專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞分離方法。更具體而言，本發(fā)明涉及一種通過(guò)使用籠鎖化合物來(lái)僅從細(xì)胞群分離具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞的細(xì)胞分離方法。
背景技術(shù)：
從細(xì)胞群中分離具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞的細(xì)胞分離技術(shù)被廣泛用于血細(xì)胞辨別、 基因重組細(xì)胞的純化、細(xì)胞表型變化的分析等。迄今沿用的細(xì)胞分離技術(shù)的例子包括熒光激活細(xì)胞分選(FACS)和使用磁性微珠的方法。例如，在使用FACS來(lái)分離表達(dá)預(yù)定的細(xì)胞表面抗原的靶細(xì)胞時(shí)，使包含經(jīng)與該抗原特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體標(biāo)記的靶細(xì)胞的細(xì)胞群流過(guò)流動(dòng)池，接著進(jìn)行激光束照射。 此后，檢測(cè)從每個(gè)細(xì)胞照射的熒光以判定細(xì)胞的光學(xué)特性，由此僅將具有源自經(jīng)標(biāo)記熒光物質(zhì)的光學(xué)特性的靶細(xì)胞加以物理分離。專(zhuān)利文獻(xiàn)1(圖7)披露了 FACS，其包括流體系統(tǒng) (其將用熒光標(biāo)記試劑等染色的細(xì)胞在流動(dòng)池中成行排布，并作為液滴釋放到流動(dòng)池外)、 光學(xué)系統(tǒng)(其用激光束照射細(xì)胞以檢測(cè)散射光和熒光)、和分選系統(tǒng)(其控制所釋放的液滴的運(yùn)動(dòng)方向)。例如，在使用磁性微珠來(lái)分離表達(dá)預(yù)定細(xì)胞表面抗原的靶細(xì)胞時(shí)，用與該抗原特異性結(jié)合的磁性標(biāo)記抗體來(lái)標(biāo)記靶細(xì)胞。此后，使用磁體來(lái)捕捉結(jié)合有足夠量的磁性標(biāo)記抗體的靶細(xì)胞，使其與未結(jié)合磁性標(biāo)記抗體的細(xì)胞(或結(jié)合量少的細(xì)胞)分離。專(zhuān)利文獻(xiàn) 2披露了一種用于磁性分離細(xì)胞的方法和裝置。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)[PTL l]JP-A-2007-46947[PTL 2]JP-T-2002-515319發(fā)明概述依照FACS，有可能通過(guò)以每秒數(shù)千 數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的高速度判定細(xì)胞特性來(lái)分離靶細(xì)胞。然而，另一方面，為了實(shí)施高速度分離，需要使細(xì)胞在高壓下流過(guò)流動(dòng)池(flow cell)，因此由于形成液滴的噴嘴部分的突然壓力變化等而對(duì)細(xì)胞造成物理?yè)p傷。此外， FACS的流體系統(tǒng)和分選系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是非常昂貴的裝置。依照使用磁性微珠的方法，可以集中處理大量細(xì)胞，并且與FACS相比，可以降低對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷。然而，在此方法中，由于無(wú)法對(duì)每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)的光學(xué)特性來(lái)進(jìn)行定量分析，從而進(jìn)行靶細(xì)胞的判定，所以例如不可能僅分離以等于或高于一定的基準(zhǔn)值表達(dá)預(yù)定的表面抗原的細(xì)胞。此外，在此方法中，因?yàn)椴荒芙M合分析表面抗原的多種表達(dá)狀態(tài)，所以不可能使用多項(xiàng)參數(shù)來(lái)分析細(xì)胞，也不能通過(guò)設(shè)門(mén)(gating)來(lái)分離細(xì)胞。另外，在使用磁性微珠的方法中，因?yàn)獒槍?duì)細(xì)胞表面抗原，使用磁性標(biāo)記抗體來(lái)實(shí)施細(xì)胞的標(biāo)記和分離，所以無(wú)法基于不能借助抗體標(biāo)記的細(xì)胞特性來(lái)分離細(xì)胞。不能借助抗體標(biāo)記的細(xì)胞特性的具體例子包括使用Hoechst試劑的核酸熒光染色，和使用Fluo-3試劑的胞內(nèi)鈣的熒光染色。 就Hoechst試劑而言顯示高排出能力的細(xì)胞稱(chēng)作“側(cè)群細(xì)胞(SP細(xì)胞)”，據(jù)說(shuō)SP細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。使用經(jīng)Hoechst試劑染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度作為指標(biāo)進(jìn)行的SP細(xì)胞分離在干細(xì)胞研究領(lǐng)域中被廣泛實(shí)施，但是SP細(xì)胞分離不能通過(guò)使用磁性微珠的方法來(lái)實(shí)施。因此，本發(fā)明的主要目的是提供一種細(xì)胞分離方法，其不使用具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的裝置，抑制對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷，而且使得通過(guò)定量分析和多參數(shù)分析來(lái)實(shí)施細(xì)胞分離，以及使用Hoechst染色等作為指標(biāo)來(lái)實(shí)施細(xì)胞分離等成為可能。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物 (caged compound)標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出所述靶細(xì)胞的步驟。此細(xì)胞分離方法包括例如判定用籠鎖生物素標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于靶細(xì)胞的所述籠鎖生物素的步驟；及使細(xì)胞與鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行接觸，并基于所述鏈霉抗生物素蛋白與所述激活的籠鎖生物素間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出所述靶細(xì)胞的步驟?；蛘?，此細(xì)胞分離方法包括例如判定用籠鎖熒光素標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟； 通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于靶細(xì)胞的所述籠鎖熒光素的步驟；及使細(xì)胞與抗熒光素抗體進(jìn)行接觸，并基于所述抗體與所述激活的籠鎖熒光素間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出所述靶細(xì)胞的步驟。作為上述細(xì)胞分離方法的一個(gè)變形的例子，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞分離方法， 其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向沒(méi)有預(yù)定特性的非靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于非靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用，來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離除去所述非靶細(xì)胞，從而獲得靶細(xì)胞的步驟。在這些方法中，作為所述對(duì)激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)，使用具有如下所述的親和力的物質(zhì)，所述親和力在光解離性保護(hù)基從所述籠鎖化合物解離時(shí)表現(xiàn)出來(lái)。作為上述兩種細(xì)胞分離方法的一個(gè)變形的例子，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的非靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于非靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)非激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離靶細(xì)胞的步驟。或者，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)非激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離除去所述非靶細(xì)胞，從而獲得靶細(xì)胞的步驟。在這些方法中，作為所述對(duì)非激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)，使用具有如下所述的親和力的物質(zhì)，所述親和力在所述籠鎖化合物從光解離性保護(hù)基解離時(shí)喪失。依照本發(fā)明的細(xì)胞分離方法可以進(jìn)一步包括用籠鎖化合物標(biāo)記細(xì)胞的步驟。在本發(fā)明中，“籠鎖化合物”指其活性位點(diǎn)受到光解離性(光降解性)保護(hù)基保護(hù)、當(dāng)光解離性保護(hù)基通過(guò)光照射從活性位點(diǎn)解離時(shí)由無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)換成活性狀態(tài)的化合物。 另外，在本發(fā)明中，“籠鎖型化合物”指其活性位點(diǎn)被光解離性保護(hù)基保護(hù)的無(wú)活性籠鎖化合物，而“解籠鎖(uncaged)型化合物”指光解離性保護(hù)基由于光照射而解離從而變成了活性狀態(tài)的籠鎖化合物。此外，在本發(fā)明中，籠鎖化合物的“活性狀態(tài)”指籠鎖化合物可以與“對(duì)激活的籠鎖化合物具有親和力的物質(zhì)”相互作用的狀態(tài)。與此相反，“無(wú)活性狀態(tài)”指籠鎖化合物不能與該物質(zhì)相互作用的狀態(tài)。即，“對(duì)激活的籠鎖化合物具有親和力的物質(zhì)”僅對(duì)“解籠鎖型化合物”具有親和力，而對(duì)“籠鎖型化合物”不展現(xiàn)出親和力。另一方面，“對(duì)非激活的籠鎖化合物具有親和力的物質(zhì)”僅對(duì)“籠鎖型化合物”具有親和力，而對(duì)“解籠鎖型化合物”不展現(xiàn)出親和力。依照本發(fā)明，提供了一種細(xì)胞分離方法，其在不使用具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的裝置的情況下抑制對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷，而且使細(xì)胞分離能夠通過(guò)定量分析和多參數(shù)分析來(lái)實(shí)施及使細(xì)胞分離能夠使用Hoechst染色等作為指標(biāo)來(lái)實(shí)施。附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示依照本發(fā)明的細(xì)胞分離方法的程序的流程圖。圖2是顯示依照本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的程序的示意圖。圖3是顯示依照本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的程序的示意圖。圖4是顯示依照本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的程序的示意圖。圖5是顯示依照本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的程序的示意圖。符號(hào)說(shuō)明3 抗體4 柱5 對(duì)解籠鎖型化合物22有親和力的物質(zhì)(鏈霉抗生物素蛋白、抗熒光素抗體)6 磁性物質(zhì)7 磁體11 靶細(xì)胞12 非靶細(xì)胞21 籠鎖型化合物(籠鎖型生物素、籠鎖型熒光素)
22 解籠鎖型化合物(解籠鎖型生物素、解籠鎖型熒光素)D 容器F1、F2:激光束發(fā)明詳述在下文中將參照附圖來(lái)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。雖然如下描述的實(shí)施方案例示了本發(fā)明的代表性實(shí)施方案的例子，但是本發(fā)明的范圍不受實(shí)施方案狹窄地解釋。將以下列次序進(jìn)行描述。1.使用籠鎖生物素的細(xì)胞分離(1)籠鎖化合物的標(biāo)記(步驟Si)(2)熒光物質(zhì)標(biāo)記(步驟S》和特性判定(步驟S3)(3)解籠鎖(步驟S4)
(4)分離(步驟 S5)2.使用籠鎖熒光素的細(xì)胞分離(1)籠鎖化合物的標(biāo)記(步驟Si)(2)熒光物質(zhì)標(biāo)記(步驟S》和特性判定(步驟S3)(3)解籠鎖(步驟S4)(4)分離(步驟 S5)1.使用籠鎖生物素的細(xì)胞分離圖1是顯示依照本發(fā)明的細(xì)胞分離方法的程序的流程圖。圖2和圖3是顯示依照本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的程序的示意圖。在下文中，參照?qǐng)D1至3來(lái)描述依照第一個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的程序。(1)籠鎖化合物標(biāo)記(步驟Si)在圖1中，以符號(hào)Sl標(biāo)示的“籠鎖化合物標(biāo)記步驟”是用籠鎖化合物標(biāo)記細(xì)胞的步驟(參見(jiàn)圖2(A))。在此步驟中，用籠鎖化合物標(biāo)記包含要分離的靶細(xì)胞的所有細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)使用例如結(jié)合籠鎖化合物的抗體來(lái)用籠鎖化合物標(biāo)記細(xì)胞。在此情形中，使用這樣的抗體其以存在于包括靶細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞的表面上的物質(zhì)作為抗原。存在于所有細(xì)胞表面上的物質(zhì)的例子包括細(xì)胞表面上普遍表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白、和細(xì)胞表面上普遍存在的糖鏈及脂質(zhì)等?？梢酝ㄟ^(guò)使用例如結(jié)合籠鎖化合物的凝集素來(lái)用籠鎖化合物標(biāo)記細(xì)胞。在此情況中，使用這樣的凝集素，其能結(jié)合普遍存在于包括靶細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞的表面上的糖鏈。 另外，用籠鎖化合物標(biāo)記細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限制，可以使用任何方法，只要所述方法使細(xì)胞能夠直接或間接地結(jié)合籠鎖化合物即可。作為標(biāo)記細(xì)胞的籠鎖化合物，例如可以使用籠鎖生物素或籠鎖熒光素等。作為籠鎖化合物，籠鎖核苷酸、籠鎖肽、籠鎖鈣螯合劑等是可用的，并且已經(jīng)有人報(bào)告了包括核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等籠鎖化合物(參見(jiàn)“Biologically active molecules with a "light switch”· ”Angew Chem Int Ed Engl. 2006 年 7 月 24 日；45(30) :4900-21)。在本發(fā)明中， 可以使用任何上述籠鎖化合物，沒(méi)有任何特定限制，只要可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。圖2 (A)顯示了在籠鎖化合物標(biāo)記步驟Sl中使用抗體3用籠鎖型化合物21標(biāo)記靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12的情況。下面，在本實(shí)施方案中，以使用籠鎖生物素作為籠鎖型化合物21的情況為例加以說(shuō)明。作為籠鎖生物素，有可能使用MeNPOC-生物素、氫醌-生物素等。下面，在本實(shí)施方案中，籠鎖型化合物21指“籠鎖型生物素21”。(2)熒光物質(zhì)標(biāo)記(步驟S》和特性判定(步驟S3)在圖1中，以符號(hào)S3標(biāo)示的“特性判定步驟”是判定已經(jīng)用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟(參見(jiàn)圖2(B))。在此步驟中，實(shí)施已經(jīng)用籠鎖型生物素21標(biāo)記的細(xì)胞的光學(xué)特性的檢測(cè)和判定?？梢允褂美绻牧魇郊?xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的光學(xué)特性。具體地，使包含靶細(xì)胞 11和非靶細(xì)胞12的樣品溶液流過(guò)流動(dòng)池，接著進(jìn)行激光束Fl照射，由此檢測(cè)從細(xì)胞產(chǎn)生的要測(cè)量的光。作為要測(cè)量的光，可以使用前散射光、側(cè)散射光、瑞利散射、米氏散射等散射光，以及熒光等。將要測(cè)量的檢測(cè)光轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，并基于電信號(hào)來(lái)判定每個(gè)細(xì)胞的特性。在通過(guò)檢測(cè)從細(xì)胞照射的熒光來(lái)判定細(xì)胞的光學(xué)特性時(shí)，可以用熒光標(biāo)記抗體來(lái)標(biāo)記靶細(xì)胞11 (或非靶細(xì)胞12)，之后進(jìn)行特性判定步驟S3。在圖1中，以符號(hào)S2標(biāo)示的 “熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟”是在分離表達(dá)預(yù)定細(xì)胞表面抗原的靶細(xì)胞11的情形中，用與該抗原特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體來(lái)對(duì)靶細(xì)胞11進(jìn)行標(biāo)記的步驟。可以使用與常規(guī)的FACS的細(xì)胞分離方法相同的步驟實(shí)施熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟S2。此外，可以與籠鎖化合物標(biāo)記步驟Sl同時(shí)或在籠鎖化合物標(biāo)記步驟Sl前實(shí)施熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟S2。在本實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞特性是進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)并判定；然而，可以使用例如電學(xué)或磁學(xué)檢測(cè)手段來(lái)實(shí)施細(xì)胞特性的檢測(cè)和判定。在電學(xué)或磁學(xué)檢測(cè)細(xì)胞特性時(shí)，將微電極布置于流動(dòng)池中，從而測(cè)量流過(guò)流動(dòng)池的細(xì)胞電阻值、電容值、電感值、阻抗、電極間電場(chǎng)的變化值、或者磁化、磁界變化、磁場(chǎng)變化等。在此情況下，基于細(xì)胞的電學(xué)或磁學(xué)特性來(lái)分離細(xì)胞。(3)解籠鎖(步驟S4)在圖1中，以符號(hào)S4標(biāo)示的“解籠鎖步驟”是通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記靶細(xì)胞的籠鎖化合物的步驟(參見(jiàn)圖2(C))。在此步驟中，將激光束F2照射到在特性判定步驟S3中已經(jīng)被判定為具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞11，由此激活標(biāo)記的籠鎖型生物素21。作為用于激活籠鎖化合物的激光束F2，使用具有適合于解離保護(hù)籠鎖化合物的活性位點(diǎn)的光解離性保護(hù)基的波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激光束。作為激光光源，例如可以使用與公知的流式細(xì)胞儀中提供的上述激光束Fl的同樣的光源，諸如汞燈、氙氣燈和各種激光光源(固相激光、氣體激光、和半導(dǎo)體激光)。作為激光光源，可以合適地使用小型但是能高輸出的巨脈沖激光。用于檢測(cè)細(xì)胞的光學(xué)特性的激光束Fl和用于激活籠鎖化合物的激光束F2由不同光學(xué)系統(tǒng)或相同光學(xué)系統(tǒng)構(gòu)成。另外，可以在不同時(shí)機(jī)或在基本上相同的時(shí)間將激光束Fl 和F2照射到靶細(xì)胞11。在本文中，“基本上相同的時(shí)間，，意為在流動(dòng)池中的相同位置處實(shí)施激光束Fl向靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12的照射及激光束F2向已經(jīng)判定為具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞11的照射。通過(guò)根據(jù)判定細(xì)胞特性所需要的時(shí)間來(lái)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)流動(dòng)池中的細(xì)胞流速，有可能在基本上相同的時(shí)間實(shí)施激光束Fl和激光束F2的照射。在照射激光束F2時(shí)，由于光解離性保護(hù)基從活性位點(diǎn)解離，標(biāo)記于靶細(xì)胞11的籠鎖型生物素21從無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)換成活性狀態(tài)。S卩，如圖2(C)中所顯示的，籠鎖型生物素21 變成“解籠鎖型生物素22”。另一方面，因?yàn)榧す馐鳩2不照射到非靶細(xì)胞12，所以標(biāo)記非靶細(xì)胞12的籠鎖型生物素21不被激活，而且不發(fā)生變化。圖2(D)是示意性顯示在解籠鎖步驟S4后已經(jīng)從流動(dòng)池收集的靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12的視圖。如該圖中所顯示的，解籠鎖型生物素22已經(jīng)標(biāo)記于靶細(xì)胞11，并且籠鎖型生物素21已經(jīng)標(biāo)記于非靶細(xì)胞12。(4)分離(步驟 S5)在圖1中，以符號(hào)S5標(biāo)示的“分離步驟”是使細(xì)胞與對(duì)激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)接觸，并基于該物質(zhì)與激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從細(xì)胞中分離靶細(xì)胞的步驟(參見(jiàn)圖幻。在此步驟中，使經(jīng)解籠鎖型生物素22標(biāo)記的靶細(xì)胞11與對(duì)解籠鎖型生物素22具有親和力的鏈霉抗生物素蛋白5接觸。此后，基于解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用來(lái)分離靶細(xì)胞11。
具體地，首先，如圖3(A)中所顯示的，使從流動(dòng)池收集的靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12 流過(guò)固相化(made into a solid phase)有鏈霉抗生物素蛋白5的柱4。由于解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用，經(jīng)解籠鎖型生物素22標(biāo)記的靶細(xì)胞11被保留在柱4中，如圖3(B)中所顯示的。另一方面，經(jīng)籠鎖型生物素21標(biāo)記的非靶細(xì)胞12 不保留在柱4中而通過(guò)柱4。由此，能夠分離靶細(xì)胞11與非靶細(xì)胞12。靶細(xì)胞11不必通過(guò)解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用而完全捕獲并保留在柱4中， 只要通過(guò)與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用，使靶細(xì)胞11和不與鏈霉抗生物素蛋白5 發(fā)生相互作用而通過(guò)的非靶細(xì)胞12之間，在通過(guò)柱4的時(shí)間上有差異即可。這里，已經(jīng)描述了在解籠鎖步驟S4中，將激光束F2照射到靶細(xì)胞11，將靶細(xì)胞11 保留在柱4中從而被分離的情形。然而，在依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法中，在解籠鎖步驟S4中將激光束F2照射到非靶細(xì)胞12也是可以的。在此情況中，由于激活的解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用，非靶細(xì)胞12被保留在柱4中，從而被分離。 這樣，被籠鎖型生物素21標(biāo)記的靶細(xì)胞11照原樣通過(guò)柱4，并被收集。本在實(shí)施方案中，作為柱4，使用的是已經(jīng)固相化了鏈霉抗生物素蛋白的柱。然而， 可以使用任何物質(zhì)作為固相化到柱4中的物質(zhì)，只要該物質(zhì)對(duì)解籠鎖型生物素22具有親和力即可。此類(lèi)物質(zhì)的例子包括抗生物素抗體。在使用其他化合物例如籠鎖熒光素等作為籠鎖化合物時(shí)，將對(duì)解籠鎖型化合物具有親和力的物質(zhì)例如抗熒光素抗體固相化到柱4中。如上文所描述的，依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法，通過(guò)使用常規(guī)的流式細(xì)胞手段來(lái)實(shí)施特性判定步驟S3，可以定量、多參數(shù)地分析細(xì)胞的光學(xué)特性。作為分析的結(jié)果，可以?xún)H激活已經(jīng)判定為具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞的籠鎖化合物，并從而分離靶細(xì)胞。依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法，可以無(wú)需使用具有流體系統(tǒng)和分選系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的FACS而分離靶細(xì)胞。在依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法中，通過(guò)在從流動(dòng)池收集細(xì)胞后使用柱4來(lái)實(shí)施分離步驟S5，有可能防止伴隨液滴形成的對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷，而這是使用FACS進(jìn)行分離的問(wèn)題之一。此外，在通過(guò)FACS分離有風(fēng)險(xiǎn)(諸如有感染之虞)的細(xì)胞時(shí)，液滴形成過(guò)程中產(chǎn)生的氣溶膠會(huì)引起污染問(wèn)題，然而在依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法中，沒(méi)有關(guān)于污染的擔(dān)憂(yōu)。2.使用籠鎖熒光素的細(xì)胞分離圖4和圖5是顯示依照本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的順序的示意圖。在依照第一個(gè)實(shí)施方案的方法中，在流動(dòng)池中實(shí)施特性判定步驟S3和解籠鎖步驟S4。 與此相反，依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法的特征在于依靠使用顯微鏡的成像技術(shù)來(lái)實(shí)施特性判定步驟S3和解籠鎖步驟S4。(1)籠鎖化合物標(biāo)記(步驟Si)圖4(A)示意性顯示了籠鎖化合物標(biāo)記步驟Si，其中用籠鎖化合物標(biāo)記容納于容器D諸如培養(yǎng)皿(Petri dish)中的靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12。在籠鎖化合物標(biāo)記步驟Sl 中，用籠鎖化合物標(biāo)記包括要分離的靶細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞。如第一個(gè)實(shí)施方案中所描述的，用籠鎖化合物標(biāo)記細(xì)胞可以通過(guò)使用例如結(jié)合籠鎖化合物的抗體，或結(jié)合籠鎖化合物的凝集素來(lái)進(jìn)行。細(xì)胞可以是懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞。通過(guò)向已經(jīng)培養(yǎng)了這些細(xì)胞的容器D中的培養(yǎng)基中添加抗體等，或者將培養(yǎng)基替換成合適的緩沖溶液后添加抗體溶液，籠鎖化合物直接或間接地結(jié)合細(xì)胞。圖4 (A)顯示了通過(guò)在籠鎖化合物標(biāo)記步驟Sl中使用抗體3來(lái)用籠鎖型化合物21 標(biāo)記靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12的情況。在下文中，在本實(shí)施方案中，以使用籠鎖熒光素作為籠鎖型化合物21的情況為例子來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。作為籠鎖熒光素，例如，可以使用通過(guò)將5-羧基甲氧基-2-硝基芐基(CMNB)添加到熒光素而獲得的籠鎖熒光素。在下文中，在本實(shí)施方案中，籠鎖型化合物21指“籠鎖型熒光素21”。(2)熒光物質(zhì)標(biāo)記(步驟S》和特性判定(步驟S3)圖4(B)示意性顯示了特性判定步驟S3，其中檢測(cè)并判定用籠鎖型熒光素21標(biāo)記的細(xì)胞的光學(xué)特性。在本實(shí)施方案中，通過(guò)例如使用顯微鏡的成像技術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的光學(xué)特性。具體地，例如通過(guò)使用作為照射機(jī)構(gòu)的激光束Fl和作為成像機(jī)構(gòu)的顯微鏡(其包括區(qū)域成像裝置諸如CCD或CMOS裝置)，檢測(cè)由于激光束Fl的照射而從細(xì)胞產(chǎn)生的熒光，并將檢測(cè)到的熒光轉(zhuǎn)化成電信號(hào)?；陔娦盘?hào)來(lái)判定每個(gè)細(xì)胞的特性。在此情況中，在特性判定步驟S3 之前，可以以與上文所描述(參見(jiàn)熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟幻)的那樣，先用熒光標(biāo)記抗體來(lái)標(biāo)記靶細(xì)胞11 (或非靶細(xì)胞12)。在本文中是通過(guò)檢測(cè)熒光來(lái)判定細(xì)胞的特性。然而，例如也可以基于通過(guò)上述成像機(jī)構(gòu)獲得的細(xì)胞形狀來(lái)檢測(cè)并判定細(xì)胞的特性。(3)解籠鎖(步驟S4)圖4 (C)示意性顯示了解籠鎖步驟S4，其中將激光束F2照射到在特性判定步驟S3 中已經(jīng)判定為具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞11，由此激活標(biāo)記的籠鎖型熒光素21。激光束F2的照射機(jī)構(gòu)在顯微鏡中作為不同或相同的光學(xué)系統(tǒng)提供。作為用于激活籠鎖化合物的激光束F2，使用具有適合于解離保護(hù)籠鎖化合物的活性位點(diǎn)的光解離性保護(hù)基的波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激光束。另外，可以在不同時(shí)間或在基本上相同的時(shí)間將激光束Fl和 F2照射到靶細(xì)胞11。在照射激光束F2時(shí)，由于光解離性保護(hù)基從活性位點(diǎn)解離，標(biāo)記于靶細(xì)胞11的籠鎖型熒光素21從無(wú)活性狀態(tài)變換成活性狀態(tài)。S卩，如圖4(C)中所顯示的，籠鎖型熒光素21 變成“解籠鎖型熒光素22”。另一方面，因?yàn)榧す馐鳩2不照射到非靶細(xì)胞12，所以標(biāo)記非靶細(xì)胞12的籠鎖型熒光素21不被激活，而不發(fā)生改變。圖4(D)是示意性顯示解籠鎖步驟S4后的靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12的視圖。如該圖中所顯示的，解籠鎖型熒光素22已經(jīng)標(biāo)記于靶細(xì)胞11，而籠鎖型熒光素21已經(jīng)標(biāo)記于非靶細(xì)胞12。(4)分離(步驟 S5)圖5示意性顯示了分離步驟S5，其中使細(xì)胞與對(duì)所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出所述靶細(xì)胞。在此步驟中，使經(jīng)解籠鎖型熒光素22標(biāo)記的靶細(xì)胞11與對(duì)解籠鎖型熒光素22有親和力的抗熒光素抗體5進(jìn)行接觸?；诮饣\鎖型熒光素22與抗熒光素抗體5之間的相互作用，分離靶細(xì)胞11。具體地，首先，將結(jié)合磁性物質(zhì)6的抗熒光素抗體5添加至已經(jīng)從容器D諸如培養(yǎng)皿收集的靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12?？篃晒馑乜贵w5特異性結(jié)合標(biāo)記靶細(xì)胞11的解籠鎖型熒光素22，由此用磁性物質(zhì)6磁性標(biāo)記靶細(xì)胞11 (參見(jiàn)圖5(A))。另一方面，因?yàn)榭篃晒馑乜贵w5不結(jié)合用籠鎖型熒光素21標(biāo)記的非靶細(xì)胞12，所以未磁性標(biāo)記非靶細(xì)胞12。在下文中，如圖5(B)中所顯示的，使靶細(xì)胞11和非靶細(xì)胞12流過(guò)設(shè)置有磁體7 的柱4。由于磁性物質(zhì)6與磁體7之間的磁性吸引力而將經(jīng)磁性標(biāo)記的靶細(xì)胞11保留在柱 4中(參見(jiàn)圖5(C))。另一方面，未經(jīng)磁性標(biāo)記的非靶細(xì)胞不被保留在柱4中而通過(guò)。由此可以分離靶細(xì)胞11與非靶細(xì)胞12。靶細(xì)胞11通過(guò)磁性物質(zhì)6與磁體7之間的磁性吸引力吸附到柱4的內(nèi)壁上而完全保留在其中不是必要的，只要在該磁性吸引力的作用下靶細(xì)胞 11與非靶細(xì)胞12通過(guò)柱的時(shí)間產(chǎn)生差異即可。這里，已經(jīng)描述了在解籠鎖步驟S4中，將激光束F2照射到靶細(xì)胞11，并將靶細(xì)胞 11保留在柱4中，從而加以分離的情況。然而，在依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法中，還有可能在解籠鎖步驟S4中將激光束F2照射到非靶細(xì)胞12。在此情況中，由于激活的解籠鎖型熒光素22結(jié)合抗熒光素抗體5，非靶細(xì)胞12被磁性標(biāo)記，非靶細(xì)胞12保留在柱4中，從而被分離。這樣，未被磁性標(biāo)記的靶細(xì)胞11通過(guò)柱4，從而被分離。在本實(shí)施方案中使用的是籠鎖熒光素作為籠鎖化合物，但是籠鎖化合物不限于籠鎖熒光素。在使用與籠鎖熒光素不同的籠鎖化合物時(shí)，使用特異性結(jié)合解籠鎖型化合物的抗體代替抗熒光素抗體5來(lái)磁性標(biāo)記靶細(xì)胞11。如上文所描述的，依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法，通過(guò)使用成像技術(shù)來(lái)實(shí)施特性判定步驟S3，可以定量、多參數(shù)地分析細(xì)胞的光學(xué)特性。作為該分析的結(jié)果，可以?xún)H激活已經(jīng)判定為具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞的籠鎖化合物，并分離靶細(xì)胞。另外，依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法，可以無(wú)需使用具有流體系統(tǒng)和分選系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的FACS而分離靶細(xì)胞。在依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法中，通過(guò)在從容器D諸如培養(yǎng)皿收集細(xì)胞后使用柱4來(lái)實(shí)施分離步驟S5，有可能防止伴隨液滴形成的對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷，而這是使用 FACS進(jìn)行分離的問(wèn)題之一。此外，在通過(guò)FACS分離具有風(fēng)險(xiǎn)(諸如關(guān)于感染的擔(dān)憂(yōu))的細(xì)胞時(shí)，此外，在通過(guò)FACS分離有風(fēng)險(xiǎn)(諸如有感染之虞)的細(xì)胞時(shí)，液滴形成過(guò)程中產(chǎn)生的氣溶膠會(huì)引起污染問(wèn)題，然而，依照本實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法沒(méi)有關(guān)于污染的擔(dān)憂(yōu)。在如上文所描述的依照第一個(gè)和第二個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞分離方法中，已經(jīng)描述了通過(guò)使用僅對(duì)解籠鎖型化合物而不對(duì)籠鎖型化合物有特異性親和力的物質(zhì)(鏈霉抗生物素蛋白5或抗熒光素抗體幻來(lái)分離靶細(xì)胞或非靶細(xì)胞的例子。然而，在依照本發(fā)明的細(xì)胞分離方法中當(dāng)然還可能通過(guò)使用僅對(duì)籠鎖型化合物而不對(duì)解籠鎖型化合物有特異性親和力的物質(zhì)來(lái)分離靶細(xì)胞或非靶細(xì)胞。例如，作為抗熒光素抗體，制備不結(jié)合解籠鎖型熒光素，但僅結(jié)合籠鎖型熒光素的抗體。隨后，在解籠鎖步驟S4中激活標(biāo)記于非靶細(xì)胞的籠鎖型熒光素，而靶細(xì)胞保持被解籠鎖型熒光素標(biāo)記。這樣，可以?xún)H將靶細(xì)胞保留在固相化有抗熒光素抗體的柱中，并分離靶細(xì)胞。工業(yè)實(shí)用性依照本發(fā)明的細(xì)胞分離方法可以廣泛用于血細(xì)胞辨別、基因重組細(xì)胞的純化、對(duì)細(xì)胞表型變化的分析等。依照本發(fā)明的細(xì)胞分離方法可以抑制對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷，而且使得借助定量或多參數(shù)地分析的細(xì)胞分離成為可能。因此，該方法特別可用于血液學(xué)或干細(xì)胞研究領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出靶細(xì)胞的步驟。
2.一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向沒(méi)有預(yù)定特性的非靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于非靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并經(jīng)由基于所述物質(zhì)與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離除去所述非靶細(xì)胞，從而獲得靶細(xì)胞的步驟。
3.依照權(quán)利要求1或2的細(xì)胞分離方法，其中，使用在光解離性保護(hù)基從所述籠鎖化合物解離時(shí)表現(xiàn)出所述親和力的物質(zhì)，作為所述對(duì)激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)。
4.一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的非靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于非靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)非激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出靶細(xì)胞的步驟。
5.一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于靶細(xì)胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細(xì)胞與對(duì)非激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于所述物質(zhì)與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞分離除去所述非靶細(xì)胞，從而獲得靶細(xì)胞的步驟。
6.依照權(quán)利要求4或5的細(xì)胞分離方法，其中，使用在光解離性保護(hù)基從所述籠鎖化合物解離時(shí)所述親和力喪失的物質(zhì)，作為所述對(duì)非激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)。
7.依照權(quán)利要求3或6的細(xì)胞分離方法，其進(jìn)一步包括用籠鎖化合物標(biāo)記細(xì)胞的步馬聚ο
8.依照權(quán)利要求1的細(xì)胞分離方法，其包括 判定用籠鎖生物素標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記靶細(xì)胞的所述籠鎖生物素的步驟；及使細(xì)胞與鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行接觸，并基于所述鏈霉抗生物素蛋白與所述激活的籠鎖生物素間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出所述靶細(xì)胞的步驟。
9.依照權(quán)利要求1的細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖熒光素標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記于靶細(xì)胞的所述籠鎖熒光素的步驟；及使細(xì)胞與抗熒光素抗體進(jìn)行接觸，并基于所述抗體與所述激活的籠鎖熒光素間的相互作用來(lái)僅從所述細(xì)胞中分離出所述靶細(xì)胞的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞分離方法，其在不使用具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的裝置的條件下抑制對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷，而且使借助定量分析和多參數(shù)分析的細(xì)胞分離、以及利用Hoechst染色等作為指標(biāo)的細(xì)胞分離成為可能。本發(fā)明提供了一種細(xì)胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標(biāo)記的細(xì)胞的特性的步驟(S3)；通過(guò)僅向具有預(yù)定特性的靶細(xì)胞照射光來(lái)激活標(biāo)記靶細(xì)胞的籠鎖化合物的步驟(S4)；及使細(xì)胞與對(duì)激活的籠鎖化合物有親和力的物質(zhì)進(jìn)行接觸，并基于該物質(zhì)與激活的籠鎖化合物之間的相互作用來(lái)僅從細(xì)胞中分離靶細(xì)胞的步驟(S5)。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102341504SQ20108001017
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者新田尚 申請(qǐng)人:索尼公司