專利名稱:促進靈芝酸和靈芝多糖生物合成的發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物細胞培養(yǎng)方法，尤其涉及一種促進靈芝細胞生長、靈芝多糖和靈芝酸生物合成的發(fā)酵方法，屬于微生物發(fā)酵領域。
背景技術：
靈芝(Ganodermalucidum(Leyss ex Fr. )Krast.)屬于擔子菌綱、多孔菌科、靈芝屬高等真菌。傳統(tǒng)中醫(yī)認為，靈芝味甘、性溫、無毒，可補心、肝、脾、肺、腎五臟之氣，具滋補強身、扶正固本之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)靈芝中所含有效成分主要為靈芝多糖和靈芝酸，靈芝酸和靈芝多糖具有抗癌和抗艾滋病病毒等療效(Russell R, Paterson M. (2006)Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory.Phytochemistry67 :1985-2001 ；Tang ff,
Liu Jff, Zhao WM, Wei DZ, Zhong JJ. (2006) Ganoderic acid Tfrom Ganoderma lucidummycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lungcancer cells. Life Sci80 :205-211 ；E1-Mekkawy S, Meselhy MR, Nakamura N, Tezuka Y, Hattori M, KakiuchiN, Shimotohno K, Kawahata T, Otake T. (1998)Anti-HIV-I andanti-HIV-l-proteasesubstances from Ganoderma lucidum. Phytochemistry49 :1651-1657)。
在靈芝酸和靈芝多糖的藥用價值被廣泛揭示的同時，靈芝產量和質量成為限制其應用的瓶頸，因為在自然界中野生靈芝十分稀少，且其中靈芝酸含量僅為I毫克/100毫克干重，遠不能滿足人們的需要；而人工栽培靈芝周期長、產品質量易受環(huán)境氣候及蟲害的影響；因此發(fā)酵法生產靈芝酸和靈芝多糖將是一種有效的方法。目前，通過靈芝細胞液體深層發(fā)酵所獲得的靈芝酸和靈芝多糖的產量仍然較低，李平作等(李平作，徐柔，章克昌.靈芝胞外多糖深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化；無錫輕工大學學報1998，17 (4) :26-30)報道了靈芝批培養(yǎng)中培養(yǎng)基的優(yōu)化方案，但該方法只報道了胞外多糖的生產情況，所公開的最大生物量與胞外多糖的產量分別是14. 8克/升和2. 91克/升(胞外多糖的測定方法為乙醇沉淀-干重法)。
日本特許公報(特開平4-304890，5pp)公開了一種靈芝酸的發(fā)酵生產工藝，但該專利未涉及靈芝多糖的生產，且所得產物中靈芝酸的含量僅為0. 46-1. 0毫克/100毫克細胞。
還有一些專利和文獻也公開報道了各種方法，例如，公開號為CN1264743A(發(fā)明名稱液體發(fā)酵法同時生產靈芝多糖和靈芝酸的工藝)、CN1375557A(發(fā)明名稱生物反應器中靈芝細胞兩階段培養(yǎng)生產靈芝酸的方法)，授權公告號為CNl 141392C (發(fā)明名稱中間補料發(fā)酵生產靈芝多糖和靈芝酸的方法)等專利文獻公開了一系列的通過發(fā)酵生產靈芝多糖和靈芝酸的細胞培養(yǎng)方法，但上述這些文獻中所公開的細胞培養(yǎng)產物中靈芝多糖或靈芝酸的含量或產量相對較低，尚有待提高。
細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件中，pH和溶氧濃度是靈芝細胞生長和產物合成的關鍵性影響因子，F(xiàn)ang 等(Fang QH, Zhong JJ. (2002)Effect of initial pH on productionofganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganodermalucidum. Process Biochem. 37 :769-774.)公開了起始pH值對靈芝細胞液體發(fā)酵生產靈芝酸和靈芝多糖的影響，Tang 等(Tang YJ, Zhong JJ, (2003)Role of oxygen supplyin submergedfermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganodermapolysaccharide andganoderic acid. Enzyme Microb. Technol. 32 :478-484.)報道了溶氧濃度對靈芝細胞液體發(fā)酵生產靈芝酸和靈芝多糖的影響。上述這些文獻中，沒有根據靈芝細胞生長和產物合成所需要的環(huán)境條件(如pH和溶氧濃度)的不一致性，采用相應的組合控制策略來分別促進芝細胞生長和產物合成，所以其靈芝酸和靈芝多糖的產量或含量還有待提升。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種提高靈芝細胞生長、靈芝酸和靈芝多糖生物合成的靈芝細胞培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的
一種促進靈芝酸或靈芝多糖生物合成的發(fā)酵方法，包括靈芝細胞斜面菌種培養(yǎng)、一級液體種子培養(yǎng)、二級液體種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，其中，在液體深層發(fā)酵時選用以下任何一種方式進行細胞培養(yǎng)(I)PH兩階段將液體發(fā)酵液的pH值分成兩個階段來進行調控，使兩個階段的PH值恒定且互不相同；(2)溶氧濃度兩階段將發(fā)酵液的溶氧濃度分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為25 %，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10% ;(3)pH兩階段與補料相協(xié)同將液體發(fā)酵液的PH值分成兩個階段來進行調控，使兩個階段的pH值恒定且互不相同；當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)；(4)溶氧濃度兩階段與補料相協(xié)同將發(fā)酵液的溶氧濃度分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為25%，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10% ;當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖；(5)pH兩階段與溶氧濃度兩階段相協(xié)同將液體發(fā)酵液的PH值分成兩個階段來進行調控，使兩個階段的pH值恒定且互不相同；將發(fā)酵液的溶氧濃度分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為25%，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10 % ； (6) pH兩階段、溶氧濃度兩階段和補料相協(xié)同在一起將液體發(fā)酵液的pH值分成兩個階段來進行調控，使兩個階段的PH值恒定且互不相同；將發(fā)酵液的溶氧濃度值分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為25 %，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10% ;當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)。
優(yōu)選的，所述的pH兩階段是指在細胞培養(yǎng)的前4天將發(fā)酵培養(yǎng)體系的pH值控制為3.0 ;自細胞培養(yǎng)的第四天起，將發(fā)酵培養(yǎng)體系的pH值控制為4. 5或5.5 ;更優(yōu)選的，自細胞培養(yǎng)的第四天起，將發(fā)酵培養(yǎng)體系的PH值控制為4. 5 ；
所述的溶氧濃度兩階段中由第一階段向第二階段轉換的時間點優(yōu)選自液體深層發(fā)酵的第4天、第6天、第8天或第10天；更優(yōu)選自液體深層發(fā)酵的第6天或第8天。
所述的pH兩階段與補料相協(xié)同優(yōu)選為在細胞培養(yǎng)的前四天(第一階段)控制發(fā)酵培養(yǎng)體系的PH值為3.0，自細胞培養(yǎng)的第四天起(第二階段)將發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值調控在4. 5 ;當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)。
所述的溶氧濃度兩階段與補料相協(xié)同優(yōu)選為在細胞培養(yǎng)的前六天控制培養(yǎng)液溶氧濃度25%，自細胞培養(yǎng)的第六天開始控制發(fā)酵體系的溶氧濃度10% ;當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)；
所述的pH兩階段與溶氧濃度兩階段相協(xié)同優(yōu)選為；在細胞培養(yǎng)的前四天(第一階段)控制發(fā)酵培養(yǎng)體系的PH值為3.0，自細胞培養(yǎng)的第四天起(第二階段)將發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值調控在4. 5 ;在細胞培養(yǎng)的前六天控制培養(yǎng)液溶氧濃度25%，自細胞培養(yǎng)的第六天起控制發(fā)酵培養(yǎng)液的溶氧濃度為10%。
所述的pH兩階段、溶氧濃度兩階段和補料相協(xié)同優(yōu)選為在細胞培養(yǎng)的前四天控制液體發(fā)酵體系的PH值為3. 0，自細胞培養(yǎng)的第四天起，控制液體發(fā)酵體系的pH值為4. 5 ；在細胞培養(yǎng)的前六天控制培養(yǎng)液的溶氧濃度為25%，自細胞培養(yǎng)的第六天起控制培養(yǎng)液的
溶氧濃度為10% ;當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)。
靈芝液體深層發(fā)酵將取代野生和人工栽培的趨勢，已經得到本領域的普遍認同?，F(xiàn)有的靈芝細胞培養(yǎng)方法中大多未能同時生產靈芝多糖和靈芝酸，底物利用效率比較低，而且，現(xiàn)有的靈芝液體深層發(fā)酵都是沒有根據靈芝細胞生長和產物合成所需要的環(huán)境條件(如PH和溶氧濃度)的不一致性，采用一系列相應的組合控制手段，導致靈芝多糖或靈芝酸的產量或含量都偏低。
本發(fā)明在機械攪拌式生物反應器中對靈芝細胞生長階段和產物合成階段所需要的條件進行了考察和分析，依據靈芝細胞生長階段和產物合成階段所需要的環(huán)境條件的不一致性，分別考察了 PH兩階段、溶氧濃度兩階段的控制策略對靈芝酸和靈芝多糖的生物合成的影響，在此基礎上，結合現(xiàn)有的中間補料策略，又分別考察了 PH兩階段、溶氧濃度兩階段或補料策略相互協(xié)同在一起后對靈芝酸和靈芝多糖的生物合成的影響。試驗結果說明，在靈芝液體深層發(fā)酵過程中無論是分別采用PH值兩階段、溶氧濃度兩階段或是將pH值兩階段、溶氧濃度兩階段與補料手段相協(xié)同在一起，都可以顯著促進靈芝細胞生長，大幅度提高靈芝酸或靈芝多糖的含量或產量。
本發(fā)明中，所述的靈芝細胞斜面菌種培養(yǎng)、一級液體種子培養(yǎng)、二級液體種子培養(yǎng)均為靈芝細胞培養(yǎng)中的常規(guī)培養(yǎng)基和常規(guī)培養(yǎng)條件，液體深層發(fā)酵所用到的培養(yǎng)基的組成成分也是本領域的常規(guī)培養(yǎng)基，這些都是本領域技術人員所公知的，作為參考，所述的培養(yǎng)基和有關的培養(yǎng)條件可按照有關文獻所公開的內容進行(TangYJ，ZhongJJ. (2002)Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproductionofpolysaccharide and ganoderic acid.Enzyme Microb. Technol. 31 :20-28)。
作為參考
所述的斜面培養(yǎng)基是PDA瓊脂培養(yǎng)基(I. 5克/升的七水硫酸鎂，3. 0克/升的磷酸二氫鉀，20克/升的葡萄糖，0. 05克/升的維生素B1和200克土豆/升的提取液)。靈芝細胞斜面菌種培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度28°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天。
所述的一級液體種子培養(yǎng)基為葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2. 5克/升，七水硫酸鎂0.5克/升，磷酸二氫鉀I克/升，維生素B1 0.05克/升。一級液體種子培養(yǎng)條件 溫度30°C，旋轉式搖床，轉速為120轉/分。
所述的二級液體種子培養(yǎng)基為葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2. 5克/升，七水硫酸鎂0. 5克/升，磷酸二氫鉀I克/升，維生素B1O. 05克/升。二級液體種子培養(yǎng)條件 溫度30°C，旋轉式搖床，轉速為120轉/分。
所述的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基為乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，七水硫酸鎂0.5克/升，磷酸二氫鉀I克/升，維生素B1 0.05克/升。液體深層發(fā)酵溫度條件溫度30°C。
所述的靈芝菌種可以通過各種商業(yè)途徑購買得到，例如，可以購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，其菌種的編號為CGMCC 5. 616。
將本發(fā)明細胞培養(yǎng)方法所得到的產物分別用濃硫酸-苯酚法測定靈芝多糖的含量，采用紫外分光光度法測定靈芝酸的含量，測定結果表明，本發(fā)明方法可有效促進靈芝
細胞生長，所得到的細胞培養(yǎng)產物中，靈芝酸、靈芝多糖的含量或產量也都有不同程度地提高，說明在靈芝液體深層發(fā)酵過程中采用PH值兩階段、溶氧濃度兩階段或將pH值兩階段、溶氧濃度兩階段與補料手段相協(xié)同，都可以顯著促進靈芝細胞生長，明顯提高靈芝酸和靈芝多糖的含量和產量。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。試驗材料
靈芝菌種(Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr. ) Krast):購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，其編號為CGMCC 5.616。
實施例I
本試驗旨在考察液體發(fā)酵體系采用不同的pH值時，其對靈芝細胞生長及靈芝酸或/和靈芝多糖生物合成所產生的影響。
—、靈芝斜面菌種培養(yǎng)、一級液體種子培養(yǎng)、二級液體種子培養(yǎng)按照以下的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行
所述的斜面培養(yǎng)基是PDA瓊脂培養(yǎng)基(I. 5克/升的七水硫酸鎂，3. 0克/升的磷酸二氫鉀，20克/升的葡萄糖，0. 05克/升的維生素B1和200克土豆/升的提取液)。靈芝斜面菌種培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度28°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天。
所述的一級液體種子培養(yǎng)基為葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2. 5克/升，七水硫酸鎂0.5克/升，磷酸二氫鉀I克/升，維生素B1O. 05克/升。一級液體種子培養(yǎng)條件 溫度30°C，旋轉式搖床，轉速為120轉/分。
所述的二級液體種子培養(yǎng)基為葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2. 5克/升，七水硫酸鎂0. 5克/升，磷酸二氫鉀I克/升，維生素B1 0. 05克/升。二級液體種子培養(yǎng)條件 溫度30°C，旋轉式搖床，轉速為120轉/分。
二、液體深層發(fā)酵
在機械攪拌式生物反應器中進行液體深層發(fā)酵(發(fā)酵溫度30°C )，液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基為乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，七水硫酸鎂0. 5克/升，磷酸二氫鉀I克/升，維生素B1O. 05克/升。[0036]Fang 等(Fang QH, Zhong JJ, (2002) Effect of initial pH on productionof ganodericacid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganodermalucidum. ProcessBiochem. 37 :769-774.)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)液不同的起始pH如果不進行人為的調空，其PH值均會在四天內迅速下降到3.0左右，而從發(fā)酵的第十天開始，不同的起始pH又會有不同程度的升高。
為了考察恒定pH對培養(yǎng)體系的影響。本實施例同時進行了 6組平行試驗，其中，5組為試驗組，I組為對照組；6組平行試驗的區(qū)別僅在于發(fā)酵體系的pH值不同，其它的培養(yǎng)條件完全相同。5組試驗組的發(fā)酵體系采用恒定的pH值，分別為2. 0,2. 5,3. 0,4. 5、5. 5(說明采用8摩爾/升的氫氧化鈉和8% (v/v)的硫酸控制發(fā)酵體系的pH值)，將對照組發(fā)酵體系的起始PH值調為5. 5，在其后的整個液體發(fā)酵過程中，不對該發(fā)酵體系的pH值采取任何人為的調控措施，任其自然發(fā)展。試驗結果見表I。
表I靈芝發(fā)酵體系采用不同的恒定pH值對靈芝酸和靈芝多糖的含量和產量的影響
權利要求
1.一種促進靈芝酸或靈芝多糖生物合成的發(fā)酵方法，包括靈芝細胞斜面菌種培養(yǎng)、一級液體種子培養(yǎng)、二級液體種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，其特征在于在液體深層發(fā)酵時選用以下四種方法中的任何一種進行細胞培養(yǎng)(I)溶氧濃度兩階段將發(fā)酵液的溶氧濃度分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為25%，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10% ;所述的溶氧濃度兩階段中由第一階段向第二階段轉換的時間點選自液體深層發(fā)酵的第6天；(2)溶氧濃度兩階段與補料相協(xié)同將發(fā)酵液的溶氧濃度分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為25%，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10% ;所述的溶氧濃度兩階段中由第一階段向第二階段轉換的時間點選自液體深層發(fā)酵的第6天；當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)；(3) pH兩階段與溶氧濃度兩階段相協(xié)同將液體發(fā)酵液的PH值分成兩個階段來進行調控，使兩個階段的PH值恒定且互不相同；將發(fā)酵液的溶氧濃度分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為25%，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10% ;所述的溶氧濃度兩階段中由第一階段向第二階段轉換的時間點選自液體深層發(fā)酵的第6天；(4)pH兩階段、溶氧濃度兩階段和補料相協(xié)同在一起將液體發(fā)酵液的PH值分成兩個階段來進行調控，使兩個階段的pH值恒定且互不相同；將發(fā)酵液的溶氧濃度分成兩個階段來進行調控，其中，在液體發(fā)酵的第一階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為 25%，在液體發(fā)酵的第二階段將發(fā)酵體系的溶氧濃度控制為10% ;所述的溶氧濃度兩階段中由第一階段向第二階段轉換的時間點選自液體深層發(fā)酵的第6天；當培養(yǎng)液殘?zhí)菨舛仍?-10g/L時，每升培養(yǎng)液補加15g乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種促進靈芝酸或靈芝多糖生物合成的發(fā)酵方法。本發(fā)明對靈芝細胞生長階段和產物合成階段所需要的條件進行了考察，依據靈芝細胞生長和產物合成階段所需環(huán)境條件的不一致性，分別考察了pH兩階段、溶氧兩階段的控制策略對靈芝酸和靈芝多糖生物合成的影響，在此基礎上，結合中間補料策略，又分別考察了pH兩階段、溶氧兩階段控制策略或補料策略相互協(xié)同在一起后對靈芝酸和靈芝多糖生物合成的影響。試驗結果說明，無論是分別采用pH值兩階段控制策略、溶氧濃度兩階段控制策略或是將pH兩階段控制策略、溶氧濃度兩階段控制策略與補料策略協(xié)同在一起，均顯著促進靈芝細胞生長，大幅度提高靈芝酸或靈芝多糖的含量或產量。
文檔編號C12P19/04GKCN101235393 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200810007833
公開日2012年11月14日 申請日期2008年2月25日
發(fā)明者張偉, 湯亞杰 申請人:湖北工業(yè)大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (7),