專利名稱：用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量pcr檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)細(xì)胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞形態(tài)和功能高度統(tǒng)一。細(xì)胞骨架系統(tǒng)在維持細(xì)胞形態(tài)、承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用。然而，同一組織內(nèi)細(xì)胞的功能不同，基因表達(dá)在細(xì)胞個體間也存在顯著性差異。cAMP誘導(dǎo)的細(xì)胞早期分化形態(tài)改變和骨架蛋白亞型基因的表達(dá)呈現(xiàn)非同步性；同一環(huán)境中生長細(xì)胞的形態(tài)變化和骨架蛋白亞型基因的表達(dá)呈非同步性。因此建立單細(xì)胞分離技術(shù)，精確定量特定形態(tài)細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白基因表達(dá)，對理解細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制很有必要。定量分析單細(xì)胞內(nèi)特定基因mRNA的拷貝數(shù)，進(jìn)而闡明細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，成為分析同一環(huán)境下細(xì)胞功能和基因表達(dá)差異的發(fā)展趨勢。精確定量單細(xì)胞內(nèi)mRNAs的拷貝數(shù)， 需要解決兩個技術(shù)問題。一是準(zhǔn)確、快速地收集特定細(xì)胞，并提取細(xì)胞內(nèi)的mRNAs ；二是精確定量單細(xì)胞內(nèi)特定基因的mRNA拷貝數(shù)。解決第一個問題有兩種方法，一是用膜片鉗吸吮法吸取細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)；二是激光顯微切割法收集細(xì)胞內(nèi)的mRNAs。然而，膜片鉗吸吮方法不能確保細(xì)胞內(nèi)的全部胞質(zhì)被負(fù)壓吸進(jìn)移液器；激光顯微切割術(shù)可以分離和獲取單個細(xì)胞， 但分離的細(xì)胞經(jīng)過固定，脫水和包埋等步驟后，細(xì)胞內(nèi)的RNA質(zhì)量受到影響。因此，上述兩種方法都不能有效地獲得細(xì)胞內(nèi)的mRNAs。另外一個問題是如何精確定量單細(xì)胞內(nèi)特定基因的mRNA拷貝數(shù)。Northern blot和競爭PCR等傳統(tǒng)方法可以定量分析特定基因的mRNA拷貝數(shù)，但需要的mRNA模板量較大。因此，這兩種方法用于檢測單細(xì)胞內(nèi)數(shù)量極少的mRNA( 20pg)拷貝情況都很困難。近年來建立的實時定量PCR技術(shù)，能夠快速、精確地定量分析細(xì)胞內(nèi)的少量mRNA。 目前已經(jīng)有少量文獻(xiàn)從單細(xì)胞水平分析特定細(xì)胞的功能變化與分子機(jī)制的關(guān)系。Tkatch 等在分離單細(xì)胞時，用胰蛋白酶消化組織，細(xì)胞和組織分離后收集單細(xì)胞。實驗結(jié)果雖然是在單細(xì)胞水平，但由于消化后的細(xì)胞形狀一樣，不能挑選特定的細(xì)胞。并且實驗過程比較耗時，不能用于mRNAs的檢測。Liss等用膜片鉗技術(shù)吸取細(xì)胞胞質(zhì)。實驗用時較短，但不能確保全部胞質(zhì)被吸進(jìn)微電極內(nèi)。因此，從流程的速度、準(zhǔn)確和結(jié)果的可信性方面評估方面都需要改進(jìn)。尤其在Korneev等的實驗中，他們對單細(xì)胞內(nèi)總RNA純化后，僅分析了一氧化氮合成水平，而對一氧化氮mRNAs精確拷貝數(shù)未做報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決當(dāng)前細(xì)胞骨架亞型基因表達(dá)對細(xì)胞形態(tài)影響分形方法中存在的微量檢測、高靈敏度和高通量分形等特點難以并存的缺陷；本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法；該方法對細(xì)胞內(nèi)數(shù)量極低的特定信使RNA(mRNA)進(jìn)行分析，具有高度的特異性和敏感性。本發(fā)明的另外一個目的是提供上述的方法的一個應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案—種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，該方法包括以下的步驟1)重組載體 pPCRIcriptTM AMP SK (+)的構(gòu)建；2) β -actin, y-actin, α-tubulin 禾口 β-tubulin 基因的引物設(shè)計和 PCR 擴(kuò)增牛艮據(jù) β -actin, y-actin, α-tubulin 禾口 β-tubulin 基因的核昔酸序歹lj，Primer Express 軟件設(shè)計基因引物；PCR 擴(kuò)增出 β -actin, y-actin, α-tubulin 和 β-tubulin 基因；3)進(jìn)行酶切和連接；4)制備RNA合成用的cDNA①轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA提取、酶切和RNA合成；②反轉(zhuǎn)錄DEPC水倍比稀釋RNA樣品1 X 109—2 ； 2 μ 1樣品RNA稀釋液+8 μ 1反應(yīng)液混合后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄25°C 1 Omin,48°C 30min，95°C 5min ；4°C保存；5)實時定量PCR檢測樣品cDNAs① Primer Express 軟件設(shè)計 β -actin, y -actin, α-tubulin 禾口 β—tubulin 的實時定量PCR引物序列；② Primer Express 軟件設(shè)計 β -actin, y-actin, α-tubulin 禾口 β-tubulin 的實時定量PCR探針序列；③實時定量PCR反應(yīng)液2 μ 1樣品cDNA+8 μ 1反應(yīng)液混合后進(jìn)行預(yù)變性95 °C IOmin.變性95°C 15sec. 45cycles退火/ 延伸 58°C 45sec.6)繪制樣品mRNA的擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)曲線。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述的步驟2)中所述的基因引物如下β -actin F 5’-CACTGGCATTGTGATGGACT-3’β-actin R 5’-TGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’y-actin F 5’-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3’y-actin R 5’-CGGACTTTCCCACCCTGTTA-3’α -tubulin F 5，-GCCAACCTTGAAGCCAGTG-3，α -tubulin R 5， -CTCGCATCCACTTCCCTCTG-3，β -tubulin F 5，-ATGTGGTCAGGAAGGAGTCAG-3，β-tubulin R 5，-TACACCAGTCCTTCCTCAGTC-3，；作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述的步驟3)中酶切和連接如下內(nèi)切酶插入位點啟動子
β-actinSacI3’T7
γ-actinSal I5Ij
α-tubulinEcoRV5'T3
β-tubulinEcoRV5'T3。作為進(jìn)一歩的改進(jìn)，上述的步驟4)中反應(yīng)體系如下
Yeast tRNA6.72 μ
DEPC66.169 μ
IOxRTbuffer33.6 μ
MaCL273.92 μ
dNTP67.2 μ
R-primer Ιμιτι8.4 μ
RNase InH.4.4 μ
Reverse transcription8.4 μ 。作為進(jìn)一歩的改進(jìn)，上述的步驟5)中PCR引物序列如下β-actin F 5，-CGGTCAGGTCATCACTATCGG-3，β-actin R 5，-CACAGGATTCCATACCCAGGA-3，y-actin F 5，-CTGCTGCATGAGCTGATTCTG-3，y-actin R 5，-CAAAGGCTTATTCCAGTTTCATGAG-3，α -tubulin F 5， -CTCGCATCCACTTCCCTCTG-3，α -tubulin R 5， -GCTGTTCATGGTAGGCTTTCTC-3，β -tubulin F 5， -TTCCATTGACAATGAGGCTCTGT-3，β-tubulin R 5，-TGGTTGAGATCGCCATAGGTG-3，；PCR探針序列如下β-actin 5，F(xiàn)AM-AATGAGCGGTTCCGATGCCC-TAMRA3，y-actin 5，F(xiàn)AM-CCCTGGCAAATGTACACACCTCATGCTAG-TAMRA3，α -tubulin 5， FAM-CCACTTATGCCCCTGTCATCTCTGC-TAMRA3，
β -tubulin 5，F(xiàn)AM-TGACATCTGCTTCCGCACCCTGAA-TAMRA3，。作為進(jìn)一歩的改進(jìn)，上述的步驟5)中定量PCR反應(yīng)液如下10 χ buffer1 μ dH203.672 μ 25mM MgCl21.4 μ 2.5 mMdNTP0.8 μ PCR引物1 mM1 μ PCR 探針 12.4 pmol/ml0.081 μ AmpliTaq Gold0.05 μ Total10 μ 。為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案應(yīng)用上述的PCR檢測方法對單細(xì)胞進(jìn)行分析的方法，該方法包括以下的步驟1)細(xì)胞cDNA的合成①收集到的單細(xì)胞注入含有4. 5μ1裂解液的0. 2mL印pendorf微型離心管中，_80°C液氮保存；②將含有裂解液的細(xì)胞樣品從-80°C液氮中取出后，立即65°C水浴lmin，冰上靜置5min，然后加入10 μ 1的反轉(zhuǎn)錄溶液；③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件25°C 1 Omin,48°C 30min,95°C 5min ；反應(yīng)后的cDNA溶液加入 5 μ 1去離子水稀釋，全部體積20 μ 1，-20°C保存；2) β-actin, y-actin, α-tubulin 和 β-tubulin 基因的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備倍比稀釋RNA產(chǎn)物后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNAs標(biāo)準(zhǔn)品；在實時定量PCR中，mRNAs的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝范圍為 β-actin 和 α-tubulin 4X IO1 7 和 γ-actin 和 β-tubulin 4X10~53)單細(xì)胞實時定量PCR系統(tǒng)的評估將標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)樣品RNA溶液進(jìn)行倍比稀釋，每次反應(yīng)上樣三孔，檢測二者的拷貝數(shù)和臨界循環(huán)數(shù)Ct相關(guān)性的直線是否平行；此外，已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品在每次反應(yīng)中上樣三個孔，用來檢測全部反應(yīng)的組內(nèi)和組間差異；4)單細(xì)胞實時定量PCR分析單細(xì)胞內(nèi)β-actin，y-actin, α-tubulin和 β-tubulin基因的表達(dá)在單細(xì)胞實時定量PCR反應(yīng)中，2 μ 1的cDNA樣品溶于8μ 1的PCR反應(yīng)液中；每次反應(yīng)上樣兩個孔，計算組內(nèi)差異，避免技術(shù)誤差；反應(yīng)條件95°C10min，l 個循環(huán)，95°C 15s，58°C 45s，50 個循環(huán)。作為優(yōu)選，上述的步驟1)中4. 5 μ 1的裂解液中含有0. 75 μ 1的50 μ mol/L oligo d(T)16 引物，0· 2μ 1 的 lmg/ml 酵母 tRNA，0. 05μ 1 的 30U/μ 1 RNase 抑制劑，和 0. 2 μ 1 的 10% ΝΡ40 ；所有試劑都用DEPC水配置；10 μ 1的反轉(zhuǎn)錄溶液含有0. 375 μ 1的50U μ 1/L 反轉(zhuǎn)錄酶，1. 5μ 1 的 10 X iTaciMan 緩沖液 Α，3. 24 μ 1 的 25mmol/L MgCl2, 3. 0 μ 1 的 2. 5mmol/ L dNTP,和0. 1 μ 1的30U/ μ IRNase抑制劑；所有試劑都溶于DEPC中。作為優(yōu)選，上述的步驟4)中10μ 1的實時定量PCR反應(yīng)液含有0.025υ/μ 1AmpliTaq GoldDNA 聚合酶，1/10 體積的 IOXiTaciMan 緩沖液 A，3. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/ L dNTP，0. 1 μ mol/L的PCR引物，和50nmol/L的PCR探針；所有試劑溶于去離子水中。作為優(yōu)選，上述的步驟1)單細(xì)胞的分離方法如下用微電極控制儀自行拉制尖端直徑為25 μ m的玻璃微電極，并將尖端磨成約40°的斜面，通過控制與玻璃微電極相連的吸液管內(nèi)負(fù)壓，在分形表面上收集特定形態(tài)的單細(xì)胞，并且控制吸取最少量的培養(yǎng)基。分形表面(中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報觀卷2期，p280 觀4)，以十六烷基烯酮二聚物(AKD，脂質(zhì)類有機(jī)物質(zhì))為原料，基于熔化-凝固、固-固相轉(zhuǎn)變，控制固態(tài)中不同晶型的比例，調(diào)控固-固相轉(zhuǎn)變的速度和穩(wěn)定晶型的分形生長(如圖1)，具備超疏水特性 (157° )，如圖2，從而得到固體表面的分形維數(shù)0.26)介于大腦皮層(2.0-2.6)之間，如圖3。利用分形結(jié)構(gòu)具有不規(guī)則性和超斥水性，細(xì)胞的貼壁能力下降，對顯微操作系統(tǒng)稍加負(fù)壓，細(xì)胞可能很容易與表面分離，達(dá)到準(zhǔn)確快速收集特定細(xì)胞，如圖4。同時，降低細(xì)胞裂解液(10μ 1)和樣品上樣量Qyl)的體積，這樣可以保證單細(xì)胞內(nèi)mRNA的濃度及同一樣本組內(nèi)差異的計算。本發(fā)明通過PCR 擴(kuò)增出 β-actin，y-actin, α-tubulin 和 β-tubulin 基因，長度分別為443，482，512，596bp。分子克隆技術(shù)構(gòu)建攜帶有肌動蛋白和微管蛋白亞型基因的表達(dá)載體，目的基因RNAs的合成、cDNAs的制備、倍比稀釋后建立熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。 在對結(jié)果的組內(nèi)和組間差異分析后，精確定量C6細(xì)胞內(nèi)4ng總RNA的骨架蛋白亞型基因 mRNAs的拷貝數(shù)。最后提取分形表面細(xì)胞內(nèi)的總RNA，在細(xì)胞整體水平確定分形表面對細(xì)胞骨架亞型基因表達(dá)的影響。同時，對細(xì)胞內(nèi)4ng總RNA樣本進(jìn)行檢測，具有高度的特異性和敏感性。為今后從分子水平上分析骨架蛋白基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)變化的關(guān)系，以及研究人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和個性化治療提供一種高效的分析方法。


圖1為AKD合成新型的具有納米結(jié)構(gòu)的分形表面，圖中方框為放大的圖片部分，標(biāo)尺示 15 μ m (A), 5 μ m (B), 2 μ m (C), 1 μ m (D) ο圖2為分形表面的超斥水特性圖。圖3為分形表面的分形維數(shù)圖。圖4為顯微操作下分離分形表面上的指定單細(xì)胞圖。圖5為樣品mRNA的擴(kuò)增曲線。圖6為樣品mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為實時定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖8為低血清+cAMP誘導(dǎo)C6 glioma細(xì)胞分化的非同步性圖，根據(jù)形態(tài)將細(xì)胞分為四類圓形細(xì)胞(arrow a)、未分化細(xì)胞(arrow b)、I型分化細(xì)胞(arrowhead a)和II 型分化細(xì)胞(arrowhead b)。Scale bar, 50 μ m.。
具體實施例方式實施例1單細(xì)胞實時定量PCR檢測體系1. 1 重組載體pPCR-ScriptTM AMP SK (+)的構(gòu)建具體步驟按照 PCRIcript AMP 克隆試劑說明書進(jìn)行。
1. 2β -actin, y-actin, α-tubulin 和 β-tubulin 基因的引物設(shè)計和 PCR 擴(kuò)增牛艮據(jù)β-actin， y-actin, α-tubulin和 β-tubulin基因的核昔酸序列(序列號分別為NM007393，NM001614, AB221061 和 BC133064)，Primer Express 軟件設(shè)計基因引物(表 1)。PCR 擴(kuò)增出 β-actin，y-actin, α-tubulin 和 β-tubulin 基因，長度分別為 443，482，512，596bp。表1 β -actin, y -actin，α -tubulin 禾Π β -tubulin 基因克隆的引物序列
權(quán)利要求
1.一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)重組載體pPCRIcriptTM AMP SK (+)的構(gòu)建；2)β -actin, y-actin, α-tubulin 和 β-tubulin 基因的引物設(shè)計和 PCR 擴(kuò)增牛艮據(jù) β -actin, y-actin, α-tubulin 禾口 β-tubulin 基因的核昔酸序歹lj，PrimerExpress 軟件設(shè)計基因引物；PCR 擴(kuò)增出 β -actin, y-actin, α-tubulin 和 β-tubulin 基因；3)進(jìn)行酶切和連接；4)制備RNA合成用的cDNA①轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA提取、酶切和RNA合成；②反轉(zhuǎn)錄DEPC水倍比稀釋RNA樣品1 X 109—2 ；2 μ 1樣品RNA稀釋液+8 μ 1反應(yīng)液混合后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄25°C 1 Omin,48°C 30min，95°C 5min ；4°C保存；5)實時定量PCR檢測樣品cDNAs①Primer Express 軟件設(shè)計 β -actin, y -actin, α-tubulin 禾口 β-tubulin 的實時定量PCR引物序列；②Primer Express 軟件設(shè)計 β -actin, y -actin, α-tubulin 禾口 β-tubulin 的實時定量PCR探針序列；③實時定量PCR反應(yīng)液2 μ 1樣品cDNA+8 μ 1反應(yīng)液混合后進(jìn)行 預(yù)變性95 °C IOmin.變性95 "C 15sec. 45cycles退火/延伸 58°C 45sec.6)繪制樣品mRNA的擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，其特征在于步驟2)中所述的基因引物如下β -actin F 5' -CACTGGCATTGTGATGGACT-3‘ β -actin R 5' -TGGCATAGAGGTCTTTACGG-3‘ y-actin F 5' -GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3‘ y-actin R 5' -CGGACTTTCCCACCCTGTTA-3‘ α -tubulin F 5’ -GCCAACCTTGAAGCCAGTG-3’ α -tubulin R 5’ -CTCGCATCCACTTCCCTCTG-3， β -tubulin F 5’ -ATGTGGTCAGGAAGGAGTCAG-3， β -tubulin R 5’ -TACACCAGTCCTTCCTCAGTC-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，其特征在于步驟3)中酶切和連接如下β-actin γ-actin a-tubulin內(nèi)切酶 SacI SalI EcoRV插入位點3'5'5'啟動子 T7 T3 T3β-tubulinEcoRV5'T3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，其特征在于步驟4)中反應(yīng)體系如下Yeast tRNA6.72 μ DEPC66.169 μ 10 xRT buffer33.6 μ MaCL273.92 μ dNTP67.2 μ R-primer 1 μιη8.4 μ RNase InH.4.4 μ Reverse transcription8.4 μ ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，其特征在于步驟5)中PCR引物序列如下β -actin F β -actin R Y-actin F Y-actin Rα -tubulin F 5' α -tubulin R 5' β -tubulin F 5， β -tubulin R 5， PCR探針序列如下-CGGTCAGGTCATCACTATCGG-3‘ -CACAGGATTCCATACCCAGGA-3’ -CTGCTGCATGAGCTGATTCTG-3’ -CAAAGGCTTATTCCAGTTTCATGAG-3‘ -CTCGCATCCACTTCCCTCTG-3’ -GCTGTTCATGGTAGGCTTTCTC-3’ -TTCCATTGACAATGAGGCTCTGT-3’ -TGGTTGAGATCGCCATAGGTG-3‘；β -actin 5’ fam-AATGAGCGGTTCCGATGCCC-tamea3’ Y-actin 5' fam-CCCTGGCAAATGTACACACCTCATGCTAG-tamea3’ a -tubulin 5’ fam-CCACTTATGCCCCTGTCATCTCTGC-tamea3' β -tubulin 5’ fam-TGACATCTGCTTCCGCACCCTGAA-tamea3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，其特征在于步驟5)中定量PCR反應(yīng)液如下\10 χ buffer1 μ dH203.672 μ 25mM MgCl21.4 μ \2.5 mMdNTP0.8 μ PCR引物1 mM1 μ PCR 探針 12.4 pmol/ml0.081 μ AmpliTaq Gold0.05 μ Total10 μ 。
7.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法對單細(xì)胞進(jìn)行分析的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)細(xì)胞cDNA的合成①收集到的單細(xì)胞注入含有4.5 μ L裂解液的0. 2mL eppendorf微型離心管中，_80°C 液氮保存；②將含有裂解液的細(xì)胞樣品從-80°C液氮中取出后，立即65°C水浴lmin，冰上靜置 5min，然后加入10 μ 1的反轉(zhuǎn)錄溶液；③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件25°C1 Omin, 48°C 30min,95°C 5min ；反應(yīng)后的cDNA溶液加入5 μ 1 去離子水稀釋，全部體積20 μ 1，-20°C保存；2)β-actin, y-actin, α-tubulin和β-tubulin基因的引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備倍比稀釋RNA產(chǎn)物后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNAs標(biāo)準(zhǔn)品；在實時定量PCR中，mRNAs的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝范圍為 β-actin 和 α-tubulin 4X IO1 7 和 γ-actin 和 β-tubulin 4X101 5;3)單細(xì)胞實時定量PCR系統(tǒng)的評估將標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)樣品RNA溶液進(jìn)行倍比稀釋，每次反應(yīng)上樣三孔，檢測二者的拷貝數(shù)和臨界循環(huán)數(shù)Ct相關(guān)性的直線是否平行；此外，已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品在每次反應(yīng)中上樣三個孔，用來檢測全部反應(yīng)的組內(nèi)和組間差異；4)單細(xì)胞實時定量PCR分析單細(xì)胞內(nèi)β-actin，y-actin,α-tubulin和β-tubulin 基因的表達(dá)在單細(xì)胞實時定量PCR反應(yīng)中，2 μ 1的cDNA樣品溶于8μ 1的PCR反應(yīng)液中；每次反應(yīng)上樣兩個孔，計算組內(nèi)差異，避免技術(shù)誤差；反應(yīng)條件95°C 10min，l 個循環(huán)，95°C 15s，58°C 45s, 50 個循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的對單細(xì)胞進(jìn)行分析的方法，其特征在于步驟1)中4.5μ1 的裂解液中含有0. 75μ 1 的 50ymol/L oligo (KT)16 引物，0. 2μ 1 的 lmg/ml 酵母 tRNA， 0. 05μ 1的30U/μ IRNase抑制劑，和0. 2 μ 1的10 % ΝΡ40 ；所有試劑都用DEPC水配置； 10 μ 1的反轉(zhuǎn)錄溶液含有0. 375 μ 1的50U μ 1/L反轉(zhuǎn)錄酶，1. 5 μ 1的IOXTaqMan緩沖液 Α, 3. 24 μ 1 的 25mmol/LMgCl2, 3. 0 μ 1 的 2. 5mmol/L dNTP,禾口 0. 1 μ 1 的 30U/ μ 1 RNase 抑制劑；所有試劑都溶于DEPC中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的對單細(xì)胞進(jìn)行分析的方法，其特征在于步驟4)中10μ1的實時定量PCR反應(yīng)液含有0. 025U/y 1 AmpliTaq Gold DNA聚合酶，l/10volume的 IOXTaqMan 緩沖液 A，3. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/L dNTP，0. 1 μ mol/L 的 PCR 弓丨物，和 50nmol/L的PCR探針；所有試劑溶于去離子水中。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的對單細(xì)胞進(jìn)行分析的方法，其特征在于步驟1)單細(xì)胞的分離方法如下用微電極控制儀自行拉制尖端直徑為25 μ m的玻璃微電極，并將尖端磨成約 40°的斜面，通過控制與玻璃微電極相連的吸液管內(nèi)負(fù)壓，在分形表面上收集特定形態(tài)的單細(xì)胞，并且控制吸取最少量的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)細(xì)胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法及其應(yīng)用。一種用于檢測細(xì)胞骨架亞型基因的單細(xì)胞實時定量PCR檢測方法，該方法包括以下的步驟1)重組載體pPCR-ScriptTMAMPSK(+)的構(gòu)建；2)b-actin,g-actin,a-tubulin和b-tubulin基因的引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增；3)進(jìn)行酶切和連接；4)制備RNA合成用的cDNA；5)實時定量PCR檢測樣品cDNAs；6)繪制樣品mRNA的擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明建立的實時定量PCR檢測體系，能對細(xì)胞內(nèi)4ng總細(xì)胞骨架亞型基因RNA樣本進(jìn)行檢測，具有高度的特異性和敏感性。
文檔編號C12Q1/02GK102559894SQ20111045915
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者王維莉, 王萍, 黃帥帥 申請人:寧波大學(xué)