一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和儀器科學(xué)領(lǐng)域，具體的說是基于微流控芯片上液滴包裹和液滴分選的方法實現(xiàn)低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活體單細(xì)胞是生命活動的基本單元和進(jìn)化的基本單位,從單個細(xì)胞層面研究細(xì)胞生物學(xué)過程有著重要的意義，能夠從本質(zhì)上揭示癌癥發(fā)病機(jī)制，理解細(xì)胞分化與組織發(fā)育原理，識別基因表達(dá)特性與細(xì)胞特征。
[0003]快速分離、獲取單細(xì)胞已成為單細(xì)胞研究與分析的關(guān)鍵技術(shù)。流式細(xì)胞分選儀在單細(xì)胞分選和分析方面的重要儀器平臺，是分離細(xì)胞的有效手段。然而由于絕大多數(shù)活體細(xì)胞本身熒光效應(yīng)較弱或沒有熒光，外加熒光標(biāo)記不適用于活體細(xì)胞篩選。商業(yè)化集成的微流控芯片單細(xì)胞分析儀能實現(xiàn)對單細(xì)胞的某種或某些分析的目的，但是其集成度較高，可擴(kuò)展性不強(qiáng)，價格昂貴，不易實現(xiàn)單細(xì)胞的物理分離獲取，限制了對單細(xì)胞的下游自主化分析，阻礙了其在實驗室研究中的應(yīng)用。目前實驗室研究中常用的單細(xì)胞分離方法還包括激光光鑷、顯微分離和無限稀釋法。前兩種技術(shù)平臺價格昂貴，分離通量較低；無限稀釋法簡單方便，但無法可控分離獲得單細(xì)胞。
[0004]微流控芯片有著尺寸小、試劑消耗量少、高通量、易集成等特點，適用于微體系的研究和分析工作；微液滴作為獨立的研究與分析單元，使基于微流控芯片的微液滴技術(shù)應(yīng)用到單細(xì)胞研究與分析有著巨大的優(yōu)勢和前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足之處，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。
[0006]本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)，其特征在于，包括:微流控芯片、液滴信號檢測器、信號分析與分選控制單元、電磁閥、導(dǎo)管、液滴收集微管；
[0007]所述微流控芯片內(nèi)部包括微通道網(wǎng)絡(luò)，用于使流體在外力驅(qū)動下在其微流道內(nèi)定向流動，液滴的生成和分選，以及廢液、被分選液滴的導(dǎo)出；
[0008]所述液滴信號檢測器用于采集流經(jīng)所述微流控芯片的檢測區(qū)的液滴的光學(xué)信號，并將其傳送至信號分析與分選控制單元；
[0009]所述信號分析與分選控制單元用于分析來自所述液滴信號檢測器的信號，并控制電磁閥的工作；
[0010]所述電磁閥用于接收所述信號分析與分選控制單元發(fā)送的分選控制指令，并通過改變液滴在微流控芯片的運(yùn)動方向執(zhí)行相應(yīng)的液滴分選操作；
[0011]所述導(dǎo)管連接所述微流控芯片與電磁閥，用于導(dǎo)出分選的液滴；
[0012]所述液滴收集微管連接所述導(dǎo)管的一端，用于收集所述微流控芯片分選出的滴液。
[0013]所述微流控芯片是由上層和下層基片鍵和而成的，材質(zhì)均可為塑料、玻璃或石英。
[0014]所述微流控芯片的上層包括微通道網(wǎng)絡(luò)，所述微通道網(wǎng)絡(luò)的出入口包括連續(xù)油相入口、細(xì)胞懸浮液入口、側(cè)流油相入口、電磁閥連接口、廢液出口和被分選液滴出口 ；
[0015]所述連續(xù)油相入口所連通的一支微通道和細(xì)胞懸浮液入口所連通的一支微通道連通后，再與所述側(cè)流油相入口、電磁閥連接口、廢液出口和被分選液滴出口連通。
[0016]所述微通道為25-100微米寬，40-60微米深，形成的液滴直徑為30_80微米。
[0017]所述被分選液滴出口為200-250微米寬、200-250微米深的微通道。
[0018]所述液滴信號檢測器是高速相機(jī)、熒光檢測器和拉曼光譜檢測器中的任意一種。
[0019]所述信號分析與分選控制單元是由與所述液滴信號檢測器相對應(yīng)的信號分析軟件和電磁閥控制軟硬件耦合而構(gòu)成。
[0020]所述電磁閥有吸、推兩種分別可控的工作模式。
[0021]一種低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0022]液體注入和液滴的形成:利用壓力驅(qū)動油相通過連續(xù)油相入口進(jìn)入微流控芯片的一支微通道，驅(qū)動細(xì)胞懸浮液水相通過細(xì)胞懸浮液入口進(jìn)入微流控芯片的另一支微通道，在上述兩支微通道的連接處通過油相對水相的剪切作用形成油包水微液滴；
[0023]液滴流向的控制:從側(cè)流油相入口引入的油相，使油包水微液滴在微流道內(nèi)定向流動，且默認(rèn)流入廢液出口 ；
[0024]液滴信號采集和分析:當(dāng)油包水微液滴流經(jīng)液滴信號檢測器時，油包水微液滴的液滴信號將被采集并傳送到信號分析與分選控制單元，通過將所接收的信號與設(shè)定的分選規(guī)則進(jìn)行比對，判定所采集的液滴信號是否滿足所述分選規(guī)則的條件；
[0025]液滴分選:當(dāng)采集的液滴信號滿足分選條件時，信號分析與分選控制單元觸發(fā)電磁閥工作，使油包水微液滴受到電磁閥施加的力，進(jìn)而改變其運(yùn)動方向，流向被分選液滴出Π ；
[0026]液滴的收集和單細(xì)胞的獲取:被分選液滴出口處的導(dǎo)管流入液滴收集微管中，實現(xiàn)單液滴收集并通過后續(xù)破乳化、提取操作獲取單細(xì)胞。
[0027]所述分選規(guī)則為一個液滴中包裹有且只有單個細(xì)胞。
[0028]本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果:
[0029]1.本發(fā)明有效地利用微流控芯片的微液滴包裹技術(shù)，通過液滴包裹細(xì)胞的方法，提高了對單細(xì)胞操控的程度和精確度，尤其是對尺寸較小的細(xì)胞，此方法的優(yōu)勢更為突出。
[0030]2.本發(fā)明有效地利用微流控芯片的微液滴分選技術(shù)，通過對包裹細(xì)胞的液滴分選，實現(xiàn)了對單細(xì)胞的分離和獲取的目的。
[0031]3.本發(fā)明通過調(diào)節(jié)電磁閥工作的時間，有效地控制了液滴所受力的大小，擴(kuò)大此方法對尺寸不同液滴的適用范圍。
[0032]4.本發(fā)明優(yōu)化了微流控芯片與外界連接的界面結(jié)構(gòu)，解決了微觀與宏觀界面上尺度差異等引起的問題，實現(xiàn)了液滴的無阻滯、高效導(dǎo)出。
[0033]5.本發(fā)明提出的技術(shù)方法提供了一套簡單可行、適用于不同檢測方法的液滴分選、細(xì)胞分離與獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)和方法，該方法相比于傳統(tǒng)獲取單細(xì)胞的方法具有效率高、耗時短、成本低、無污染、適用范圍廣、可擴(kuò)展性強(qiáng)等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0034]圖1為分離獲取單細(xì)胞的微流控芯片示意圖:
[0035]其中，1、連續(xù)油相入口 ；2、細(xì)胞懸浮液入口 ；3、側(cè)流油相入口 ；4、電磁閥連接口 ；5、廢液出口 ；6、被分選液滴出口。
[0036]圖2為分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖:
[0037]其中，7、微流控芯片；8、液滴信號檢測器；9、信號分析與分選控制單元；10、電磁閥；11、導(dǎo)管；12、檢測區(qū)；13、液滴收集微管。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0039]實施例1:基于實驗室常規(guī)成像技術(shù)低成本、高效分離獲取單細(xì)胞
[0040]如圖1、2所示，本實例所構(gòu)建的基于實驗室常規(guī)成像技術(shù)低成本、高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)，微流控芯片7的結(jié)構(gòu)見圖1，其包括:1、連續(xù)油相入口 ；2、細(xì)胞懸浮液入口 ；3、側(cè)流油相入口 ；4、電磁閥連接口 ；5、廢液出口 ；6、被分選液滴出口。微流控芯片7由上層PDMS和下層玻璃基片鍵和而成，其中上層有25-150微米寬，40-60微米深的微通道網(wǎng)絡(luò)采用濕法刻蝕而得，下層玻璃基片上附著一層約I毫米厚的PDMS，其作用是易于產(chǎn)生油包水液滴和上下兩層的鍵合封接。液滴靠油對水的剪切形成，通過加入表面活性劑使其均勻和穩(wěn)定；微流控芯片7的出口和入口通過固定接口和微管與外界相連，實現(xiàn)油相和水相的導(dǎo)入，被分選液滴和廢液的導(dǎo)出。具體實施方案如下:釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomycescerevisiae)經(jīng)PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)稀釋為16-1O7個/毫升，用微量注射泵以0.2 μ 1/min的流量從細(xì)胞懸浮液入口 2處進(jìn)樣，油相從連續(xù)油相入口 I以1.5 μ 1/min的流量進(jìn)樣，通過油相的剪切作用形成約50 μ m左右的油包水(W/0)液滴，同時側(cè)流油相從側(cè)流油相入口 3以1.2 μ Ι/min的流量進(jìn)樣用于引導(dǎo)液滴向廢液出口 5流向；通過顯微鏡觀察分選處的液滴包裹細(xì)胞的個數(shù)，當(dāng)包裹單個細(xì)胞時，觸動電磁閥工作，進(jìn)而改變該液滴受力和運(yùn)動狀態(tài)，從而使目標(biāo)液滴從被分選液滴出口 6流向單液滴收集微管，至此，實現(xiàn)單液滴收集的目的，通過后續(xù)破乳化、提取等操作可獲取單個細(xì)胞。
[0041]實施例2:基于高速相機(jī)和圖像處理技術(shù)高效分離獲取單細(xì)胞
[0042]如圖1、2所示，本實例所構(gòu)建的基于高速相機(jī)和圖像處理方法高效分離獲取單細(xì)胞的系統(tǒng)，微流控芯片7的結(jié)構(gòu)見圖1，其包括:1、連續(xù)油相入口 ；2、細(xì)胞懸浮液入口 ；3、側(cè)流油相入口 ；4、電磁閥連接口 ；5、廢液出口 ；6、被分選液滴出口。微流控芯片7由上層PDMS和下層玻璃基片鍵和而成，其中上層有25-150微米寬，40-60微米深的微通