專利名稱:用于單細(xì)胞組學(xué)的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,對單細(xì)胞內(nèi)容物進行雙向平面電泳,并應(yīng)用AFM或高靈敏CCD進行檢測的方法,屬于蛋白質(zhì)組學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
背景技術(shù):
如今,人類基因組計劃(Human Genome Project)已經(jīng)取得了巨大的成功,許多物種的基因組測序都已完成,但僅僅靠基因組的序列來試圖闡明生命現(xiàn)象還遠遠不夠。因此, 研究的重心從揭示分子水平的遺傳信息轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞水平的功能與調(diào)控上來。生命科學(xué)已經(jīng)跨入了后基因組時代,即蛋白質(zhì)組時代。蛋白質(zhì)組(proteome)是指一個細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指研究蛋白質(zhì)組的技術(shù)及這些研究所得到的結(jié)果,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)鑒定、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)功能確定與疾病的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)是連接基因、蛋白質(zhì)和疾病的紐帶,對蛋白質(zhì)表達的變化或差異的分析將具有重要的生物學(xué)意義和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值,為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。二維凝膠電泳(2-dimension electrophoresis)-質(zhì)譜(mass spectrometry)是目前石if究蛋白質(zhì)組學(xué)最流行和可靠的技術(shù)平臺。其一般過程是細(xì)胞或組織培養(yǎng),樣品制備,二維凝膠電泳分離蛋白質(zhì),染色,計算機輔助分析電泳圖象,對感興趣蛋白進行酶解,質(zhì)譜分析,數(shù)據(jù)庫檢索,蛋白質(zhì)鑒定,分析蛋白質(zhì)在細(xì)胞和組織中的表達情況。二維凝膠電泳技術(shù)早在1975年就由0’ Farrell建立起來,包括第一維上的pH等電聚焦和第二維上的SDS凝膠電泳,使蛋白質(zhì)分別按不同的等電點和荷質(zhì)比進行分離。但凝膠電泳在靈敏度上有著先天的局限性, 銀染條件下的最小檢出量只有0. Ingo隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入,研究單個細(xì)胞的全部蛋白,特別是低豐度蛋白成了目前亟待解決的關(guān)鍵問題。但是單個細(xì)胞的蛋白量遠遠達不到一般電泳的上樣量,重要的低豐度蛋白質(zhì)分子根本無法檢出,或者被大量表達的蛋白將其覆蓋。目前,人們發(fā)展了精度更高的二維色譜0D-LC),二維毛細(xì)管電泳0D-CE),液相色譜-毛細(xì)管電泳(LC-CE)等新型分離技術(shù)來應(yīng)對這一蛋白質(zhì)組學(xué)中的關(guān)鍵問題,但都存在操作復(fù)雜費時,效率低,無法獲得蛋白間相互作用等多維信息的問題。
原子力顯微鏡(AFM)發(fā)明于上世紀(jì)80年代,具有原子級分辨能力和納米級操縱能力,是在納米尺度和單分子級別進行表征和操縱的重要工具,特別適用于在原有生物環(huán)境中對生物大分子的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)進行分析。目前,應(yīng)用AFM在固體-液體界面觀察蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的長度、形狀、體積、微結(jié)構(gòu),并對它們進行針尖-分子、分子-分子間相互作用力的測量,以及拉伸、切割、移動等操縱的技術(shù)已十分成熟。AFM操作簡單,無需染色,所得信息真實、多樣,完全滿足單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究要求。但AFM檢測要求在平坦的基底上進行,樣品與基底間要有一定作用力,溶液中也不能有干擾針尖的雜質(zhì)存在。而傳統(tǒng)的二維電泳是在凝膠中進行的,不適合AFM即時檢測。因此,至今國內(nèi)外還沒有二維電泳與AFM檢測相結(jié)合的相關(guān)報道。
高靈敏C⑶技術(shù)的發(fā)展使單分子熒光檢測越來越便捷和高效。EM(XD(EleCtr0n Multiplying (XD)技術(shù)是一種全新的微弱光信號增強探測技術(shù),由Andor TechnologyLtd.首先應(yīng)用于2001年發(fā)布的iXon系列高端超高靈敏相機上。該技術(shù)在固體成像器件中嵌入可控的電荷雪崩倍增寄存器,使信號電荷在讀出過程中得到雪崩增強,具有是高量子效率、高靈敏度、高信噪比、高空間分辨率、高讀出速率、高幀速工作和可變的增益控制等特點,克服了傳統(tǒng)ICXD(Intensified (XD)背景噪聲大、光電效率低等諸多缺點。EMC⑶在對極微弱光信號的實時快速動態(tài)檢測方面具有先天優(yōu)勢,其靈敏度可達到真正的單光子水平,非常適合單分子熒光檢測。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是對現(xiàn)有雙向電泳技術(shù)進行改進,提供一種用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,使其在單細(xì)胞水平上進行,并與AFM或高靈敏CCD檢測結(jié)合,實現(xiàn)單分子層次上的檢測??捎糜诘鞍踪|(zhì)組學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
技術(shù)方案本發(fā)明單細(xì)胞組學(xué)的方法,其雙向電泳分離過程在固體-液體界面上進行,或者在薄層凝膠中進行。在固體-液體界面上進行的電泳中,電泳物質(zhì)與基底間有一定相互作用力,主要包括靜電力和疏水作用力。蛋白、核酸、多糖等生物分子自身帶有大量電荷,基底的二氧化硅層表面由于氫氧根電離而帶電,不同的功能化基團的單分子層也帶有電荷。它們之間存在靜電作用力。帶有疏水基團的單分子層與電泳物質(zhì)間存在疏水作用力。在外加電場作用時,帶電生物分子克服基底結(jié)合力和摩擦力,以爬行狀態(tài)局限在界面上并在電場方向上移動。這種界面電泳方式,為AFM的即時檢測提供了良好平臺。由于 AFM的加入,檢測精度大大提高,電泳物質(zhì)的量可以很少。本發(fā)明取單個細(xì)胞的內(nèi)容物進行電泳。根據(jù)需要,電泳的目標(biāo)物質(zhì)可以是單細(xì)胞內(nèi)容物的某些組成部分,如全部或部分的蛋白、DNA、RNA或它們之間形成的復(fù)合物。通過選擇自組裝單分子層的種類,以及加入了溶液與基底間的垂直電場,可以控制電泳物質(zhì)與基底的作用力。在電泳時,較弱的作用力可以加速電泳的進行;而在AFM檢測時,較強的作用力可以有助于得到準(zhǔn)確的圖像。
高靈敏度CCD技術(shù)的發(fā)展,使得單分子熒光檢測高效而簡單。本發(fā)明取單個細(xì)胞的內(nèi)容物進行電泳,并把電泳改在薄層凝膠中進行的。薄層電泳介質(zhì)可以減少熒光在介質(zhì)中的損耗,用助于微弱的單分子熒光的檢測。應(yīng)用高靈敏度CCD檢測生物分子的激光激發(fā)熒光,可以是分子本身受激發(fā)出的熒光,或是熒光標(biāo)記受激發(fā)出的熒光。
本發(fā)明用于單細(xì)胞組學(xué)的方法包括以下步驟
步驟1 將單個細(xì)胞移動到基片上并破碎,使其內(nèi)容物流出;
步驟2 施加電場,對單細(xì)胞內(nèi)容物進行雙向電泳;
步驟3 對電泳產(chǎn)物進行高靈敏度檢測;
步驟4 將分離與檢測結(jié)果制成數(shù)據(jù)庫,便于比對。
單細(xì)胞雙向電泳的方法,按如下步驟進行
a.在硅片上蒸鍍電泳所需的鉬電極;
b.按需要在硅片上修飾功能化自組裝單分子層,或加入薄層凝膠;
c.加入用于形成PH梯度的電解質(zhì)溶液和電泳液;
d.取單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到硅片上,并破壞細(xì)胞,使其內(nèi)容物流出;
e.施加一個方向的電場,進行等電聚焦電泳;
f.施加另一個方向的電場,使生物分子按荷質(zhì)比進行電泳;
g.選擇性的施加垂直方向電場,控制生物分子與基底的結(jié)合力; h.用AFM或高靈敏CXD對電泳分離物質(zhì)進行檢測;
i.將分離和檢測結(jié)果制成數(shù)據(jù)庫。
單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳時,參與電泳的物質(zhì)為單個細(xì)胞的內(nèi)容物。單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳過程發(fā)生在固體-液體界面上,或薄層凝膠中。單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳時,所述固體-液體界面為硅片或硅片上的組裝單分子層與溶液間的界面。單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳施加的電場是通過在基片上蒸鍍鉬金屬層作為電極來施加。單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳過程中施加了垂直方向的電場來控制雙電層和電滲流。所述高靈敏度檢測是指應(yīng)用AFM或高靈敏 CCD檢測電泳產(chǎn)物。
有益效果本發(fā)明所述的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,具有以下優(yōu)點
1.本發(fā)明僅對單個細(xì)胞的內(nèi)容物進行分離,分離精度高,能得到大量細(xì)胞系綜平均后被掩蓋的單細(xì)胞特性;
2.本發(fā)明對生物分子的檢測可以精確到單個分子的水平;
3.本發(fā)明能得到生物分子在電泳過程中的連續(xù)時間過程,可用于研究生物分子在電場下的物理化學(xué)性質(zhì);第四,本發(fā)明應(yīng)用AFM對生物分子進行檢測,得到大量有關(guān)分子形狀、體積等傳統(tǒng)電泳方法無法獲得的信息。
圖1是本發(fā)明的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法的示意圖。其中有蒸鍍的鉬電極1、基片 2、破壞細(xì)胞,使其內(nèi)容物流出的過程3、pH梯度等電聚焦4、溶液5、形成垂直電場的電極6、 電壓源7、薄層凝膠8、AFM針尖9、高靈敏CXD與激光源10。
具體實施方式
本發(fā)明的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法包括以下步驟
步驟1 將單個細(xì)胞移動到基片上并破碎,使其內(nèi)容物流出;
步驟2 施加電場,對單細(xì)胞內(nèi)容物進行雙向電泳;
步驟3 對電泳產(chǎn)物進行高靈敏度檢測;
步驟4 將分離與檢測結(jié)果制成數(shù)據(jù)庫,便于比對。
單細(xì)胞雙向電泳的方法,按如下步驟進行
a.在硅片上蒸鍍電泳所需的鉬電極;
b.按需要在硅片上修飾功能化自組裝單分子層,或加入薄層凝膠;
c.加入用于形成pH梯度的電解質(zhì)溶液和電泳液;
d.取單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到硅片上,并破壞細(xì)胞,使其內(nèi)容物流出;
e.施加一個方向的電場,進行等電聚焦電泳;
f.施加另一個方向的電場,使生物分子按荷質(zhì)比進行電泳;
g.選擇性的施加垂直方向電場,控制生物分子與基底的結(jié)合力;
h.用AFM或高靈敏CCD對電泳分離物質(zhì)進行檢測;
i.將分離和檢測結(jié)果制成數(shù)據(jù)庫。
例 1
本發(fā)明單細(xì)胞界面電泳與AFM檢測結(jié)合的方法如圖一所示。所用基片2為摻雜的單晶硅片,有一定導(dǎo)電性,表面有二氧化硅層,且具有較高平整度。單細(xì)胞內(nèi)容物的成分較復(fù)雜,每次電泳的目標(biāo)物質(zhì)不一樣。根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)和目標(biāo)分離效果,選擇PH梯度電解液,電泳液5的成分和濃度;選擇兩次電泳外加電壓的大小、方向、波形和時間;選擇垂直電壓7 的大小、方向和時機;選擇蒸鍍鉬電極1的形狀和位置;選擇AFM的檢測區(qū)域和時機;選擇在電泳區(qū)的硅片上自組裝單分子層的種類、位置和圖樣,用于控制不同區(qū)域電泳物質(zhì)與基底的結(jié)合力和雙點層的種類和大小。根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)與基底的結(jié)合強度和是否進行力學(xué)或電學(xué)測量,選擇不同AFM檢測模式和針尖9類型。
轉(zhuǎn)移單個細(xì)胞到基片上的方法采用微吸管的方法。在防震平臺上安裝三維電控平移臺操縱微吸管,在長焦顯微鏡下進行操作。根據(jù)細(xì)胞類型和目標(biāo)分離物質(zhì),選擇電擊、酶解或穿刺等方法破碎細(xì)胞或在細(xì)胞上打孔,使其內(nèi)容物流出3。選擇不同的內(nèi)容物組分進行研究,多余的組分可以通過在基底修飾配對基團將其固定下來,或使其電泳速度與目標(biāo)物質(zhì)相差較大,或直接酶解。在一個水平方向上施加電壓形成PH梯度,進行等電聚焦??刂齐娪疚镔|(zhì)與基底間的相互作用力,在另一個水平方向上施加電壓,使電泳物質(zhì)按荷質(zhì)比進行分離。應(yīng)用AFM檢測電泳產(chǎn)物。
控制電泳物質(zhì)與基底間的相互作用力可以通過以下方案實現(xiàn)(1)改變?nèi)芤簆H 值,或在基底上自組裝具有帶電基團的單分子層可以調(diào)節(jié)電泳物質(zhì)與基底間的靜電力;(2) 在基底上自組裝帶有疏水基團的單分子層,可以調(diào)節(jié)電泳物質(zhì)與基底間的疏水作用力;(3) 在溶液與硅片間施加相應(yīng)的垂直電場后,基底表面的固定電荷會受到感應(yīng)而改變極性和大小,從而控制溶液中帶電生物分子與基底間的相互作用。
例 2
本發(fā)明單細(xì)胞薄層電泳與高靈敏CCD檢測的方法如圖一所示。所用基片、電極、 單細(xì)胞轉(zhuǎn)移和破壞方法與具體實施舉例1相同。選擇電泳液、電泳強度和時間,選擇性加入分子熒光標(biāo)記。薄層凝膠8仍采用傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺或瓊脂糖,并將其厚度限制在5 IOOym0在雙向電泳進行的過程中和過程后,應(yīng)用高靈敏度CCD 10即時檢測生物分子的激光激發(fā)熒光,包括分子本身受激發(fā)出的熒光,或是熒光標(biāo)記受激發(fā)出的熒光。
權(quán)利要求
1. 一種用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,其特征在于該方法包括以下步驟步驟1 將單個細(xì)胞置于基片上并破碎,使其內(nèi)容物流出;步驟2 施加電場,對單細(xì)胞內(nèi)容物進行雙向電泳;步驟3 對電泳產(chǎn)物進行高靈敏度檢測;步驟4 將分離與檢測結(jié)果制成數(shù)據(jù)庫,便于比對;其中,單細(xì)胞雙向電泳的方法,按如下步驟進行a.在硅片上蒸鍍電泳所需的鉬電極;b.按需要在硅片上修飾功能化自組裝單分子層,或加入薄層凝膠;c.加入用于形成pH梯度的電解質(zhì)溶液和電泳液;d.取單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到硅片上,并破壞細(xì)胞,使其內(nèi)容物流出;e.施加一個方向的電場,進行等電聚焦電泳;f.施加另一個方向的電場,使生物分子按荷質(zhì)比進行電泳;g.選擇性的施加垂直方向電場,控制生物分子與基底的結(jié)合力;h.用AFM或高靈敏CCD對電泳分離物質(zhì)進行檢測;i.將分離和檢測結(jié)果制成數(shù)據(jù)庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,其特征在于單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳時,參與電泳的物質(zhì)為單個細(xì)胞的內(nèi)容物。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,其特征在于單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳過程發(fā)生在固體-液體界面上,或薄層凝膠中。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,其特征在于單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳時,所述固體-液體界面為硅片或硅片上的組裝單分子層與溶液間的界面。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,其特征在于單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳施加的電場是通過在基片上蒸鍍鉬金屬層作為電極來施加。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,其特征在于單細(xì)胞內(nèi)容物雙向電泳過程中施加了垂直方向的電場來控制雙電層和電滲流。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于單細(xì)胞組學(xué)的方法,其特征在于所述高靈敏度檢測是指應(yīng)用AFM或高靈敏CCD檢測電泳產(chǎn)物。
專利摘要
用于單細(xì)胞組學(xué)的方法涉及一種對單細(xì)胞內(nèi)容物進行雙向平面電泳,并應(yīng)用AFM或高靈敏CCD進行檢測的方法。該方法的核心是將單個細(xì)胞的內(nèi)容物在固體/液體界面或薄層凝膠中進行雙向電泳,然后應(yīng)用原子力顯微鏡或高靈敏CCD進行檢測鑒定,最后將分離與檢測結(jié)果制成數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明設(shè)備簡單、操作便利,能對單細(xì)胞級別的微量樣品進行分離,并對分離產(chǎn)物進行單分子級別檢測,可用于蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
文檔編號G01N21/64GKCN101231262 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200810020732
公開日2011年9月14日 申請日期2008年2月22日
發(fā)明者肖忠黨, 田田, 王海濤, 朱釗奇 申請人:東南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4),