專利名稱：一種番茄基因組總dna提取試劑盒及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從番茄幼嫩葉片中簡便快速提取基因組總DNA的試劑盒及其提取方法。
背景技術(shù)：
在番茄分子生物學(xué)和遺傳育種研究中，采用一種簡單高效的DNA提取技術(shù)具有極大的優(yōu)勢和潛力1.番茄是茄科作物分子生物學(xué)研究的模式植物，由于番茄葉片中含有較多的酚類、蛋白和多糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)嚴(yán)重影響DNA的提取質(zhì)量，傳統(tǒng)的番茄DNA提取方法并不能很好的去除酚類和蛋白等大分子物質(zhì)，并容易造成DNA樣品的褐化，從而影響番茄分子生物學(xué)研究的結(jié)果。采用一種快速高效的番茄基因組DNA提取方法，提高番茄基因組DNA提取的質(zhì)量，為茄科作物基因組生物信息學(xué)研究以及番茄分子生物學(xué)研究奠定材料基礎(chǔ)。2.番茄的重要經(jīng)濟性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性、抗逆性等均為數(shù)量性狀，數(shù)量性狀變異是位于染色體上多個基因與環(huán)境效應(yīng)共同作用的結(jié)果，經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)將控制數(shù)量性狀的多基因作為整體進(jìn)行研究，無法鑒別單個的數(shù)量基因座位(QTL)及其功能，近年來發(fā)展的 DNA分子標(biāo)記技術(shù)，使得我們對復(fù)雜性狀的數(shù)量性狀進(jìn)行DNA分子水平研究成為可能，進(jìn)行這項研究的前提是要構(gòu)建大數(shù)量的遺傳群體，然后對群體內(nèi)的單株進(jìn)行DNA分子標(biāo)記，因此采用一種快速高效的DNA提取方法，能夠大大提高番茄數(shù)量性狀研究的效率，更加深入地研究番茄復(fù)雜形狀的遺傳機制，更為有效的對控制番茄數(shù)量性狀基因座(QTL)的基因進(jìn)行圖位克隆以及基因功能的驗證，并為分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。3.隨著分子生物學(xué)和基因工程研究的不斷深入，分子標(biāo)記輔助育種已成為現(xiàn)代番茄育種中的一種極為重要的輔助工具，在分子標(biāo)記輔助育種中常常需要在短期內(nèi)對幾百甚至上千株植株的模板DNA進(jìn)行分析，以確定入選植株是否攜帶目標(biāo)基因。因此，采用一種快速高效的DNA提取方法來獲得高純度的番茄基因組總DNA，可以大大縮短番茄育種進(jìn)程，提高育種效率。4.隨著番茄育種水平的不斷提高和我國設(shè)施栽培的迅速發(fā)展，我國當(dāng)前的番茄品種日益多樣化，番茄品種更新?lián)Q代的速度逐年加快，面對良莠不齊的國內(nèi)外番茄品種，如何迅速鑒定優(yōu)良番茄品種的質(zhì)量和純度，是目前種子管理部門急需解決的問題。從DNA水平鑒定番茄品種的質(zhì)量和純度是目前快速檢測番茄品種質(zhì)量和純度的主要方法，因此，采用一種快速高效的DNA提取方法來獲得高純度的番茄基因組總DNA，對于加快番茄品種檢測的工作進(jìn)程非常重要，并能夠大大減輕大批量番茄品種的檢測的工作量。番茄基因組總DNA提取方法的研究是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)性研究，早期研究多集中在基因組總DNA提取方法的研究方面，1995年Theresa等利用傳統(tǒng)CTAB法提取番茄基因組總DNA，提取過程耗時過長，所提取的DNA需要經(jīng)過反復(fù)抽提后才能達(dá)到實驗要求。1997年 Michaels等利用SDS法提取番茄基因組總DNA，所提取的DNA樣品去酚效果較差，DNA樣品褐化嚴(yán)重。國內(nèi)研究人員劉建新等也對番茄基因組總DNA的提取方法進(jìn)行了研究，所選方法也存在耗時過長和純度較低的問題。雖因研究對象和目的的不同而有所差異，但每種DNA提取方法最關(guān)鍵的都有三部分，首先破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使DNA充分放到緩沖液中；其次消除蛋白質(zhì)、多糖、色素等的干擾；最后防止DNA的降解。應(yīng)用傳統(tǒng)的番茄基因組總DNA提取方法提取的DNA需要反復(fù)抽提才能使DNA樣品達(dá)到所需純度，在進(jìn)行大規(guī)模樣本分析時，DNA的提取仍是非常耗時的，并且不能很好的去除酚類物質(zhì)，從而影響下一步的研究結(jié)果。高質(zhì)量DNA的獲得是進(jìn)行各項遺傳操作的基礎(chǔ)，近年來各種改良的CTAB法、SDS法層出不窮。提取DNA的適宜方法和材料因不同的植物而異。在對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測時，需要在短期內(nèi)對幾百甚至幾千株植物的模板DNA進(jìn)行分析，因此選用適宜的方法快速高效地提取總DNA非常關(guān)鍵。番茄的葉片中含有較多的酚類、多糖和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)的存在嚴(yán)重影響提取DNA的質(zhì)量，不利于后續(xù)分析研究的進(jìn)行。應(yīng)用傳統(tǒng)的CTAB法及SDS法提取番茄DNA需反復(fù)抽提蛋白才能使樣品達(dá)到所需純度，在進(jìn)行大規(guī)模樣本分析時，DNA的提取仍是非常耗時并且不能很好地去除酚類物質(zhì)，造成DNA樣品褐化，從而影響了進(jìn)一步的PCR分析。本研究發(fā)現(xiàn)對傳統(tǒng)的 CTAB提取方法中幾個關(guān)鍵步驟加以改進(jìn)后，DNA的純度明顯提高。改進(jìn)后的CTAB法簡單、 快速、高效，全部過程在2. Oml離心管內(nèi)完成，一人獨立操作每天可提取樣品100個以上，所提取的DNA純度高、濃度較大，完全適于進(jìn)行規(guī)?；瘧?yīng)用于番茄種群遺傳學(xué)、分子標(biāo)記輔助育種等研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種番茄基因組總DNA提取試劑盒及其提取方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了番茄基因組總DNA提取試劑盒，包括以下試劑(1) IM Tris-HCl (ρΗ8· 0)稱取 Tris · base 12. 114g，用少量蒸餾水加熱溶解，溶解后用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH = 8. 0，最后加水定容至lOOmL，121°C 25min高壓滅菌。(2) 0. 25M EDTA (pH8. 0)稱取EDTA鈉鹽9. 305g,加少量蒸餾水溶解后，用NaOH調(diào)至pH = 8.0，最后加水定容至lOOmL，121°C 25min高壓滅菌。(3)2. 5M NaCl 稱取14. 625g Nacl，加蒸餾水溶解后定容至lOOmL。(4) TE (pH8. 0)溶液量取前面滅過菌的 IM Tris-HCl (pH8. 0) ImL, 0. 25MEDTA (pH8. 0) 0. 4mL,加水定容至 IOOmL 備用。(5)Tris飽和酚氯仿異戊醇05 24 1)量取50mL Tris飽和酚，48ml氯仿和2mL異戊醇，混勻即可。(6)氯仿異戊醇04 1)量取96ml氯仿和4mL異戊醇，混勻即可。(7) 70%乙醇量取70mL無水乙醇，加水定容至100mL。(8)3M 乙酸鈉(PH = 5. 2)稱量 40. 8gNaAC · 3H20 于 IOOrnl 燒杯中，加入約 40ml 的蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓尤氡姿嵴{(diào)節(jié)PH值至5. 2，蒸餾水定容至100ml，121°C 25min高壓滅菌。(9)無水乙醇。(10) 2 X CTAB 提取液①稱取IOg CTAB，蒸餾水溶解后定容至IOOmL,配制成10% CTAB (W/V)母液；②?、僦?0 % 的 CTAB 提取液 20ml，IM Tris-HCl (pH8. 0)溶液 10ml， 0. 25MEDTA (pH8. 0)溶液 8ml，0. 25M NaCl 溶液 56ml，最后用蒸餾水定容至 100ml ；
③配制好②溶液后，向其加入2gPVPK_30 ；(11) β-巰基乙醇；(12)異丙醇。本發(fā)明還提供了番茄基因組總DNA提取的方法(1)樣品的采集與研磨采摘番茄植株上10片長寬約Icm的幼嫩葉片，裝入2ml的離心管，加滿液氮后置于預(yù)冷的離心管架上迅速用研磨棒研磨至粉末狀；(2)粗提DNA 加65°C的2XCTAB提取液900ul和30ul的β -巰基乙醇，混合均勻后65°C水浴60min，每隔5min上下顛倒混勻一次；(3)抽提DNA 取出離心管放冰上冷卻lOmin，加4°C預(yù)冷的Tris飽和酚氯仿 異戊醇05 24 1)溶液抽提一次，加4°C預(yù)冷的氯仿異戊醇04 1)溶液抽提2次， 轉(zhuǎn)移上清至1. 5ml的離心管；(4)沉淀與洗滌DNA 加4°C預(yù)冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液，放_20°C下沉淀池， 40C HOOOrpm離心lOmin，棄上清，加70%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干后加TE溶液溶解沉淀；(5)純化DNA 向管內(nèi)加RNAase, 37°C水浴60min，加4°C預(yù)冷的Tris飽和酚氯仿異戊醇05 24 1)溶液抽提1次，加氯仿異戊醇04 1)溶液抽提2次，轉(zhuǎn)移上清至新1. 5ml離心管；(6)沉淀、洗滌、溶解DNA樣品加4°C預(yù)冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液，放_20°C 冰箱中沉淀池，40C HOOOrpm離心lOmin，棄上清，加70%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，加TE溶液溶解沉淀，放-20°C下長期保存。用該方法在提取番茄植株基因組總DNA實施例中均獲得了大量DNA，提取到的DNA顏色為透明色，經(jīng)紫外分光光度計檢測，O擬60/0D280在1. 8 1. 9，說明該DNA純度較好。同時將提取的DNA在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上檢測發(fā)現(xiàn)，該方法提取的番茄總DNA有清晰的主帶，幾乎沒有降解，無RNA污染，所以提取的總DNA質(zhì)量較好。


圖1采用本方法提取的番茄基因組總DNA樣品電泳圖片；圖2采用傳統(tǒng)CTAB法提取的番茄基因組總DNA樣品電泳圖片；
具體實施例方式下面用具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。實施例11、樣品的采集與研磨采摘番茄植株側(cè)枝上10片長寬約Icm的幼嫩葉片，裝入2ml的離心管，加滿液氮后置于預(yù)冷的離心管架上迅速用研磨棒研磨至粉末狀；2、番茄基因組總DNA提取(1)粗提DNA 加65°C的2XCTAB提取液900ul和30ul的β -巰基乙醇，混合均勻后65°C水浴60min，每隔5min上下顛倒混勻一次；
(2)抽提DNA 取出離心管放冰上冷卻lOmin，加4°C預(yù)冷的Tris飽和酚氯仿 異戊醇05 24 1)溶液抽提一次，加4°C預(yù)冷的氯仿異戊醇04 1)溶液抽提2次， 轉(zhuǎn)移上清至1. 5ml的離心管；(3)沉淀與洗滌DNA 加4°C預(yù)冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液，放_20°C下沉淀池， 40C HOOOrpm離心lOmin，棄上清，加70%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干后加TE溶液溶解沉淀；(4)純化DNA 向管內(nèi)加RNAase, 37°C水浴60min，加4°C預(yù)冷的Tris飽和酚氯仿異戊醇05 24 1)溶液抽提1次，加氯仿異戊醇04 1)溶液抽提2次，轉(zhuǎn)移上清至新1. 5ml離心管；(5)沉淀、洗滌、溶解DNA樣品加4°C預(yù)冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液，放_20°C 冰箱中沉淀:3h，4°C 14000rpm離心lOmin，棄上清，加70%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，加TE溶液溶解沉淀，放-20°C下長期保存。實驗結(jié)果用該方法在提取番茄植株基因組總DNA實施例中均獲得了大量DNA，提取到的DNA 顏色為透明色，經(jīng)紫外分光光度計檢測，0D260/0D280在1. 8 1. 9，說明該DNA純度較好。 同時將提取的DNA在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上檢測發(fā)現(xiàn)，該方法提取的番茄總DNA有清晰的主帶，幾乎沒有降解，無RNA污染，所以提取的總DNA質(zhì)量較好。以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.番茄基因組總DNA提取試劑盒，其特征在于，包括以下試劑(1)IM Tris-HCl (ρΗ8· 0)稱取Tris · base 12. 114g，用少量蒸餾水加熱溶解，溶解后用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH = 8. 0，最后加水定容至100mL，12rC 25min高壓滅菌；(2)0.25M EDTA (pH8. 0)稱取EDTA鈉鹽9. 305g，加少量蒸餾水溶解后，用NaOH調(diào)至pH =8. 0，最后加水定容至IOOmL, 121 °C 25min高壓滅菌；(3)2.5M NaCl 稱取14. 625g Nacl，加蒸餾水溶解后定容至IOOmL ；(4)TE (pH8. 0)溶液量取前面滅過菌的 IM Tris-HCl (pH8. 0) ImL, 0. 25MEDTA (pH8. 0)0. 4mL，加水定容至 IOOmL 備用；(5)Tris飽和酚氯仿異戊醇(25 24 1)量取50mL Tris飽和酚，48ml氯仿禾口 2mL異戊醇，混勻即可；(6)氯仿異戊醇04 1)量取96ml氯仿和4mL異戊醇，混勻即可；(7)70%乙醇量取70mL無水乙醇，加水定容至IOOmL ；(8)3M乙酸鈉(PH = 5. 2)稱量40. 8gNaAC · 3H20于IOOml燒杯中，加入約40ml的蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，加入冰醋酸調(diào)節(jié)PH值至5. 2，蒸餾水定容至100ml，121°C 25min高壓滅菌；(9)無水乙醇；(10)2 X CTAB 提取液；(11)β-巰基乙醇;(12)異丙醇。
2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述試劑盒進(jìn)行番茄基因組總DNA提取的方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行(1)樣品的采集與研磨采摘番茄植株上10片長寬約Icm的幼嫩葉片，裝入2ml的離心管，加滿液氮后置于預(yù)冷的離心管架上迅速用研磨棒研磨至粉末狀；(2)粗提DNA 加65°C的2 X CTAB提取液900ul和30ul的β -巰基乙醇，混合均勻后65°C水浴 60min，每隔5min上下顛倒混勻一次；(3)抽提DNA 取出離心管放冰上冷卻lOmin，加4°C預(yù)冷的Tris飽和酚氯仿異戊醇05 24 1)溶液抽提一次，加4°C預(yù)冷的氯仿異戊醇04 1)溶液抽提2次，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml的離心管；(4)沉淀與洗滌DNA:加4°C預(yù)冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液，放_20°C下沉淀池，40C HOOOrpm離心lOmin，棄上清，加70% 的乙醇溶液洗滌沉淀2次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干后加TE溶液溶解沉淀；(5)純化DNA 向管內(nèi)加RNAase, 37°C水浴60min,加4°C預(yù)冷的Tris飽和酚氯仿 異戊醇05 24 1)溶液抽提1次，加氯仿異戊醇04 1)溶液抽提2次，轉(zhuǎn)移上清至新1. 5ml離心管；(6)沉淀、洗滌、溶解DNA樣品加4°C預(yù)冷的異丙醇溶液和醋酸鈉溶液， 放_20°C冰箱中沉淀池，40C HOOOrpm離心lOmin，棄上清，加70%的乙醇溶液洗滌沉淀2 次，加無水乙醇溶液洗滌沉淀1次，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，加TE溶液溶解沉淀，放-20°C下長期保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中所采摘的番茄幼嫩葉片為番茄生長側(cè)枝上的葉片，葉片應(yīng)依次放入離心管，相互之間不能擠壓。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟O)中的2XCTAB提取液，每IOOml 2XCTAB 提取液由 10%的 CTAB(W/V)溶液 20ml、IM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液 lOml.O. 25M EDTA (pH = 8. 0)溶液 8ml、0. 25M NaCl 溶液 56ml，雙蒸水 6ml 組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中所加Tris飽和酚氯仿異戊醇05 24 1)溶液為900ul進(jìn)行1次抽提，所加氯仿異戊醇04 1)溶液的體積與第一次抽提后所取上清體積相同，每次所取上清體積和所加溶液體積為SOOul 850ul。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟中所加異丙醇溶液為700ul，3M 乙酸鈉溶液為70ul，所加70 %乙醇溶液、無水乙醇溶液和TE溶液均為200ul，每IOOmlTE溶液由 IM Tris-HCl (pH = 8. 0) ImL, 0. 25M EDTA (pH = 8. 0)0. 4mL，雙蒸水 98. 6mL 配制而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的的方法，其特征在于步驟(5)中，所加RNAase的濃度為 IOmg · ml-1，加入Iul，所加1Tris飽和酚氯仿異戊醇Q5 24 1)溶液為200ul，所加氯仿異戊醇04 1)溶液的體積與第一次抽提后所取上清體積相同，每次所取上清體積和所加溶液體積為150ul 200ul。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的的方法，其特征在于步驟(6)中，所加異丙醇溶液為200ul， 3M乙酸鈉溶液為20ul，所加70%乙醇溶液、無水乙醇溶液為200ul，TE溶液為IOOul，每 IOOmlTE 溶液由 IM Tris-HCl (pH = 8. 0) ImL, 0. 25M EDTA (pH = 8. 0)0. 4mL，雙蒸水 98. 6mL 配制而成。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或6或7中所述的方法，其特征在于1MTris-HCl (pH = 8. 0)溶液和0. 25M EDTA (pH = 8. 0)溶液其特征在于=IM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為8.0，0. 25M EDTA (pH = 8. 0)溶液用NaOH調(diào)至pH值為8. 0，兩溶液均用雙蒸水配制， 121°C 25min高壓滅菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于各化學(xué)試劑的純度等級均為化學(xué)分析純等級，各化學(xué)藥品的稱量使用千分之一的電子天平，液體試劑配制使用容量瓶和精密移液槍，DNA提取過程中各上清液的吸取使用精密移液槍吸取。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)番茄的生長習(xí)性提供了一種番茄基因組總DNA提取試劑盒及其提取方法，包括以下試劑(1)1M Tris-HCl(pH8.0)；(2)0.25M EDTA(pH8.0)；(3)2.5M NaCl；(4)TE(pH8.0)溶液；(5)Tris飽和酚氯仿；(6)氯仿；(7)70％乙醇；(8)3M乙酸鈉(PH＝5.2)；(9)無水乙醇；(10)2×CTAB提取液；(11)β-巰基乙醇；(12)異丙醇。該方法主要包括取材冷卻研磨、加緩沖液振蕩后水浴抽提、放置沉淀、洗滌沉淀、風(fēng)干純化、溶解保存等步驟。本發(fā)明優(yōu)化了番茄基因組DNA提取過程中番茄葉片用量、液氮研磨方法、水浴時間、洗滌以及純化步驟等參數(shù)，可有效防止DNA的褐化，建立了一種適合大批量提取番茄幼嫩葉片基因組DNA的方法。用本發(fā)明方法提取番茄葉片的基因組DNA時間短、速度快、提取效率高，提取的DNA質(zhì)量穩(wěn)定，可應(yīng)用于番茄種群遺傳學(xué)、分子標(biāo)記輔助育種等研究。
文檔編號C12N15/10GK102533731SQ201210016509
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者吳江敏, 孫亞東, 梁燕, 鄭戌翔 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)