專利名稱:一種產(chǎn)堿性果膠酶菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種產(chǎn)堿性果膠酶菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
目前堿性果膠酶在各個(gè)行業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，其應(yīng)用領(lǐng)域包括全棉織物的生物 精練，混紡織物以及功能織物的前處理精煉，植物韌皮纖維脫膠，食品加工行業(yè)，環(huán)保行業(yè) (處理果膠廢水)以及煙草行業(yè)等。根據(jù)已有的報(bào)道，中國(guó)專利(公開號(hào)CN 1480529A) 中公開了一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CCTCC NO =M 203042經(jīng)液體深層發(fā)酵生 產(chǎn)堿性果膠酶，可用于棉紡織物精練處理。中國(guó)專利(公開號(hào)CN 1177003 A)中公開了 一株嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)CCTCC NO =M 96009能直接用于苧麻脫膠。中 國(guó)專利(公開號(hào):CN 1113951 Α)中公開了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)CCTCC NO :M0213經(jīng)高濃度液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶。我們從山東煙臺(tái)葡萄榨汁工廠土壤中分離 篩選出一株嗜堿細(xì)菌，具有較高的產(chǎn)堿性果膠酶能力，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。本發(fā)明將該原始菌株進(jìn)行紫外誘變，得到產(chǎn)堿性果膠酶的突變株，并通過后期流 加液體發(fā)酵獲得堿性果膠酶，目前還沒有這樣的專利和報(bào)道。由于芽孢桿菌有良好的酶系， 以及外分泌體系在發(fā)酵后期由于蛋白酶的產(chǎn)生會(huì)影響其他酶的活力，通過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流 加檸檬酸鈉能夠有效的抑制蛋白酶的生產(chǎn)而不影響堿性果膠酶的活力以及產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)果膠酶的短小芽孢桿菌(Baci 1 Ius pumiIus) BP-C0-01，其保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 207194，并提供一種利用該菌株液體流加發(fā)酵產(chǎn)堿性 果膠酶的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)堿性果膠酶的細(xì)菌，其分類命名為短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)BP-CO-01,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 207194。
利用所述細(xì)菌生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，采用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) BP-C0-01為出發(fā)菌株，經(jīng)過種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)后處理得到堿性果膠酶溶液；
菌種保藏一批20支甘油管保存在-70°C冰箱內(nèi)。甘油管轉(zhuǎn)接到瓊脂培養(yǎng)基斜面， 培養(yǎng)基組成胰蛋白胨1.5%，酵母浸膏0.4%，葡萄糖0.3% ,K2HPO4O. 10%, Na2CO3 0.3%, 瓊脂1.2%，用10% NaOH調(diào)pH到7. 5后，于115°C滅菌15分鐘。
種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)菜粕20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸 氫二鉀5-15、碳酸鈉5-15，培養(yǎng)條件500L種子罐，60%裝料量，初始pH7. 5-9. 0，培養(yǎng)溫度 30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間 8-16h ；
液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)菜粕50-100、棉粕40-120、葡萄 糖20-60、磷酸氫二鉀5-15、碳酸鈉5-15，培養(yǎng)條件5噸發(fā)酵罐，60 %裝料量，初始pH7. 0-9. 0，培養(yǎng)溫度30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間36-60h ；在發(fā)酵30h后流加檸檬酸鈉溶液，流加的溶 液中檸檬酸鈉濃度為0. 5-10g/L，總流加量為發(fā)酵液重量的1%，均勻流加至發(fā)酵結(jié)束。
發(fā)酵液后處理液態(tài)發(fā)酵后發(fā)酵液經(jīng)高速離心或者壓濾，濾液用截留分子量為IOOOODa的中空纖維管式超濾膜濃縮，收集濃縮液，即得堿性果膠酶溶液。
該菌株是將從葡萄榨汁工廠土壤中分離得到的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 產(chǎn)堿性果膠酶菌株，經(jīng)紫外誘變得到的堿性果膠酶高產(chǎn)突變株(Bacilluspumilus) BP-C0-01，其產(chǎn)堿性果膠酶的能力比原始菌株提高150%，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)性能穩(wěn)定。菌種保藏 編號(hào)為 CCTCC NO :M 207194。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明將原始菌株進(jìn)行紫外誘變，得到產(chǎn)堿性果膠酶的突變 株，并通過后期流加液體發(fā)酵獲得堿性果膠酶，目前還未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。由于芽孢桿菌 有良好的酶系，以及外分泌體系在發(fā)酵后期由于蛋白酶的產(chǎn)生會(huì)影響其他酶的活力，通過 大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流加檸檬酸鈉能夠有效的抑制蛋白酶的生產(chǎn)而不影響堿性果膠酶的活力以
及產(chǎn)量。
生物材料樣品保藏
短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BP-C0_01，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏單位簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏日期2007年12月6日，保藏編號(hào)為CCTCCNO =M 207194。
具體實(shí)施方式
以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施，不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1
將在37 V培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60小時(shí)的斜面短小芽孢桿菌(Baci 1 Ius pumi Ius) BP-C0-01在無菌臺(tái)中轉(zhuǎn)入IOOOmL瓶、裝液量350mL的種子培養(yǎng)基中。
種子培養(yǎng)基組成(g/L計(jì))菜粕45、棉粕40、葡萄糖25、K2HP045, Na2C035,培養(yǎng)條 件初始PH 7. 5，35°C，在500L種子罐(60%裝料量)中培養(yǎng)10小時(shí)后轉(zhuǎn)入5噸發(fā)酵罐 (60%裝料量)中，培養(yǎng)基組成為(g/L計(jì))，菜粕55、棉粕45、葡萄糖30、K2HP045、Na2C035, 培養(yǎng)條件初始PH 7.5，35°C，培養(yǎng)48小時(shí)。在發(fā)酵30小時(shí)后，進(jìn)行流加檸檬酸鈉溶液，溶 液中檸檬酸鈉濃度為0. 5-10g/L，總流加量為發(fā)酵液重量的1%，均勻流加至發(fā)酵結(jié)束。
放罐時(shí)，經(jīng)DNS法測(cè)定，堿性果膠酶活100u/mL(酶活力單位定義為在pH 10，溫 度55°C條件下每分鐘降解半乳糖醛酸鈉產(chǎn)生1 μ mol半乳糖醛酸所需的酶量為1個(gè)酶活力 單位。)
發(fā)酵后處理液態(tài)發(fā)酵后高速離心，收集離心液，加入0.5%苯甲酸鈉防腐劑，即 得清澈堿性果膠酶溶液。
實(shí)施例2
種子培養(yǎng)基組成(g/L計(jì))菜粕85、棉粕100、葡萄糖55、K2HP0414，Na2C0313，培養(yǎng) 條件初始PH 8. 5，37°C，在500L種子罐(60%裝料量)中培養(yǎng)10小時(shí)后轉(zhuǎn)入5噸發(fā)酵罐 (60%裝料量)中，培養(yǎng)基組成為(g/L計(jì))，菜粕55、棉粕100、葡萄糖50、K2HP0414、Na2C0313， 培養(yǎng)條件初始PH 8.5，35°C，培養(yǎng)60小時(shí)。在發(fā)酵30小時(shí)后，進(jìn)行流加檸檬酸鈉溶液，溶 液中檸檬酸鈉濃度為0. 5-10g/L，總流加量為發(fā)酵液重量的1%，均勻流加至發(fā)酵結(jié)束。
其余條件同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
一株產(chǎn)堿性果膠酶的細(xì)菌，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BP-CO-01，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM207194。
2.一種利用權(quán)利要求
1所述細(xì)菌生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，其特征在于，采用短小芽孢 桿菌(Bacillus pumiluS)BP-C0-01為出發(fā)菌株，經(jīng)過種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)后處理 得到堿性果膠酶溶液；種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)菜粕20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氫 二鉀5-15、碳酸鈉5-15，培養(yǎng)條件:500L種子罐，60 %裝料量，初始pH7. 5-9. 0，培養(yǎng)溫度 30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間 8-16h ；液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)菜粕50-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷 酸氫二鉀5-15、碳酸鈉5-15，培養(yǎng)條件5噸發(fā)酵罐，60%裝料量，初始pH 7. 0-9. 0，培養(yǎng)溫 度30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間36-60h ；在發(fā)酵30h后流加檸檬酸鈉溶液，流加的溶液中檸檬酸鈉濃 度為0. 5-10g/L，總流加量為發(fā)酵液重量的1%，均勻流加至發(fā)酵結(jié)束。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征是發(fā)酵液后處理液態(tài)發(fā)酵后發(fā)酵液經(jīng)高速離 心或者壓濾，濾液用截留分子量為lOOOODa的中空纖維管式超濾膜濃縮，收集濃縮液，即得 堿性果膠酶溶液。
專利摘要
一種產(chǎn)堿性果膠酶菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供了一株產(chǎn)堿性果膠酶的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BP-CO-01突變株，并提供了用該菌株在液體流加培養(yǎng)基中發(fā)酵制備堿性果膠酶的方法。本發(fā)明菌種為從山東煙臺(tái)某葡萄處理工廠土壤中分離后誘變得到，本發(fā)明以菜粕為碳源的誘導(dǎo)物，豆粕為氮源，添加適當(dāng)葡萄糖、磷酸氫二鉀、碳酸鈉和水分，在發(fā)酵后期流加檸檬酸鈉以控制發(fā)酵液中蛋白酶的含量，減少蛋白酶對(duì)短小芽孢桿菌表達(dá)的其他酶的分解，從而達(dá)到產(chǎn)堿性果膠酶。發(fā)酵液過濾后，濾液即堿性果膠酶溶液，超濾濃縮得到濃縮酶液或通過其他后加工方式得到不同的堿性果膠酶制劑，如微丸，顆粒或粉劑。
文檔編號(hào)C12R1/08GKCN101514328 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810020636
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2008年2月19日
發(fā)明者周偉峰, 王清聲, 陶丁偉, 魏晨飛 申請(qǐng)人:無錫德冠生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),