專利名稱：改進(jìn)的2-酮基-l-古洛糖酸的生產(chǎn)的制作方法
改進(jìn)的2-酮基-L-古洛糖酸的生產(chǎn)本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸O-KGA)和/或L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)的重組微生物(特別是GluconcAacter屬的)的產(chǎn)生，其中該微生物已被修飾，以過量表達(dá)L-山梨糖脫氫酶(SDH)。該過量表達(dá)已通過將編碼SDH的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝引入宿主微生物的基因組中來實(shí)現(xiàn)，這導(dǎo)致較之未經(jīng)修飾的微生物而言 2-KGA和/或維生素C生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率提高。sdh的所述一個(gè)或多個(gè)額外拷貝的表達(dá)依賴于整合位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳工程改造的微生物和它們用于生產(chǎn)2-KGA和 /或維生素C的用途。維生素C是對(duì)人類來說非常重要且必不可少的營養(yǎng)因子。維生素C還用于動(dòng)物飼料，盡管一些畜牧動(dòng)物可自身體內(nèi)合成維生素C。在過去的70年中，已通過公知的Reichstein方法從D-葡萄糖對(duì)維生素C進(jìn)行了工業(yè)生產(chǎn)。該工藝中的所有步驟都是通過化學(xué)方式進(jìn)行的，只除了其中一個(gè)步驟(從D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化)，其通過微生物轉(zhuǎn)化來進(jìn)行。從對(duì)維生素C的工業(yè)生產(chǎn)的最初實(shí)踐開始，就已使用了多種化學(xué)改良和技術(shù)改良，來提高Reichstein方法的效率。近來對(duì)維生素 C 生產(chǎn)的發(fā)展被概括于 Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition, Vol. A27(1996)，pp.547ff 中。2-KGA是用于生產(chǎn)L-抗壞血酸的重要的中間體。已知AcetcAacter屬、 Gluconobacter屬或I^seudomonas屬的微生物可用于從D-山梨糖醇生產(chǎn)2-KGA。這些微生物能在生產(chǎn)2-KGA的需氧條件下氧化D-山梨糖醇。可通過發(fā)酵工藝，通過屬于例如Ketogulonicigenium屬或Gluconobacter屬的菌株從L-山梨糖起始來生產(chǎn)2-KGA，或者通過屬于GluconcAacter屬或Pantoea屬的重組菌株，從D-葡萄糖起始進(jìn)行另一種發(fā)酵工藝來生產(chǎn)2-KGA。底物(例如D-山梨糖醇)向2-KGA的轉(zhuǎn)化是涉及若干種酶(例如若干種脫氫酶) 的多步工藝。D-山梨糖醇向L-山梨糖的轉(zhuǎn)化，例如是通過D-山梨糖醇脫氫酶(SLDH)催化的。L-山梨糖被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為L-山梨糖酮，這由L-山梨糖脫氫酶(SDH)催化。最后， L-山梨糖酮被轉(zhuǎn)化為2-KGA，該步驟通過L-山梨糖酮脫氫酶(SNDH)催化。2-KGA再被還原為L-艾杜糖酸，L-艾杜糖酸由L-艾杜糖酸脫氫酶氧化回2-KGA (Hoshino et al. Agric. Biol. Chem. Vol. 54，No. 9，p. 2257-2263,1990)。或者，L-山梨糖酮還可被直接轉(zhuǎn)化為維生素C，該步驟是通過另一類型的SNDH催化的?？赏ㄟ^，例如增加轉(zhuǎn)化過程中涉及的酶的活性，來增加從給定底物進(jìn)行的2-KGA 和/或維生素C生產(chǎn)。一種已被選擇作為用于此類實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)的酶是SDH。當(dāng)在給定的微生物中增加SDH-活性(例如通過引入sdh的多個(gè)拷貝)時(shí)，人們能增加目標(biāo)產(chǎn)物(例如 2-KGA或維生素C)的產(chǎn)量。但是，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率仍可被改進(jìn)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是改進(jìn)2-KGA和/或維生素C生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力。令人吃驚地，我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，在攜帶sdh的多個(gè)額外拷貝的宿主細(xì)胞中，2-KGA和/ 或維生素C生產(chǎn)的增加強(qiáng)烈地依賴于宿主細(xì)胞基因組中的整合位點(diǎn)。已選擇了合適的基因座，其中對(duì)各基因的打斷(用于sdh的整合)不對(duì)2-KGA和/或維生素C生產(chǎn)負(fù)面影響。
具體地，本發(fā)明的目標(biāo)是產(chǎn)生下述微生物(例如Gluconobacter，優(yōu)選 Gluconobacter oxydans)，所述微生物是編碼SDH的基因的二倍體，以作為通過過量表達(dá) sdh來增加L-山梨糖到L-山梨糖酮的氧化的手段。本發(fā)明涉及sdh基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝向G. oxydans的基因組的引入，以及其使用不同的啟動(dòng)子的表達(dá)。合適的整合位點(diǎn)和啟動(dòng)子顯示出改進(jìn)了 SDH的表達(dá)。可用于本發(fā)明的編碼SDH的多核苷酸可選自已知的編碼SDH的基因，例如在EP 1846553中公開的，其已從Gluconobacter oxydans DSM 17078分離出。因此，本發(fā)明涉及整合于合適的宿主細(xì)胞的基因組中的編碼SDH蛋白的多核苷酸或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈， 其中所述多核苷酸選自下述組，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有山梨糖脫氫酶的活性；(e)編碼山梨糖脫氫酶的多核苷酸，其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼山梨糖脫氫酶的多核苷酸，其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同；構(gòu)成。根據(jù)SEQ ID NO 1的多核苷酸，可使用根據(jù)SEQ ID NO :3和4的引物通過PCR獲得的多核苷酸，編碼根據(jù)SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸、編碼根據(jù)SEQ ID NO :2的多肽的含有經(jīng)保守取代的氨基酸殘基的片段/衍生物的多核苷酸，編碼SDH并在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :1雜交的多核苷酸，或與所述多核苷酸至少70、85、90或95%相同的多核苷酸被詳細(xì)描述于EP 1846553中，特別參見所述參考文獻(xiàn)的第17頁第6行到第觀頁第23行。示于 SEQ ID NO :1 中的 sdh 已從 G. oxydans DSM 17078 分離出?？捎糜诒景l(fā)明的目的的另一 SDH是從G. oxydans T-100分離的多核苷酸，其公開于 EP 753575 中，或被 Saito 等人(Applied and Environmental Microbiology, Vol. 63, No. 2，p. 454-460，1997)描述過?？捎糜诒景l(fā)明的微生物可被公眾從不同來源獲得，例如，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ), Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Germany、American Type Culture Collection (ATCC), P. 0. Box 1549, Manassas, VA 20108USA 或 Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japan (以前是 Institue for Fermentation, Osaka(IFO),17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686，Japan)。保藏至IFO的優(yōu)選的細(xì)菌的例子例如是Gluconobacter oxydans (以前被禾爾為 G. melanogenus) IF03293>Gluconobacter oxydans (以前被禾爾為 G. melanogenus)IF03292、Gluconobacter oxydans (以前被禾爾為 G. rubiginosus) IF03244、Gluconobacter frateurii (以前被禾爾為 G. industrius) IF03260、Gluconobacter cerinus IF03266、 Gluconobacter oxydans IFO 3287 禾口 Acetobacter aceti subsp. orleanus IFO 3259,上述這些都于1卯4年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13693 和 1977 年 12 月 8 日保藏的 Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13773。菌株Acetobacter sp. ATCC 15164也是優(yōu)選細(xì)菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans (以前被稱為G. melanogenus)N44-1是優(yōu)選細(xì)菌的另一個(gè)例子，其是菌株 IFO 3293 的衍生物，在 Sugisawa et al.，Agric, Biol. Chem. 54 1201-1209， 1990中對(duì)其有所描述。此外，還可使用Gluconobacter oxydans (以前被稱為G. albidus) IFO 3250> Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G. albidus) IFO 325U Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G. albidus) IFO 3253、Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G. suboxydans) IFO 3255、Gluconobacter oxydans (以前被禾爾為 G. cerinus) IFO 3263、 Gluconobacter oxydans (以前被禾爾為 G. cerinus) IFO 3264>Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G. cerinus) IFO 3265、Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G. cerinus) IFO 3267、 Gluconobacter oxydans (以前被禾爾為 G. cerinus) IFO 3268、Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G. cerinus) IFO 3269、Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G. melanogenus) IFO 3294、Gluconacetobacter Iiquefaciens (以前被禾爾為 Acetobacter liquefaciens) IFO 12257 禾口 Gluconacetobacter liquefaciens (以前被禾爾為 Acetobacter liquefaciens) IFO 12258。特別地，本發(fā)明提供了用于直接生產(chǎn)2-KGA和/或維生素C的工藝，所述工藝包括將底物轉(zhuǎn)化為2-KGA和/或維生素C。這例如可在包含微生物的培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述微生物可以是靜止微生物或生長中的微生物。合適的宿主細(xì)胞和培養(yǎng)條件(包括可用的底物)已被描述于EP 1846553中，具體參見第8頁第1行到第17頁第5行，其中針對(duì)生產(chǎn)維生素C 概括的條件可以加以必要變更適用于2-KGA生產(chǎn)。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是 Gluconobacter 或 Acetobacter aceti,例如 G. oxydans、 G. cerinus、G. frateurii> A. aceti subsp. Xylinum 或 Α. aceti subsp. orleanus,優(yōu)選 G.oxydans DSM 17078。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，應(yīng)當(dāng)理解，上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬性的異名(synonym)或基原異名(basonym)，其如hternational Code of Nomenclature of Prokaryotes所定義。本文中使用的對(duì)微生物的命名是 International Committee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Union of Microbiological Societies官方接受的(在優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的提交日期時(shí))，并被其官方出版物hternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM)所公開。具體白勺參考文獻(xiàn)是 Urbance et al. , IJSEM(2001) vol 51 1059-1070，以及 IJSEMQ001) vol 51: 1231-1233 上的修訂通知,其中描述了對(duì)作為 Ketogulonicigenium vuIgare 的 G. oxydans DSM 4025的分類學(xué)上的重新歸類。本文中使用的靜止細(xì)胞指下述微生物的細(xì)胞，所述微生物例如是存活但不能活躍生長的，或者是以低的比生長速率[μ]生長的，例如，低于0.021Γ1的生長速率，優(yōu)選地，低
5于0. Oir10顯示出上述生長速率的細(xì)胞被稱為“靜止細(xì)胞模式”。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，在生長階段中，比生長速率例如為至少 0. 021Γ1。對(duì)于以分批、補(bǔ)料分批或半連續(xù)模式生長的細(xì)胞而言，生長速率取決于，例如，生長培養(yǎng)基的組成、PH、溫度等。通常，生長速率可以例如在大約0.05至大約o.ar1的范圍內(nèi)， 優(yōu)選地，在大約0. 06至大約0. 151Γ1的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，在大約0. 07至大約0. I^T1的范圍內(nèi)。本文中使用的以“靜止細(xì)胞方法”進(jìn)行的測(cè)量包括(i)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法培養(yǎng)細(xì)胞，(ii)從生長培養(yǎng)基收獲細(xì)胞，以及(iii)在含有將被轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)物(例如2-KGA)的底物的培養(yǎng)基中，于其中細(xì)胞不再生長的條件下，溫育收獲的細(xì)胞 (即，在該所謂的轉(zhuǎn)化步驟期間，生物質(zhì)沒有量上的增加)。根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了上文定義的編碼具有SDH活性的多肽的多核苷酸或者已用此類多核苷酸進(jìn)行過遺傳工程改造的微生物在生產(chǎn)2-KGA和/或維生素C中的用途。為使宿主微生物產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)拷貝的SDH基因(S卩，過量表達(dá)該基因)和/或蛋白而進(jìn)行的修飾包括使用強(qiáng)啟動(dòng)子，或者對(duì)SDH基因(的部分)或其調(diào)控元件加以突變 (例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。其還包括將基因的多個(gè)拷貝(或僅單拷貝)插入到合適的微生物中，所述微生物可有或可沒有SDH基因。如果基因的轉(zhuǎn)錄水平較之野生型基因有所增強(qiáng)，那么認(rèn)為該基因被“過量表達(dá)”。這可通過例如對(duì)mRNA的量加以定量的Northern印跡分析來測(cè)量，mRNA的量被用作為對(duì)基因表達(dá)的指示。在本文中，如果產(chǎn)生的mRNA的量較之野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200% 或者甚至超過500%，那么基因是過量表達(dá)的。本發(fā)明包括改變微生物的步驟，其中，本文中使用的“改變”包括下述工藝，該工藝以使得發(fā)酵產(chǎn)物(特別是2-KGA和/或維生素C)的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力較之野生型微生物有所提高的方式來進(jìn)行“遺傳改變”或“改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或改變用于培養(yǎng)的方法”。本文中使用的“2-KGA和/或維生素C的提高的產(chǎn)率”表示較之野生型微生物(即， 沒有被遺傳改變的微生物)而言增加至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、 200%或者甚至超過500%。當(dāng)使用不具有功能性sdh基因的微生物并通過整合到本發(fā)明示例的整合位點(diǎn)將sdh基因引入時(shí)，2-KGA和/或維生素C的產(chǎn)率可從沒有產(chǎn)量提高到顯著水平，這在下文中示出。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的一個(gè)方面，本發(fā)明的工藝導(dǎo)致2-KGA的產(chǎn)率通常為至少約1. 8g/l、優(yōu)選至少約2. 5g/l、更優(yōu)選至少約4. Og/Ι和最優(yōu)選至少約5. 7g/l或超過66g/l。在一種實(shí)施方式中，通過本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的2-KGA的產(chǎn)率在大約1. 8g/l到 600g/l的范圍內(nèi)。2-KGA的產(chǎn)率指直接來自生產(chǎn)容器的收獲流(即包含2-KGA的不含細(xì)胞上清液)中2-KGA的濃度。術(shù)語“遺傳工程改造”或“遺傳改變”表示對(duì)活的生物體(即微生物)中遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的科學(xué)改變。這包括生產(chǎn)和使用重組DNA。更特別地，這用于描述來自天然存在的生物而經(jīng)遺傳工程改造或修飾的生物。遺傳工程改造可通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來進(jìn)行，例如，基因替換，基因擴(kuò)增，基因打斷，使用質(zhì)粒、病毒或其它載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染。經(jīng)遺傳修飾的微生物，例如，經(jīng)遺傳修飾的微生物通常還被稱作重組微生物。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以經(jīng)分離的形式提供，優(yōu)選地，被純化至均質(zhì)。術(shù)語“經(jīng)分離的”表示物質(zhì)被移出其原來的環(huán)境(例如，如果其天然存在的話，就是天然環(huán)境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經(jīng)分離的，但與天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開的同樣的多核苷酸或多肽就是經(jīng)分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經(jīng)分離的，因?yàn)榇祟愝d體或組合物并非其天然環(huán)境的一部分。本文中使用的經(jīng)分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA，它們與從中獲得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰的兩條編碼序列(5’末端一條，3’末端一條)并非緊密相鄰。因此，在一種實(shí)施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰的5’非編碼(例如，啟動(dòng)子)序列的一些或全部。術(shù)語“經(jīng)分離的多核苷酸”因此包括，例如，加入到載體中、加入到自主復(fù)制質(zhì)?；虿《局?，或者加入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或者作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)分子(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))或化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)通過化學(xué)方式合成時(shí))的額外多肽。此外，“經(jīng)分離的核酸片段”是這樣的核酸片段其天然并不作為片段存在，并且將不會(huì)在天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。術(shù)語“同源性”或“相同性百分比，，在本文中可互換使用。就本發(fā)明的目的而言， 在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優(yōu)比較的目的 (例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條氨基酸序列或核苷酸序列達(dá)到最佳的比對(duì))，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。然后對(duì)相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列上相應(yīng)位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，％相同性=相同位置的數(shù)量/位置(即重疊位置)總數(shù)X 100)。優(yōu)選地，這兩條序列長度相同。技術(shù)人員會(huì)知道有若干計(jì)算機(jī)程序可被用于確定兩條序列間的同源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法來完成對(duì)序列的比對(duì)和對(duì)兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用 Needleman 和 Wunsch(J. Mol. Biol. (48) :444-453(1970))算法來確定兩條氨基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG軟件包(可從http://WWW. accelrys. com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到上述的所有不同參數(shù)將導(dǎo)致有細(xì)微區(qū)別的結(jié)果，但是使用不同算法時(shí)兩條序列的總體％相同性不會(huì)有顯著改變。在又一種實(shí)施方式中，使用GCG軟件包(可從http://WWW· accelrys. com獲得)的 GAP程序來確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna. CMP矩陣，缺口權(quán)重為40、50、60、70或80，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一種實(shí)施方式中，使用E. Meyers 和W.Miller(CABI0S，4 :11-17(1989))的算法來確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2. 0版)(可從http://vega. igh. cnrs. fr/ bin/align-guess. cgi獲得)中，其中使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長度懲罰(penalty)為12，缺口懲罰為4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步地被用作“查詢序列，，來進(jìn)行針對(duì)公眾數(shù)據(jù)庫的搜索，例如，去鑒定相關(guān)序列或家族中其它成員?？梢允褂肁ltschUl，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10的BLASTN和BLASTX程序(2. 0版)來進(jìn)行此類搜索。可以用 BLASTN程序，以分?jǐn)?shù)=100，字長(word length) = 12來進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分?jǐn)?shù)=50，字長=3來進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。本著比較的目的，為獲得有缺口的比對(duì)，可以利用 Altschul et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402中描述的Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如 BLASTX 禾口 BLASTN)的缺省參數(shù)。見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。待整合進(jìn)合適的宿主細(xì)胞的sdh基因可被可操作地連接到合適的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。技術(shù)人員知道如何選擇合適的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體可以含有用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點(diǎn)，還可在轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以用于翻譯。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可優(yōu)選包括處于起點(diǎn)的起始密碼子，以及恰當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诖g的多肽末尾的終止密碼子。有用的啟動(dòng)子和將所述啟動(dòng)子克隆進(jìn)合適的載體的方法被描述于例如Mito等人(見前文)或EP 453575中。優(yōu)選地，啟動(dòng)子可從I^sndh 和PtufB選擇。此外，可使用對(duì)所選擇的宿主起作用的任何啟動(dòng)子。可通過傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入合適的宿主細(xì)胞中。本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)橋聯(lián)(transconjugation) ”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域內(nèi)已知的、用于將外源核酸(例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的合適方法可在Sambrook，et al.(上文所述的)，Davis et al. ,Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中找到。為對(duì)已將外源DNA整合進(jìn)它們基因組的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和選擇，通常，將編碼選擇標(biāo)記(例如，對(duì)抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物(例如卡納霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素和鏈霉素)抗性的那些。編碼選擇標(biāo)記的核酸優(yōu)選在與編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細(xì)胞，或者其可在單獨(dú)的載體上引入，例如該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制?？赏ㄟ^藥物選擇鑒定出經(jīng)過引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已合并有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞會(huì)死亡)?？蛇x擇地，通過使用其技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的sacB系統(tǒng)的方法，此選擇標(biāo)記在外源DNA整合進(jìn)基因組后可被去除。術(shù)語“產(chǎn)量”或“生產(chǎn)能力”是本領(lǐng)域已知的，其包括給定的時(shí)間和給定的發(fā)酵體積中形成的發(fā)酵產(chǎn)物(例如2-KGA和/或維生素C)的濃度(例如，每升每小時(shí)的kg產(chǎn)物)。 術(shù)語“生產(chǎn)效率”包括獲得的特定水平的生產(chǎn)所需要的時(shí)間(例如，細(xì)胞達(dá)到發(fā)酵產(chǎn)物的特定速率輸出所需時(shí)間有多長)。術(shù)語“產(chǎn)率”是本領(lǐng)域已知的，其包括碳源向產(chǎn)物(即， 2-KGA和/或維生素C)轉(zhuǎn)化的效率。這通常寫作，例如，kg產(chǎn)物/kg碳源?！霸黾印被衔锏摹爱a(chǎn)率和/或產(chǎn)量和/或生產(chǎn)能力”表示，給定的時(shí)間中給定量的培養(yǎng)物中回收的該化合物分子或回收的該化合物有用分子的量增加。術(shù)語“生物合成”或“生物合成途徑”是本領(lǐng)域已知的，其包括通過細(xì)胞，以可能是多步驟且被高度調(diào)控的過程，從中間產(chǎn)物化合物對(duì)化合物(優(yōu)選地，有機(jī)化合物)的合成。措辭“代謝”是本領(lǐng)域已知的，其包括對(duì)生物中發(fā)生的生化反應(yīng)的總稱。然后，特定化合物的代謝(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代謝)包含細(xì)胞中與該化合物相關(guān)的總的生物合成、修飾和降解途徑。措辭“轉(zhuǎn)運(yùn)”或“運(yùn)入”是本領(lǐng)域已知的，其包括一種或多種分子在協(xié)助下移動(dòng)經(jīng)過該分子本來不能經(jīng)過或不能高效經(jīng)過的細(xì)胞膜。本發(fā)明與對(duì)2-KGA和/或維生素C的發(fā)酵生產(chǎn)中涉及的一種關(guān)鍵酶的過量表達(dá) (即SDH的過量表達(dá))有關(guān)?！癝DH的過量表達(dá)”包括將sdh的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝引入本文所定義的合適的微生物中，其中所述一個(gè)或多個(gè)拷貝被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的內(nèi)源性質(zhì)?；蛉旧w上的基因座中，該整合不會(huì)抑制微生物生長和sdh基因的表達(dá)。用于測(cè)量SDH活性的檢驗(yàn)被描述于例如Saito等人的(見前文)或Sugisawa等人的(Agric. Biol. Chem. 55， ρ· 363-370，1991)中。在一種實(shí)施方式中，sdh的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝已被整合進(jìn)L-山梨糖還原酶(SR) 基因的基因座中。SR催化L-山梨糖向D-山梨糖醇的轉(zhuǎn)化，其已被，例如Siinjoh等人 (Journal of Bacteriology，Vol. 184，No. 3，ρ· 861-863，2002)或在 EP 1859031 中描述過。在另一實(shí)施方式中，sdh的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝已被整合進(jìn)2-KGA還原酶(KR) 基因的基因座中，其在例如 Hoshino 等人(Agric. Biol. Chem. 54，p. 1211-1218，1990)和 Manning等人(USP 5082785)中描述過，他們沒有指出將SDH基因引進(jìn)用Tn5打斷的基因中而導(dǎo)致無KR活性的實(shí)例。在另一實(shí)施方式中，sdh的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝的已被整合進(jìn)葡糖脫氫酶(⑶H) 基因的基因座中。編碼⑶H的基因已在例如EP 1931785或EP 1934337中描述過。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，sdh的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝已被整合進(jìn)細(xì)胞色素bd氧化酶(CydB)基因的基因座中。涉及電子傳遞系統(tǒng)并可被用于實(shí)施本發(fā)明的此類酶的例子被描述于WO 2006/084730中。特別地，sdh的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝被引入GluconobacteH特別是 Gluconobacter oxydans，優(yōu)選G. oxydans DSM 17078)中，其中優(yōu)選地，在上述整合位點(diǎn)/ 基因座(即，sr、kr、gdh和/或cydB)中的至少一個(gè)中發(fā)生整合。用于將外源DNA整合進(jìn)微生物中的方法(例如Gluconobacter oxydans)是本領(lǐng)域已知的，并且其被示例于在實(shí)施例中。已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，sdh整合進(jìn)kr、gdh或cydB基因座導(dǎo)致2-KGA與相關(guān)的產(chǎn)物 (例如L-山梨糖酮、維生素C和L-艾杜糖酸)一起的高產(chǎn)量。而將sdh整合進(jìn)sr基因座， 獲得了非常低的2-KGA和相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。含有sdh盒的整合構(gòu)建體可再與代替天然啟動(dòng)子I^sndh的啟動(dòng)子(例如PtufB)結(jié)合。但是，已證明，當(dāng)使用其中sdh基因已被打斷的菌株(例如得自G. oxydans DSM 17078 的菌株6020 )時(shí)，在本文描述的染色體的sdh整合方面，Psndh是最好的啟動(dòng)子。可通過本領(lǐng)域已知的方法，特別是通過本文描述的薄層色譜法(TLC)或高效液相色譜法(HPLC)分析，來進(jìn)行對(duì)2-KGA或維生素C的產(chǎn)量的測(cè)量。天然存在的任何啟動(dòng)子或衍生物可用于在合適的宿主微生物中表達(dá)sdh基因。本文中使用的維生素C可以是水性溶液中發(fā)現(xiàn)的L-抗壞血酸的任何化學(xué)形式，例如未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽形式的特
9征為在通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵上清液中的任何種類的陽離子(例如，鉀、鈉、銨或鈣)存在時(shí)的陰離子。還包括在內(nèi)的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經(jīng)過分離的晶體。另一方面，用其相應(yīng)的鹽的名稱來命名L-抗壞血酸的鹽形式的經(jīng)過分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鈣等。可用于將sdh整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中而不帶入載體部分的載體是本領(lǐng)域已知的。此類有用的載體的一個(gè)具體的例子是dK18(見http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ nuccore/207845)。在本發(fā)明中有用的載體可以是自殺性質(zhì)粒，其不能在作為宿主的微生物中復(fù)制，或當(dāng)質(zhì)粒具有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)時(shí)不能在一定條件(例如較高的溫度，例如 420C )下復(fù)制的質(zhì)粒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，用于整合期望的多核苷酸而沒有載體部分的載體的設(shè)計(jì)可能取決于以下因素例如對(duì)將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的用于整合的載體(下文中為整合載體)可被引入宿主細(xì)胞中，由此以協(xié)助用具有整合位點(diǎn)基因的上游和下游側(cè)翼序列的期望的多核苷酸片段替換整合位點(diǎn)基因。該事件可通過下述兩種方法中的任一種來完成(1)在上游和下游側(cè)翼序列上同時(shí)發(fā)生雙交換事件。(2)通過在上游和下游側(cè)翼序列之一上進(jìn)行第一次單交換事件，然后在另一側(cè)翼序列上進(jìn)行第二次單交換事件以缺失整合載體的載體部分，將具有期望的多核苷酸片段的整合載體一次整合到染色體或內(nèi)源質(zhì)粒中。兩種方法最后都產(chǎn)生具有替換整合基因序列的期望的多核苷酸片段序列的重組微生物。本發(fā)明中期望的多核苷酸片段序列可被引入宿主細(xì)胞中，由此生產(chǎn)本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，其包括但不限于本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，SDH蛋白、SDH蛋白的突變體形式、融合蛋白等。本發(fā)明的有利的實(shí)施方式通過從屬權(quán)利要求而顯而易見。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的上述和其它方面以及上述和其它實(shí)施方式。將通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被理解為起限制作用。本文提到的所有參考文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、專利和公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容都通過引用并入本文。圖例

圖1具有側(cè)翼區(qū)域FRl和FR2片段的載體的構(gòu)建。用于PCR的引物表示為p7_pl0。圖2Ampr_Psndh和sdh盒的構(gòu)建。用于PCR的引物表示為pl_p6(SEQ ID NOs 21-26)。圖3使用pK18: :FR1_FR2構(gòu)建整合載體。圖4針對(duì)Amp^promotei^sdh盒的整合位點(diǎn)的替換。產(chǎn)生的質(zhì)粒在右邊示出。圖5驗(yàn)證實(shí)施例3的不同的構(gòu)建體的PCR方案。圖6根據(jù)SEQ ID NO 1多核苷酸序列，即從G. oxydans DSM 17078分離的sdh。圖7根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列，即從G. oxydans DSM 17078分離的SDH0圖8根據(jù)SEQ ID NO :3和4的多核苷酸序列，即用于擴(kuò)增根據(jù)SEQ ID NO=I的sdh 的引物。
實(shí)施例
實(shí)施例1 攜帶 Gluconobacter oxydans DSM 17078 的 L-山梨糖脫氫酶(SDH)基因的整合載體的構(gòu)建下述整合位點(diǎn)已被選擇作為用于在Gluconobacter oxydans DSM 17078中整合 sdh基因的額外拷貝的靶基因(a)山梨糖還原酶(sr)基因座、(b)葡糖脫氫酶(gdh)基因座、(c)2-KGA還原酶(kr)基因座和(d)細(xì)胞色素bd氧化酶(cydB)基因座。在pK18上克隆將被敲除的靶基因的側(cè)翼區(qū)域FRl和FR2。為了稍后切割整合盒，設(shè)計(jì)了 HindIII和 XbaI位點(diǎn)。在第一輪PCR(High Fidelity系統(tǒng)Roche Diagnostics，以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)條件，例如“94°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸1分鐘的35個(gè)循環(huán)”進(jìn)行)，設(shè)計(jì)引物對(duì)p7/p8，來制備具有FR2的5'-末端的部分序列的FR1，以及設(shè)計(jì)引物對(duì)p9/pl0來制備具有FRl的3'-末端的部分序列的FR2。然后使用引物對(duì)p7/pl0，在第二輪PCR(HighFidelity系統(tǒng)Roche Diagnostics,以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)條件，例如“94°C 2分鐘，10個(gè)循環(huán)的[94°C 30秒，63°C 30秒，68°C 6分鐘]，接著是20個(gè)循環(huán)的 [940C 30秒，63°C 30秒，68°C 6分鐘以及每個(gè)循環(huán)額外的20秒]以及在68°C最后延伸10 分鐘”來進(jìn)行)中將第一輪PCR的兩種產(chǎn)物連接。G. oxydans DSM 17078的基因組DNA被用作模板。在FRl和FR2的連接處，設(shè)計(jì)MlI和SpeI限制性位點(diǎn)，以插入即將被分別制備的Amp-promoter-sdh基因片段。實(shí)驗(yàn)的示意圖在圖1中表示。針對(duì)不同的整合位點(diǎn)，使用下述引物序列p7_cydB(SEQ ID NO 17) :ctcgagaagcttcaagatcgccatcccctatctgp8_cydB (SEQ ID NO :18)gtccgtattcgatccgcatgggtcgactctcactagtgttcttactccgccatgccagcp9_cydB (SEQ ID NO :19)gctggcatggcggagtaagaacactagtgagagtcgacccatgcggatcgaatacggacplO_cydB(SEQ ID NO :20) :ctcgagtctagatgtcctgttcagtctggggtg構(gòu)建了命名為pK18: :sr、pK18: :kr、pK18: :gdh 和 pK18: :cydB 的四種整合載體。 載體被引入G.oxydans DSM 17078中，通過測(cè)序驗(yàn)證了 FR1_FR2片段對(duì)靶基因的替換。含有sdh基因的額外拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子Psndh的整合盒被如下構(gòu)建用圖2中示出的流程，通過PCR制備具有SpeI和ClaI限制位點(diǎn)的amp^Psndh盒。同時(shí)，制備了具有ClaI 和SalI位點(diǎn)的sdh基因盒。使用的PCR引物(見圖2)如下pi(SEQ ID NO :21) :ctcgagactagtaaacttggtctgacagttaccp2 (SEQ ID NO :22):gtcagggacgctgaggccactcgagccgctcatgagacaataaccctgp3(SEQ ID NO :23) :ctgactcgagtggcctcagcgtccctgacp4(SEQ ID NO :24) :ctcgaatcgataactaactcctgtgcgaactatggtgcp5 (SEQ ID NO :25):gcaccatagttcgcacaggagttagttatcgatgacgagcggttttgattacatcgp6(SEQ ID NO :26) :ctcgaggtcgactcaggcgttcccctgaatgaaatcAmp^Psndh和sdh盒被克隆進(jìn)上述4個(gè)整合載體中，驗(yàn)證了完整的序列。產(chǎn)生的載體被命名為 pK18: :sr-ampr_Psndh_sdh、pK18: kr_ampr_Psndh_sdh、pK18: :gdh_ampr_ Psndh_sdh 和 pKl8: : cydB_ampr_Psndh_sdh (見圖 3)。實(shí)施例2 :用組成型啟動(dòng)子替換Psndh為了進(jìn)一步改進(jìn)sdh的表達(dá)，將實(shí)施例1的整合載體與組成型啟動(dòng)子PtufB組合(Saito et al. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 63, No. 2, p. 454-460, 1997)。使用引物prim3/prim4和作為模板的G.oxydans DSM 17078的染色體DNA，通過 PCR，構(gòu)建啟動(dòng)子片段prim3(SEQ ID NO 45) :ctgactcgagttgaagtccgcgccgagcgprim4(SEQ ID NO :46) :ctcgagtcgactttctccaaaaccccgctc因?yàn)镻tufB內(nèi)部具有ClaI位點(diǎn)，在構(gòu)建整合載體的情況下，設(shè)計(jì)AccI位點(diǎn)，并將其與ClaI位點(diǎn)連接。將PtufB與sdh基因盒組合(見實(shí)施例1)，將獲得的構(gòu)建體與各整合載體連接，產(chǎn)生下述構(gòu)建體pK18: wr-amptPtufB—sdh、pK18: kr-ampr_PtufB_sdh, pK18: : gdh-ampr_PtufB_sdh、ρΚ18: : cydB-ampr_PtufB_sdh。所述方法在圖4中被示意性概括出。實(shí)施例3 將整合盒轉(zhuǎn)化進(jìn)G. oxydans G02026中已獲得了全部8個(gè)不同的整合載體(見實(shí)施例1和2)，其被用于G.oxydans G02026(基于G. oxydans DSM17078的圖變體，其中天然sdh基因已被敲除)的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。沒有進(jìn)行純化步驟的單切割載體直接被用于轉(zhuǎn)化G.oxydans G02026，其中用 EcoRI 將 pK18: :sr-Ampr_Psndh_sdh 線性化，并用 BglII 將 pK18: :kr(gdh 或 cydB)-Ampr_ Psndh_sdh 線性化。將DNA片段(IOOng或400ng)添加到50 μ 1的感受態(tài)G. oxydans G02(^6細(xì)胞中。 電穿孔脈沖設(shè)置為1.7kV、25yF*100Q。電穿孔之后，將細(xì)胞懸浮進(jìn)Iml的MB培養(yǎng)基， 在下振蕩QOOrpm)溫育3小時(shí)，將250 μ 1的細(xì)胞培養(yǎng)物涂布于含有Km和Amp (每種 40 μ g/ml)的MB瓊脂平板(含有組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子含有50 μ g/ml Km和40 μ g/ml Amp的MB瓊脂平板)和含有40 μ g/ml Km和20 μ g/ml Amp的那些MB瓊脂平板上。在27 °C 下溫育3天后，菌落被轉(zhuǎn)移到含有40 μ g/ml Km和30 μ g/ml Amp的MB (液體培養(yǎng)基)中， 在下振蕩(150rpm)培養(yǎng)2天。使用轉(zhuǎn)化子的染色體DNA，通過PCR擴(kuò)增整合部分周圍的4個(gè)不同基因座，來驗(yàn)證整合事件(見圖5)。使用下述引物對(duì)進(jìn)行四套不同的PCR流程㈧到(D)。(A)進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證整合位點(diǎn)的缺乏針對(duì) sr (SEQ ID NO 27 禾口 28)的 sr_fwd (cgccggactgggcgatcgttgg)禾口 sr_ rev (gccttttccagcgggggacgacca)針對(duì) kr (SEQ ID NO 29 禾口 30)的 kr_fwd (tcgcaaccacccagaacac)禾口 kr_ rev (tgtccacgaccagattagcca)# gdh(SEQ ID NO :31 禾口 32)的 gdh_fwd(aatcgtcccggctccggaaa)禾口 gdh_ rev(gcttgccgttgatcgcataggtg)針對(duì) cydB(SEQ ID NO 33 禾口 34)的 cydB_fwd(agcttcgactggttctcc)禾口 cydB_ rev(agtacgaataggccgtgtag)(B)進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證FRl位點(diǎn)上的重組sr_FRl_ 上游(gcatggaccagcttctcaagagcg ；SEQ ID NO :35)禾口 amp_ fwd(ttgctcacccagaaacgctggtg ；SEQ ID NO 39)kr_FRl_ 上游(catgtgctggaacgtgaaattgc ；SEQ ID NO 36)禾口 amp_fwdgdh_FRl_ 上游(caatgcgatagttcgtggacg ；SEQ ID NO 37)禾口 amp_fwdcydB_FRl_ 上游(ggcattccggacatgaagaacg ；SEQ ID NO 38)禾口 amp_fwd(C)進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證FR2位點(diǎn)上的重組sdh_ 內(nèi)部 _fwd(gtcatcgggtgttcctgatctc ;SEQ ID NO :40)和 sr_FR2_ T 游 (gatttcctgcagcgcgtgcacc ；41)sdh_ 內(nèi)部 _fwd 禾口 kr_FR2_ 下游(acggcatgaattatggaacggttg ；SEQ ID NO :42)sdh_ 內(nèi)部 _fwd 禾口 gdh_FR2_ 下游(ggtcgatctgacagaggacggt ；SEQ ID NO 43)sdh_ 內(nèi)部 _fwd 禾口 cydB_FR2_ 下游(gtgtcgtatgtggttcccgagg ；SEQ ID NO 44)(D)進(jìn)行PCR,以驗(yàn)證啟動(dòng)子(例如Psndh :p3和p6)的存在實(shí)施例4 靜止細(xì)胞反應(yīng)中的2-KGA生產(chǎn)通過靜止細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)，分析整合體(見實(shí)施例3)的2-KGA生產(chǎn)能力。通過 TLC (薄層色譜法)和HPLC (高效液相色譜法)分析2-KGA和其它代謝產(chǎn)物。將實(shí)施例3中獲得的整合體在含有Km和Amp每種40 μ g/ml的MB瓊脂平板上
13接種，并在27°C下溫育3天。再將菌落完全涂布于具有含有Km和Amp每種40 μ g/ml的 No. 3BD-7%山梨糖醇瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，并在27°C下溫育3天。然后回收細(xì)胞物質(zhì)， 將其在500 μ 1的無菌水中懸浮，適當(dāng)稀釋，然后測(cè)量600nm下的OD。最后，制備0D_ = 20 的細(xì)胞懸浮液，將其用于靜止細(xì)胞反應(yīng)。反應(yīng)混合物由250 μ 1的細(xì)胞懸浮液(0D_ = 20)、 50 μ 1的20%山梨糖溶液、125 μ 1的4%CaC03+1.2%NaCl溶液、75μ1的無菌水構(gòu)成。反應(yīng)混合物在30°C下振蕩O20rpm)溫育20小時(shí)。將反應(yīng)混合物離心，并回收上清液用于TLC 分析。或者，將上清液與等體積的0. OlM 混合并冷凍，直到HPLC分析。對(duì)于TLC 分析，使用正丙醇H2O 1 % H3PO4 HCOOH = 40 10 1 1 的溶劑， 將2μ 1 的樣品或標(biāo)準(zhǔn)物(10mg/ml)應(yīng)用到 TLC 平板(Merck Silica gel 60 F254 5x20cm) 上，對(duì)四元堿(tetrabase)、四唑藍(lán)(bluetetrazolium)禾口間萘二酚(naphtoresorcinol)的檢測(cè)按照下文所述進(jìn)行四元堿噴霧0. 5% KIO4,良好風(fēng)干，隨后將經(jīng)四元堿飽和的溶液噴霧進(jìn)2N乙酸15% MnS04(處于水中)=1 1。四唑藍(lán)將0.5%的四唑藍(lán)噴霧進(jìn)MeOH 6N NaOH = 1 1中，并在100°C加熱。間萘二酚將0. 2%間萘二酚噴霧進(jìn)KOH &H2S04 = 50 1中，隨后在100°C加熱。對(duì)于所有被測(cè)試的整合體，在TLC上檢測(cè)到了 2-KGA和/或維生素C與L-山梨糖酮和艾杜糖酸一起被生產(chǎn)，這表示通過將不同的構(gòu)建體整合進(jìn)突變菌株G. oxydans G02(^6，對(duì)SDH活性產(chǎn)生了再活化。用具有與Aminex-HPX-78H(300x 7. 8mm)柱(Biorad, Reinach, Switzerland)相的 LiChrospher-100-RP18(125x 4. 6mm) ft (Merck, Darmstadt, Germany)的 Agilent
1100HPLC 系統(tǒng)(Agilent ^Technologies，Wilmington，USA)，進(jìn)行 HPLC 分析。移動(dòng)相為 0.004M硫酸，流速為0.6ml/min。用UV探測(cè)器(波長254nm)組合折射系數(shù)探測(cè)器，記錄了 2 個(gè)信號(hào)。此外，使用氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II，YMC，he. ,Kyoto，Japan)，在 254nm 處進(jìn)行UV探測(cè)，來進(jìn)行對(duì)L-抗壞血酸的鑒定。移動(dòng)相為50mM NH4H2PO4和乙腈 60)。HPLC檢驗(yàn)驗(yàn)證了 sdh盒(包括作為啟動(dòng)子的Psndh)在所有四個(gè)整合位點(diǎn)—— sr、kr、gdh和cydB中的整合，導(dǎo)致了 2-KGA和/或維生素C與L-山梨糖酮和艾杜糖酸一起被生產(chǎn)。整合體生產(chǎn)的SDH-相關(guān)產(chǎn)物(L-山梨糖酮、2-KGA、維生素C、L-艾杜糖酸)在由G. oxydans DSM 17078生產(chǎn)的這些產(chǎn)物的30%到80%的范圍內(nèi)，但宿主菌株G. oxydans G02026不產(chǎn)生它們中的任何一種。使用kr、gdh和cydB基因的sdh盒的整合尤其適于生產(chǎn)2-KGA和/或維生素C，但使用sr基因沒有那么適合。包括PtufB作為啟動(dòng)子的sdh盒的整合也導(dǎo)致當(dāng)其被整合進(jìn)kr、gdh和cydB基因時(shí)，SDH相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)生在由G. oxydans DSM 17078產(chǎn)生的那些的1-5%的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.重組微生物，其包含整合的多核苷酸片段，所述片段含有編碼具有L-山梨糖脫氫酶 (SDH)活性的蛋白的多核苷酸或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多核苷酸選自下述組，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQID NO 2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組 DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的引物組，通過核酸擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來獲得；(d)多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SDH多肽的活性；(e)編碼SDH多肽的多核苷酸，所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼SDH多肽的多核苷酸，所述多核苷酸與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同；構(gòu)成并且其中所述多核苷酸被整合進(jìn)重組微生物的基因組中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組微生物，其中所述sdh基因進(jìn)一步與外源啟動(dòng)子序列組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的重組微生物，其中所述sdh基因被整合進(jìn)內(nèi)源質(zhì)?；蛉旧w上的基因座中，其整合不抑制所述微生物的生長和所述sdh基因的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的重組微生物，其中在所述染色體上的所述基因座選自針對(duì)L-山梨糖還原酶、2-酮基-L-古洛糖酸還原酶、葡糖脫氫酶和細(xì)胞色素bd氧化酶的基因座構(gòu)成的組。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的重組微生物，其中所述微生物選自Gluconobacter、 Gluconacetobacter 禾口 Acetobacter0
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組微生物，其是Gluconobacteroxyckns，特別是 Gluconobacter oxydans DSM 17078。
7.用于產(chǎn)生重組微生物的方法，所述方法包括下述步驟(a)產(chǎn)生整合載體，所述載體包含下述多核苷酸片段，所述片段具有L-山梨糖脫氫酶基因盒的一個(gè)或多個(gè)拷貝以及整合位點(diǎn)的上游和下游側(cè)翼多核苷酸序列，和(b)產(chǎn)生推定的整合位點(diǎn)基因的敲除，這通過將(a)的整合載體引入微生物中，用根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸片段替換所述整合位點(diǎn)基因來實(shí)現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在步驟(a)之后，在所述L-山梨糖脫氫酶基因引入整合位點(diǎn)之前，啟動(dòng)子被克隆于L-山梨糖脫氫酶基因之前。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在步驟(a)之后，在所述L-山梨糖脫氫酶基因引入整合位點(diǎn)之前，標(biāo)記基因被克隆進(jìn)L-山梨糖脫氫酶基因的上游或下游。
10.生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸和/或維生素C的方法，其中使用根據(jù)權(quán)利要求1到6 中任一項(xiàng)的微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)和/或L-抗壞血酸(下文也稱為維生素C)的重組微生物(特別是Gluconobacter屬的)的生產(chǎn)，其中所述微生物已被修飾，以過量表達(dá)L-山梨糖脫氫酶(SDH)。通過將編碼SDH的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝引入宿主微生物的基因組中，來實(shí)現(xiàn)該過量表達(dá)，導(dǎo)致較之未經(jīng)修飾的微生物的2-KGA和/或維生素C生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率提高。sdh的所述一個(gè)或多個(gè)額外拷貝的表達(dá)依賴于整合位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳工程改造的微生物和它們用于生產(chǎn)2-KGA和/或維生素C的用途。
文檔編號(hào)C12N9/04GK102356153SQ201080010633
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者奈杰爾·約翰·芒希亞, 新城雅子, 星野達(dá)雄, 清水亞希子 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司