專利名稱：一種構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物細(xì)胞學(xué)中構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型對(duì)藥用食用真菌中降血脂有效成分進(jìn)行篩選的方法。
背景技術(shù)：
泡沫細(xì)胞指富含脂質(zhì)的吞噬細(xì)胞。細(xì)胞漿內(nèi)脂質(zhì)在制片過程中被有機(jī)溶劑溶解而抽提，染色后呈淡色泡沫狀結(jié)構(gòu)而得名。泡沫細(xì)胞形成是動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期事件， 在血管內(nèi)皮發(fā)生損傷的情況下，血液中的單核細(xì)胞通過內(nèi)皮間隙，在內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)滲入血管內(nèi)皮下的低密度脂蛋白膽固醇發(fā)生氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白膽固醇，并主要通過A型清道受體吞噬大量氧化型低密度脂蛋白膽固醇，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，形成泡沫細(xì)胞。越來越多的泡沫細(xì)胞堆積在一起形成脂質(zhì)條紋乃至脂質(zhì)斑塊。傳統(tǒng)的檢測(cè)降血脂藥物的方法特別是食用藥用真菌中提取到混合物和分離得到的活性物質(zhì)的方法大多為構(gòu)建高血脂小鼠模型，但是動(dòng)物模型具有個(gè)體差異大，受操作和環(huán)境影響大，用藥量大并且后期藥效的檢測(cè)方式復(fù)雜，試驗(yàn)周期長(zhǎng)耗時(shí)耗力，不能進(jìn)行大規(guī)模的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法，有效地解決了目前存在的難題。本發(fā)明所述的構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法，包括下述步驟
(1)構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型對(duì)小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞7進(jìn)行M孔板種板，每孔接種量為2*104個(gè)處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁率達(dá)到60—80%時(shí)進(jìn)行分組，分別設(shè)置正常組，模型組，正對(duì)照組和加藥組；
正常組為貼壁率達(dá)到60—80%正常巨噬細(xì)胞7繼續(xù)培養(yǎng)M h ； 模型組為在貼壁率達(dá)到60—80%的7巨噬細(xì)胞中加入終濃度為70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)M h后形成泡沫細(xì)胞；
正對(duì)照組為貼壁率達(dá)到60—80%的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白和終濃度為100 Pg/mL的辛伐他丁繼續(xù)培養(yǎng)M h ；
藥物組為貼壁率達(dá)到60—80%的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70 Pg/ml的氧化低密度脂蛋白和終濃度依次為50 Pg/mL、100 Pg/mL、200 Pg/mL的濃度梯度的目的藥物繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。(2)細(xì)胞泡沫化程度的形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基用PBS沖洗細(xì)胞數(shù)次，中性甲醛固定30 min后加入油紅0染液，37°C染色10 min，60%異丙醇脫色后進(jìn)行倒置顯微鏡觀察并拍照；
(3)泡沫細(xì)胞脂流出的檢測(cè)12孔板按每孔2X IO4細(xì)胞數(shù)接種巨噬細(xì)胞7，細(xì)胞融合達(dá)70-80%按上述第(1)步驟中方法分組為正常組、模型組、正對(duì)照組、藥物組，棄掉陳舊培養(yǎng)基，換成10%無脂蛋白血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行脂流出的檢測(cè)。本發(fā)明中所述脂流出檢測(cè)的方法是培養(yǎng)M h后用PBS洗板3次，每次ImL/孔； 每孔中加入1 mL的PBS，細(xì)胞刮小心刮取，轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液入相應(yīng)的玻璃管，室溫，離心，800 rpm,2 min ；移走上面PBS，迅速加入體積比3:2的己烷異丙醇溶液，900 μ 1/每孔，提脂， 室溫放置30 min ；將溶液平均分兩份分別移入4 mL的EP管中，一份用于測(cè)定游離膽固醇， 一份用于測(cè)定總膽固醇；總膽固醇減去游離膽固醇得到膽固醇酯。本方法是基于細(xì)胞學(xué)上的降血脂藥物的篩選和藥效的檢測(cè)，具有用藥量少，檢測(cè)周期短，操作簡(jiǎn)單藥品消耗少，受環(huán)境因素影響小，并且藥效檢測(cè)具有很高的承認(rèn)度等一系列優(yōu)點(diǎn)，可以為食用藥用真菌中提取的具有降血脂藥物的檢測(cè)和篩選提供可靠的平臺(tái)。通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，以辛伐他丁為正對(duì)照，在構(gòu)建的泡沫細(xì)胞模型上我們的杏鮑菇水提多糖混合物 PEPE (Pleurotus eryngii water-soluble polysaccharidicextracts)具有很好的促進(jìn)泡沫細(xì)胞的脂流出，與前期動(dòng)物細(xì)胞模型上降血脂功效的檢測(cè)效果一致。本發(fā)明不僅可以對(duì)大型食用藥用真菌中的有效降血脂活性成分進(jìn)行檢測(cè)和篩選， 對(duì)于其它合成材料或生物活性提取物中的相關(guān)降血脂有效成分也能進(jìn)行鑒定和篩選，并且可以為降血脂在細(xì)胞水平上的機(jī)理的研究提供依據(jù)，具有良好的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。


圖1是細(xì)胞泡沫化程度的形態(tài)學(xué)觀察照片。圖2泡沫細(xì)胞脂流出檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式1、構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型。對(duì)巨噬細(xì)胞7 (細(xì)胞系是美國(guó)ATCC產(chǎn)品，上海申科生物科技有限公司代理銷售)進(jìn)行M孔板種板，每孔接種量為2X IO4個(gè)處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)條件為10%DMEM培養(yǎng)基，溫度37攝氏度，二氧化碳濃度5%。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁率達(dá)到60—80%進(jìn)行泡沫細(xì)胞的構(gòu)建和加藥實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置正常組，模型組，正對(duì)照組和加藥組。正常組為貼壁率達(dá)到60—80%正常巨噬細(xì)胞7繼續(xù)培養(yǎng)M h ；模型組為在貼壁率達(dá)到60—80%的7巨噬細(xì)胞中加入終濃度為70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白 (OX-LDL)進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)M h后形成泡沫細(xì)胞；正對(duì)照組為貼壁率達(dá)到60—80%的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70ug/ml的氧化低密度脂蛋白和終濃度為lOOug/ml的辛伐他丁繼續(xù)培養(yǎng)M h ；藥物組為貼壁率達(dá)到60—80%的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70 Pg/mL 的氧化低密度脂蛋白和終濃度和終濃度依次為50 Pg/mL、100 Pg/mL、200 Pg/mL的濃度梯度的目的藥物PEPE繼續(xù)培養(yǎng)M h。2、細(xì)胞泡沫化程度的形態(tài)學(xué)觀察。上述各組處理的細(xì)胞培養(yǎng)M h后，吸去培養(yǎng)基用PBS沖洗細(xì)胞數(shù)次，中性甲醛固定30 min后加入油紅0染液，37°C染色10 min, 60%異丙醇脫色后進(jìn)行倒置顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果如圖1，通過油紅0對(duì)細(xì)胞中的脂質(zhì)進(jìn)行染色可以看出，在以RAW^H. 7細(xì)胞為基礎(chǔ)以氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)形成的泡沫細(xì)胞通過采用PEPE治療后與正對(duì)照辛伐他丁和正常細(xì)胞以及高脂模型細(xì)胞相比較可以看出，在經(jīng)過 PEPE治療的泡沫細(xì)胞模型均有很好的脂流出效果，相對(duì)于高脂泡沫細(xì)胞而言得到了很好的治療效果，與前期我們?cè)谛∈竽Ｐ蜕系臋z測(cè)效果是一致的，說明該細(xì)胞模型上建立的泡沫細(xì)胞模型可以對(duì)杏鮑菇水溶性多糖提取物(PEPE)的降血脂成分具有檢測(cè)和篩選作用。3、泡沫細(xì)胞脂流出的檢測(cè)。1) 12孔板按每孔2 X IO4細(xì)胞數(shù)接種巨噬細(xì)胞7，細(xì)胞融合達(dá)70-80%按上述第1步驟中方法分組為正常組、模型組、正對(duì)照組、藥物組，棄掉陳舊培養(yǎng)基，換成10% 無脂蛋白血清(LPDS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行脂流出的檢測(cè)，檢測(cè)方法如下；
2)用PBS洗板3次，每次ImL/孔；
3)每孔中加入ImL的PBS，細(xì)胞刮小心刮取，轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液入相應(yīng)的玻璃管，室溫，離心，800 rpm,2 min ；
4)小心移走上面PBS，迅速加入己烷異丙醇溶液(3:2)，900μ 7每孔，提脂，室溫放置 30 min ；
5)將溶液平均分兩份分別移入4mL的EP管中，一份用于測(cè)定游離膽固醇(FC)，一份用于測(cè)定總膽固醇(TC)。總膽固醇減去游離膽固醇得到膽固醇酯(CE)。在對(duì)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)進(jìn)行提取后進(jìn)行熒光酶法檢測(cè)，并與總蛋白進(jìn)行對(duì)比，得到單位蛋白內(nèi)的脂含量如圖2，通過數(shù)據(jù)可以看出，在經(jīng)過PEPE治療后，泡沫細(xì)胞中的脂流出相比較于正對(duì)照組辛伐他丁和誘導(dǎo)組，經(jīng)過杏鮑菇水溶性多糖提取物(PEPE)治療后的泡沫細(xì)胞模型中的脂流出顯著增加了 20%-40%，并且具有劑量依賴效應(yīng)，說明該泡沫細(xì)胞模型可以很好的起到對(duì)食用藥用真菌中的降血脂成分的檢測(cè)和篩選作用。細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯測(cè)定操作如下 1試劑配制
1.1普通試劑終濃度
HRP: 60 U/mL ；HPAA (4-hydroxypheyl acetic acid) 0. 3mg/mL ；0. 05M NaH2P04^7t 液，pH 7. 0: 50mL ；Cholesterol Oxidase :0. 16U/mL ；最后體積 50mL，完全混合，避光放
置。現(xiàn)用現(xiàn)配。1.2膽固醇酯酶的配置
1)膽固醇酯酶?jìng)溆靡好科?5U，用0. ImL蒸餾水溶解得到備用液A (0.25U/yL)。2)稀釋將16 μ L備用液A加9 μ L水得到25 μ L濃度為0. 16U/μ L(膽固醇酯酶)(最終備用液)。現(xiàn)用現(xiàn)配。1. 3膽固醇標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)備
1)配制0. OlM的膽固醇，將一定量的膽固醇溶于50 mL的異丙醇中。2)準(zhǔn)備好的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品蓋子要密封，且用封口膜包好。2 提脂
1)按每孔2XIO5細(xì)胞數(shù)接種于六孔板，細(xì)胞融合達(dá)70-80%，棄掉陳舊培養(yǎng)基，換成10% LPDS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)給予不同的藥物處理相應(yīng)的時(shí)間
2)用PBS洗板三次，每次ImL/孔3)每孔中加入ImL的PBS，細(xì)胞刮小心刮取，轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液入相應(yīng)的玻璃管，室溫，離心，800 rpm,2 min
4)小心移走上面PBS，迅速加入己烷異丙醇溶液(3:2)，900μ 7每孔，提脂，室溫放置 30 min
5)將溶液平均分兩份分別移入4mL的EP管中，不能接觸上部(要特別小心，不接觸試管上部，直接加到底部)，一份用于測(cè)定游離膽固醇，一份用于測(cè)定總膽固醇。6)將樣品用隊(duì)干燥 7)將培養(yǎng)孔置室溫干燥 3測(cè)量游離膽固醇
1)將0.OlM的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0 biiM。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型對(duì)巨噬細(xì)胞7進(jìn)行M孔板種板，每孔接種量為2*104 個(gè)處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁率達(dá)到60—80%時(shí)進(jìn)行分組，分別設(shè)置正常組，模型組，正對(duì)照組和加藥組；正常組為貼壁率達(dá)到60—80%正常巨噬細(xì)胞7繼續(xù)培養(yǎng)M h ；模型組為在貼壁率達(dá)到60—80%的7巨噬細(xì)胞中加入終濃度為70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)M h后形成泡沫細(xì)胞；正對(duì)照組為貼壁率達(dá)到60—80%的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白和終濃度為lOOug/mL的辛伐他丁繼續(xù)培養(yǎng)M h ；藥物組為貼壁率達(dá)到60—80%的巨噬細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為70 Pg/mL的氧化低密度脂蛋白和終濃度和終濃度依次為50 Pg/mL、100 Pg/mL、200 Pg/mL的濃度梯度的目的藥物繼續(xù)培養(yǎng)M h ；(2)細(xì)胞泡沫化程度的形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基用PBS沖洗細(xì)胞數(shù)次，中性甲醛固定30 min后加入油紅0染液，37°C染色10 min，60%異丙醇脫色后進(jìn)行倒置顯微鏡觀察并拍照；(3)泡沫細(xì)胞脂流出的檢測(cè)12孔板按每孔2XIO4細(xì)胞數(shù)接種巨噬細(xì)胞7，細(xì)胞融合達(dá)70-80%按上述第(1)步驟中方法分組為正常組、模型組、正對(duì)照組、藥物組，棄掉陳舊培養(yǎng)基，換成10%無脂蛋白血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)對(duì)h后進(jìn)行脂流出的檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型檢測(cè)食用菌中降血脂有效成分的方法，其中所述脂流出檢測(cè)的方法是培養(yǎng)24h后用PBS洗板3次，每次ImL/孔；每孔中加入ImL的 PBS，細(xì)胞刮小心刮取，轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液入相應(yīng)的玻璃管，室溫，離心，800 rpm，2 min ；移走上面PBS，迅速加入體積比3:2的己烷異丙醇溶液，900 μ L/每孔，提脂，室溫放置30 min ； 將溶液平均分兩份分別移入4 mL的EP管中，一份用于測(cè)定游離膽固醇，一份用于測(cè)定總膽固醇；總膽固醇減去游離膽固醇得到膽固醇酯。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物細(xì)胞學(xué)中構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型對(duì)藥用食用真菌中降血脂有效成分進(jìn)行篩選的方法。該方法是通過采用氧化低密度脂蛋白OX-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7造成脂肪變性的泡沫細(xì)胞，并結(jié)合油紅O染色和測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇含量以及游離膽固醇和膽固醇脂的含量來檢測(cè)胞內(nèi)膽固醇的流出情況，以達(dá)到驗(yàn)證該巨噬細(xì)胞是否產(chǎn)生脂肪變性和損害以及藥物對(duì)其治療效果，通過檢測(cè)泡沫細(xì)胞模型上的治療效果來檢測(cè)和篩選食用真菌中降血脂的有效成分。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK102559845SQ20121001651
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者陸玲, 陳晶晶, 雍陽陽 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)