專利名稱：用于治療或預(yù)防與血脂和血糖水平升高相關(guān)的疾病的含有新橙皮苷雙氫查爾酮的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的與血脂和血糖水平升高相關(guān)的疾病如高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、肝病和高血糖的藥物組合物，該組合物包括有效量的作為活性組分的新橙皮苷雙氫查爾酮以及藥學(xué)可接受的載體；本發(fā)明還涉及用于治療此類疾病的功能食品或飲料組合物，其包括有效量的新橙皮苷雙氫查爾酮。
酰基CoA-膽甾醇-o-?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)促進(jìn)血液中膽甾醇的酯化作用。泡沫細(xì)胞是通過ACAT的作用形成的，其含有大量的由血液中的低密度脂蛋白攜帶的膽甾醇酯。在動(dòng)脈壁上泡沫細(xì)胞的形成會(huì)隨ACAT的活性而增加，因而ACAT的抑制劑也可以是防止動(dòng)脈硬化的試劑。另外，已報(bào)導(dǎo)，通過抑制ACAT活性可以降低血液LDL-膽甾醇的水平(參見Witiak,D.T.和D.R.Feller(eds.),Anti-LipidemicDrugs:Medicinal Chemical and Biochemical Aspects,Elsevier,pp159-195(1991))。
此外，已有報(bào)導(dǎo)，通過抑制介導(dǎo)脂蛋白間膽甾醇的轉(zhuǎn)移的膽甾醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)或抑制介導(dǎo)甲羥戊酸，一種生物合成甾醇或類異戊二烯的中間體合成的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，而降低膽甾醇的生物合成速率，可以有效地治療高膽甾醇血癥(參見Cardiovascular Pharmacology,William W.Parmlev和Kanu Chatterjee Ed.,Wolfe Publishing,pages 8.6-8.7,1994)。
因而，人們進(jìn)行了許多努力以開發(fā)抑制HMG-CoA還原酶的藥物；結(jié)果，已有從青霉屬和曲霉屬衍生而來的幾種化合物被商品化。具體說來，由美國的Merck公司開發(fā)的洛伐他汀和辛伐他汀，以及由日本的Sankyo公司開發(fā)的普伐他汀已被商品化(參見C.D.R.Dunn,Stroke:Trends.Treatment and Markets,SCRIPT Report,PJBPublications Ltd.,1995)。
但是，這些藥物非常昂貴，且其長期給予已知在中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起不利的副作用。此外，雖然洛伐他汀和辛伐他汀可通過增強(qiáng)肝中LDL受體的活性來降低血漿LDL膽甾醇水平，但它們引起諸如肝中肌酸激酶增加和橫紡肌溶解癥等副作用(參見Farmer,J.A.，等，Baillers-clin.Endocrinol.Metal.,9,825-847(1995))。因而，仍需要開發(fā)便宜且無毒的HMG-CoA還原酶抑制劑。
與血脂水平升高相關(guān)的疾病的另一個(gè)例子是脂肪肝。特別地，過度攝取含脂肪的食物和醇類引起脂肪肝，其中，大量的脂質(zhì)沉積于肝組織中，血清GOT(谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶)、GPT(谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶)和γ-GTP(γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶)水平升高(參見T.Banciu等，Med Interne.,20,69-71(1982)和A.Par等，Acta.Med Acad.Sci.Hung.,33,309-319(1976))。
脂肪主要以甘油三酯和脂肪酸的形式積聚在肝臟中，同時(shí)少量地以膽甾醇的形式積聚。另外，已有報(bào)導(dǎo)，脂肪肝的一個(gè)主要跡象是高血膽甾醇和/或甘油三酯含量。因而，脂肪肝與血液中膽甾醇含量和/或甘油三酯含量密切相關(guān)。
另一方面，高血糖是一種在發(fā)達(dá)國家的成年人群中的一種常見疾病。Ⅰ型高血糖，例如胰島素依賴性糖尿病，可通過給予胰島素來治療，但超過90％的高血糖患者患有非胰島素依賴性高血糖，胰島素治療對(duì)其無效。雖然已開發(fā)出許多的藥物用于非胰島素依賴性高血糖患者，但這些藥物仍是無效且相對(duì)毒性的。
生物類黃酮是多酚類抗氧化劑，其廣泛存在于自然界，特別是蔬菜、水果、葡萄酒等中。已有報(bào)導(dǎo)，生物類黃酮顯示出各種有用的藥理活性，如抗炎、毛細(xì)管增強(qiáng)、抗氧化、抗癌、抗病毒和抗血小板聚集活性(參見O.Benavente-Garcia等，柑桔類黃酮的用途和性質(zhì)，J Aqr.Food Chem.,45,4506-4515,1997)。
表1列出了可在柑桔中找到的代表性的生物類黃酮。表1
新橙皮苷雙氫查爾酮，一種可以容易地從圓軸提取或從柚苷合成的生物類黃酮，已知其甜度比蔗糖高1000-1500倍。
本發(fā)明的發(fā)明人致力于開發(fā)生物類黃酮的新的藥理學(xué)用途，這種物質(zhì)在藥草、食物、蔬菜和水果中含量豐富。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷雙氫查爾酮可有效地治療或預(yù)防與血脂和血糖水平升高相關(guān)的疾病。具體而言，對(duì)哺乳動(dòng)物，其可大大降低血漿膽甾醇水平；抑制HMG-CoA還原酶和ACAT的活性；抑制巨噬細(xì)胞-脂質(zhì)復(fù)合物在動(dòng)脈的內(nèi)皮壁上積聚；預(yù)防肝功能不良；降低血糖水平。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療或預(yù)防與血脂或血糖水平升高相關(guān)的疾病的含有新橙皮苷雙氫查爾酮食品或飲料組合物。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種治療或預(yù)防與血脂或血糖水平升高相關(guān)的疾病的藥物組合物，該組合物包括作為活性組分的新橙皮苷雙氫查爾酮和藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
發(fā)明詳述在整個(gè)發(fā)明書中，術(shù)語“血脂”指存在于血液中的脂質(zhì)，“血糖”指存在于血液中的葡萄糖。血脂由血液中的膽甾醇和甘油三酯代表。
術(shù)語血脂或血糖“高或升高的水平”指高于正常水平，正常水平根據(jù)患者的具體情況如年齡、性別和體重而改變。血脂或血糖水平高通常被認(rèn)為是有害于健康的。
術(shù)語“與血脂水平升高相關(guān)的疾病”或“與血糖水平升高相關(guān)的疾病”指由于血脂或血糖水平高或升高引起的疾病，和/或其癥狀包括血脂或血糖水平高或升高的疾病。這些疾病的實(shí)例包括高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、肝病如脂肪肝，以及高血糖等。
新橙皮苷雙氫查爾酮(C28H36O15,M.W.612.60，參見MerckIndex 11th ed.(1989))可以容易地從圓軸的皮中提取或根據(jù)常規(guī)方法從柚苷合成。
新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)與血脂和血糖水平升高相關(guān)的疾病發(fā)揮抑制及治療作用，這些疾病例如，高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、肝疾。另外，盡管新橙皮苷雙氫查爾酮的功效有力，但當(dāng)它以1000 mg/kg的劑量口服給予小鼠時(shí)，它未顯示毒性。此外，它對(duì)肝功能沒有不利影響。
可根據(jù)任何常規(guī)過程制備藥物配方。在制備配方時(shí)，活性組分優(yōu)選用載體混合或稀釋，或者封裝于膠囊、小藥囊(sachet)或其它容器的形式的載體中。當(dāng)載體用作稀釋劑時(shí)，其可以是固體、半固體或液體物質(zhì)，來充當(dāng)活性組分的載色劑、賦形劑或介質(zhì)。因此，配方的形式可是片劑、丸劑、粉劑、小藥囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣霧劑、軟和硬明膠膠囊、無菌注射液、無菌小包裝(packaged)粉劑等。
合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。配方另外可以包括填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、矯味劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可通過使用任何本領(lǐng)域熟知的過程來配方以在將它們給予哺乳動(dòng)物后提供活性成分的速釋、緩釋或延遲釋放。
本發(fā)明的藥物組合物可通過各種途徑給予，包括口服、經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)和肌內(nèi)引入。對(duì)于人類，生物類黃酮通常的每日劑量可以在約0.1到500mg/Kg體重，優(yōu)選為1到100mg/Kg體重，并且可單次劑量或分多次劑量給予。
然而，應(yīng)該理解實(shí)際給予的活性組分的量應(yīng)該由各種相關(guān)因素確定，這些因素包括要治療的癥狀、選擇的給予途徑、各病人的年齡、性別和體重，以及病人癥狀的嚴(yán)重程度；因而，以上劑量不應(yīng)試圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
另外，新橙皮苷雙氫查爾酮被混入食品或飲料中，用以治療或預(yù)防與血脂和血糖水平升高相關(guān)的疾病，如高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、肝病和高血糖。食品或飲料可以包括肉；汁如蔬菜汁(例如胡蘿卜汁和番茄汁)和果汁(例如橙汁、葡萄汁、菠蘿汁、蘋果汁和香蕉汁)；巧克力；小吃；糖果；比薩；用谷粉制成的食品如面包、蛋糕、薄脆餅干、曲奇、餅干、面條等；膠質(zhì)軟糖；乳制品如牛奶、干酪、酸奶和冰淇淋；湯；肉湯；醬，番茄醬和沙司；茶；酒精飲料；碳酸飲料；維生素復(fù)合物；以及各種保健食品。
新橙皮苷雙氫查爾酮在食品或飲料中的含量可為0.01-20wt％，優(yōu)選為0.1-5wt％。
如上所述，新橙皮苷雙氫查爾酮可用作有效且無毒的藥物，治療或預(yù)防與血脂和血糖水平升高相關(guān)的疾病，如高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、肝病和高血糖。
下述實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但它們并非對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
另外，以下所給的固體混合物中固體的百分比、液體中液體的百分比以及液體中固體的百分比分別基于wt/wt、vol/vol、wt/vol，且除非特別說明，所有的反應(yīng)都在室溫下進(jìn)行。實(shí)施例1口服給予新橙皮苷雙氫查爾酮的毒性將12只7周大的無特殊病原體的ICR雌性小鼠，6只每只體重為約25-29g的雌性小鼠和6只每只體重為約34-38g的雄性小鼠保持在溫度22±1℃，相對(duì)濕度55±5％及光周期12L/12D的環(huán)境中。將飼料(Cheiljedang Co.，小鼠和大鼠飼料)和水消毒并喂給小鼠。
將購自Aldrich-Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,U.S.A)的新橙皮苷雙氫查爾酮溶解于0.5％吐溫80中至濃度為100mg/ml，將溶液口服給予小鼠，用量為0.2ml/20g小鼠體重。將溶液給予小鼠一次，按照以下時(shí)間表觀察不利影響或死亡的信號(hào)10天給予后1、4、8和12小時(shí)，此后每隔12小時(shí)，記錄小鼠重量的變化以檢查新橙皮苷雙氫查爾酮的作用。另外，在第10天時(shí)，將小鼠處死，目視觀察內(nèi)部器官。
所有的小鼠在第10天均存活，在劑量為1000mg/kg下，新橙皮苷雙氫查爾酮未顯示毒性。尸體解剖表明，小鼠并未發(fā)生任何病理學(xué)異常，在10天的試驗(yàn)期內(nèi)，未觀察到體重減少。因而，可以得出結(jié)論，當(dāng)口服給予動(dòng)物時(shí)，新橙皮苷雙氫查爾酮無毒。實(shí)施例2新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)血漿膽甾醇、HDL-膽甾醇和中性脂質(zhì)水平的影響(步驟1)給予大鼠新橙皮苷雙氫查爾酮將20只3周大的白色Sprague-Dawley大鼠(Taihan laboratoryanimal center，韓國)，每只體重大約為90-110g，通過隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)平均地分成兩個(gè)食物組。兩組大鼠分別用兩種不同的高膽甾醇含量的飼料飼養(yǎng)，即，含有1％膽甾醇(對(duì)照組)，l％膽甾醇加0.05％新橙皮苷雙氫查爾酮組(新橙皮苷雙氫查爾酮組)的AIN-76實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物食物(ICN Biochemicals,Cleveland,OH，美國)。給兩組大鼠進(jìn)食的食物的組成如表2所示表2
*1購自TEKLAD premier Co.(Madison,WI，美國)*2購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO，美國)
在6周內(nèi)，使大鼠自由進(jìn)食指定的食物及水，每日記錄攝取量，每7天對(duì)大鼠稱重，然后對(duì)記錄進(jìn)行分析。所有的大鼠均顯示出正常的生長速度，在食物攝取量和體重增加方面兩組間沒有顯著差異。(步驟2)測定血液中的總膽甾醇、HDL-膽甾醇和中性脂質(zhì)含量如下測定給予大鼠新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)血漿膽甾醇和中性脂質(zhì)含量的影響。
將在步驟1中得到的兩個(gè)食物組的大鼠處死，從其取血樣。將血液放置2小時(shí)，在3000rpm下離心15分鐘，分離出上清液，在使用前貯藏于深冷冷凍機(jī)中。采用血液化學(xué)分析儀(CIBA Coming 550Express，美國)對(duì)血液進(jìn)行化學(xué)分析，測定總膽甾醇、HDL-膽甾醇和甘油三酯水平的變化。結(jié)果如表3所示。表3
*總-C總-膽甾醇*HDL-C:HDL-膽甾醇*TG甘油三酯從表2可以看出，總血漿膽甾醇水平新橙皮苷雙氫查爾酮組比對(duì)照組低15％。另外，中性脂質(zhì)含量新橙皮苷雙氫查爾酮組比對(duì)照組低9％。實(shí)施例3新橙皮苷雙氫查爾酮在抑制ACAT中的活性(步驟1)制備微粒體為測定給大鼠進(jìn)食新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)ACAT活性的影響，從準(zhǔn)備使用的肝組織中分離出微粒體作為酶源。
將來自實(shí)施例2每一組大鼠的各1g肝在5ml的均化介質(zhì)(0.1MKH2PO4,pH7.4,0.1mM EDTA和10mMβ-巰基乙醇)中均化。將勻漿在3000xg及4℃下離心15分鐘，將這樣得到的上清液在15000xg及4℃下離心15分鐘，得到上清液。將該上清液放入超離心管(Beckman)中，并在100000xg及4℃下離心以得到微粒體小丸，然后，將其懸浮于3ml的均化介質(zhì)中并在100000xg及4℃下離心1小時(shí)。將所得到的小丸懸浮于1ml的均化介質(zhì)中。用Lowry法測定形成的懸浮液中蛋白質(zhì)的濃度，并調(diào)節(jié)至4-8mg/ml。將形成的懸浮液在深冷冷凍機(jī)(Biofreezer,Forma Scientific Inc.)中貯藏。(步驟2)ACAT測定將6.67μ的1mg/ml膽甾醇的丙酮溶液與在6μl的10％TritonWR-1339(Sigma Co.)的丙酮溶液混合，然后，通過在氮?dú)夥障逻M(jìn)行蒸發(fā)，從混合物中除去丙酮。向形成的混合物中加入蒸餾水，調(diào)節(jié)膽甾醇的濃度為30mg/ml。
向10μl形成的膽甾醇水溶液中加入10μl的1MKH2PO4(pH7.4)、5μl的0.6mM牛血清白蛋白(BSA)、10μl上述步驟1得到的微粒體溶液和55μl蒸餾水(總共90μl)。將混合物在37℃的水浴中預(yù)保溫30分鐘。
再向預(yù)保溫的混合物中加入10μl的(1-14C)油?；?CoA溶液(0.05μCi，終濃度10μM)，將形成的混合物在37℃的水浴中保溫30分鐘。再向混合物中加入500μl的異丙醇∶庚烷混合物(4∶1(v/v))、300μl的庚烷和200μl的0.1M KH2PO4(pH 7.4)，將混合物用渦旋混合機(jī)劇烈混合，然后，使其在室溫下放置2小時(shí)。
將200μl形成的上清液放置在閃爍瓶中，并向其中加入4ml的閃爍液體(Lumac)。采用1450 Microbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallacoy，芬蘭)進(jìn)行放射活性測定。以每分鐘每mg的蛋白質(zhì)合成的膽甾醇油酸酯的皮摩爾數(shù)(pmols/min/mg蛋白質(zhì))來計(jì)算ACAT活性。結(jié)果如表4所示。表4
從表5可以看出，在新橙皮苷雙氫查爾酮組中觀察到的ACAT活性比在對(duì)照組中觀察到的ACAT活性低20％。實(shí)施例4新橙皮苷雙氫查爾酮在HMG-CoA還原酶抑制中的活性為了測定HMG-CoA還原酶的活性，采用Hulcher法但進(jìn)行了一些改進(jìn)(參見J.Lipid Res 14,625-641(1973))。在該方法中，通過光譜法測定輔酶-A(CoA-SH)的濃度，輔酶-A(CoA-SH)是在HMG-CoA還原酶作用下，當(dāng)HMG-CoA還原成甲羥戊酸鹽時(shí)產(chǎn)生的，從而計(jì)算出HMG-CoA還原酶活性。(步驟1)制備微粒體將取自實(shí)施例2的每一組大鼠的肝組織3g依次用100ml的冷鹽水(0.15M NaCl)和100ml的冷緩沖液A(0.1M三乙醇胺，HCl/0.2M EDTA/2 mM二硫蘇糖醇(DTT))洗滌。向肝組織中加入冷的緩沖液A，用量為2ml/1g肝組織，將混合物用均化器均化。將勻漿在15000xg下離心15分鐘，然后，將上清液在100000xg下超離心60分鐘，得到微粒體沉淀。將這樣得到的沉淀用冷的緩沖液A洗滌，并將其保持在-70℃下的1.5ml管中。(步驟2)HMG-CoA還原酶活性測定用于HMG-CoA還原酶活性測定中的反應(yīng)底物如下ⅰ)緩沖液B0.1M三乙醇胺，HCl/0.02M EDTA(pH7.4),ⅱ)HMG-CoA溶液150μmmol/培養(yǎng)介質(zhì)，以及ⅲ)NADPH溶液2μmol/培養(yǎng)介質(zhì)。
將懸浮液(微粒體)與反應(yīng)底物混合，將混合物放置在離心管中，在37℃下反應(yīng)30分鐘。將反應(yīng)混合物用20μl的0.01M亞砷酸鈉(sodium arsenous)處理，使其放置1分鐘，然后使其與100μl的檸檬酸鹽緩沖液(2M檸檬酸鹽/3％鎢酸鈉，pH 3.5)在37℃下反應(yīng)10分鐘，隨后在25000xg下離心15分鐘以除去蛋白質(zhì)。將1ml這樣得到的上清液轉(zhuǎn)移至帶蓋的管中，向其加入0.1ml的2Mtris-HCl溶液(pH10.6)和0.1ml的2Mtris-HCl溶液(pH8.0)以調(diào)節(jié)反應(yīng)物的pH值至8.0。
然后，將反應(yīng)物與20μl的DTNB緩沖液(3mM DTNB/0.1 M三乙醇胺/0.2MEDTA,pH7.4)混合，測量在412nm處混合物的吸光度以計(jì)算CoA-SH的量(HMG-CoA還原酶的活性)。
基于上述結(jié)果計(jì)算新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)HMG-CoA還原酶活性的抑制程度。結(jié)果如表5所示。表5
從表5可以看出，在新橙皮苷雙氫查爾酮組中觀察到的HMG-CoA還原酶的活性比在對(duì)照組中的活性低30％。實(shí)施例5給予人新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)血漿脂質(zhì)代謝的影響給予兩位55歲的男性每日口服劑量為10mg/kg的新橙皮苷雙氫查爾酮，藥物為膠囊形式，給予60天。測定在給予前和給予后血漿膽甾醇和中性脂質(zhì)(甘油三酯)的含量。
通過給予新橙皮苷雙氫查爾酮，血漿膽甾醇和中性脂質(zhì)含量分別降低20％和15％。實(shí)施例6動(dòng)脈硬化的抑制(步驟1)給予兔新橙皮苷雙氫查爾酮將30只3個(gè)月大的新西蘭白兔(Yeonam Horticulture和AnimalHusbandry College，韓國)，每只重約2.5-2.6kg，在下述條件下飼養(yǎng)溫度20±2℃，相對(duì)濕度55±5％和光周期12 L/12 D。將兔分成三組，三組兔用不同的食物喂養(yǎng)，即含有1％膽甾醇(對(duì)照組)，1％膽甾醇加1mg/kg洛伐他汀(Merck，美國)(洛伐他汀組)，1％膽甾醇加0.1％新橙皮苷雙氫查爾酮(新橙皮苷雙氫查爾酮組)的RC4食物(Oriental Yeast Co.，日本)。RC4食物括含7.6％的水分，22.8％的粗蛋白，2.8％的粗脂肪，8.8％的粗灰分，14.4％粗纖維素和43.6％的可溶性無氮物質(zhì)。新橙皮苷雙氫查爾酮購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。
將兔喂養(yǎng)6周，期間使其自由進(jìn)食食物和水。(步驟2)血液的化學(xué)分析在6周后，在股骨區(qū)肌內(nèi)注射氯胺酮(50mg/kg)將兔麻醉并處死。從每只兔的心臟取得血樣，使其放置2小時(shí)，在3000 rpm下離心15分鐘，分離出上清液血清，使用前將其貯藏于冰箱內(nèi)。
采用血液化學(xué)分析儀(CIBA Corning 550 Express，美國)對(duì)血液進(jìn)行化學(xué)分析，測定GOT、GPT、γ-GTP和總膽甾醇水平的變化。結(jié)果如表6所示。(步驟3)主動(dòng)脈中脂肪條紋的分析將步驟2處死的每只兔的胸部切開。將主動(dòng)脈瓣膜上方1cm位置處的主動(dòng)脈向下部分切開，長度為約5cm，將主動(dòng)脈周圍的脂肪除去。沿縱軸在中部將主動(dòng)脈切開，用針別在盤中。將濕的動(dòng)脈進(jìn)行照相，然后根據(jù)Esper,E.，等(J.Lab.Clin.Med 121,103-110(1993))的方法如下進(jìn)行脂肪條紋的染色。
將一部分切下的主動(dòng)脈用無水丙二醇在2分鐘內(nèi)洗滌3次，用油性紅O(ORO,Sigma Co.)在丙二醇中的飽和溶液染色30分鐘。此后，將動(dòng)脈用85％的丙二醇在3分鐘內(nèi)洗滌兩次，以除去殘余的染色溶液，然后用生理鹽水洗滌。對(duì)動(dòng)脈照相，追蹤照片。采用圖像分析儀(LEICA,Q-600，德國)測定染色區(qū)的面積(脂肪條紡區(qū))，計(jì)算其與總動(dòng)脈面積的比(％)。結(jié)果如表6所示。


圖1A、1B和1C顯示了分別給予1％的膽甾醇(對(duì)照組)，1％的膽甾醇加1mg/kg的洛伐他汀(洛伐他汀組)，和1％膽甾醇加0.05％的新橙皮苷雙氫查爾酮(新橙皮苷雙氫查爾酮組)的兔的動(dòng)脈內(nèi)皮。如圖1A、1B和1C所示，在給予1％的膽甾醇的兔的動(dòng)脈內(nèi)皮上觀察到一厚層的巨噬細(xì)胞-脂質(zhì)復(fù)合物，而在給予1％的膽甾醇加1mg/kg以及給予1％膽甾醇加0.05％新橙皮苷雙氫查爾酮組的兔的動(dòng)脈內(nèi)皮上未觀察到或只有非常薄的巨噬細(xì)胞-脂質(zhì)復(fù)合物層。
因而，可以得出結(jié)論，本發(fā)明的新橙皮苷雙氫查爾酮組合物可強(qiáng)烈地抑制巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈內(nèi)皮上的沉積。(步驟4)器官的組織學(xué)觀察從每只步驟2中處死的兔取出一部分主動(dòng)脈、心臟、肺、肝、腎和肌肉，目視檢測以確認(rèn)未發(fā)現(xiàn)致病性異常。將各器官每部分的一半進(jìn)行深冷凍，而另一半固定于10％中性緩沖福爾馬林中超過24小時(shí)。將固定的器官片段用自來充分水洗滌，逐步用70％、80％、90％和100％的乙醇脫水，然后采用SHANDON Histocentre 2(美國)將其包埋于石蠟中。將包埋的器官片段用切片機(jī)(LSICA,RM2045,德國)切成4μm厚度，并用蘇木精和曙紅進(jìn)行染色。將染色后的器官樣本用二甲苯制成透明的，用permount進(jìn)行封固，然后在顯微鏡下觀察以尋找存在的損害。在任一種器官樣本中未觀察到損害。
圖2A、2B和2C給出了分別給予1％的膽甾醇，1％的膽甾醇加1mg/kg洛伐他汀以及給予1％膽甾醇加0.05％新橙皮苷雙氫查爾酮的兔的肝臟的顯微特征。在圖2A和2B中，在中央靜脈周圍觀察到許多含過量脂肪的細(xì)胞。與此相反，在圖2C中，幾乎所有的肝細(xì)胞均具有正常的形狀，這表明，新橙皮苷雙氫查爾酮可顯著地抑制脂肪肝的形成。
從以上說明看出，給予新橙皮苷雙氫查爾酮可改善兔的脂質(zhì)代謝和肝功能，并抑制在主動(dòng)脈的內(nèi)皮中斑塊的形成和形成脂肪肝，如表6所示。結(jié)果采用Microsoft excel(7.0版)程序通過斯氏t-檢驗(yàn)進(jìn)行了檢驗(yàn)。表6
*總-C總-膽甾醇A脂肪條紋區(qū)與總動(dòng)脈的面積比(％)B含脂肪的異常細(xì)胞比從表6可以看出，與對(duì)照組相比，給予新橙皮苷雙氫查爾酮可分別降低血清GOT和GPT水平31％和35％。此外，與洛伐他汀相比，新橙皮苷雙氫查爾酮能更有效地降低血清GOT和GPT水平。實(shí)施例8新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)血糖水平的影響將20只3周大的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taihan laboratoryanimal center，韓國)用實(shí)驗(yàn)室食物顆粒狀飼料(Cheiljedang Co.)飼養(yǎng)，直至各大鼠平均體重達(dá)到280g。采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠的糖尿病，鏈脲佐菌素已知對(duì)胰腺的β-細(xì)胞有特異性作用，而對(duì)其它器官無不利影響(參見Junod A等，J.Clin.Invest 48 2129-2139(1969))。
將購自Sigma Chemical Co.的鏈脲佐菌素溶解于檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)中，將溶液肌內(nèi)注射于大鼠中，劑量為45mg/kg體重。對(duì)鏈脲佐菌素的濃度進(jìn)行控制以使最大注射體積在1ml以下。在注射24小時(shí)后，從大鼠的尾靜脈取血樣，采用Glucocard Ⅱ GT-1629(Kyto Dauchi Kagaku Co.,LTP,model 5616239)測定血糖水平。大鼠的水糖水平在350-400mg/dl內(nèi)，表明在所有大鼠中均已誘導(dǎo)了糖尿病(正常值118mg/dl)。
如下測定給予大鼠新橙皮苷雙氫查爾酮對(duì)血糖的作用。
在注射鏈脲佐菌素一天后，將大鼠禁食6小時(shí)，從其尾靜脈中取血樣證實(shí)大鼠中出現(xiàn)高血糖。然后，通過隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將大鼠分成兩個(gè)飲食組(n=10)。
兩組大鼠分別進(jìn)食AIN-76(American Institute of Nutrition)半純化食物(對(duì)照組)，和含0.05％新橙皮苷雙氫查爾酮的AIN-76半純化食物(新橙皮苷雙氫查爾酮組)。將大鼠保持在恒定溫度(25±2℃)、濕度(50±5％)和自然光照下5周，同時(shí)允許其自由進(jìn)食和飲水。
在五周結(jié)束時(shí)，將大鼠禁食12小時(shí)，用醚麻醉，然后，從下腔靜脈取血樣。將每份血樣在3000rpm及4℃下離心15分鐘以分離出血清。血清的血糖水平采用Glucocard Ⅱ GT 1629(Kyto Dauchi KagakuCo.,LTP,model 5616239)測定，結(jié)果如表7所示。表7
從表7中可以看出，在新橙皮苷雙氫查爾酮中血糖水平比對(duì)照組低25％。實(shí)施例9將新橙皮苷雙氫查爾酮給予人的影響給予兩位55歲的男性每日口服劑量為8mg/kg的新橙皮苷雙氫查爾酮，共給予2個(gè)月。測定給予前和給予后的血糖水平。
通過上述治療，血糖水平降低30％。配方1制備藥物配方采用下述組分制備硬明膠膠囊數(shù)量(mg/膠囊)活性組分(新橙皮苷雙氫查爾酮)200維生素C 50乳糖(載體)150總計(jì) 400mg配方2含有新橙皮苷雙氫查爾酮的食品如下制備含新橙皮苷雙氫查爾酮的食品(1)制備蕃茄醬和沙司將新橙皮苷雙氫查爾酮加至蕃茄醬和沙司中，用量為0.01-10wt％，以得到改善健康的蕃茄醬和沙司。
(2)制備含小麥粉的食品將新橙皮苷雙氫查爾酮加至小麥粉中，用量為0.01-10wt％，采用混合物制備面包、蛋糕、曲奇、薄脆餅干和面條，得到改善健康的食品。
(3)制備湯和勾芡肉汁將新橙皮苷雙氫查爾酮加至湯和勾芡肉汁中，用量為0.01-10wt％，得到改善健康的湯和勾芡肉汁。
(4)制備絞細(xì)牛肉將新橙皮苷雙氫查爾酮加至絞細(xì)牛肉中，用量為0.01-10wt％，得到改善健康的絞細(xì)牛肉。
(5)制備乳制品將新橙皮苷雙氫查爾酮加至牛奶中，用量為0.01-10wt％，得到改善健康的牛奶和各種乳制品，如由其制備的奶油和冰淇淋。
在制備干酪時(shí)，將新橙皮苷雙氫查爾酮加至凝固乳蛋白中；在制備酸奶時(shí)，將新橙皮苷雙氫查爾酮加至發(fā)酵后得到的凝固乳蛋白中。配方3含有新橙皮苷雙氫查爾酮的飲料(1 )制備蔬菜汁將100-5000mg的新橙皮苷雙氫查爾酮加至1000ml蔬菜汁中得到改善健康的蔬菜汁。
(2)制備果汁將100-5000mg的新橙皮苷雙氫查爾酮加至1000ml果汁中得到改善健康的果汁。配方4含有新橙皮苷雙氫查爾酮的保健食品將以下組分混合，并將混合物壓片制成保健食品。
數(shù)量(wt/wt％)人參粉末或提取物 50新橙皮苷雙氫查爾酮 30甜味劑和食用香料 20總計(jì)100％以上本發(fā)明由具體的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以做出各種仍在所附權(quán)利要求書定義的本發(fā)明范圍內(nèi)的變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1．一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與血脂或血糖水平升高相關(guān)的疾病的藥物組合物，該組合物包括有效量的新橙皮苷雙氫查爾酮和藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的疾病是高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、脂肪肝或高血糖。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的哺乳動(dòng)物是人。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中有效量的新橙皮苷雙氫查爾酮的范圍為0.1-500mg/kg體重/天。
5．一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與血脂或血糖水平升高相關(guān)的疾病的食品組合物，其包括0.01-20wt％的新橙皮苷雙氫查爾酮。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中的疾病是高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、脂肪肝或高血糖。
7．根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中的食品是肉、巧克力、小吃、糖果、比薩、保健食品或由谷粉制備的食品、膠質(zhì)軟糖、乳制品、湯、肉湯、醬、蕃茄醬、沙司或維生素復(fù)合物。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中由谷粉制備的食品是面包、蛋糕、薄脆餅干、曲奇、餅干或面條。
9．根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中的制品是牛奶、冰淇淋、干酪或酸奶。
10．一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與血脂或血糖水平升高相關(guān)的疾病的飲料組合物，其包括0.01-20wt％的新橙皮苷雙氫查爾酮。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中的疾病是高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、脂肪肝或高血糖。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中的飲料是蔬菜汁、果汁、茶、酒精飲料或碳酸飲料。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防與血脂或血糖水平升高相關(guān)的疾病如高血脂癥、動(dòng)脈硬化、心絞痛、中風(fēng)、肝病或高血糖的藥物組合物，該組合物包括有效量的新橙皮苷雙氫查爾酮以及藥學(xué)可接受的載體；本發(fā)明還涉及用于此類疾病的功能食品或飲料組合物，其包括有效量的新橙皮苷雙氫查爾酮。
文檔編號(hào)A23C19/093GK1317938SQ99810929
公開日2001年10月17日 申請日期1999年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月15日
發(fā)明者卜成海, 鄭泰淑, 裴基煥, 樸鏞福, 崔明淑, 文錫植, 權(quán)容國, 李恩淑, 玄柄和, 崔良圭, 李哲浩, 李世峰, 樸永培, 金孝洙 申請人:韓國生命工學(xué)研究院