專(zhuān)利名稱(chēng)：番茄花葉病毒弱毒疫苗k基因組全序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病毒基因工程領(lǐng)域，特別是涉及煙草花葉病毒屬的一株番茄花葉病毒弱毒疫苗基因組的全序列以及弱化的突變方式。
植物病毒弱毒疫苗在防治植物病毒病害中發(fā)揮著重要的作用，能夠在植物體內(nèi)生存和繁殖，卻不危害植物的正常生長(zhǎng)、開(kāi)花和種子生產(chǎn)，而對(duì)攻擊病毒侵染植物具有防御作用，這種共生和保護(hù)宿主的現(xiàn)象是大多數(shù)植物弱病毒所具有的共同特征，具有普遍性。Kunkel、Grant、Posnett和Todd曾先后提出利用植物天然弱病毒分離物預(yù)防強(qiáng)病毒侵染的設(shè)想，并在果樹(shù)病毒研究中曾以自然界分離的弱病毒作了保護(hù)試驗(yàn)。但由于這些果樹(shù)病毒不容易深入分析其保護(hù)作用和進(jìn)一步研究，后來(lái)又轉(zhuǎn)入草本植物病毒的人工誘變?nèi)醵疽呙绲难芯俊?br> 大島信行等利用高溫誘變獲得L11系列番茄花葉病毒疫苗，在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用，80年代后對(duì)其進(jìn)行了分子生物學(xué)的研究，對(duì)三個(gè)克隆的病毒基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)病毒基因組核苷酸不一致，因而未能得到進(jìn)一步的研究。Rast曾用亞硝酸誘變得到M-Ⅱ-16弱毒分離物，由于這個(gè)分離物還引起花葉癥狀和遺傳性不夠穩(wěn)定，未在生產(chǎn)上應(yīng)用。
八十年代，人們展開(kāi)了對(duì)弱病毒致弱與交叉保護(hù)機(jī)理的分子生物學(xué)研究，Banerjee發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒(TMV)普通株(U1)突變體YSI/1致弱的原因是病毒外殼蛋白基因在5770和6127位點(diǎn)的突變使Val→Asp和Phe→Ser；Nishiguchi認(rèn)為T(mén)MV弱毒疫苗L11和L11A(番茄株)的致弱是由于126kDa復(fù)制酶3個(gè)氨基酸的突變?cè)斐?；Shiian對(duì)TMV弱毒疫苗V-69(番茄株)54％的基因組分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)堿基的突變引起了編碼蛋白氨基酸的變化，但其中那幾個(gè)堿基的突變起關(guān)鍵作用，卻不清楚，由此可見(jiàn)，植物病毒致弱的分子機(jī)理尚無(wú)定論。
八十年代初，曾報(bào)道過(guò)用亞硝酸處理番茄花葉病毒強(qiáng)株而獲得了弱毒疫苗，可以防治煙草和番茄免受大多數(shù)煙草花葉病毒屬成員的侵染，在溫室和大田使用具有明顯的增產(chǎn)效果，而且遺傳性穩(wěn)定。對(duì)其理化性質(zhì)、感病組織中雙鏈RNA的變化情況和免疫蛋白以及RNA體外翻譯產(chǎn)物等進(jìn)行了研究，然而皆無(wú)其弱化機(jī)理的明確報(bào)導(dǎo)。為進(jìn)一步揭示番茄花葉病毒弱毒疫苗(以下簡(jiǎn)稱(chēng)K)致弱的分子機(jī)理，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄、PCR、克隆、體外轉(zhuǎn)錄和煙草感染獲得了侵染性cDNA(infectiouscDNA)克隆pK；測(cè)定和分析了其基因組核苷酸全序列，與番茄花葉病毒強(qiáng)株(日本分離物)相比，發(fā)現(xiàn)K基因組中復(fù)制酶和運(yùn)動(dòng)蛋白分別發(fā)生了乳石和赭石突變；在普通株和K之間用基因交換法構(gòu)建了K的重組病毒，體外轉(zhuǎn)錄和侵染性分析表明K突變的復(fù)制酶和運(yùn)動(dòng)蛋白對(duì)該病毒的致弱分別起主要和次要作用；用點(diǎn)突變的方法分別研究了普通株和K的3個(gè)突變體對(duì)煙草的侵染性，并分析了轉(zhuǎn)復(fù)制酶和運(yùn)動(dòng)蛋白基因植物對(duì)部分煙草花葉病毒屬成員的交叉保護(hù)作用，這些結(jié)果均表明K基因組的這種突變是其致弱和交叉保護(hù)的根本原因。
K基因組的這種突變方式是目前在植物病毒中發(fā)現(xiàn)的特有現(xiàn)象，本發(fā)明的意義在于利用這種突變所造成的病毒弱化作用模式將為其他植物病毒(主要是RNA病毒)基因組的改造和基因工程疫苗的研制提供了廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)植物病毒病的全面防治將起著重要的作用。
具體的說(shuō)本發(fā)明可應(yīng)用于1．煙草花葉病毒屬成員以及其他植物病毒基因組的改造以研制或生產(chǎn)弱毒疫苗或基因工程疫苗，防治植物病毒病。
2．可用于不影響植物的正常生長(zhǎng)與繁殖而在相應(yīng)易感植物中表達(dá)外源基因的載體。
3．可用于不對(duì)接種植物產(chǎn)生嚴(yán)重危害而在病毒粒子表面展示外源肽段的展示載體。
實(shí)施本發(fā)明可以達(dá)到如下有益效果1．K基因組的突變方式以復(fù)制酶基因組在2670-2672的UGA無(wú)義突變和運(yùn)動(dòng)蛋白基因組在5632-5634的UAA無(wú)義突變?yōu)樘卣?，這種突變是目前在植物病毒弱毒株系中發(fā)現(xiàn)的特有現(xiàn)象。含有這類(lèi)突變的病毒會(huì)致弱植物病毒的侵染，因而能夠用于植物病毒的交叉保護(hù)。而K致弱的突變方式可用于與K有類(lèi)似基因組形式的其它植物病毒，特別是正鏈RNA病毒，如虹豆花葉病毒科(Comoviridae)，馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)，番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)，線形病毒屬(Capillovirus)，香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)，長(zhǎng)線形病毒屬(Closterovirus)，黃癥病毒屬(Luteovirus)，玉米褪綠斑駁病毒屬(Machomovirus)，壞死病毒屬(Necrovirus)，馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)，南方菜豆花葉病毒屬(Sobemovirus)，煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的其它成員，毛病毒屬(Trichovirus)，蕪菁花葉病毒屬(Tymovirus)。
2．目前，TMV作為載體已應(yīng)用于某些外源基因在植物(尤其是煙草)中的表達(dá)，其主要方法是將外源基因替代病毒基因組的CP編碼區(qū)，轉(zhuǎn)錄后接種植物，同時(shí)接種缺損病毒(如僅含有病毒基因組的復(fù)制酶與外殼蛋白)，這樣利用輔助病毒的CP來(lái)包裝嵌合有外源基因的重組病毒基因組，而使外源基因得到表達(dá)；另一種方法是在轉(zhuǎn)CP基因的植物上，接種上述嵌合體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，利用在植物中表達(dá)的CP來(lái)包裝嵌合病毒，從而表達(dá)外源基因。這兩種方法都會(huì)形成重組強(qiáng)病毒而擴(kuò)散，對(duì)被接種植物具有嚴(yán)重的損傷，在田間使用必然會(huì)危害其他植物。而K作為弱毒疫苗，其本身就具有抗病毒的作用，以K的基因組作為載體進(jìn)行外源基因的表達(dá)就不會(huì)出現(xiàn)上述問(wèn)題。該病毒的潛在作用還在于針對(duì)相應(yīng)植物可以攜帶使該植物得到免疫或生長(zhǎng)的外源基因。
3．用于外源肽段在病毒顆粒表面的展示時(shí)，也存在上述的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案步驟如下將番茄花葉病毒強(qiáng)株(L-TMV)用亞硝酸誘變處理后，用枯斑寄主(心葉煙或枯斑三生煙)獲得的單斑，接種普通煙(黃苗榆品種)或番茄(加八品種)。每次挖取幾十個(gè)單斑，淘汰所有在普通煙和番茄上表現(xiàn)癥狀的單斑分離物，將不表現(xiàn)癥狀的單斑分離物回接心葉煙或枯斑三生煙，檢查病毒的存在；選取不表現(xiàn)癥狀而有病毒增殖的單斑分離物，連續(xù)進(jìn)行單斑分離和毒力鑒定3-4次，以獲得穩(wěn)定遺傳的弱毒株系。
如上所述，K是用亞硝酸誘變番茄花葉病毒強(qiáng)株后篩選獲得的，這種誘變是隨機(jī)的，但本發(fā)明所獲得的突變體卻具有穩(wěn)定的遺傳性，雖然再用亞硝酸處理番茄花葉病毒強(qiáng)株不一定能得到與K基因組完全相同的突變體，但可用點(diǎn)突變的方式對(duì)自然條件下分離和克隆的番茄花葉病毒強(qiáng)株基因組進(jìn)行改造而獲得，并通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和煙草侵染試驗(yàn)獲得穩(wěn)定遺傳的基因工程弱毒疫苗。
實(shí)施例1．點(diǎn)突變使番茄花葉病毒基因組cDNA復(fù)制酶編碼基因在2670-2672核苷酸形成乳石突變(TGA)，運(yùn)動(dòng)蛋白編碼基因在5632-5634核苷酸形成赭石突變(TAA)。點(diǎn)突變可用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，將突變位點(diǎn)引入到引物中。其方法如下(1)突變引物設(shè)計(jì)上下游(5′和3′)引物必須包括突變位點(diǎn)，而且在退火后二者完全配對(duì)形成雙鏈；復(fù)制酶5′突變引物序列為5′-GATGATCAGATGAAGAGCTAATG-3′,3′突變引物5′-CATTAGCTCTTCATCTGATCATC-3′。運(yùn)動(dòng)蛋白5′突變引物5′-AGTTTAAAAAGA GTTTAATAATTTGATTAAAGATTAAGC-3′,3′引物5′-GCTTAATCTTTAATCAAATT ATTAAACTCTTTTTAAACT-3′；引物5′端不能磷酸化，但引物必須用多聚核苷酸液相色譜(polynucleotide liquid chromatography,FPLC)或聚丙稀酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)純化；反應(yīng)時(shí)引物濃度需過(guò)量。
(2)PCR在薄壁管中按如下成分和比例加入反應(yīng)試劑，再按設(shè)定的程序在PCR循環(huán)儀上進(jìn)行反應(yīng)。
5μl 10×突變反應(yīng)緩沖液10ng克隆質(zhì)粒(含有全部或部分病毒基因組的)模板125ng上游引物(以34個(gè)堿基引物為例，100ng/μl)125ng下游引物(以34個(gè)堿基引物為例，100ng/μl)1μldNTP混合物(dATP,dGTP,dCTP,dTTP各25mM)再加雙蒸水或去離子水到終體積為50μl1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5單位/μl)，混勻覆蓋30μl礦物油94℃30s；94℃30s,55℃1min,68℃的時(shí)間按每kb質(zhì)粒長(zhǎng)度2min計(jì)算，進(jìn)行12-15個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后在冰上置2min冷卻反應(yīng)。
(3)消化反應(yīng)取10μl PCR產(chǎn)物加入1μlDpnⅠ限制性內(nèi)切酶(10U/μl),37℃消化2小時(shí)，同時(shí)取與10μlPCR產(chǎn)物中等量的模板也進(jìn)行相同條件的消化。
(4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLUEⅠ)XL1-BLUE感受態(tài)細(xì)胞的制備 采用氯化鈣制備法，方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
Ⅱ)轉(zhuǎn)化 取消化產(chǎn)物2-5μl加入到制備好的感受態(tài)XL1-BLUE中，振蕩混勻，置冰中30min，然后42℃熱激90s，再在冰中置3-5min，加入0.5mlNZY+broth,37℃225-250rpm搖床振蕩1h，取適量菌液均勻涂在有相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板中，37℃培養(yǎng)16hs以上。模板對(duì)照的轉(zhuǎn)化數(shù)應(yīng)不大于0-5‰，否則應(yīng)重新消化和轉(zhuǎn)化。
(5)篩選突變體用熒光素或放射性同位素(32P或35S)標(biāo)記，雙脫氧末端終止法測(cè)定突變位點(diǎn)及其附近的核苷酸序列(測(cè)序試劑盒T7Kit購(gòu)自Pharmacia公司)。每個(gè)突變點(diǎn)均可按上述方法進(jìn)行。
2．體外轉(zhuǎn)錄與煙草侵染(1)模板的制備堿法提取重組質(zhì)粒約2μg，用限制性內(nèi)切酶SphⅠ線性化，Klenow片段(5U/μg DNA)削平3′突出端，酚/氯仿抽提兩次，乙醇沉淀。線性化模板溶于DEPC處理的無(wú)菌水中。
(2)感染煙草按文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不經(jīng)DNase處理，直接用于侵染煙草。先接種枯斑三生煙(Samsun NN)，出現(xiàn)枯斑后，轉(zhuǎn)接普通煙(Nicotiana tabacum cv.黃苗榆品種)和三生煙。觀察系統(tǒng)癥狀和枯斑形成情況。選在三生煙上能出現(xiàn)枯斑，而在普通煙上不表現(xiàn)典型系統(tǒng)癥狀的突變克隆(pK)。
3．子代病毒的鑒定(1)病毒的分離與純化以及RNA的提取按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。
(2)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)A．病毒全基因組cDNA的合成 5′引物5′-GATTTAGGTGACACTATAGTATT TTTACAACAATTAC-3′；3′引物5′-GGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGT-3′。RT-PCR(購(gòu)自德國(guó)Boehringer Mannheim公司)操作均按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行RT反應(yīng)在42℃作用1h。PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件為94℃ 2min；94℃ 30s,60℃ 30s,68℃ 6min,35個(gè)循環(huán)；68℃ 10min。
B．病毒基因組cDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè) 取上述PCR產(chǎn)物約10μg用測(cè)序引物5′-CGGGAAGACAAAGGAAATTC-3′和5′-TCAGGCGGAAGGCCTAAACC-3′分別測(cè)定2670-2672與5632-5634核苷酸。測(cè)序試劑盒及方法同上。
4．K基因組全序列(圖1-1～3)弱毒疫苗K基因組結(jié)構(gòu)與強(qiáng)毒株有不同，其98.5kDa/126kDa/183kDa、27kDa(運(yùn)動(dòng)蛋白)、17.6kDa(外殼蛋白)蛋白分別起始于核苷酸序列72、4906、5703位；終止于2672/3422/4922、5634、6182；終止密碼子分別為T(mén)GA/TAG/TAA、TAA、TAA；126kDa蛋白為T(mén)GA(UGA)被通讀為色氨酸(Trp)或半胱氨酸(Cys)的產(chǎn)物；183kDa蛋白應(yīng)為98.5kDa和126kDa被通讀兩次后的產(chǎn)物(表1)。
表1．K基因組結(jié)構(gòu)基因組長(zhǎng)度 6384ntG/C 1477/1185G+C(％) 2662(41.70)A/T 1906/1816A+T(％) 3722(58.30)5′非編碼區(qū)(核苷酸) 1-71(71nt)98.5kDa蛋白(氨基酸殘基) 72-2672(867a.a.)126kDa蛋白(氨基酸殘基) 72-3422(1115a.a.)183kDa蛋白(氨基酸殘基) 72-4922(？)(1615a.a.？)運(yùn)動(dòng)蛋白(氨基酸殘基) 4906-5634(241a.a.)外殼蛋白(氨基酸殘基) 5703-6182(158a.a.)3′非編碼區(qū)(核苷酸) 6183-6384(202nt)5．KcDNA核苷酸序列與參比序列的比較K與番茄株(強(qiáng)株)日本分離物(TMV-L,Japanese isolate)基因組的核苷酸總數(shù)相同，堿基組成的同源率也在99％以上；二者3個(gè)ORF(Open Reading-Frame)的起始密碼和終止密碼相同；但K由于2670-2672nt發(fā)生了乳石突變(UGA)，比TMV-L多一個(gè)ORF，其翻譯形成98.5kDa蛋白；該乳石突變可被通讀，形成126kDa蛋白，而183kDa蛋白的形成須通讀UGA和UAG，因而產(chǎn)量可能較少；此外K運(yùn)動(dòng)蛋白基因在5634bp發(fā)生的赭石突變(UAA)致使其正常翻譯提前終止，比強(qiáng)株的運(yùn)動(dòng)蛋白小約2kDa(表2)。
表2．K與番茄強(qiáng)株(TMV-L)基因組結(jié)構(gòu)比較TMV-L K 序列平均同源率(％)基因組長(zhǎng)度)6384nt 6384nt 99.7G/C 1482/11821477/1185G+C(％) 2664(41.73) 2662(41.70)A/T 1903/18171906/1816A+T(％) 3720(58.27) 3722(58.30)5′非編碼區(qū)(核苷酸)1-71(71nt) 1-71(71nt) 10098.5kDa蛋白(氨基酸殘基)… 72-2672(867a.a.)126kDa蛋白(氨基酸殘基) 72-3422 72-3422 99.6(1115a.a.) (1115a.a.) (99.1)183kDa蛋白(氨基酸殘基) 72-4922 72-4922(？) 99.6(1615a.a)(1615a.a.？)(99.2)運(yùn)動(dòng)蛋白(氨基酸殘基) 4906-57004906-5634 100(263a.a.)(241a.a.) (100)外殼蛋白(氨基酸殘基) 5703-61825703-6182 100(158a.a.)(158a.a.) (100)3′非編碼區(qū)(核苷酸)6183-63846183-6384(204nt) (202nt) 1006．Kc DNA推斷的ORF多肽氨基酸殘基序列(圖2-6)與參比序列的比較分析K與TMV-L在126kDa/183kDa蛋白共有13個(gè)氨基酸變異。34丙氨酸(Ala)-蘇氨酸(Thr)；335蘇氨酸(Thr)-丙氨酸(Ala)；349酪氨酸(Tyr)-半胱氨酸(Cys)；385天冬酰氨(Asn)-絲氨酸(Ser)；510精氨酸(Arg)-賴(lài)氨酸(Lys)；636脯氨酸(Pro)-絲氨酸(Ser)；760天冬氨酸(Asp)-天冬酰氨(Asn)；774精氨酸(Arg)-組氨酸(His)；867無(wú)義密碼-精氨酸(Arg)；895精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)；1285甲硫氨酸(Met)-亮氨酸(Leu)；1371酪氨酸(Tyr)-苯丙氨酸(Phe)；1376天冬酰氨(Asn)-絲氨酸(Ser)。
K與TMV-L在運(yùn)動(dòng)蛋白除氨基酸殘基數(shù)不同外，無(wú)替代變異發(fā)生。預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)分別為9.248和7.998。K運(yùn)動(dòng)蛋白等電點(diǎn)變大表明其在PH7.0時(shí)，帶正電較多。
7．K復(fù)制酶基因終止密碼子UAG和UGA的滲漏與通讀煙草花葉病毒復(fù)制酶(126kDa)編碼基因的翻譯終止子UAG，已被證實(shí)可通讀為酪氨酸(Tyr)。因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)表明在正常煙草組織細(xì)胞漿及葉綠體中發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的無(wú)義抑制tRNATyr，通過(guò)反密碼子GψA識(shí)別終止密碼UAG及其3′端的基本序列CAAUUA而獲得通讀，TMV-Cv和K分別在3420-3426和3423-3429處存在該序列，因而可以通讀出183kDa蛋白，這種通讀的效率可達(dá)到30-40％。
弱毒疫苗K復(fù)制酶基因由于在2670-2672發(fā)生乳石突變(UGA)，產(chǎn)生98.5kDa蛋白，該UGA是否可被通讀而產(chǎn)生126kDa/183kDa蛋白？Karin和Carsten先后證明在煙草中帶有反密碼子CmCA或GCA的無(wú)義抑制tRNATrp或tRNACys可以通讀UGA為色氨酸(Trp)或半胱氨酸(Cys)，這種通讀的機(jī)制雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性的mRNA序列，但在終止密碼上下游的氨基酸殘基序列似乎有某種特征(表3)。
表3．具有UGA終止子的部分不同植物病毒基因組通讀區(qū)序列分析病毒種類(lèi)病毒屬 通讀區(qū)序列煙草脆裂病毒煙草脆裂病毒屬E T V L * R F R S(RNA-1)GAG ACC GUC UUA UGA CGG UUU CGG UCU豌豆早枯病毒煙草脆裂病毒屬D A M K * R C R S(RNA-1)GAU GCU AUG AAA UGA CGG UGU CGG UCA土傳小麥花葉病 真菌傳桿狀病毒屬 E L T K * R F G S毒(RNA-1)GAG CUU ACU AAA UGA CGG UUU GGG UCG花生叢生病毒真菌傳桿狀病毒屬 E Q T K * R F G S(RNA-1)GAA CAG ACC AAA UGA CGG UUU GGG UCA土傳小麥花葉病 真菌傳桿狀病毒屬 E G S S * R D G V毒(RNA-2)GAA GGU UCG AGU UGA CGG GAC GGC GUCK(RNA)煙草花葉病毒屬E M I R * R A N AGAG AUG AUC AGA UGA AGA GCU AAU GCG從6個(gè)含有UGA終止密碼的植物病毒mRNA序列分析可見(jiàn)，其通讀的氨基酸序列結(jié)構(gòu)為E×××*R×××，其中無(wú)義密碼5′端以堿性氨基酸(K,R)居多(表4)。tRNATrp在煙草組織細(xì)胞漿和葉綠體中的通讀效率分別為20-25％和12％，而tRNACys在同樣組織中的通讀效率為1.2-3％和5％，因此tRNATrp的通讀效率比tRNACys要明顯高。K要產(chǎn)生183kDa蛋白，必須對(duì)98.5kDa和126kDa蛋白連續(xù)通讀，按tRNATyr和tRNATrp的最大通讀效率計(jì)算，為10％，產(chǎn)量較少。
為更好地理解本發(fā)明，特給出附Ⅰ、附Ⅱ附圖進(jìn)一步予以說(shuō)明。*附Ⅰ部分試劑的配制*附Ⅱ圖1～

圖1-1～3K全基因組cDNA序列，下劃線部分TGA和TAA分別為乳石突變和赭石突變。圖2-1～2.183kDa蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)。圖3.98.5kDa蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)。圖4-1～2.126kDa蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)。圖5.突變的運(yùn)動(dòng)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)。圖6.外殼蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)。
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權(quán)利要求
1．番茄花葉病毒弱毒疫苗基因組，其特征在于番茄花葉病毒弱毒疫苗K基因組中，編碼復(fù)制酶和運(yùn)動(dòng)蛋白的核苷酸序列具有乳石突變和赭石突變，該突變具有致弱植物病毒的功能。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼復(fù)制酶的核苷酸序列產(chǎn)生乳石突變，其特征在于乳石突變TGA發(fā)生于2670-2672核苷酸序列，其翻譯形成98.5kDa蛋白，而且該乳石突變可被通讀，形成126kDa蛋白和183kDa蛋白。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼運(yùn)動(dòng)蛋白的核苷酸序列赭石突變，其特征在于赭石突變TAA發(fā)生于5632-5634位置，致使正常翻譯提前終止。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳石突變和赭石突變會(huì)致弱植物病毒，可以作為模式進(jìn)行植物病毒基因組的改造，制備基因工程疫苗應(yīng)用于植物病毒病的防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物病毒基因工程領(lǐng)域。通過(guò)點(diǎn)突變的方式把分離和克隆的番茄花葉病毒強(qiáng)株基因組改造為弱毒疫苗K基因組,其編碼復(fù)制酶和運(yùn)動(dòng)蛋白的核苷酸序列具有乳石突變和赭石突變,可以做為模式進(jìn)行植物病毒基因組的改造,制備基因工程疫苗,有效地用于植物病毒病的防治。
文檔編號(hào)C12N15/33GK1306090SQ0010021
公開(kāi)日2001年8月1日 申請(qǐng)日期2000年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月14日
發(fā)明者邱并生, 楊恭, 田波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所