專利名稱：生產(chǎn)2－酮－l－古洛糖酸的細(xì)菌菌株的制作方法
背景技術(shù)：
背景信息2-酮-L-古洛糖酸(“2-KLG”)在制備必需營養(yǎng)素抗壞血酸(維生素C)中是重要的中間體。過去工業(yè)規(guī)模合成2-KLG采用了菜氏(Reichstein)法((Helvetica Chimica Acta 17:311(1934))。但是，該方法在商業(yè)應(yīng)用中具有若干缺點(diǎn)，包括使用了大量的溶劑和涉及若干復(fù)雜的反應(yīng)步驟。
因而，為替代菜氏法，發(fā)展出了利用一種或多種微生物通過發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的方法。例如美國專利2421611公開了如下方法，包括微生物氧化D-葡萄糖為5-酮-D-古洛糖酸、隨后化學(xué)或微生物還原為L-艾杜酸、隨后微生物氧化成2-KLG的方法。日本專利公開文本39-14493、53-25033、56-15877和59-35290公開了類似的方法，例如包括微生物氧化D-葡萄糖為2,5-二酮-D-葡糖酸，接著微生物或化學(xué)還原為2-KLG。
但是，因?yàn)檫@些方法也由于一系列缺點(diǎn)而減小了其在商業(yè)生產(chǎn)2-KLG中的實(shí)用性。例如，這些方法中的化學(xué)還原步驟(即將5-酮-D-葡糖酸還原為L-艾杜酸和將2,5-二酮-D-葡糖酸還原為2-KLG)伴隨著控制還原的立體化學(xué)問題(所以分別生產(chǎn)D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸作為副產(chǎn)品)，因而減小了2-KLG的產(chǎn)率。另外，當(dāng)使用一種或多種微生物進(jìn)行還原，則需要過量的糖提供還原所需的能量，這也減小了2-KLG的產(chǎn)率。
面對這些問題，使用了一種替代途徑用于2-KLG的發(fā)酵生產(chǎn)，它僅包括將L-山梨糖通過山梨酮中間體氧化為2-KLG。已發(fā)展出若干利用這一途徑的方法，使用了廣泛的如下來源微生物葡糖桿菌屬(Gluconabacter)的例如氧化葡糖桿菌(Gluconabacter oxydans)(美國專利4935359、4960695、5312741和5541108)、假葡糖桿菌屬(Pseudogluconobacter)的例如生糖酮假葡糖桿菌(Pseudogluconobactersaccharoketogenes)(美國專利4877735；歐洲專利221707)、假單胞菌屬(Pseudomonas)的例如山梨糖氧化假單胞菌(Pseudomonassorbosoxidans)(美國專利4933289和4892823)和來自這些和其它屬的微生物，例如醋桿菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、分枝桿菌屬(Mycobacter)和鏈霉菌屬(Streptomyces)(美國專利3912592、3907639和3234105)但是，因?yàn)檫@些方法存在某些缺點(diǎn)限制了其用于商業(yè)生產(chǎn)2-KLG中的實(shí)用性。例如上述使用氧化葡糖桿菌的方法，為了生產(chǎn)足夠高水平的商業(yè)用途的2-KLG需要存在附加的“輔助”微生物菌株，例如巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterrium)，或者需要導(dǎo)致商業(yè)上沒有吸引力的酵母或來自酵母的生長成分的量。類似地，對使用假葡糖桿菌屬的方法，為了獲得商業(yè)上合適的2-KLG濃度和山梨糖底物的有效使用，需要在培養(yǎng)基中補(bǔ)充昂貴的和不常用的稀土鹽或者存在輔助菌株例如巨大芽孢桿菌，和/或存在酵母。對使用山梨糖氧化假單胞菌的其他方法，也需要在培養(yǎng)基中含有商業(yè)上沒有吸引力的酵母或酵母提取物的量。
吡咯并喹啉醌(PQQ)(2,7,9-三羧基-1-H-吡咯并[2,3-f]喹啉-4,5-二酮)最初是從甲基營養(yǎng)菌(利用甲醇的)的培養(yǎng)物中分離出來，以后發(fā)現(xiàn)它在許多動(dòng)物組織中存在。PQQ的結(jié)構(gòu)如下
PQQ可能是一種新的維生素，因?yàn)閾?jù)信其對正常的生長和發(fā)育是必需的。當(dāng)作為補(bǔ)充成分喂養(yǎng)動(dòng)物時(shí)，PQQ防止通常情況下發(fā)生的氧化性改變。此外，PQQ能增加小鼠星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中神經(jīng)生長因子的合成，且在大腦中具有治療功能的潛力。(Bishop等人?！斑量┎⑧环N新維生素”。營養(yǎng)綜述(Nutrition Reviews)56:287-293(1998))有機(jī)化學(xué)合成是生產(chǎn)PQQ的常規(guī)方法。但是，有機(jī)化學(xué)合成具有若干缺點(diǎn)。例如，由于合成需要許多并且有時(shí)是復(fù)雜的反應(yīng)步驟，生產(chǎn)得率低，所以化學(xué)合成不經(jīng)濟(jì)并消耗時(shí)間。
因而，需要克服化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)PQQ的缺點(diǎn)，通過使用細(xì)菌菌株用于生產(chǎn)PQQ部分滿足了這種需要(美國專利4994382和5344768)。但是，仍然需要更有效的和更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)PQQ的微生物菌株。
脂多糖(LPS)是一種兩親分子，是許多革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分。它參與人和動(dòng)物的與革蘭氏陰性細(xì)菌感染相關(guān)聯(lián)的許多病理生理學(xué)。來自類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的LPS是無毒性的，有作為免疫調(diào)節(jié)物和抗腫瘤劑的多種用途。但是通過類球紅細(xì)菌生產(chǎn)無毒性的LPS會(huì)有幾個(gè)缺點(diǎn)與之相伴，例如光營養(yǎng)型培養(yǎng)的不方便性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了有效地生產(chǎn)2-酮-L-古洛糖酸的微生物菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及與輔助菌株合作用于生產(chǎn)2-酮-L-古洛糖酸的菌株。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案提供了一種生產(chǎn)PQQ的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種生產(chǎn)無毒性的LPS的方法。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了被載體轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的細(xì)菌菌株，和一種載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌株的方法。
通過本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了這些和其他實(shí)施方案，其中本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及以下任一微生物菌株的培養(yǎng)物ADM291-19(NRRL B-30035)、ADM62A-12A(NRRL B-30037N)、ADM266-13B(NRRL B-30036)，或者其突變株。
本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的對優(yōu)選的實(shí)施方案的詳述中予以闡明，并且，這些特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在一定程度上會(huì)從描述中顯而易見，或者通過實(shí)施本發(fā)明而認(rèn)識到。由本文的書面描述和權(quán)利要求書中特別指出的本發(fā)明的方法可認(rèn)識并了解本發(fā)明的這些優(yōu)點(diǎn)。
應(yīng)當(dāng)明白，前面的一般性描述及后面的詳述都僅僅是示范性的和解釋性的，旨在為所要求保護(hù)的本發(fā)明提供進(jìn)一步的解釋。
附圖簡述

圖1描述了能夠從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG的細(xì)菌菌株的Riboprint譜。從以下細(xì)菌菌株中獲得Riboprint譜ADM X6L(NRRL B-21627)、ADM291-19(NRRL B-30035)、ADM266-13B(NRRL B-30036)、ADM62A-12A(NRRL B-30037N)、DSM4025C(混合培養(yǎng)保藏物DSM4072中的小菌落組分菌株的二次分離菌，美國專利4935359)、生糖酮假葡糖桿菌菌株IFO 14484和山梨糖氧化假單胞菌菌株IFO 14502。
發(fā)明詳述在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種具有如下菌株的鑒定特征的生物學(xué)純培養(yǎng)物，菌株選自ADM291-19(NRRL B-30035)、ADM62A-12A(NRRL B-30037N)、266-13B(NRRL B-30036)，或其突變體。通過純培養(yǎng)物，即沒有一個(gè)或多個(gè)附加的微生物菌株的存在時(shí)的發(fā)酵，本實(shí)施方案中的微生物菌株能從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物菌株和微生物菌株ADM X6L(NRRL B-21627，美國專利5834231)能從合適的碳源生產(chǎn)PQQ。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，菌株ADM291-19和ADM266-13B于1998年6月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL),1815NorthUniversity Street,Peoria,Illinois 61604，美國。保藏號分別為NRRL B-30035和NRRL B-30036。菌株ADM62A-12A于1998年8月25日保藏于NRRL，保藏號為NRRL B-30037N。菌株NRRL B-30035、NRRLB-30037N和NRRL B-30036的特征包括，但不限于(1)細(xì)胞形態(tài)-革蘭氏陰性；較老培養(yǎng)物的革蘭氏染色可以有變化；小短桿或球桿狀；細(xì)胞以單個(gè)或成雙形式出現(xiàn)；可以為多型性；可以形成短鏈或長不規(guī)則細(xì)胞；不形成孢子；(2)菌落形態(tài)-點(diǎn)狀，凸面，邊緣光滑，平滑，奶油狀和半透明；在某些培養(yǎng)基中較老的菌落帶米色或棕色；(3)色素-菌落產(chǎn)可擴(kuò)散的棕色色素，在含有碳酸鈣和以果糖為碳源的營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中尤其如此。(4)生理學(xué)特性(a)過氧化氫酶陽性(b)氧化酶陽性(c)明膠酶陰性(5)培養(yǎng)特性(a)腦心浸液瓊脂生長(b)在沒有NaCl的DM液體基本培養(yǎng)基(袁5)或者瓊脂固化的DM基本培養(yǎng)基中，生長，(c)在pH4.0-5.0的葡萄糖或甘露醇肉湯 基中靜置培養(yǎng)24小時(shí)，不形成薄膜或環(huán)；(d)在沒有NaCl的DM液體基本培養(yǎng)基(表5)或者瓊脂固化的DM基本培養(yǎng)基中4℃時(shí)生長，但在37℃時(shí)不生長。在沒有NaCl的DM液體基本培養(yǎng)基(表5)或者瓊脂固化的DM基本培養(yǎng)基中，最適生長溫度為25-30℃。(e)在沒有NaCl的DM基本培養(yǎng)基(表5)或者瓊脂固化的DM體基本培養(yǎng)基中，最適生長pH為pH7.0和8.0之間；(6)抗生素抗性-對丁胺卡那霉素、奧格門丁(羥氨芐青霉素+棒酸)、氨芐青霉素、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢噻呋、頭孢噻吩、恩氟沙星(enrofloxacin)、氟苯尼考(florfenic01)、慶大霉素、亞胺硫霉素、卡那霉素、sarafioxicin、四環(huán)素、ticarcillin、tilmicosin敏感，但對
tribrssen(奧格門丁+磺胺甲噁唑)有抗性；采用最低抑制濃度(MIC)測定，依據(jù)生理上能達(dá)到的抗生素濃度，使用商品化的“Pasco”系統(tǒng)；和(7)Riboprint分析Riboprint為自動(dòng)化的機(jī)器人分類系統(tǒng)，產(chǎn)生并分析細(xì)菌的遺傳指紋。遺傳指紋譜為每個(gè)樣品的遺傳數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)字表現(xiàn)形式。經(jīng)此法獲得的譜不僅對區(qū)分不同種的生物體而且對區(qū)分相同物種的不同菌株有用。圖1描述了從菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)和NRRL B-30036(ADM266-13B)以及若干已知的能夠從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG的相類似菌株中獲得的Riboprint譜。
在這些譜不同的情況下，細(xì)菌菌株的獨(dú)特性可以從其Riboprint譜得到證明。當(dāng)兩個(gè)菌株給出的Riboprint譜無法區(qū)分開來時(shí)，Riboprint數(shù)據(jù)就是非結(jié)論性的，這時(shí)需要其他方法來顯示菌株的獨(dú)特性。其中的一個(gè)方法是DNA重新組合，該方法中在完整的細(xì)菌染色體水平上估計(jì)菌株間的相關(guān)性?？梢酝ㄟ^來自兩個(gè)菌株的染色體DNA的定量的、正反雜交達(dá)到此目的。對于菌株NRRL B-30035(ADM291-19)和NRRL B-30036(ADM266-13B)，從這些研究中得到的結(jié)果顯示染色體的相似性小于70％，根據(jù)現(xiàn)代細(xì)菌分類學(xué)，這個(gè)結(jié)果通常提示這些菌株屬于獨(dú)立的物種(Wayne等人。國際細(xì)菌分類學(xué)雜志.(Int.J.System.Bacteriol.)37:463-464(1987))。所以，DNA重新組合數(shù)據(jù)明白無誤地顯示菌株NRRLB-30035(ADM291-19)和NRRL B-30036(ADM266-13B)為獨(dú)特的且彼此不同。
于1998年11月10日授權(quán)的美國專利號5834231和于1997年7月11日提交的美國專利申請?zhí)?8/893598中分別公開了通過發(fā)酵從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG的細(xì)菌菌株ADM X6L(NRRL B-21627)及其突變體。這個(gè)申請所公開的菌株及其突變體與本發(fā)明中的菌株及其突變體有明顯區(qū)別，從圖1中其Riboprint譜的比較可以看出這一點(diǎn)。
除了生物學(xué)純菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)和NRRL B-30036(ADM266-13B)外，只要這些菌株的突變體能夠從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG，則也可以用它們來生產(chǎn)2-KLG。
本發(fā)明的微生物菌株及其突變體和菌株NRRL B-21627(ADM X6L)及其突變體，也可以用來生產(chǎn)PQQ，只要這些突變體也能生產(chǎn)PQQ。
如本文中所用的，“生物學(xué)純”菌株要表達(dá)的含義為菌株與它在自然界中在正常情況下與其相結(jié)合的物質(zhì)分開。注意，如果一個(gè)菌株與其他菌株或者其他化合物或物質(zhì)相結(jié)合，但是在正常情況下自然界中沒有發(fā)現(xiàn)該菌株如此，則仍將其定義為“生物學(xué)純”。特定菌株的單一培養(yǎng)物當(dāng)然是“生物學(xué)純”。
如本文中所用的，本發(fā)明中的給定菌株的突變體來自本發(fā)明中的以下菌株之一，即NRRL B-30035(ADM291-19),NRRL B-30037N(ADM62A-12A)，或NRRL B-30036(ADM266-13B)，或微生物菌株NRRLB-21627(ADM X6L)。
制備本發(fā)明的微生物菌株的突變體的合適的方法之闡明性例子包括但不限于通過紫外線或X-射線照射，或用化學(xué)誘變劑如亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、甲基磺酸甲酯、氮芥等誘變處理；基因整合技術(shù)，例如由插入元件或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因整合技術(shù)，或者轉(zhuǎn)化的線性或環(huán)狀DNA分子同源重組的基因整合技術(shù)；以及由噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。這些方法在本領(lǐng)域廣為所知，在例如J.H.Miller.分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(Experiments in Molecular Genetics),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New Yorl(1972)；J.H.Miller.細(xì)菌遺傳學(xué)簡明教程(A Short Course in Bacterial Genectics),Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1992)；M.Singer和P.Berg.基因和基因組(Genes & Genomics),University Science Books,Mill Valley,California(1991)；J.Sambrook,E.F.Fritsch和Maniatis.分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Mannual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork(1989)；P.B.Karfman等人。生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的分子和細(xì)胞學(xué)方法手冊(Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology andMedicine),CRC Press,Boca Raton,Florida(1995)；植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy),B.R.Glick和J.E.Thompson編寫，CRC Press,Boca Raton,Florida(1993)；P.F.Smit-Kear.大腸桿菌分子遺傳學(xué)(Molecular Genetics of EscherichiaColi),The Guilford Press,New York,NY(1989)中予以描述。
生產(chǎn)2-KLG的突變體可以具有或可以不具有與其親株或先祖菌株相同的生物學(xué)鑒定特征，只要突變體生產(chǎn)2-KLG。
相似地，生產(chǎn)PQQ的突變體可以具有或可以不具有與其親株或先祖菌株相同的生物學(xué)鑒定特征，只要突變體生產(chǎn)PQQ。
針對提高的2-KLG和/或PQQ的生產(chǎn)潛力或者其他與從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG的實(shí)用性和/或生產(chǎn)PQQ的實(shí)用性相關(guān)的理想特性，使用已知方法，優(yōu)選地選擇或篩選來自本發(fā)明的生物體NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)或NRRL B-30036(ADM266-13B)的突變菌株，或來自NRRL B-21627(ADMX6L)的突變體。
依照本發(fā)明，將本發(fā)明微生物菌株或其突變體與L-山梨糖接觸足夠的時(shí)間，接著分離積累的2-KLG。優(yōu)選地，微生物菌株在含有L-山梨糖的天然或合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定的時(shí)間以生產(chǎn)2-KLG，接著分離積累的2-KLG。或者，來自微生物菌株細(xì)胞的制備物可與L-山梨糖接觸足夠的時(shí)間，然后可分離積累的2-KLG。
依照本發(fā)明，將本發(fā)明微生物菌株或其突變體在包含碳源和氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。碳源可以是多種糖醇類、多元醇類、醛醇糖類或酮糖類，包括但不限于阿拉伯糖，纖維二糖，果糖，葡萄糖，甘油，肌醇，乳糖，麥芽糖，甘露醇，甘露糖，鼠李糖，棉子糖，山梨醇，山梨糖，蔗糖，海藻糖，丙酮酸，琥珀酸，或甲胺，或其他可被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的底物。培養(yǎng)基優(yōu)選地含有多元醇或醛醇糖，更優(yōu)選地含有甘露醇，肌醇，山梨糖，甘油，山梨醇，乳糖和阿拉伯糖作為碳源，以重量計(jì)濃度在0.1％-20.0％。所有的碳源可以在培養(yǎng)開始之前加入，或者可在培養(yǎng)過程中一步一步地或連續(xù)地加入。
如本文中所用的，“來自細(xì)胞的制備物”要表達(dá)的含義為來自發(fā)明菌株或其突變體的培養(yǎng)液、丙酮干燥的細(xì)胞、固定于支持物(例如聚丙烯酰胺、κ-角叉藻聚糖、藻酸鈣等)之上或之內(nèi)的細(xì)胞的任何或所有抽提物，或類似的制備物。
該流程的闡明性實(shí)例包括將溶于合適水性緩沖液(例如2-(N-甲基嗎啉代)乙基磺酸(pH6.5；0.5M))的L-山梨糖和CaCO3加入到搖瓶中的微生物菌株的水性提取物中。該反應(yīng)優(yōu)選地在pH6.0-8.0、溫度20-40℃的范圍內(nèi)進(jìn)行大約1-100個(gè)小時(shí)。L-山梨糖的濃度應(yīng)該在大約0.1％-10％(w/v)，更優(yōu)選地在大約0.3％-6％(w/v)，來自菌株NRRL B-30035(ADM291-19)，NRRL B-30037N(ADM62A-12A)或NRRL B-30036(ADM266-13B)或其突變體的細(xì)胞制備物的量應(yīng)該為大約1-30毫克/毫升。在經(jīng)驗(yàn)性地確定的使2-KLG得率最大的溫度和pH值條件下?lián)u蕩足夠時(shí)間后，可以通過常規(guī)方法分離積累的2-KLG。
這里使用的培養(yǎng)基可以是固體的或液體的，合成的(即人工制造)或天然的，并且含有足夠的營養(yǎng)物以培養(yǎng)發(fā)明的微生物菌株。優(yōu)選地使用液體培養(yǎng)基，更優(yōu)選地使用合成的液體培養(yǎng)基。
在本發(fā)明方法(如本文中所用的，與過程的含義相同)的多種實(shí)施方案中，起始物質(zhì)L-山梨糖可以在發(fā)明的微生物菌株引入之前就存在于培養(yǎng)基中；或者可以在引入菌株后在開始時(shí)一次全部加入或在培養(yǎng)過程中連續(xù)地或者分批地加入培養(yǎng)基中；或者可以通過D-山梨醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化于原位產(chǎn)生?？梢杂杀绢I(lǐng)域的技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)性地確定L-山梨糖的使用量，但至少足夠微生物菌株生產(chǎn)至少大約40克/升的2-KLG。優(yōu)選地，L-山梨糖在培養(yǎng)基中的含量為3％-30％(w/v)，更優(yōu)選地5％-20％。
在一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，起始物質(zhì)L-山梨糖是通過使用合適的微生物或微生物的混合物經(jīng)D-山梨醇發(fā)酵轉(zhuǎn)化于原位產(chǎn)生的。NRRLB-30035(ADM291-19)，NRRL B-30037N(ADM62A-12A)或NRRLB-30036(ADM266-13B)或其突變體的存在下能夠?qū)-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖而不影響其將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KLG的任何微生物或者微生物的混合物均可以使用。優(yōu)選地使用的微生物為氧化葡糖桿菌菌株，更優(yōu)選地為氧化葡糖桿菌菌株ATCC621或氧化葡糖桿菌菌株IFO3293。根據(jù)本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方案，起始物質(zhì)D-山梨醇可以在引入一種微生物或多種微生物之前存在于培養(yǎng)基中，或者在引入一種或多種微生物后加入培養(yǎng)基，無論在開始時(shí)一次全部加入或在培養(yǎng)過程中連續(xù)或分批加入。
上面所使用的和下面描述的本發(fā)明實(shí)施方案中所使用的天然或合成培養(yǎng)基也包含有氮源，合適的無機(jī)鹽類，如果合適，以及適于微生物菌株培養(yǎng)的多種微量營養(yǎng)素類、生長因子類等，也可以包含至少一種補(bǔ)充碳源。優(yōu)選地，選擇這些附加營養(yǎng)成分中的每一種所使用的量，以使2-KLG和成PQQ和/或LPS生產(chǎn)最大化。這些量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域已知的多種方法和技術(shù)經(jīng)驗(yàn)性地確定。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生產(chǎn)2-KLG的培養(yǎng)基中含有大約10％(重量/體積)L-山梨糖，大約3％(重量干固體/體積)玉米漿和大約0.2％MgSO4·7H2O(重量/體積)，使用NH4OH、Ca(OH)2或CaCO3控制pH。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生產(chǎn)PQQ的培養(yǎng)基中含有大約5-40克/升的甘露醇、葡萄糖、山梨糖或肌醇，優(yōu)選地10-20克/升的甘露醇、葡萄糖、山梨糖或肌醇，并且培養(yǎng)在0-40℃，優(yōu)選2-35℃，優(yōu)選地20-35℃的溫度進(jìn)行。培養(yǎng)基的pH一般為6-9，優(yōu)選地6.5-8.0。培養(yǎng)時(shí)間一般在20-150小時(shí)，優(yōu)選地20-50小時(shí)。在本實(shí)施方案中，PQQ積累于細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中。從ADM X6L(NRRL B-21627)生產(chǎn)PQQ的培養(yǎng)基的闡明性例子是DM基本培養(yǎng)基(表5)，pH6.0-7.8。對于ADM62A-12A、266-13B和291-19菌株，使用了沒有NaCl的DM基本培養(yǎng)基。其他任何多元醇類或糖醇類(如手性肌醇、山梨糖和葡萄糖)均可用來替代甘露醇。
制備接種物所使用的培養(yǎng)基如果合適可以含有附加組分，例如蛋白胨、N-Z胺、酶解大豆水解物、附加的酵母提取物、麥芽提取物、補(bǔ)充性碳源和多種維生素。
合適的補(bǔ)充碳源的闡明性例子，包括但不限于其他碳水化合物類，如葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉或淀粉水解物、纖維素水解物和糖蜜；有機(jī)酸類，如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸和延胡索酸；醇類，如甘油、肌醇、甘露醇和山梨醇。
合適的補(bǔ)充氮源的闡明性例子，包括但不限于氨，包括氨氣和氨水；有機(jī)酸或無機(jī)酸的銨鹽，如氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、乙酸銨、尿素；硝酸或亞硝酸鹽類，和其他含氮物質(zhì)，包括純的和粗品氨基酸制備品，肉提取物，蛋白胨，魚粉，魚水解物，玉米漿，酪蛋白水解物，大豆餅水解物，酵母抽提物，干酵母，乙醇酵母蒸餾物，大豆粉，棉籽粉等等。
合適的無機(jī)鹽類的闡明性例子，包括但不限于鉀鹽，鈣鹽，鈉鹽，鎂鹽，錳鹽，鐵鹽，鈷鹽，鋅鹽，銅鹽，鉬鹽，鎢鹽和其他微量元素的鹽和磷酸鹽。
合適的微量營養(yǎng)素類、生長因子類等的闡明性例子，包括但不限于輔酶A，泛酸，鹽酸吡哆醇，生物素，硫胺素，核黃素，黃素單核苷酸，黃素腺嘌呤二核苷酸，DL-6,8硫辛酸，葉酸，維生素B12，其他維生素類，氨基酸類如半胱氨酸、羥脯氨酸，堿基如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，硫代硫酸鈉，對-或r-氨基苯甲酸，尼克酰胺，次氮基乙酸等等，其可為純的或部分純的化學(xué)化合物，或者以天然物質(zhì)存在的形式。使用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的深層培養(yǎng)技術(shù)，例如氣升式、傳統(tǒng)的噴射-攪拌設(shè)計(jì)或搖蕩培養(yǎng)，都可以達(dá)到培養(yǎng)發(fā)明的微生物菌株的目的。
所使用的培養(yǎng)條件，包括溫度、pH、通氣速率、攪拌速率、培養(yǎng)時(shí)間等等可以由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員經(jīng)驗(yàn)性地確定，以便最大化地生產(chǎn)2-KLG和/或PQQ。特定培養(yǎng)條件的選擇要依賴于多種因素，例如所使用的特定發(fā)明菌株、培養(yǎng)基組成和類型、培養(yǎng)技術(shù)和類似的考慮因素。在一個(gè)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)使用菌株NRRL B-30035(ADM291-19),NRRL B-30037N(ADM62A-12A)、NRRL B-30036(ADM266-13B)或NRRL B-21627(ADM X6L)或其突變體時(shí)，開始培養(yǎng)的溫度為22-35℃，優(yōu)選地在大約30℃；pH為6.0-8.0，優(yōu)選地大約6.0-7.5，更優(yōu)選地大約6.5-7.5。在培養(yǎng)過程中的不同時(shí)間點(diǎn)上通過已知的方法當(dāng)然可以改變所使用的培養(yǎng)條件，以便最大化地生產(chǎn)2-KLG和/或PQQ。
在培養(yǎng)足夠的一段時(shí)間后，例如10-150小時(shí)，將已積累于細(xì)胞和/或培養(yǎng)液中的2-KLG和/或PQQ通過任何已知的方法予以分離，包括離子交換層析，凝膠過濾，溶劑萃取，親和層析或其任意組合?？墒褂门c所選培養(yǎng)條件相適合的任何方法?；厥?-KLG的合適方法的闡明性例子，在美國專利5474924；5312741；4960695；4935359；4877735；4933289；4892823；3043749；3912592；3907639和3234105中已經(jīng)予以描述?；厥誔QQ的合適方法的闡明性例子在美國專利4994382和5344768中已經(jīng)予以描述。
根據(jù)這樣的一個(gè)移出PQQ的方法，對培養(yǎng)液應(yīng)用固液分離(例如過濾和成離心)以有效地將細(xì)胞除去。不管是上清液(其為脫去細(xì)胞后所得液體部分)還是含有細(xì)胞的培養(yǎng)液都可以在進(jìn)一步的回收步驟中使用。使用例如離子交換層析、凝膠過濾、溶劑萃取或親和層析都可以從上清液或者培養(yǎng)液中回收PQQ。
使用例如紙層析、薄層層析、凝膠滲透層析、元素分析例如質(zhì)譜、核磁共振光譜、吸收光譜或高效液相色譜(HPLC)或其任意組合，通過與純標(biāo)準(zhǔn)品(Fluca公司產(chǎn)品號64682)比較，鑒定回收的PQQ。
使用D-葡萄糖脫氫酶活性缺失的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(Ameyama等人.FEBSlett.130:179-183(1981))和大腸桿菌(Ameyama等人。農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)49:1227-1231(1985))變株，利用紫外吸收光譜(Dekker等人。歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)125:69-73(1982))、HPLC、凝膠滲透色譜聯(lián)合質(zhì)譜或傅立葉轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)紅外光譜(FTIR)，可以對PQQ進(jìn)行定量分析。
根據(jù)這樣的一個(gè)回收2-KLG方法，使用已知的方法(例如離心或過濾)首先將培養(yǎng)液中的微生物除去，所得溶液在真空下濃縮。接著通過過濾回收2-KLG晶體，如果需要，重結(jié)晶純化。相似地，可以使用這些已知的方法如離子交換樹脂、溶劑萃取、沉淀、鹽析等等來回收2-KLG。
當(dāng)2-KLG作為游離酸回收時(shí)，可以用鈉、鉀、鈣、銨或類似的陽離子使用常規(guī)方法將其轉(zhuǎn)變?yōu)樗枰柠}?；蛘?，當(dāng)2-KLG作為鹽回收時(shí)，可以使用常規(guī)方法將其轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x形式或者不同的鹽。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明菌株與一種或多種輔助菌株混合培養(yǎng)。如本文中所用的，“輔助菌株”要表達(dá)的含義為那些能夠在發(fā)明的方法中增加2-KLG和/或PQQ生產(chǎn)的量的微生物菌株?？梢杂杀绢I(lǐng)域的技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)性地確定合適的輔助菌株。合適的輔助菌株的闡明性例子包括但不限于下列屬中的成員金桿菌屬(Aureobacterium)，優(yōu)選地液化金桿菌(A.liquefaciens)或天牛金桿菌(A.saperdae)；棒桿菌屬(Corynebacterium)優(yōu)選地產(chǎn)氨棒桿菌(C.ammoniagenes)或谷氨酸棒桿菌(C.glutimicum)；短桿菌屬(Brevibacterium)，優(yōu)選地?cái)U(kuò)展短桿菌(B.linens)或黃色短桿菌(B.flavum)；假單胞菌屬；變形菌屬(Proteus)；腸桿菌屬(Enterobacter)；檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)；歐文氏菌屬(Erwinia)；黃單胞菌屬(Xanthomonas)；黃桿菌屬(Flavobacterium)。優(yōu)選地，輔助菌株為谷氨酸棒桿菌ATCC21544。
輔助菌株優(yōu)選地在適合的條件下于合適的培養(yǎng)基中培育足夠的時(shí)間，直到獲得足夠量的培養(yǎng)物。接著可以將該輔助菌株接種物單獨(dú)地或與發(fā)明的微生物菌株組合在一起(即混合接種物)引入到用于生產(chǎn)2-KLG和/或PQQ的培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，為生產(chǎn)2-KLG，輔助菌株與菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(AMD62A-12A)或NRRL B-30036(ADM266-13B)的量的比值為10∶1到1∶10000范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，為生產(chǎn)PQQ，輔助菌株與菌株NRRL B-21627(ADM X6L)的量的比值范圍為10∶1到1∶10000之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于在發(fā)酵過程中生產(chǎn)2-KLG的上述新微生物菌株。
本發(fā)明的附加實(shí)施方案提供了一種從NRRL B-30035(ADM291-19)，NRRL B-30037N(ADM62A-12A),NRRL B-30036(ADM266-13B)或NRRL B-21627(ADM X6L)或其突變體中分離無毒性脂多糖(LPS)的方法。在該實(shí)施方案中，突變體被定義為能夠生產(chǎn)無毒性脂多糖的來自本發(fā)明的菌株之一的菌株。
可以通過任何已知的下面描述的任一方法，從本發(fā)明的菌株中純化LPS，例如Strittmater等人?！皝碜灶惽蚣t細(xì)菌ATCC17023的無毒性的脂多糖?！奔?xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)155:153-158(1983)；Galanos,C等人?！疤崛脂多糖的一種新方法?！睔W洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)9:245-249(1969)；Qureshi等人。“從傷寒沙門氏菌(Saimonella typhimurium)中得到的脂多糖的脂肪A骨架中酯基的部位?！鄙锘瘜W(xué)雜志(J.Bio.Chem.)258:12947-12951(1983)。
從NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)、NRRL B-30036(ADM266-13B)或NRRL B-21627(ADM X6L)中生產(chǎn)和純化LPS的這樣的一個(gè)方法中包括在包含1％Difco大豆蛋白胨、1％Difco酵母提取物、0.5％Difco麥芽提取物、0.5％NaCl、0.25％KH2PO4、2％甘露醇或其他合適的碳源，pH7.8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？梢詮陌视?、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡萄糖和果糖的組中選擇合適的碳源。宿主為ADM62A-12A、ADM266-13B和ADM291-19時(shí)，使用沒有NaCl的培養(yǎng)基。也可以使用經(jīng)NaOH調(diào)pH至pH7.8的胰酶解大豆肉湯(Difico)。細(xì)胞可以在液體培養(yǎng)基中生長，或在經(jīng)1.3％DifcoBacto瓊脂固化的培養(yǎng)基的表面生長。接著，用含大約0.1％到5％乙酸的正丁醇至少洗細(xì)菌一次。進(jìn)一步用乙醇、丙酮和乙醚洗，之后在例如真空下干燥。接著，用酚-氯仿-石油醚對細(xì)胞進(jìn)行萃取，所得LPS任選地用酚-氯仿-石油醚再處理。
本發(fā)明也涉及到用載體(任選地含有至少一個(gè)標(biāo)記基因)轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的菌株。
可以使用眾所周知的技術(shù)，例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、接合和電穿孔或其他轉(zhuǎn)化方法，將重組構(gòu)建物引入到本發(fā)明的細(xì)菌菌株中。載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、粘?；蛭⑷旧w。
本文中所指的“宿主”和“宿主細(xì)胞”對本發(fā)明的微生物菌株的細(xì)胞來說含義相同。
目的多核苷酸可以連接到載體上，所述載體含有選擇性標(biāo)記，以便在宿主中增殖。質(zhì)粒載體可以在沉淀例如磷酸鈣沉淀中，或者與帶電脂類形成復(fù)合物而被引入。
優(yōu)選含有針對目的多核苷酸的順式作用控制區(qū)的載體。合適的反式作用因子可以由宿主提供、由互補(bǔ)性載體提供、或在引入宿主時(shí)由載體本身提供。
這方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，由載體提供特異性表達(dá)，其可以是可誘導(dǎo)的、突變體特異性的和/或條件特異性的。在這類載體中尤其優(yōu)選那些由容易操作的環(huán)境因子，例如溫度、營養(yǎng)添加劑或化學(xué)添加劑誘導(dǎo)的載體。其他合適的環(huán)境因子對熟練技術(shù)人員來講是顯而易見的。
用于本發(fā)明中的表達(dá)載體包括染色體型的、游離型的載體，例如來自質(zhì)粒、噬菌體的載體和來自其組合的載體，如粘粒和噬菌粒。
應(yīng)該將目的DNA插入體有效地連接于合適的啟動(dòng)子，優(yōu)選來自宿主的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體應(yīng)進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點(diǎn)和在轉(zhuǎn)錄區(qū)中含有翻譯用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄子的編碼區(qū)，其開始部分應(yīng)含有對宿主適宜的翻譯起始密碼子，和適當(dāng)?shù)刂糜诖g多肽的末端的終止密碼子。
正如所示，表達(dá)載體優(yōu)選地包含至少一個(gè)可以被選擇和篩選的標(biāo)記。這類標(biāo)記包括丁胺卡那霉素、奧格門丁(羥氨芐青霉素+棒酸)、氨芐青霉素、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢他啶、ceftiofur、頭孢噻吩、氯霉素、enrofloxacin、紅霉素、florfenicol、慶大霉素、亞胺硫霉素、卡那霉素、青霉素、sarafloxicin、壯觀霉素、鏈霉素、四環(huán)素、ticarcillin或tilmicosin抗性基因。優(yōu)選的標(biāo)記包括氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素、青霉素、壯觀霉素、鏈霉素和/或四環(huán)素。
pMF1014-α是優(yōu)選的載體(M.T.Follettie.“谷氨酸棒桿菌的DNA技術(shù)氨基酸生物合成基因的分離和表征”。博士論文，麻省理工學(xué)院，劍橋，麻省(1989))，它包括pSR1-α復(fù)制子和卡那霉素抗性決定基。特別地，pMF1014-α包含pSR1復(fù)制子(Archer,J.A.普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)139:1753-1759(1993)),pSR1-α突變允許該質(zhì)粒在大腸桿菌宿主中復(fù)制性地保持(Follettie論文)，以及包含來自質(zhì)粒pUC4K的Tn-903衍生的卡那霉素抗性基因(Taylor,L.A.等人。核酸研究(Nucleic.Acid.Res.)16:358(1988))。本發(fā)明提供的本發(fā)明菌株及其突變體包含pMF1014-α。本發(fā)明提供的微生物菌株NRRL B-21627或其突變體的生物學(xué)純培養(yǎng)物包含pMF1014-α。
通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔和其他轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其他方法，將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞。在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊中描述了這類方法，例如Davis等人的“分子生物學(xué)基本方法”(1986年)。
本處所使用和描述的方法在本領(lǐng)域中眾所周知，尤其在J.H.Miller.分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York(1972)；J.h.Miller.細(xì)菌遺傳學(xué)簡明教程，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1992)；M.Singger和P.Berg.基因和基因組，University Science Books,MillValley,California(1991)；J.Sambrook,E.F.Fritsch和Maniatis.分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York(1989)；P.B.Karfman等人。生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的分子和細(xì)胞學(xué)方法手冊，CRC Press,Boca Raton,Florida(1995)；植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法，B.R.Glick和J.E.Thompson編輯，CRCPress,Boca Raton,Florida(1993)；P.F.Smit-Kear.大腸桿菌分子遺傳學(xué)，The Guilford Press,New York,NY(1989)；“質(zhì)粒實(shí)用方法”(Plasmids:A Pracctical Approach),Hard,K.D.編Oxford University Press,NewYork,NY(1993)；“載體基本數(shù)據(jù)”(Vectors:Essential Data)Gacesa P.和Ramii,D.P.編輯，John Wiley & Sons Pub.New York,NY(1994)；“電穿孔和電融合指南”(Guide to Electroporation and Electrofusions),Chang,D.等人，Acadamic Press,San Diego,CA(1992)；“革蘭氏陰性細(xì)菌的混雜質(zhì)粒”(Promiscuous Plasmids of Gram-NegatiVe Bacteria),Thomas,C.M.編輯，Acadamic Press,London(1989)；“質(zhì)粒的生物學(xué)”(The Biology of Plasmids),Summers D.K.,Blackwell Science,Cambridge,MA(1996)；“理解DNA和基因克隆好奇者指南”,Derlica,K.編輯，John Wiley & Sons Pub.New York,NY(1997)；“載體分子克隆載體及其使用掠影”(Vectors:A Survey of Molecular CloningVectors and Their Uses),Rodriguez,R.,L.等人編輯，Butterworth,Boston,MA(1998)；“細(xì)菌的接合作用”(Bacterial Conjugation),Clewel,D.B.編輯，Plenum Press,New York,NY(1993)；Del Solar G.等人，“環(huán)狀細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制和控制”，(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:434-464；Meiier,W.J.等人，“枯草桿菌的滾環(huán)質(zhì)粒pTA1015,pTA1040,pTA1050和pTA1060的核苷酸完整序列及分析及與來自革蘭氏陰性細(xì)菌的相關(guān)質(zhì)粒比較”，(FEMS Microbiol.Rev.),21:338-368(1998)；Khan,S.A.,“細(xì)菌質(zhì)粒的滾環(huán)復(fù)制”，(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)61:442-455；Baker,R.L.，“應(yīng)用遍在蛋白質(zhì)融合和切割表達(dá)蛋白質(zhì)”(Curr.Opin.Biotechnol.)7:541-546(1996)；Makrides,S.C.，“在大腸桿菌中獲得基因高水平表達(dá)的策略”(Microbiol.Rev.),60:512-538(1996)；Alonso,J.C.等人，“在革蘭氏陽性細(xì)菌θ-復(fù)制質(zhì)粒的位點(diǎn)特異重組”(FEMSMicrobiol.Lett.)),142:1-10(1996)；Miroux,B.等人，“在大腸桿菌中過量生產(chǎn)蛋白質(zhì)允許高水平合成某些膜蛋白和球蛋白的突變體宿主”，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)260:289-298(1996)；Kurland,C.G.，和Dong,H.“由過量生產(chǎn)蛋白質(zhì)抑制的細(xì)菌生長”分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)21:1-4(1996)；Saki,H.和Komato，T.,“在革蘭氏陰性細(xì)菌中的寬宿主范圍的質(zhì)粒IncQ的DNA復(fù)制”，(Biosci.Biotechnol.Biochem.)60:377-382(1996)；Deb,J.K.和Nath,N.,“棒桿菌的質(zhì)粒”(FEMS Microbioi.Lett.)175:11-20(1999)；Smith,G.P.,“絲狀噬菌體作為克隆載體”，生物技術(shù)(Biotechnol.)10:61-83(1988)；Espinosa,M.等人，“質(zhì)粒滾環(huán)復(fù)制及其控制”，(FEMS Microbiol.Lett.),130:111-200(1995)；Lanka,E.和Wilkins,B.M.，“在細(xì)菌接合作用中的DNA加工反應(yīng)”，(Ann.Rev.Biochem.)64:141-169(1995)；Drieseikelmann,B.,“DNA跨越細(xì)菌細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位”，微生物學(xué)評論(Microbiol.Rev.)58:293-316(1994)；Nordstorm,K.,和Wagner,E.G.,“由反義RNA控制的質(zhì)粒復(fù)制的動(dòng)力學(xué)”，生物化學(xué)趨勢(TrendsBiochem.Sci.)19:194-300(1994)；Frost,L.S.等人，“F性因子轉(zhuǎn)移區(qū)的基因產(chǎn)物的序列分析”，微生物學(xué)評論(Microbiol.Rev.)58:162-210(1994)；Drury,L.,“電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌”，(Methods Mol.Biol.)58:249-256(1996)；Dower,W.J.,“電穿孔細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的通用方法”，遺傳工程(Genet.Eng.)12:275-295(1990)；Na,S.等人，“影響棒桿菌電穿孔轉(zhuǎn)化效率的因素”，臨床生物技術(shù)雜志(Clin.J.Biotechnol.)11:193-198(1995)；Pansegrau,.,“質(zhì)粒RP4上的基因traI的產(chǎn)物與5”末端核苷酸在松弛缺口位點(diǎn)共價(jià)連接”，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265:10637-10644(1990)；和Bailey,J.E.，“大腸桿菌中的宿主-載體相互作用”，(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.)48:29-52(1993)中予以特別描述。
以下的實(shí)施例僅僅是闡明性的，并不希望限制所附權(quán)利要求書所確定的本發(fā)明的范圍。對本發(fā)明中的方法作多種修飾和變化而沒有脫離本發(fā)明的精神和范疇，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員這將是顯而易見的。因此，本發(fā)明旨在覆蓋對本發(fā)明的修飾和變化，只要這些修飾和變化落入到附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)或其相等物。
此處所引用的所有專利和出版物明確地作為參考。
通過發(fā)酵篩選富集物，取每一富集物0.5-0.75毫升，轉(zhuǎn)至含有30毫升新鮮培養(yǎng)基B(表1)的250毫升帶擋板搖瓶中。將這些搖瓶在30℃、230轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩大約3天。之后取部分混合發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行2-KLG的含量分析，并在低溫下保存。保存時(shí)，每2.0毫升培養(yǎng)物與1.0毫升溶于水的40％無菌甘油混合，保存于-70℃。
在厚度為250毫米的Whatman LK5硅膠150平板(貨號4855-820)上采用薄層層析法篩選生產(chǎn)2-KLG的搖瓶。將5微升離心的培養(yǎng)液點(diǎn)樣于平板上，在溶劑(157毫升正丙醇；39毫升去離子水；4毫升1％磷酸；0.4毫升冰醋酸)中展開5-6小時(shí)?？諝飧稍锲桨澹萌苡?5毫升甲醇的氯化四唑藍(lán)0.125克和25毫升6N NaOH噴涂，然后在60℃下烘烤5分鐘。山梨糖和2-KLG在處理好的平板上顯示可見的紫色斑點(diǎn)，通過與含有2-KLG和山梨糖各10克/升的標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行鑒定。
用HPLC對2-KLG的生產(chǎn)進(jìn)行定量。在流動(dòng)相中按1∶10的比例稀釋，用0.45微米孔徑的濾膜過濾，制備樣品。流動(dòng)相含有將1.1毫升ACS級的硫酸用Milli-Q制備的水稀釋至4.0升。每個(gè)樣品取100微升，加載到串聯(lián)的2根2毫米×300毫米×7.8毫米Aminex HPX-87H型柱(Bio-rad公司)上，使總柱長為600毫米，其前面有一個(gè)裝有相同樹脂的保護(hù)柱。柱子在溫度55℃運(yùn)行，流速為0.6毫升/分鐘。L-山梨糖和2-KLG的檢測用Waters公司No.410型差示折射儀，通過與含L-山梨糖和2-KLG的標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行鑒定。
33個(gè)混合培養(yǎng)物發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG，產(chǎn)量在1.8-9.3克升。以后分別從中分離出菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)和NRRL B-30036(ADM266-13B)的混合培養(yǎng)物發(fā)酵分別生產(chǎn)6.9克/升、9.3克/升和5.4克/升 2-KLG。B．分離和測試單培養(yǎng)從上述富集中分離出了在單種培養(yǎng)或與其他微生物混合培養(yǎng)下能夠從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG的微生物菌株的純培養(yǎng)物。根據(jù)其優(yōu)越的2-KLG生產(chǎn)能力，從實(shí)施例1A中挑選出11個(gè)混合培養(yǎng)的富集物。將這些富集物融化并用培養(yǎng)基A以10倍增加系列稀釋，然后從各稀釋度均取出0.1毫升，涂布于培養(yǎng)基A瓊脂平板表面上。平板在30℃保溫24小時(shí)，接著在8-40倍放大鏡下檢查。為了從稀釋平板上回收2-KLG生產(chǎn)菌株，有必要注意那些最小的、生長最慢的菌落。每種菌落類型和大小均篩選幾個(gè)作為例子并在新鮮的培養(yǎng)基平板A上進(jìn)行亞培養(yǎng)，其后將稀釋平板放回到30℃保溫24小時(shí)。在第二次溫育期滿后，從稀釋平板上篩選新增加的生長緩慢的菌落并進(jìn)行亞培養(yǎng)。每一菌株均在培養(yǎng)基A平板上或者在PYM平板(10g/L蛋白胨；10g/L酵母提取物；0.5g/L甘油；30g/L甘露醇；20g/L瓊脂)上進(jìn)行1-3輪劃線純化。純菌株在-70℃下低溫保存于含20％甘油的PYM液體培養(yǎng)基。從11個(gè)富集混合物中共回收到118個(gè)純菌株。
測試118個(gè)新菌株在搖瓶中將L-山梨糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的潛力?？紤]到2-KLG的生產(chǎn)可能需要兩種或多種微生物的組合活性，每一新分離株均與源自相同富集物的其他菌株成對組合進(jìn)行測試，在純培養(yǎng)中也進(jìn)行測試。為制備接種物，每一菌株在PYM瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)后，將一大接種環(huán)細(xì)胞懸浮于含50mM磷酸鈉、0.4％氯化鈉和0.05％甘露醇、pH7.2的無菌緩沖液中。對每一純菌株或成對菌株的測試，各取其相關(guān)菌株的0.2毫升細(xì)胞懸浮液，接種于含有30毫升培養(yǎng)基C(表1)的250毫升搖瓶中。這些搖瓶在30℃、230轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩24小時(shí)，之后，取出1.0毫升轉(zhuǎn)至30毫升發(fā)酵培養(yǎng)基D(表1)。發(fā)酵搖瓶在30℃、230轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩3天，接著，使用TLC和HPLC分析培養(yǎng)液中2-KLG和山梨糖的含量。含有菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)和NRRL B-30036(ADM266-13B)的搖瓶，比其他不含這些菌株的搖瓶在總體上顯示較高的2-KLG水平。將這些菌株作為2-KLG生產(chǎn)菌的候選物單獨(dú)挑出，供進(jìn)一步研究。表1實(shí)施例1中使用的培養(yǎng)基
*葡萄糖，玉米漿，硫酸亞鐵離子和碳酸鈣的pH調(diào)整為7.9，接著，滅菌20分鐘。其余組分的pH調(diào)整為6.3，過濾除菌。配好的培養(yǎng)基的pH為7.1-7.4。酵母氮堿基為Difco公司產(chǎn)品，產(chǎn)品號#0335-15-9。實(shí)施例2在搖瓶中由菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)和NRRL B-30036(ADM266-13B)從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG對每一個(gè)已測試菌株，將一個(gè)接種環(huán)量的生長于瓊脂培養(yǎng)基上的新鮮培養(yǎng)物接種至裝有20毫升種子培養(yǎng)基A或B(表2)的250毫升帶擋板的搖瓶中，在30℃、240轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩22-24小時(shí)。將2毫升種子培養(yǎng)液接種至含有25毫升發(fā)酵培養(yǎng)基C或D(表2)的250毫升帶擋板的搖瓶中，在30℃、240轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩72-92小時(shí)。接著，提取培養(yǎng)液進(jìn)行HPLC分析。表3是2-KLG的生產(chǎn)結(jié)果。表2實(shí)施例2和3中使用的培養(yǎng)基
*可溶大豆來自大豆加工中的液體廢物部分。數(shù)量表示為每升培養(yǎng)基的干固體克數(shù)。表3．在搖瓶中通過純培養(yǎng)從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG
*產(chǎn)率表示為在反應(yīng)中從每100克初始的L-山梨糖生產(chǎn)出的2-KLG克數(shù)。實(shí)施例3由包含生產(chǎn)菌株NRRL B-30035(ADM291-19)或NRRL B-30037N(ADM62A-12A)或NRRL B-30036(ADM266-13B)的混合培養(yǎng)物與第二種微生物共培養(yǎng)從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG對每一個(gè)生產(chǎn)菌株，將一個(gè)接種環(huán)量的生長于瓊脂培養(yǎng)基上的新鮮培養(yǎng)物接種至裝有20毫升種子培養(yǎng)基A(表2)的250毫升帶擋板的搖瓶中，緊接著接種液化金桿菌菌株X6S的冷凍培養(yǎng)物100微升，在30℃、240轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩22-24小時(shí)。將2毫升該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至裝有25毫升培養(yǎng)基C(表2)的250毫升帶擋板的搖瓶中，在30℃、240轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩72-92小時(shí)。接著，提取培養(yǎng)液進(jìn)行HPLC分析。表4是2-KLG的生產(chǎn)結(jié)果。表4．在搖瓶中通過混合培養(yǎng)從L-山梨糖生產(chǎn)2-KLG
*產(chǎn)率表示為在反應(yīng)中從每100克初始的L-山梨糖生產(chǎn)出的2-KLG克數(shù)。實(shí)施例4在搖瓶中由菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)、NRRL B-30036(ADM266-13B)和NRRLB-21627(ADM X6L)生產(chǎn)PQQ菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)、NRRL B-30036(ADM266-13B)或NRRL B-21627(ADMX6L)接種到10毫升pH為7.8的DM基本培養(yǎng)基中，在30℃、300轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩，直至600納米的光密度值達(dá)到最大為止。對于菌株ADM62A-12A、266-13B和291-19，使用沒有NaCl的培養(yǎng)基。5毫升該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至裝有500毫升新鮮培養(yǎng)基的2升帶擋板的搖瓶中，將其在30℃、300轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩培養(yǎng)足夠的時(shí)間，直至600納米的光密度值達(dá)到最大為止。
為確定培養(yǎng)基中PQQ的含量，在預(yù)定的時(shí)間取樣并離心，以獲得上清液。根據(jù)美國專利4994382和/或5344768中的方法，或者通過與質(zhì)譜偶聯(lián)的凝膠滲透色譜分析上清液。實(shí)施例5從菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)、NRRL B-30036(ADM266-13B)和NRRL B-21627(ADMX6L)中提取無毒性的脂多糖在包含1％Difco大豆蛋白胨、1％Difco酵母提取物、0.5％Difco麥芽提取物、0.5％NaCl、0.25％K2HPO4、2％甘露醇、2％手性肌醇或2％葡萄糖，或其他合適的碳源，pH為7.8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株NRRLB-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)、NRRLB-30036(ADM266-13B)或NRRL B-21627(ADM X6L)；在30℃、300轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩。對于菌株NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)、NRRL B-30036(ADM266-13B)，使用沒有NaCl的培養(yǎng)基。接著，收集細(xì)胞，然后用水洗三次。120克濕細(xì)菌洗三次，每次用含有大約1％乙酸的正丁醇600毫升。接著用乙醇、丙酮和乙醚(每一種用600毫升洗三次)進(jìn)一步洗細(xì)菌，并在真空下干燥。
將干燥的細(xì)菌置于離心容器中，加入萃取混合物(200毫升)。萃取混合物中含有液體苯酚(90克無水苯酚+11毫升水)、氯仿和石油醚(沸點(diǎn)40-60℃)，其體積比分別為2∶5∶8。當(dāng)使用無水苯酚時(shí)，該混合物為單相。如果在原始的苯酚制備物中有水存在，則混合物呈渾濁狀，可以通過加入固體苯酚使其變得清澈。然后將懸浮液在冷卻條件下勻漿2分鐘，溫度保持在5-20℃。該處理不是想破壞細(xì)胞而是為了獲得精細(xì)的懸浮液。如果已經(jīng)將細(xì)菌精細(xì)懸浮，那么，攪拌混合物幾分鐘就足夠了。有時(shí)勻漿處理后懸浮液非常粘。這時(shí)需要加入更多的萃取混合物。離心(5000轉(zhuǎn)/分15分鐘)去除細(xì)菌，含有脂多糖的上清液經(jīng)濾紙過濾后進(jìn)入圓底燒瓶。細(xì)菌殘留物用等量的萃取混合物再萃取一次，如上攪拌和離心，上清液加入到第一次的萃取液中?？梢灾貜?fù)進(jìn)行第三次萃取。
合并的上清液溶液的顏色為淡黃色至深棕色。接著使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于30-40℃(或在低于0℃的高真空狀態(tài))徹底除去石油醚和氯仿。此時(shí)如果剩余的苯酚結(jié)晶，就加入足夠的水溶解之。溶液轉(zhuǎn)至玻璃離心器中，逐滴加入水，直至脂多糖沉淀。將混合物靜置1-2分鐘后脂多糖開始下沉，停止加入水。盡管在苯酚被水遠(yuǎn)遠(yuǎn)飽和之前脂多糖已經(jīng)完全沉淀，但仍需要小心注意，不要加入過多的水，以免形成兩相。將沉淀的脂多糖離心(3000轉(zhuǎn)/分、10分鐘)，傾去上清液，將離心管倒置2-3分鐘。接著用濾紙擦干內(nèi)側(cè)。沉淀用少量80％苯酚(大約5毫升)洗2-3次。傾去上清液后用濾紙將離心管內(nèi)側(cè)擦干。最后，沉淀用乙醚洗三次以除去任何殘留的苯酚，在真空下干燥。脂多糖用蒸餾水(50毫升)溶解，加熱至45℃，仔細(xì)地施加真空以除去空氣。接著搖蕩幾分鐘，由此得到粘的、有時(shí)特別粘的溶液。將溶液置于超級振蕩器中5分鐘，可以減小其粘度。將脂多糖溶液高速離心一次(100000×g,4小時(shí))。由于得到的沉淀物清澈透明，所以有時(shí)在傾去上清液之前難以認(rèn)出來。將脂多糖重溶于水中并凍干。表5．用于分離株表征的限定基本培養(yǎng)基(DM)
實(shí)施例6用載體轉(zhuǎn)化菌株通過電穿孔法將質(zhì)粒載體pMF1014-α轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主菌株ADMX6L,pMF1014-α包含pSR1-α復(fù)制子和卡那霉素抗性決定基。從所得的ADM X6L轉(zhuǎn)化子中再分離質(zhì)粒pMF1014-α，隨后用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主。本實(shí)施例證明了用載體轉(zhuǎn)化ADM菌株及在ADM宿主中表達(dá)卡那霉素抗性以選擇轉(zhuǎn)化子，質(zhì)粒作為染色體外元件在ADM宿主中的保持及pMF1014-α作為新的大腸桿菌/ADM宿主菌株穿梭載體的用途。
使用了“Wizard Plus Miniprep”DNA純化系統(tǒng)(Promega公司)提供的材料和方法，從在含硫酸卡那霉素50微克/毫升的LB肉湯(1％Difco胰蛋白胨、0.5％Difco酵母提取物、0.5％NaCl)中培養(yǎng)的50毫升大腸桿菌DH5αMCR/pMF1014-α之過夜培養(yǎng)物中，分離質(zhì)粒pMF1014-α的DNA(M.T.Follettie.谷氨酸棒桿菌的DNA技術(shù)氨基酸生物合成基因的分離和特性”博士論文，美國麻省理工學(xué)院，1989年)。
為了制備感受態(tài)ADM X6L宿主細(xì)胞，將單菌落ADM X6L接種至10毫升X6L培養(yǎng)基(1％Difco大豆蛋白胨、1％Difco酵母提取物、0.5％Difco麥芽提取物、0.5％NaCl、0.25％K2HPO4、2％甘露醇，pH7.8)，在30℃、300轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩，直至OD600達(dá)到0.8吸收單位為止。對于ADM62A-12A、266-13B和291-19宿主，使用沒有NaCl的X6L培養(yǎng)基。將5毫升該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至裝有500毫升新鮮X6L培養(yǎng)基的2升帶擋板的搖瓶中，在30℃、300轉(zhuǎn)/分下?lián)u蕩培育足夠時(shí)間，直至OD600達(dá)到1.0吸收單位為止。將成熟的培養(yǎng)物快速冷卻，在以后各步驟中溫度均保持在2-4℃。離心收集細(xì)胞，洗兩個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為在500ml冰冷的水中重懸浮，然后離心。將第二次洗滌的沉淀懸浮于40毫升冰冷的10％甘油中，混合，再離心。估計(jì)沉淀物的體積，將其懸浮于等體積的冰冷的10％甘油中。所得到的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞懸浮液分裝于為微量離心管中，每管40微升，保存于-80℃。
將2微升水中含140微克/毫升純化的pMF1014-α的DNA的冷溶液加入到40微升冷的、感受態(tài)ADM X6L細(xì)胞中，混合。細(xì)胞-DNA混合物轉(zhuǎn)至預(yù)冷的電穿孔小池中(1毫米的小池，貨號940-00-100-5,Eppendorf科學(xué)公司)，迅速轉(zhuǎn)至“Biorad Gene Pulser Ⅱ”電穿孔裝置，以1.5kV、25μF、200歐姆施加脈沖。在脈沖結(jié)束后，立即加1毫升室溫的X6L培養(yǎng)基于脈沖室中，將混合物轉(zhuǎn)至10毫升無菌試管中搖蕩培育，30℃、300轉(zhuǎn)/分。培養(yǎng)2小時(shí)以表達(dá)卡那霉素抗性，之后，取出1.04毫升細(xì)胞懸浮液以14000轉(zhuǎn)/分微離心2分鐘。除去0.9毫升上清液，細(xì)胞沉淀懸浮于剩余的上清液中，將細(xì)胞懸浮液涂布于含有20微克/毫升卡那霉素和1.3％Difco瓊脂的X6L培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。在30℃下培育平板2天。根據(jù)該方法，得到了20個(gè)卡那霉素抗性的ADM X6L轉(zhuǎn)化子菌落。
質(zhì)粒pMF1014-α以染色體外元件保持于ADM X6L轉(zhuǎn)化子中。為證明這一點(diǎn)，使用上面概括的適用于大腸桿菌的方法從X6L轉(zhuǎn)化子中再分離質(zhì)粒DNA，但X6L轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長于含有40微克/毫升卡那霉素的X6L培養(yǎng)基。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證明，從X6L轉(zhuǎn)化子中分離的質(zhì)粒DNA與原始的pMF1014-α質(zhì)粒大小相同。從X6L轉(zhuǎn)化子中分離的質(zhì)粒仍然攜帶有卡那霉素抗性基因和大腸桿菌復(fù)制決定基。為證明這一點(diǎn)，根據(jù)Letterberg和Cohen(細(xì)菌學(xué)雜志，119:1072-1074(1964))的方法制備感受態(tài)大腸桿菌，使用D.A.Morris(細(xì)菌學(xué)雜志，132:349-351(1977))的方法用來自X6L轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用此方法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞獲得了卡那霉素抗性，并且顯示有與原始pMF1014-α質(zhì)粒大小相同的質(zhì)粒存在。
權(quán)利要求
1．一種微生物菌株的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其包括選自NRRL B-30035(ADM291-19)、NRRL B-30037N(ADM62A-12A)和NRRL B-30036(ADM266-13B)，或來自所述菌株的突變體的菌株的鑒定特征。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其包括微生物菌株NRRLB-30035(ADM291-19)，或來自所述菌株的突變體。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其包括微生物菌株NRRLB-30037N(ADM62A-12A)，或來自所述菌株的突變體。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其包括微生物菌株NRRLB-30036(ADM266-13B)，或來自所述菌株的突變體。
5．一種生產(chǎn)2-酮-L-古洛糖酸的方法，其包括將根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1的菌株在含L-山梨糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)足夠的時(shí)間，使所述L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮-L-古洛糖酸；以及回收所述的2-酮-L-古洛糖酸。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)化所述的2-酮-L-古洛糖酸為抗壞血酸或其鹽。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的菌株能產(chǎn)生至少大約40克/升的2-酮-L-古洛糖酸至抗壞血酸或其鹽。
8．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的培養(yǎng)在pH大約6.0-8.0下進(jìn)行。
9．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的培養(yǎng)在溫度大約22℃到大約35℃下進(jìn)行。
10．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的微生物于純培養(yǎng)物中培養(yǎng)。
11．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的微生物菌株培養(yǎng)于含有至少一種附加微生物菌株的混合培養(yǎng)物中。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的附加微生物菌株是選自以下屬中的一員金桿菌屬、棒桿菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、變形菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、歐文氏菌屬、黃單胞菌屬和黃桿菌屬。
13．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的L-山梨糖是通過D-山梨醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的L-山梨糖是使用氧化葡糖桿菌通過D-山梨醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的氧化葡糖桿菌為菌株ATCC621或菌株IFO3293或其突變體。
16．一種生產(chǎn)2-酮-L-古洛糖酸的方法，其包括在含有D-山梨醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1的菌株與能夠?qū)-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖的微生物的混合培養(yǎng)物，培養(yǎng)足夠的時(shí)間使所述的D-山梨醇轉(zhuǎn)化為2-酮-L-古洛糖酸；以及回收所述的2-酮-L-古洛糖酸。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述的附加微生物菌株是葡糖桿菌屬或醋桿菌屬的一員。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的附加微生物菌株是氧化葡糖桿菌ATCC621或氧化葡糖桿菌IFO3293或其突變體。
19．一種分離PQQ的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1的菌株培養(yǎng)于包含葡萄糖、山梨糖、甘油、甘露醇、山梨醇或肌醇的培養(yǎng)基中；以及回收所述PQQ。
20．一種分離PQQ的方法，包括將微生物菌株NRRL B-21627或其突變體培養(yǎng)于包含葡萄糖、山梨糖、甘油、甘露醇、山梨醇或肌醇的培養(yǎng)基中；以及回收所述PQQ。
21．根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的方法，其中將所述的微生物菌株或其突變體培養(yǎng)于包含至少一種附加菌株的混合培養(yǎng)物中。
22．一種分離無毒性脂多糖的方法，包括將權(quán)利要求1的菌株培養(yǎng)于包含甘油、葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇或肌醇的培養(yǎng)基中，并回收所述的脂多糖。
23．一種分離無毒性脂多糖的方法，包括將微生物菌株NRRL B-21627培養(yǎng)于包含甘油、葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇或肌醇的培養(yǎng)基中，并回收所述的脂多糖。
24．權(quán)利要求1的培養(yǎng)物，其中所述的菌株包含載體。
25．權(quán)利要求24的培養(yǎng)物，其中所述的載體為pMF1014-α。
26．一種微生物菌株NRRL B-21627或其突變體的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其包含pMF1014-α。
27．權(quán)利要求24的培養(yǎng)物，其中所述的載體包含標(biāo)記基因。
28．權(quán)利要求27的培養(yǎng)物，其中所述的標(biāo)記基因包含在宿主細(xì)胞中有效指導(dǎo)賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)合成的核苷酸序列。
29．權(quán)利要求28的培養(yǎng)物，其中所述的抗生素抗性包括對氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素、壯觀霉素、鏈霉素和四環(huán)素的抗性。
30．權(quán)利要求24的培養(yǎng)物，其中所述的載體包含(a)外源的轉(zhuǎn)錄終止子；(b)外源的啟動(dòng)子；和(c)一系列不連續(xù)的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，所述的系列位于所述的啟動(dòng)子和所述的終止子之間。
31．一種轉(zhuǎn)化根據(jù)權(quán)利要求1的菌株的方法，包括將載體插入所述的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)2－酮－L－古洛糖酸的新細(xì)菌菌株。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過L－山梨糖的發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2－酮－L－古洛糖酸的這些菌株的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些新細(xì)菌菌株用于生產(chǎn)吡咯并喹啉醌和無毒脂多糖的用途。對由載體轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的菌株亦進(jìn)行了描述。
文檔編號C12P7/60GK1317042SQ99810778
公開日2001年10月10日 申請日期1999年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月11日
發(fā)明者S·F·斯托達(dá)德, H·J·廖, J·德艾里亞 申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭公司