一種單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及細(xì)胞培養(yǎng)，特別涉及一種單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜及單細(xì)胞克隆分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單細(xì)胞克隆指的是分離單個細(xì)胞，其增殖產(chǎn)生的后代都是來源于同一個細(xì)胞，即為單細(xì)胞克隆。單細(xì)胞克隆分離技術(shù)的成功解決是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平研宄的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的單細(xì)胞克隆分離可采用有限稀釋法或克隆環(huán)法。
[0003]有限稀釋法:即把細(xì)胞稀釋到理論上的5~10 μ I培養(yǎng)液中含I個細(xì)胞，然后用移液器吸取相應(yīng)容積的細(xì)胞懸液至96孔板中，每孔補(bǔ)足培養(yǎng)液至200 μ 1，在顯微鏡下找到有單細(xì)胞克隆生長的培養(yǎng)孔，進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離。實(shí)際的操作中，該法效率不高，大量存在的空白孔和多細(xì)胞孔(細(xì)胞數(shù)大于或等于2)需要研宄人員觀察排除，費(fèi)時費(fèi)力。
[0004]克隆環(huán)法:在顯微鏡下找到要挑取的單克隆，用記號筆在培養(yǎng)板的背面標(biāo)示出來。用鑷子夾取克隆環(huán)，在環(huán)的底部均勻的涂上凡士林，扣在標(biāo)記的單克隆上，形成相對封閉的空間，然后在克隆環(huán)內(nèi)滴入適量的胰酶，細(xì)胞消化下來后用槍頭吸出，放到新的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。該方法對操作技巧要求較高，初學(xué)者不易掌握。
[0005]目前高端的流式細(xì)胞儀不僅可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的多通道分選(熒光激活細(xì)胞分選，F(xiàn)ACS)，還可以進(jìn)行單細(xì)胞的分離種植分選，為大規(guī)模的單細(xì)胞研宄奠定技術(shù)基礎(chǔ)。但是這些分選設(shè)備價格昂貴，目前還難以普及。因此，探索一種操作簡單、快速、高效的單細(xì)胞克隆分離方法十分有意義。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006]為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，本實(shí)用新型提供一種單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜及單細(xì)胞克隆分離方法。
[0007]本實(shí)用新型的技術(shù)方案是:
[0008]一種單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，包括培養(yǎng)膜本體，所述培養(yǎng)膜本體上表面呈矩陣式排列多個正方形分離培養(yǎng)單元，每個正方形分離培養(yǎng)單元的中心處設(shè)有圓形分離培養(yǎng)區(qū)。
[0009]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)膜本體為聚苯乙烯膜。
[0010]優(yōu)選的，所述圓形分離培養(yǎng)區(qū)表面進(jìn)行過改性處理，接枝羥基(ΟΗ)，或者羧基(COOH)，或者氨基(NH或NH2)等親水基團(tuán)。
[0011]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)膜本體除每個正方形分離培養(yǎng)單元中心的分離培養(yǎng)區(qū)外，其它部分表面覆蓋有超疏水納米層。
[0012]優(yōu)選的，超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水納米層還可以為超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，
[0013]優(yōu)選的，每個正方形分離培養(yǎng)單元的邊緣有邊界線，每個正方形分離培養(yǎng)單元的左上角標(biāo)有字母和數(shù)字的組合編號。
[0014]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)膜本體為透光膜。
[0015]優(yōu)選的，每個正方形分離培養(yǎng)單元邊長5~8mm，其中心的圓形分離培養(yǎng)區(qū)直徑2?4mmο
[0016]一種使用單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離的方法，包括步驟:
[0017]S1、將單細(xì)胞克隆分離專用納米培養(yǎng)膜置于配套培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中；
[0018]S2、制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，將有限稀釋的單細(xì)胞懸液加入置有培養(yǎng)膜的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，細(xì)胞只能在正方形分離培養(yǎng)單元中心經(jīng)過表面親水改性的分離培養(yǎng)區(qū)粘附貼壁，而不能在培養(yǎng)皿上其它經(jīng)過超疏水處理的部位粘附生長；
[0019]S3、每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，記錄有單克隆生長的培養(yǎng)單元；無菌條件下，用鑷子取出培養(yǎng)膜，根據(jù)記錄的編號，用剪刀剪下有單克隆細(xì)胞生長的正方形分離培養(yǎng)單元，在PBS中輕柔漂洗，置于24孔板中，在顯微鏡下復(fù)檢驗(yàn)證，確定剪下的分離培養(yǎng)單元上有單細(xì)胞克隆生長；
[0020]S4、將生長有單細(xì)胞克隆的分離培養(yǎng)單元轉(zhuǎn)移至24孔板的培養(yǎng)孔中，加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞；
[0021]S5、收集消化好的單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS重懸，在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，再次在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的24孔中，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，所得即為單細(xì)胞克隆。
[0022]本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是:
[0023]本實(shí)用新型所提供的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜及單細(xì)胞克隆分離方法，培養(yǎng)膜本體上表面呈矩陣式排列多個正方形分離培養(yǎng)單元，每個正方形分離培養(yǎng)單元的中心處設(shè)有圓形分離培養(yǎng)區(qū)。所述圓形分離培養(yǎng)區(qū)表面進(jìn)行親水性改性處理，有利于細(xì)胞貼壁生長。所述培養(yǎng)膜本體除每個正方形分離培養(yǎng)單元中心的分離培養(yǎng)區(qū)外，其它部分表面覆蓋有超疏水納米層，不利于細(xì)胞貼壁生長。只有貼壁到每個正方形分離培養(yǎng)單元中心分離培養(yǎng)區(qū)的細(xì)胞能夠存活并繼續(xù)增殖生長成單細(xì)胞克隆，超疏水納米層將單細(xì)胞克隆彼此隔離開，可方便的進(jìn)行單細(xì)胞克隆的分離操作。
【附圖說明】
[0024]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本實(shí)用新型作進(jìn)一步描述:
[0025]圖1為本實(shí)用新型所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜的俯視圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]如圖1所示，本實(shí)用新型所揭示的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，包括由聚苯乙烯制成的培養(yǎng)膜本體1，所述培養(yǎng)膜本體為透光膜，培養(yǎng)膜本體上表面呈矩陣式排列多個正方形分離培養(yǎng)單元2，每個正方形分離培養(yǎng)單元的中心處設(shè)有圓形分離培養(yǎng)區(qū)3。每個正方形分離培養(yǎng)單元的邊緣有邊界線，每個正方形分離培養(yǎng)單元邊長5~8_，其中心的圓形分離培養(yǎng)區(qū)直徑2~4mm。每個正方形分離培養(yǎng)單元的左上角標(biāo)有字母和數(shù)字的組合編號，字母代表該正方形分離培養(yǎng)單元所在行，數(shù)字代表該正方形分離培養(yǎng)單元所在列，方便區(qū)分。
[0027]所述圓形分離培養(yǎng)區(qū)3表面進(jìn)行過改性處理，如接枝羥基(OH)，或者羧基(COOH)，或者氨基(NH或NH2)等親水基團(tuán)。所述培養(yǎng)膜本體除每個正方形分離培養(yǎng)單元中心的分離培養(yǎng)區(qū)外，其它部分表面覆蓋有超疏水納米層。超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水納米層還可以為超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，上述超疏水納米層的制作方法為現(xiàn)有技術(shù)中采用的方法，例如在聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料表面蝕刻具有一定粗糙度的微觀結(jié)構(gòu)從而構(gòu)建超疏水表面，采用氣相沉積的方法制備超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。
[0028]本實(shí)用新型的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜的細(xì)胞分離方法，包括步驟:
[0029]本實(shí)用新型的使用單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離的方法，包括步驟:
[0030]S1、將單細(xì)胞克隆分離專用納米培養(yǎng)膜置于配套培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中；
[0031]S2、制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，將有限稀釋的單細(xì)胞懸液加入置有培養(yǎng)膜的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，細(xì)胞只能在正方形分離培養(yǎng)單元中心經(jīng)過表面親水改性的分離培養(yǎng)區(qū)粘附貼壁，而不能在培養(yǎng)皿上其它經(jīng)過超疏水處理的部位粘附生長；
[0032]S3、每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，記錄有單克隆生長的培養(yǎng)單元；無菌條件下，用鑷子取出培養(yǎng)膜，根據(jù)記錄的編號，用剪刀剪下有單克隆細(xì)胞生長的正方形分離培養(yǎng)單元，在PBS中輕柔漂洗，置于24孔板中，在顯微鏡下復(fù)檢驗(yàn)證，確定剪下的分離培養(yǎng)單元上有單細(xì)胞克隆生長；
[0033]S4、將生長有單細(xì)胞克隆的分離培養(yǎng)單元轉(zhuǎn)移至24孔板的培養(yǎng)孔中，加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞；
[0034]S5、收集消化好的單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS重懸，在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，再次在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的24孔中，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，所得即為單細(xì)胞克隆。
[0035]另外，本實(shí)用新型的單細(xì)胞克隆分離專用納米培養(yǎng)膜可制備成各種形狀，以適應(yīng)目前市售的各種培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿，也可以制備配套的專用培養(yǎng)皿，如方形，此專用培養(yǎng)皿的底面和側(cè)壁均覆蓋有超疏水納米層。
[0036]上述實(shí)施例只為說明本實(shí)用新型的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人能夠了解本實(shí)用新型的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本實(shí)用新型主要技術(shù)方案的精神實(shí)質(zhì)所做的修飾，都應(yīng)涵蓋在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:包括培養(yǎng)膜本體，所述培養(yǎng)膜本體上表面呈矩陣式排列多個正方形分離培養(yǎng)單元，每個正方形分離培養(yǎng)單元的中心處設(shè)有圓形分離培養(yǎng)區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:所述培養(yǎng)膜本體為聚苯乙稀膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:所述圓形分離培養(yǎng)區(qū)表面進(jìn)行過改性處理，接枝羥基、羧基或氨基等親水基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:所述培養(yǎng)膜本體除每個正方形分離培養(yǎng)單元中心的分離培養(yǎng)區(qū)外，其它部分表面覆蓋有超疏水納米層。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:所述超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙烯層、聚L-乳酸層、聚四氟乙烯層、陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:每個正方形分離培養(yǎng)單元的邊緣有邊界線，每個正方形分離培養(yǎng)單元的左上角標(biāo)有字母和數(shù)字的組合編號。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:所述培養(yǎng)膜本體為透光膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，其特征在于:每個正方形分離培養(yǎng)單元邊長5~8_，其中心的圓形分離培養(yǎng)區(qū)直徑2~4_。
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)膜，包括培養(yǎng)膜本體，所述培養(yǎng)膜本體上表面呈矩陣式排列多個正方形分離培養(yǎng)單元，每個正方形分離培養(yǎng)單元的中心處設(shè)有圓形分離培養(yǎng)區(qū)。所述圓形分離培養(yǎng)區(qū)表面進(jìn)行親水性改性處理，有利于細(xì)胞貼壁生長。所述培養(yǎng)膜本體除每個正方形分離培養(yǎng)單元中心的分離培養(yǎng)區(qū)外，其它部分表面覆蓋有超疏水納米層，不利于細(xì)胞貼壁生長。只有貼壁到每個正方形分離培養(yǎng)單元中心分離培養(yǎng)區(qū)的細(xì)胞能夠存活并繼續(xù)增殖生長成單細(xì)胞克隆，超疏水納米層將單細(xì)胞克隆彼此隔離開，可方便的進(jìn)行單細(xì)胞克隆的分離操作。
【IPC分類】C12M3-04, C12N5-02
【公開號】CN204608032
【申請?zhí)枴緾N201520253752
【發(fā)明人】何向鋒, 強(qiáng)福林, 沈康, 王建紅, 施文
【申請人】何向鋒, 南通市腫瘤醫(yī)院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月24日