath P. Ripening of fleshy fruit: Molecular insight and the role of ethylene.Biotechnol Adv, 2010, 28: 94 - 107)。植物轉(zhuǎn)錄因子主要分為 MYB、bZIP (basic-domain
leucine-zipper)、WRKY、DREB (dehydration responsive element binding protein)、NAC等。其中，NAC轉(zhuǎn)錄因子是近年來新發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)功能的特異轉(zhuǎn)錄因子(冶曉芳，唐益苗，高世慶，楊穎，劉美英，王永波，趙昌平.植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報，2009，10:20-25)。其命名是基于最初發(fā)現(xiàn)的該家族的幾個基因NAM (NO APICALMERISTEM)、ATAF1-2、CUC2 (CUP-SHAPED COTYLEDON) (Gutierrez RA, Green PJ, KeegstraK, Ohlrogge JB. Phylogenetic profiling of the Arabidopsis thaliana proteome:what proteins distinguish plants from other organismsGenome Bio, 2004, 5:53)首字母的縮寫。目前，在擬南芥基因組中已發(fā)現(xiàn)了 109個NAC轉(zhuǎn)錄因子(Yamasaki K，Kigawa T, Inoue M, Watanabe S， Tateno M, Seki M, Shinozaki K， Yokoyama S.Structures and evolutionary origins of plant-specific transcription factorDNA-binding domains. Plant Physiology and Biochemistry, 2008, 46:394-401),水稻中發(fā)現(xiàn)了 75個NAC轉(zhuǎn)錄因子，在其他植物如小麥、大豆、玉米、油菜、棉花、甘蔗等中都相繼發(fā)現(xiàn)了 NAC轉(zhuǎn)錄因子。NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答、生長素傳導(dǎo)葉片凋亡等中都起著重要的作用(冶曉芳，唐益苗，高世慶，楊穎，劉美英，王永波，趙昌平.植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報，2009，10:20-25)。除此之外，NAC基因在次生壁加厚和維管組織的形成中也發(fā)揮重要作用。NSTl (NAC Secondary WallThickening Promoting Factors)和NST2在花藥開裂中有功能冗余性,這兩者的突變體都會導(dǎo)致花藥內(nèi)壁的次生壁無法正常加厚(Pirrello J, Regad F，Latche A, Pech JC,Bouzayen M. Regulation of tomato fruit ripening. CAB Reviews, 2009, 4:051)。NAC家族成員一NON RIPENING (NOR)突變后，番茄果實不能正常成熟(Matas AJ，GapperNE, Chung MY, Giovannoni JJ, Rose JK. Biology and genetic engineering of fruitmaturation for enhanced quality and shelf-life. Curr Opin Biotechnol, 2009,20:197-203)，顯示轉(zhuǎn)錄因子NAC在調(diào)控漿果類果實的成熟過程中也有重要功能。番茄等漿果類蔬菜在儲藏、運輸和銷售的過程中，很容易軟化腐爛，給商業(yè)生產(chǎn)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此通過育種的方式控制其成熟度和硬度是目前蔬菜生產(chǎn)中亟待解決的問題。與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢。主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)體系的建立使可利用的基因資源大大拓寬；轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗，適應(yīng)各種不良環(huán)境條件的優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑；另外，利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可以對植物的目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇，同時隨著對基因認(rèn)識的不斷深入和轉(zhuǎn)基因手段的完善，對多個基因進(jìn)行定向操作也將成為可能，這在常規(guī)育種中是難以想象的；除此之外，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以大大提高選擇育種效率，加快育種進(jìn)程，顯示了常規(guī)育種無可比擬的優(yōu)勢。番茄是研究漿果類果實的一種模式植物。本發(fā)明就是利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，從番茄野生型Ailsa Craig中克隆得到一個新的NAC成員一幻干涉S1NAC3的轉(zhuǎn)基因番茄顯示果實成熟進(jìn)程變慢，通過合理利用這種轉(zhuǎn)基因材料可以調(diào)節(jié)番茄的上市時間，為生產(chǎn)服務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種番茄果實成熟基因S1NAC3,其具有如SEQ ID NO. I所示核昔酸序列或編碼如SEQ ID NO. 2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；其具有典型的NAC家族保守結(jié)構(gòu)域，編碼NAC蛋白。本發(fā)明另一目的是將番茄果實成熟基因幻傾0應(yīng)用在控制番茄以及其他呼吸躍變型果實(呼吸躍變型果實是指某些肉質(zhì)果實從生長停止到開始進(jìn)入衰老之間的時期，其呼吸速率的突然升高，例如蘋果、香蕉、番茄、鱷梨、芒果等)成熟進(jìn)程中；具體是將基因S1NAC3構(gòu)建到植物表達(dá)載體上并導(dǎo)入番茄中表達(dá)，對分別獲得的S1NAC3超量和干涉轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行果實成熟相關(guān)生理生化和分子生物學(xué)檢測，確認(rèn)幻傾0可以改變番茄果實的成熟進(jìn)程，為后期利用該基因改良番茄以及其他呼吸躍變型果實成熟進(jìn)程的能力奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明分別分離克隆番茄Ailsa Craig中攜帶的一個番茄果實成熟基因的完整cDNA片段和C-端特異性末端序列片段，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中并分別超量表達(dá)和干涉表達(dá)，進(jìn)而通過實驗驗證該基因在番茄果實成熟過程中所起的作用，為后期利用該基因改良番茄以及其他呼吸躍變型果實成熟進(jìn)程的能力奠定基礎(chǔ)。對S1NAC3基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明S1NAC3全長cDNA為1318bp，具有990bp的開放閱讀框(ORF)，201bp的5’非翻譯區(qū)和390bp的3’非翻譯區(qū)，編碼含有329個氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)預(yù)測大小為37KD，其N端序列包括160個氨基酸，位于16-176位氨基酸。57傾61 編碼蛋白具有NAC家族的保守結(jié)構(gòu)域,與來自蘋果(Malus domestica)、紙iPrunuspersica)和香瓜{Cucumis meIo)以及其他物種的NAC蛋白高度相似,分析顯示該序列N端有5個保守的NAC結(jié)構(gòu)域。干涉表達(dá)幻傾C-端特異性末端可以顯著延遲番茄果實成熟的進(jìn)程。上述基因可以用于控制番茄和其他呼吸躍變型果實的成熟進(jìn)程，具體操作如下
(I)基因的獲得以番茄野生型Ailsa Craig為材料，提取果皮的總RNA，利用RT-PCR
分別擴(kuò)增得到幻似0 3’端特異性末端和全長基因序列，然后分別將其連接到PMD-18T載體上，經(jīng)測序獲得具有目的基因的克隆。(2)植物表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化
對序列進(jìn)行酶切位點分析后，用I和通o I對帶有目的基因全長片段的克隆載體和表達(dá)載體PBI121雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建超量表達(dá)載體；利用SlNAC3-a和SlNAC3_b —對弓I物擴(kuò)增S1NAC3基因的3’端特異性末端，PCR產(chǎn)物回收后通過BP反應(yīng)，連接pHeIlsgate2載體，構(gòu)建干涉表達(dá)載體。提取重組表達(dá)載體菌液的質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化番茄植株，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗生素(卡那霉素)篩選和RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行后續(xù)分析，以野生型和轉(zhuǎn)化空載體的植株作為對照。(3)轉(zhuǎn)基因番茄果實成熟特性分析將生長健壯的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株(非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，分別種植于花盆中。記錄其果實達(dá)到成熟的時間，檢測果實成熟相關(guān)指標(biāo)(包括果實呼吸速率、果實乙烯釋放速率和果實硬度等)，從而驗證幻傾0干涉轉(zhuǎn)基因番茄的果實成熟顯著延遲。本發(fā)明為控制番茄果實成熟進(jìn)程提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育轉(zhuǎn)基因植物能克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期短，而且操作簡單。將幻傾^基因在番茄中干涉表達(dá)，能夠顯著延緩果實成熟的進(jìn)程，從而可以人為控制果實上市時間，并且不改變果實的口感特征，相比用人工激素處理果實更加綠色環(huán)保，效果也更加穩(wěn)定，因而具有明顯的優(yōu)勢和不可取代的重要性。它可以為呼吸躍變型果實大規(guī)模生產(chǎn)提供方便，可以合理調(diào)控果實上市時間，大量減少因果實過熟腐爛造成的損失，可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本且提高管理水平，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應(yīng)用前景。


圖I是本發(fā)明幻傾0全長片段(A)和3’端特異性片段(B)擴(kuò)增結(jié)果示意圖，其中M 是 marker ；
圖2是本發(fā)明采用NPTII引物檢測部分陽性轉(zhuǎn)基因單株的電泳結(jié)果；其中M是Marker ;CK’是以非轉(zhuǎn)基因的Ailsa Craig為模板的PCR產(chǎn)物；CK是以陽性質(zhì)粒PMD-18T-S1NAC3為模板的PCR產(chǎn)物；1_8是轉(zhuǎn)基因植株。圖3是本發(fā)明超量表達(dá)(S1NAC3°e)和干涉表達(dá)(SlNAC3KMi)轉(zhuǎn)基因番茄果實達(dá)到不同成熟時期(綠熟期MG，破色期Br，黃熟期Or，紅熟期R)所需要的時間(開花后天數(shù))比較結(jié)果示意圖；其中WT為對照Ailsa Craig。圖4是本發(fā)明超量表達(dá)(S1NAC3°e)和干涉表達(dá)(SlNAC3KMi)轉(zhuǎn)基因番茄果實不同成熟時期(綠熟期MG，破色期Br，黃熟期Or，紅熟期R)果實呼吸速率比較結(jié)果示意圖；其中WT 為對照 Ailsa Craig0圖5是本發(fā)明超量表達(dá)(S1NAC3°e)和干涉表達(dá)(SlNAC3KMi)轉(zhuǎn)基因番茄果實不同成熟時期(綠熟期MG，破色期Br，黃熟期0r，紅熟期R)果實乙烯釋放速率比較結(jié)果示意圖；其中WT為對照Ailsa Craig。圖6是本發(fā)明超量表達(dá)(S1NAC3°e)和干涉表達(dá)(SlNAC3KMi)轉(zhuǎn)基因番茄果實不同成熟時期(綠熟期MG，破色期Br，黃熟期0r，紅熟期R)果實硬度比較結(jié)果示意圖；其中WT為對照 Ailsa Craig0
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容；本發(fā)明中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例I 'S1NAC3全長基因和3’端特異性片段的克隆
用液氮將番茄Ailsa Craig紅熟期果實的果皮研磨成粉末以后，轉(zhuǎn)入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (天根)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過程為取5 u g總RNA，依次加入50 ng oligo(dT) 15，2 u L dNTP(2. 5mM each)，最后添加ddH20 (無RNA酶)至反應(yīng)體積為13. 5 U L ;混勻后，70°C加熱變性5min后迅速在冰上冷卻5min,然后依次加入4 u L 5 XFirst-stand buffer、0. 5 u L RNA酶抑制劑(200U)、1 UL反轉(zhuǎn)錄酶(200U)、1 UL二巰基蘇糖醇(0. 1M)，混勻并短時離心，42°C溫浴I. 5h，取出后95°C加熱5min，終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置于_20°C保存?zhèn)溆?。以合成的第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增S1NAC3全長基因(引物序列為5’ -CTCACAGCACACACACCAITTCTCT-3’ 和 5’ -CCAAATCCAGCAATCCCACTAATCT-3’)。采用大連
寶生物的高保真DNA聚合酶ex taq擴(kuò)增出目的基因，PCR反應(yīng)條件94°C 3min ；94°C 45s，60°C 45s, 72°C I. 5min, 28cycles ；72°C 5 min。反應(yīng)體系(20 y L)為 I u L cDNA、2 u L10XBuffer、0. 4 u L dNTP (IOmM each) ,0. I u L 正向引物(2O y M)、0. I u L 反向引物(20 u M) >0. 2 u L ex Taq DNA polymerase (5U/ U L) > 16. 2 U L ddH20。PCR 結(jié)束后，取 5U L用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增到目的大小的片段(如圖I所示)。將PCR得到的全長幻制0片段進(jìn)行TA克隆，使用的試劑盒為pMD-18T vector kit(大連寶生物)，反應(yīng)體系和操作過程為取I. 5 UL PCR產(chǎn)物，依次加入I y L pMD18-Tvector (50ng/ u L)和 2. 5 u L 2XLigation solution I，混勻置于 16°C過夜反應(yīng)。采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a中。在涂于含有￠-半乳糖苷酶(X-Gal)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選若干個白色菌落，搖菌后用擴(kuò)增幻傾^的特異引物鑒定插入方向正確的克隆載體。對于PCR得到的3’端特異性片段，設(shè)計S1NAC3 3’UTR片段引物，直接在引物的前面加上 attB 位點(引物序列為 5’ -AAAAAGCAGGCT-(CGCTCTAGAACTAGTGGATC)-3’ 和 5’ -AGAAAGCTGGGT-(GTAAAACGACGGCCAGT) -3’)。反應(yīng)條件如下94°C 2min ；94°C 15S; 70°C 30s,68°C 2min, 30 cycles ；68°C 5min。然后以此 PCR 產(chǎn)物為模板,利用 attB-adapter 上下游引物(引物序列為 5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3 和 5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’)進(jìn)行第二次 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件如下94°C 2min ；94°C 15S; 66°C 30s,68°C2min，30 cycles ；68°C 7min。在PCR體系中添加IU的Taq聚合酶，72°C孵育8min，得到具有3’poly (A)的產(chǎn)物。用瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，純化回收。實施例2 :植物表達(dá)載體構(gòu)建
超量表達(dá)載體構(gòu)建采用堿裂解法分別提取實施例I得到的克隆載體以及植物表達(dá)載體PBI121的質(zhì)粒，取I y L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質(zhì)粒的完整性和濃度高低。用BamHl (Fermentas)和I (Fermentas)分別對質(zhì)粒 pMD_18T_SlNAC3 和 pBI 121 進(jìn)行雙酶切(100 u L體系)，反應(yīng)體系和操作過程為取10 uL pMD-18T- S1NAC3或pBI121質(zhì)粒、依次加入 10 u L IOXTango buffer,2 u L XbaI,2 u L Sail,76 u L ddH20，混勻后短時離心，置于37°C過夜反應(yīng)。將所有酶切產(chǎn)物點于瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后對幻傾^片段和pBI121大片段分別進(jìn)行膠回收，整個過程使用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)。具體操作流程為切下含有目的DNA條帶的瓊脂糖凝膠塊置于I. 5 mL離心管中，按400 u L/100 mg瓊脂糖凝膠的比例加入Binding Buffer II,置于60°C水浴IOmin,使膠徹底融化；將融化的凝膠溶液轉(zhuǎn)移至2 mL收集管內(nèi)的UNIQ-IO柱中，室溫放置2min后離心Imin (6，OOOg/min);取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，再將UNIQ-IO柱放入收集管中，加入500 V- L Wash Solution,室溫離心Imin (8，000g/min),再重復(fù)此步驟一次；取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，再將UNIQ-10柱放入收集管中，室溫離心2min(12，000g/min);取下UNIQ-10柱放入新的1.5 mL離心管中，在膜中央加入預(yù)熱的20 u LElution Buffer,室溫放置2min,室溫離心Imin (12, 000g/min),離心管中收集液體即為回收的DNA片段。取I y L回收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃度，置于-20°C保存?zhèn)溆?。利用T4 DNA Ligase (大連寶生物)，將回收的幻片段和pBI121載體片段連接起來，反應(yīng)體系(20 ii L)和操作過程為取10 uL S1NAC3 DNA片段依次加入2 y LPBI121 載體DNA、2 u L 10XT4 DNA Ligase BufferU u L T4 DNA Ligase,5 u L ddH20,混勻后短時離心，置于16°C金屬浴過夜反應(yīng)。接著采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿
菌DH5a中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin, Km)的固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴(kuò)增的特異引物進(jìn)行PCR，挑選出S1NAC3與pBI121成功連接的克隆，所檢測的菌株若為陽性，加入適量甘油并置于_80°C保存?zhèn)溆?。用堿裂解法提取并純化上述大腸桿菌中的pBI121- S1NAC3質(zhì)粒。并制備農(nóng)桿菌C58菌株的感受態(tài)細(xì)胞，操作過程為將實驗室保存的C58菌株在LB固體培養(yǎng)基(含利福平20mg/L)上劃線，28°C培養(yǎng)至長出單菌落后，挑取一個單克隆于含20mg/L利福平的2 mL LB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)至混濁；取5 mL菌液轉(zhuǎn)接于含20mg/L利福平的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 5 ;4°C離心5min (5, 000g/min)收集菌體，棄上清，力口A 10 mL預(yù)冷的0. IM CaCl2，輕輕充分懸浮菌體，冰浴20min ;接著4°C離心5min (5，OOOg/min)收集菌體，棄上清，加入4 mL預(yù)冷的含15%甘油的0. IM CaCl2溶液，充分懸浮后分裝于I. 5 mL離心管中，每管200 U L，液氮速凍后置于-80°C保存?zhèn)溆谩８缮姹磉_(dá)載體構(gòu)建'S1NAC3 3’ UTR片段的PCR產(chǎn)物回收后，溶于TE緩沖液，進(jìn)行BP反應(yīng)。反應(yīng)體系中包括PCR產(chǎn)物50-100 ng, pHellsgate 2載體2 yL，5*BP克隆酶反應(yīng)緩沖液4 U L，BP克隆酶混合物4 111，補(bǔ)充1￡緩沖液(卩118.0)至20 UL0反應(yīng)體系置25°C溫育16 h后加入2 UL蛋白酶K溶液，37°C溫育10 min以終止BP反應(yīng)。從而獲得攜帶有反向重復(fù)目的基因的片段。篩選陽性克隆。采用液氮凍融法將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體(超量表達(dá)和干涉表達(dá)載體)轉(zhuǎn)入所制備的農(nóng)桿菌C58感受態(tài)細(xì)胞中。操作步驟為取2 U g表達(dá)載體質(zhì)粒加入含有200 UL感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5min，接著轉(zhuǎn)入液氮中冷凍lmin，然后迅速置于37°C水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800 u L LB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)4h。將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28°C靜止培養(yǎng)。挑選單菌落搖菌，用擴(kuò)增幻傾0的特異引物進(jìn)行PCR，檢測表達(dá)載體是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。對于陽性克隆，加入甘油后置于_80°C保存?zhèn)溆谩嵤├? :番茄的遺傳轉(zhuǎn)化
采用的遺傳轉(zhuǎn)化體系為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌菌株是C58，轉(zhuǎn)化受體材料是番茄野生種Ailsa Craigo將番茄飽滿的種子經(jīng)過次氯酸鈉溶液(有效氯含量2%)浸泡15 min，然后將種子用蒸餾水洗凈播于1/2 MS的培養(yǎng)基上，置25°C，光周期為16 h光/8 h暗的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，至無菌苗長至7-9 d時切取子葉，在1/2 MS的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)一天。取重懸濃度為0D600 0. 5的農(nóng)桿菌浸染葉片5 min，用滅菌濾紙將多余菌液吸干后重新放置在鋪有濾紙的預(yù)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS+玉米素2.0 mg/L+卡那霉素100 mg/L +頭孢100 mg/L)對葉片進(jìn)行分化培養(yǎng)，兩周繼代一次，等形成愈傷組織后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS+玉米素0. 2 mg/L+卡那霉素100 mg/L +頭孢霉素100 mg/L)，至抗性芽長到一定大小后將其切下放入生根培養(yǎng)基中使其生根，把生根后的抗性苗轉(zhuǎn)移至滅菌的基質(zhì)中馴化培養(yǎng)一周，最后將番茄苗轉(zhuǎn)移至溫室或大棚中栽培。實施例4 :轉(zhuǎn)基因番茄植株的PCR陽性檢測
再生幼苗移栽成活后，提取轉(zhuǎn)基因單株以及對照Ailsa Craig的幼嫩葉片總RNA，逆轉(zhuǎn)
錄生成第一鏈cDNA，Ailsa Craig的cDNA作為陰性對照，用表達(dá)載體所含NPTII引物(引物序列為 5’ -AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3’ 以及 5’ -TCAITTCGAACCCCAGAGTC-3’)對得到的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行陽性檢測。PCR反應(yīng)總體系為25 W，包含I X PCR buffer (含Mg2+)、dNTPs0.38 mmol/1、正反向引物各0.62 Mmol/L、7i^酶I. 2 U、模板約60 ng。反應(yīng)程序為95 V預(yù)變性 5 min,94 °C 45 s、58 °C 45min、72 °C I. 5 min，33 個循環(huán)，72 °C 延伸 10 min。最終的PCR產(chǎn)物用濃度為0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，凝膠成像系統(tǒng)對電泳圖譜進(jìn)行觀察并記錄(圖2所示)，選擇陽性轉(zhuǎn)基因植株。實施例5 :果實開花后成熟時間統(tǒng)計
在番茄材料開花后進(jìn)行人工輔助授粉并掛牌標(biāo)注日期，統(tǒng)計不同轉(zhuǎn)基因材料達(dá)到果實不同成熟時期(綠熟期，破色期，黃熟期和紅熟期)的時間(用番茄開花后天數(shù)DPA計量)(如圖3所示)。干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄的果實成熟相比對照AC顯著延遲，最終成熟時間比對照番茄Ailsa Craig延遲了 26天。這說明干涉幻基因以后番茄果實的成熟進(jìn)程顯著延遲；而超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄的成熟時間與對照番茄Ailsa Craig相比較，成熟進(jìn)度變快，但是差異不顯著。實施例6 :果實呼吸速率的檢測
對轉(zhuǎn)基因果實成熟期進(jìn)行觀察，并隨機(jī)采摘轉(zhuǎn)基因材料和對照果實綠熟期，破色期，黃熟期和紅熟期的果實，采用CEA-800型紅外線C02分析儀測定果實的呼吸強(qiáng)度，結(jié)果表示為C02 ml/kg/h，每時期每樣品測定三個果實，并做三次生物學(xué)重復(fù)(如圖4所示)。結(jié)果顯示，超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄和對照番茄Ailsa Craig在果實成熟的過程中，都有一個呼吸釋放的高峰，顯示了呼吸躍變型果實的典型特征；然而在干涉轉(zhuǎn)基因番茄果實發(fā)育成熟的整個過程中，呼吸速率都沒有發(fā)生顯著的變化，沒有呼吸躍變高峰的出現(xiàn)。表明幻傾^基因被干涉以后，其果實成熟進(jìn)程受阻。實施例7 :果實乙烯釋放的測定
隨機(jī)采摘轉(zhuǎn)基因材料和對照不同成熟期果實進(jìn)行乙烯測定。用聚丙烯薄膜將果實密封后置于25°C 48h，用注射器從中吸取Iml氣體，注入氣相色譜儀(Agilent 6890N, USA)檢測乙烯含量，記錄出峰時間和峰面積，并與標(biāo)準(zhǔn)乙烯對比計算樣品的乙烯釋放量，以ul/L表示。每時期每樣品測定三個果實，并做三次生物學(xué)重復(fù)(如圖5所示)。檢測結(jié)果與實施例6的結(jié)果相似，超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄和對照番茄Ailsa Craig在果實成熟的過程中，都有乙烯釋放的高峰，而這也是呼吸躍變型果實的另一典型特征；然而在干涉轉(zhuǎn)基因番茄果實發(fā)育成熟的整個過程中，乙烯釋放速率都沒有發(fā)生顯著的變化。更充分的表明幻傾^基因被干涉以后，其果實成熟進(jìn)程受到抑制。實施例8 :果實硬度的檢測
采取轉(zhuǎn)基因和對照不同成熟時期的果實，用硬度計(Model GY-1, Cany PrecisionInstruments Co. , Ltd, Shanghai, China)測定每個果實果頂和赤道對稱的四個點，以柱形探頭刺破5_果皮時所消耗的力(N)表示(如圖6所示)。結(jié)果表明在干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因果實發(fā)育的前期，其果實硬度與對照番茄Ailsa Craig相比較沒有顯著差異，但到了果實發(fā)育的最終階段果實硬度是對照的一半，表明干涉轉(zhuǎn)基因番茄在發(fā)育的后期階段軟化速度降低。而超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄的果實硬度與對照沒有顯著差異，隨著果實的發(fā)育成熟果實硬度逐漸降低。這表明干涉轉(zhuǎn)基因番茄果實的成熟軟化受到抑制，而超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄的成熟進(jìn)程沒有發(fā)生顯著變化。上述實驗結(jié)果表明，干涉表達(dá)幻傾^基因可以顯著抑制番茄果實的成熟進(jìn)程?！?br> 權(quán)利要求
1.ー種番茄果實成熟基因幻傾び，其特征在于其具有如SEQ ID NO. I所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述的番茄果實成熟基因S1NAC3在控制番茄以及其他呼吸躍變型果實成熟進(jìn)程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種番茄果實成熟基因SlNAC3及其應(yīng)用，番茄SlNAC3基因具有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列或編碼如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；具有典型的NAC家族保守結(jié)構(gòu)域，編碼NAC蛋白；本發(fā)明采用功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)證實番茄SlNAC3基因在番茄果實成熟中發(fā)揮重要作用。將本發(fā)明果實成熟基因SlNAC3構(gòu)建到植物表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)入番茄中干涉表達(dá)，轉(zhuǎn)基因番茄會表現(xiàn)出果實成熟延緩的能力，可以直接用于生產(chǎn)中控制果實的成熟進(jìn)程。
文檔編號C12N15/82GK102787124SQ20121029646
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者夏雪山, 宋玉竹, 韓芹芹, 高凱 申請人:昆明理工大學(xué)