本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及靈芝多糖在制備具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群功效的保健食品中的用途。
背景技術(shù)：
：人們的飲食習(xí)慣多偏好于高脂高糖高熱量飲食，隨著物質(zhì)生活水平的提高，人們對于高脂飲食的需求也在增加。而高脂飲食也是肥胖、糖尿病等疾病的重要誘因之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一些富含多糖的食品藥品在降糖、降脂方面有較好地效果。研究顯示腸道菌群可以控制脂肪代謝、引發(fā)全身性的慢性低度炎癥，誘發(fā)肥胖和胰島素抵抗。飲食結(jié)構(gòu)是決定腸道菌群組成的重要因素。保持腸道微生態(tài)平衡是維持人體健康所必需的?，F(xiàn)有的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑多是雙歧桿菌、乳桿菌等活菌制劑，但是活菌制劑存在活菌數(shù)量難以保證、穩(wěn)定性差等問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些中草藥具有扶植正常菌群生長的作用，起到益生元的效果，是理想的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。而中藥微生態(tài)調(diào)節(jié)劑與益生菌相比有許多優(yōu)越性，如不存在保存活菌的技術(shù)難題，其穩(wěn)定性強(qiáng)、有效期長和價格較低等。尤其是中藥不僅扶植正常菌群生長，而且還可以提高機(jī)體的免疫功能，從而達(dá)到調(diào)整陰陽、扶正祛邪的目的。靈芝多糖(GanodermaLucidumPolysaccharide,GLP)是多孔菌科靈芝屬真菌菌絲體的次生代謝產(chǎn)物，存在于靈芝屬真菌的菌絲體和子實(shí)體中。靈芝多糖是靈芝的最有效成分之一，因此，也特別受到藥科技工作者的重視，對它的研究報道也最多。已分離到的靈芝多糖有200多種，其中有數(shù)十種的結(jié)構(gòu)已被搞清，分子量已被測定。靈芝多糖有多方面的藥理活性：能提高機(jī)體免疫力，加速血液微循環(huán)，提高血液供氧能力，降低機(jī)體靜止?fàn)顟B(tài)下的無效耗氧量，消除體內(nèi)自由基，提高機(jī)體細(xì)胞膜的封閉度，抗放射，提高肝臟、骨髓、血液合成DNA,RNA，蛋白質(zhì)的能力，延長壽命等。靈芝的多種藥理活性大多和靈芝多糖有關(guān)，但未有靈芝多糖對腸道菌群中能夠調(diào)節(jié)具體哪些有益有害菌的宏基因組學(xué)研究報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供靈芝多糖在制備具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群功效的保健食品中的用途。本發(fā)明公開了靈芝多糖能夠調(diào)節(jié)由飲食引起的腸道菌群紊亂，可明顯改變腸道菌群的組成，使體內(nèi)失衡的腸道菌群趨于正常，進(jìn)而調(diào)節(jié)由飲食引起的腸道菌群紊亂所導(dǎo)致的肥胖的血脂和血糖指標(biāo)，可明顯降低血漿甘油三脂的含量，可以降低膽固醇、低密度脂蛋白和游離脂肪酸的含量。通過宏基因組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)在腸道內(nèi)菌群中哪些是有益菌，哪些是有害菌，其中富集在健康人里面的菌就是有益菌，富集在病人里面的就是有害菌，而靈芝多糖能夠提高富集在健康人腸道內(nèi)菌群中有益菌的豐度，并能降低富集在肥胖和胰島素抵抗的病人中有害菌的豐度。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了靈芝多糖在制備調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂的藥物和/或食品中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，所述食品指各種供人食用或者飲用的成品和原料以及按照傳統(tǒng)既是食品又是藥品的物品，但是不包括以治療為目的的物品。具體的，本發(fā)明中的食品為可供人類食用或飲用的物質(zhì)，包括加工食品，半成品和未加工食品，還包括保健食品，不包括煙草或只作藥品用的物質(zhì)。本發(fā)明中所述食品包括但不限于保健食品。凡是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠接受的食品形式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明中，保健食品是食品的一個種類，具有一般食品的共性，能調(diào)節(jié)人體的機(jī)能，適用于特定人群食用，但不以治療疾病為目的。凡是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠接受的保健食品形式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂的藥物和/或食品中的應(yīng)用中所述調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂包括提高有益菌豐度和/或降低有害菌豐度。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂的藥物和/或食品中的應(yīng)用中所述有益菌包括Bifidobacteriumlongum，Lactobacillusplantarum，Lactobacillusacidophilus，Allobaculumstercoricanis，Streptococcusthermophilus。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂的藥物和/或食品中的應(yīng)用中所述有害菌包括Porphyromonascircumdentaria，Porphyromonascrevioricanis，Porphyromonascanoris，Porphyromonassomerae。本發(fā)明還提供了靈芝多糖在制備預(yù)防和/或治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，所述食品指各種供人食用或者飲用的成品和原料以及按照傳統(tǒng)既是食品又是藥品的物品，但是不包括以治療為目的的物品。具體的，本發(fā)明中的食品為可供人類食用或飲用的物質(zhì)，包括加工食品，半成品和未加工食品，還包括保健食品，不包括煙草或只作藥品用的物質(zhì)。本發(fā)明中所述食品包括但不限于保健食品。凡是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠接受的食品形式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明中，保健食品是食品的一個種類，具有一般食品的共性，能調(diào)節(jié)人體的機(jī)能，適用于特定人群食用，但不以治療疾病為目的。凡是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠接受的保健食品形式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備預(yù)防和/或治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用中所述腸道菌群紊亂包括有益菌豐度降低和/或有害菌豐度提高。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備預(yù)防和/或治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用中所述疾病為肥胖、胰島素抵抗、結(jié)腸功能紊亂、腸炎或代謝綜合征。本發(fā)明中所述代謝綜合征是指人體的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)發(fā)生代謝紊亂的病理狀態(tài)，是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，是導(dǎo)致糖尿病心腦血管疾病的危險因素。其具有以下特點(diǎn)：①多種代謝紊亂集于一身，包括肥胖、高血糖、高血壓、血脂異常、高血黏、高尿酸、高脂肪肝發(fā)生率和高胰島素血癥，這些代謝紊亂是心、腦血管病變以及糖尿病的病理基礎(chǔ)?？梢娞悄虿〔皇且粋€孤立的病，而是代謝綜合征的組成部分之一。②有共同的病理基礎(chǔ)，目前多認(rèn)為它們的共同原因就是肥胖尤其是中心性肥胖所造成的胰島素抵抗和高胰島素血癥。③可造成多種疾病增加，如高血壓、冠心病、腦卒中、甚至某些癌癥，包括與性激素有關(guān)的乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌， 以及消化系統(tǒng)的胰腺癌、肝膽癌、結(jié)腸癌等。④有共同的預(yù)防及治療措施，防治住一種代謝紊亂，也就有利于其他代謝紊亂的防治。臨床表現(xiàn)為：1.腹部肥胖或超重；2.脂代謝異常；3.高血壓；4.糖尿病、胰島素抵抗及/或葡萄糖耐量異常。在本發(fā)明中，所述食品指各種供人食用或者飲用的成品和原料以及按照傳統(tǒng)既是食品又是藥品的物品，但是不包括以治療為目的的物品。具體的，本發(fā)明中的食品為可供人類食用或飲用的物質(zhì)，包括加工食品，半成品和未加工食品，還包括保健食品，不包括煙草或只作藥品用的物質(zhì)。本發(fā)明中所述食品包括但不限于保健食品。凡是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠接受的食品形式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明中，保健食品是食品的一個種類，具有一般食品的共性，能調(diào)節(jié)人體的機(jī)能，適用于特定人群食用，但不以治療疾病為目的。凡是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠接受的保健食品形式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備預(yù)防和/或治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用中所述食品為固體制品、乳制品、溶液制品、粉末制品或懸浮液制品中的一種或多種。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備預(yù)防和/或治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用中所述食品的劑型為軟膠囊、硬膠囊、片劑、蜜膏、露劑、散劑、鮮汁、茶飲、酒劑、口服液、顆粒劑中的一種或多種。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備預(yù)防和/或治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用中所述藥物的劑型為片劑、顆粒劑、膠囊劑、散劑、丸劑、口服液、糖漿劑、沖劑、滴丸劑或湯劑。在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，靈芝多糖在制備預(yù)防和/或治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用中所述藥物的劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、口服液或散劑中的一種或多種。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述靈芝多糖的劑量為10mg/(kg·d)至200mg/kg，優(yōu)選為100mg/(kg·d)。本發(fā)明提供了一種靈芝多糖在制備調(diào)節(jié)腸道有益菌與有害菌的保健食品及食品中的用途。本發(fā)明申請人通過高脂飼料誘導(dǎo)小鼠肥胖二型糖尿病模型，觀察中藥通過腸道菌群對小鼠脂代謝的影響，本發(fā)明所述靈芝多糖能夠調(diào)節(jié)由飲食引起的腸道菌群紊亂，可明顯改變腸道菌群的組成，使體內(nèi)失衡的腸道菌群趨于正常，進(jìn)而調(diào)節(jié)由飲食引起的腸道菌群紊亂所導(dǎo)致的肥胖的血脂和血糖指標(biāo)，靈芝多糖組甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇顯著降低(P<0.05)，同時高密度脂蛋白膽固醇顯著升高(P<0.05)，喂飼高脂飼料9周后，模型小鼠各項(xiàng)血脂指標(biāo)進(jìn)一步升高，靈芝多糖體現(xiàn)出良好的降低低密度脂蛋白膽固醇的效果，可以降低膽固醇、低密度脂蛋白和游離脂肪酸的含量。蛋白芯片測炎癥因子結(jié)果表明，靈芝多糖組能夠顯著的降低炎性反應(yīng)，進(jìn)而改善腸炎。這是因?yàn)楦咧蚋吣芰匡嬍痴T導(dǎo)腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，增加了病菌的數(shù)量，減少了保護(hù)腸屏障細(xì)菌的數(shù)量，影響腸上皮細(xì)胞基因表達(dá)，導(dǎo)致腸道通透性增加，使得進(jìn)入血液的內(nèi)毒素增加，肌肉、肝臟和脂肪組織中多種炎性因子的表達(dá)量增加有關(guān)，如IL-1、TNF-α、MCP-1和IL-6等。而靈芝多糖調(diào)節(jié)菌群比例，降低炎癥因子水平，從而改善結(jié)腸功能紊亂，腸炎，代謝紊亂癥等疾病。與模型組比較，靈芝多糖組的IL-6、IL-1β、IL-2、MCP-1、IFN-γ、IL-10、TNF-α、Leptin分別表現(xiàn)為顯著地降低46％、17％、24％、13％、64％、10％、23％、9％。通過宏基因組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)在腸道內(nèi)菌群中哪些是有益菌，哪些是有害菌，其中富集在健康人里面的菌就是有益菌，富集在病人里面的就是有害菌，而靈芝多糖能夠提高富集在健康人腸道內(nèi)菌群中有益菌的豐度，并能降低富集在肥胖和胰島素抵抗的病人中有害菌的豐度。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示本發(fā)明實(shí)施例中3所述靈芝多糖的藥理實(shí)驗(yàn)第12周不同組別小鼠糞便樣品中菌群的基于effectsize的宏基因組學(xué)的熱圖；圖2示本發(fā)明實(shí)施例2中正常組、模型組、小檗堿、靈芝多糖組的肝臟的病理切片圖；圖3示本發(fā)明實(shí)施例2中正常組、模型組、小檗堿、靈芝多糖組的小腸的病理切片圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了靈芝多糖在制備具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群功效的保健食品中的用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明的第一方面提供了一種靈芝多糖在制備提高腸道內(nèi)菌群中有益菌豐度，并且降低有害菌豐度的保健食品中的用途，所述靈芝多糖的劑量為10mg/(kg·d)至200mg/kg，優(yōu)選為100mg/(kg·d)。特別地，所述腸道內(nèi)的有益菌為Bifidobacteriumlongum(長雙歧桿菌)，Lactobacillusplantarum(植物乳桿菌)，Lactobacillusacidophilus(嗜酸乳桿菌)，Allobaculumstercoricanis，Streptococcusthermophilus(嗜熱鏈球菌)，所述有害菌為Porphyromonascircumdentaria(齒周卟啉單胞菌)，Porphyromonascrevioricanis(狗口腔卟啉單胞菌)，Porphyromonascanoris(犬嘴卟啉單胞菌)，Porphyromonassomerae(擬桿菌門細(xì)菌)。本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)腸道有益菌與有害菌的食品組合物，所述食品組合物包含靈芝多糖。優(yōu)選地，所述食品組合物的劑型為固體、乳品、溶液制品、粉末制品和懸浮液制品中的一種。本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)腸道有益菌與有害菌的保健食品組合物，所述保健食品組合物包含靈芝多糖。優(yōu)選地，所述保健食品組合物的劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、口服液和散劑中的一種。本發(fā)明的另一方面提供了一種靈芝多糖在制備治療或預(yù)防由腸道內(nèi)菌群有益有害菌比例失調(diào)導(dǎo)致的疾病的保健食品中的用途。特別的，所述疾病為由飲食引起的腸道菌群紊亂所導(dǎo)致的肥胖、胰島素 抵抗、結(jié)腸功能紊亂、腸炎或代謝綜合癥。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種靈芝多糖在制備調(diào)節(jié)腸道有益菌與有害菌的保健食品及食品中的用途。本發(fā)明申請人通過高脂飼料誘導(dǎo)小鼠肥胖二型糖尿病模型，觀察中藥通過腸道菌群對小鼠脂代謝的影響，本發(fā)明所述靈芝多糖能夠調(diào)節(jié)由飲食引起的腸道菌群紊亂，可明顯改變腸道菌群的組成，使體內(nèi)失衡的腸道菌群趨于正常，進(jìn)而調(diào)節(jié)由飲食引起的腸道菌群紊亂所導(dǎo)致的肥胖的血脂和血糖指標(biāo)，可明顯降低血漿甘油三脂的含量，可以降低膽固醇、低密度脂蛋白和游離脂肪酸的含量。通過宏基因組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)在腸道內(nèi)菌群中哪些是有益菌，哪些是有害菌，其中富集在健康人里面的菌就是有益菌，富集在病人里面的就是有害菌，而靈芝多糖能夠提高富集在健康人腸道內(nèi)菌群中有益菌的豐度，并能降低富集在肥胖和胰島素抵抗的病人中有害菌的豐度。本發(fā)明提供的多糖的應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場購得。本發(fā)明所述靈芝多糖還可以通過以下制備方法制備獲得：將靈芝粉碎后，按照靈芝∶水＝1g∶5mL的比例加水，在75℃下加熱攪拌提取3h，過濾獲得的濾渣按照上述料液比、溫度和時間繼續(xù)提取兩次，合并三次提取液，經(jīng)過減壓濃縮和離心獲得澄清濃縮液，按照澄清濃縮液∶95％乙醇＝1∶9的體積比將9倍體積95％乙醇加入到澄清濃縮液中，混勻后于4℃下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得靈芝多糖。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1本發(fā)明所述靈芝多糖通過以下制備方法制備獲得：將靈芝粉碎后，按照靈芝∶水＝1g∶5mL的比例加水，在75℃下加熱攪拌提取3h，過濾獲得的濾渣按照上述料液比、溫度和時間繼續(xù)提取兩次，合并三次提取液，經(jīng)過減壓濃縮和離心獲得澄清濃縮液，按照澄清濃縮液∶95％乙醇＝1∶9的體積比將9倍體積95％乙醇加入到澄清濃縮液中，混勻后于4℃下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得靈芝多糖。實(shí)施例2本發(fā)明申請人使用上述實(shí)施例1所制得的靈芝多糖進(jìn)行了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1、實(shí)驗(yàn)材料1.1、實(shí)驗(yàn)儀器Thermo全波長酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技中國，1510；JA1203N型分析天平：上海精密儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠，T1000。1.2、實(shí)驗(yàn)試劑葡萄糖測定試劑盒：上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，20131207147；總膽固醇測定試劑盒：上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，20131105146；甘油三酯測定試劑盒：上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，20131105121；低密度脂蛋白測定試劑盒：上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，20140302124；游離脂肪酸定量檢測試劑盒：和光純藥工業(yè)株式會社，AME6194。1.3、實(shí)驗(yàn)動物與飼料C57BL/6小鼠40只，SPF級，18～22g，50～60天，雄性：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SCXK(粵)2013-0002；大小鼠維持飼料：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SCXK(粵)2013-0002；高脂純化飼料MD45％：江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。表1不同脂肪含量的飼料主要成分及能量構(gòu)成1.4、實(shí)驗(yàn)藥物表2動物實(shí)驗(yàn)原料清單2、實(shí)驗(yàn)方法受試動物進(jìn)入廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城實(shí)驗(yàn)動物中心后，3～4只/盒，20～25℃，RH40～70％，12h：12h晝夜間斷照明；自由進(jìn)食飲水，飲用水為實(shí)驗(yàn)動物中心制備的蒸餾水。2.1、小鼠空腹血液生化指標(biāo)測定每日觀察小鼠毛色，體重，精神狀態(tài)，記錄進(jìn)食量，每周記錄一次小鼠體重，每4weeks采集一次小鼠新鮮糞便(0weeks，4weeks，9weeks，14weeks共4批糞便)。給藥9周后，取非空腹血樣，測定膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。給藥11周后，禁食12h，進(jìn)行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)。給藥14周后，禁食12h，取空腹血樣測量血漿TG，TC，LDL-C，HDL-C。給藥15周后，小鼠采血后，脫頸椎處死，分離取組織臟器(肝、小腸等)根據(jù)需要放置于中性甲醛固定或速凍于液氮后轉(zhuǎn)移保存于-80℃冰箱。2.2、肝臟與小腸病理切片結(jié)果圖2的肝臟的病理切片結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組的肝臟組織出現(xiàn)明顯的脂肪肝，肝細(xì)胞腫大，胞漿淡染，細(xì)胞中的小脂滴將細(xì)胞核擠壓至一邊，肝細(xì)胞間隙有較為明顯的炎性浸潤。實(shí)驗(yàn)組與模型組的肝臟比較，脂肪肝有明顯改善，細(xì)胞中的脂滴明顯較少。圖3的小腸的病理切片結(jié)果顯示，模型組小鼠的小腸絨毛多斷裂，可能是由于長度較長，絨毛間隙增加；正常組和靈芝多糖組小腸絨毛形態(tài)較完整，后面將結(jié)合腸道菌群的結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組，脂肪肝均有明顯改善，細(xì)胞中的脂滴均明顯較少，實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。2.3、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)測小鼠炎癥因子蛋白質(zhì)芯片的檢測原理主要是基于抗原抗體特異性非共價結(jié)合。本實(shí)驗(yàn) 采用雙抗體夾心法。夾心法抗體芯片是將捕獲抗體預(yù)先固定在固相載體上，生物樣品加入到芯片上一起孵育反應(yīng)后，其特異性的抗原與捕獲抗體結(jié)合，然后加入生物素標(biāo)記的檢測抗體一起孵育，最后通過HRP-鏈霉親和素與化學(xué)發(fā)光底物、或者熒光染色劑-鏈霉親和素結(jié)合作為信號檢測。膠片顯影、定影后用quantityone軟件分析膜上斑點(diǎn)的灰度值。一張膜上附有39種細(xì)胞因子的抗體，一組樣本在一張膜上檢測。以模型組的灰度值為單位1作為對照，其余各組與模型組比較分析。表3蛋白芯片測炎癥因子結(jié)果表3結(jié)果顯示，與模型組比較，靈芝多糖組1的IL-6、IL-1β、IL-2、MCP-1、IFN-γ、IL-10、TNF-α、Leptin分別表現(xiàn)為顯著地降低47％、25％、33％、27％、59％、23％、31％、15％。靈芝多糖組2的IL-6、IL-1β、IL-2、MCP-1、IFN-γ、 IL-10、TNF-α、Leptin分別表現(xiàn)為顯著地降低39％、9％、15％、9％、53％、8％、18％、5％。靈芝多糖組3的IL-6、IL-1β、IL-2、MCP-1、IFN-γ、IL-10、TNF-α、Leptin分別表現(xiàn)為顯著地降低46％、17％、24％、13％、64％、10％、23％、9％。表3的蛋白芯片測炎癥因子結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組能夠顯著(P＜0.05)的降低炎性反應(yīng)，進(jìn)而改善腸炎。這是因?yàn)楦咧蚋吣芰匡嬍痴T導(dǎo)腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，增加了病菌的數(shù)量，減少了保護(hù)腸屏障細(xì)菌的數(shù)量，影響腸上皮細(xì)胞基因表達(dá)，導(dǎo)致腸道通透性增加，使得進(jìn)入血液的內(nèi)毒素增加，肌肉、肝臟和脂肪組織中多種炎性因子的表達(dá)量增加有關(guān)，如IL-1、TNF-α、MCP-1和IL-6等。而靈芝多糖調(diào)節(jié)菌群比例，降低炎癥因子水平，從而改善結(jié)腸功能紊亂，腸炎，代謝紊亂癥等疾病。且與對照組相比，本發(fā)明公開的靈芝多糖與陽性對照組的效果無顯著差異(P＞0.05)。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性分析采用statview軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異參考標(biāo)準(zhǔn)。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥9周后，正常組非空腹血糖與模型組無明顯差異，模型組總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇比正常組顯著升高(P<0.01)；靈芝多糖組甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇顯著降低(P<0.05)，同時高密度脂蛋白膽固醇顯著升高(P<0.05)，喂飼高脂飼料9周后，模型小鼠各項(xiàng)血脂指標(biāo)進(jìn)一步升高，靈芝多糖體現(xiàn)出良好的降低低密度脂蛋白膽固醇的效果。表4第九周小鼠非空腹血液生化指標(biāo)給藥14周后，與模型組比較，陽性對照小檗堿組與靈芝多糖組血漿甘油三酯、游離脂肪酸、游離脂肪酸、低密度脂蛋白膽固醇均顯著性降低(P<0.05)。對比第九周實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，靈芝多糖降低血漿中甘油三酯的效果穩(wěn)定，可一定程度上降低血中游離脂肪酸的含量。表5第十四周小鼠空腹血液生化指標(biāo)從表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明所述靈芝多糖能顯著(P＜0.05)改善二型糖尿病肥胖的血脂和血糖指標(biāo)，可明顯(P＜0.05)降低血漿甘油三脂的含量，可以降低膽固醇、低密度脂蛋白和游離脂肪酸的含量，對于治療或預(yù)防由腸道菌群紊亂導(dǎo)致的肥胖或胰島素抵抗有很好的有益效果。從圖2和圖3的病理切片結(jié)果顯示，靈芝多糖能夠減少肝臟和小腸的脂肪， 促進(jìn)改善胰島素抵抗。而長期過量的高脂飲食可引起血脂的異常升高，過多的脂質(zhì)也會在非脂肪組織中聚集，如肝臟和小腸。肝臟中的TG堆積，導(dǎo)致高脂血癥以及肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。取實(shí)施例1制得的或市場購買的靈芝多糖的劑量為10mg/(kg·d)至200mg/kg時，進(jìn)行上述多項(xiàng)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1靈芝多糖劑量為100mg/(kg·d)的功效無顯著差異(P＞0.05)，能夠達(dá)到實(shí)施例1靈芝多糖劑量為100mg/(kg·d)的的功效至少90％。實(shí)施例3采集應(yīng)用實(shí)施例1中小鼠實(shí)驗(yàn)第12周的小鼠新鮮糞便，將不同組別之間的腸道菌落進(jìn)行差異分析。圖1和表6中B、陽性藥組，C、正常組，D、靈芝多糖組1，E、靈芝多糖組2，F(xiàn)、靈芝多糖組3，M、模型組(分組同實(shí)施例2中表2)。本研究最關(guān)心的是M模型組和C正常組有差異的菌是否用藥后得到調(diào)節(jié)，做出了圖1。圖1中挑選的OTU是在C正常組和M模型組有差異的OTU(其effectsize>1.96)，然后這些OTU同樣在其他組和M模型組之間做檢驗(yàn)，得出的effectsize畫出上面的熱圖。從圖1可以輕易看出，陽性藥效果很顯著，富集在M模型組上的菌的數(shù)量全部下降了。D靈芝多糖能調(diào)控部分的OTU，使得它恢復(fù)正常。表6相比病患組對于有益菌與有害菌的調(diào)節(jié)作用結(jié)果表6展示了靈芝多糖組對于腸道菌群中的各種有益菌與有害菌的調(diào)節(jié)作用，通過宏基因組學(xué)的手段分析比對各組第12周的小鼠新鮮糞便中的菌落，可知小鼠腸道中的有益菌為Bifidobacteriumlongum，Lactobacillusplantarum，Lactobacillusacidophilus，Allobaculumstercoricanis，Streptococcusthermophilus，所述有害菌為Porphyromonascircumdentaria，Porphyromonascrevioricanis，Porphyromonascanoris，Porphyromonassomerae。本發(fā)明實(shí)施例中的靈芝多糖對上述有益菌的豐度有提高作用，對上述有害菌的豐度有降低作用。本發(fā)明實(shí)施例中的靈芝多糖對上述有益菌的豐度有提高作用，對上述有害菌的豐度有降低作用。根據(jù)宏基因組學(xué)研究的方法和原理(參見Lietal.InnateimmunityandintestinalmicrobiotainthedevelopmentofType1diabetesNature455,1109-1113，23rd，October2008)，將上述有益菌和有害菌在人腸道中的靈芝多糖(100mg/(kg·d))調(diào)節(jié)作用進(jìn)行測序鑒定，得到靈芝多糖能夠提高腸道內(nèi)菌群中有益菌Bifidobacteriumlongum，Lactobacillusplantarum，Lactobacillusacidophilus，Allobaculumstercoricanis，Streptococcusthermophilus的豐度，降低有害菌Porphyromonascircumdentaria，Porphyromonascrevioricanis，Porphyromonascanoris，Porphyromonassomerae的豐度。實(shí)驗(yàn)表明，所述實(shí)驗(yàn)組靈芝多糖的劑量為10mg/(kg·d)至200mg/kg時，試驗(yàn)結(jié)果相比模型組均具有良好的調(diào)節(jié)作用，顯著差異(P<0.05)，在實(shí)驗(yàn)組靈芝多糖組 1的100mg/(kg·d)的劑量時功效最優(yōu)。可見靈芝多糖能使有益菌的豐度顯著(P＜0.05)增加，使有害菌的豐度明顯(P＜0.05)降低，呈現(xiàn)出明顯地改善腸道菌群紊亂的作用(通過上述宏基因組學(xué)的研究，富集在健康人里面的菌就是有益菌，富集在病患者里面的就是有害菌)。與陽性對照組相比，本發(fā)明公開的實(shí)驗(yàn)組靈芝多糖與對照組的效果無顯著差異(P＞0.05)。取實(shí)施例1制得的或市場購買的靈芝多糖的劑量為10mg/(kg·d)至200mg/kg時，進(jìn)行上述多項(xiàng)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與上述的功效無顯著差異(P＞0.05)，能夠達(dá)到上述的功效至少90％。實(shí)施例4保健食品的制備取本發(fā)明實(shí)施例1提供的靈芝多糖或購自市場的靈芝多糖，添加食品中允許的輔料，按照常規(guī)方法制得食品。制得的食品可以為固體制品、乳制品、溶液制品、粉末制品或懸浮液制品。其中，保健食品的劑型可以為軟膠囊、硬膠囊、片劑、蜜膏、露劑、散劑、鮮汁、茶飲、酒劑、口服液、顆粒劑。實(shí)施例5藥物的制備取本發(fā)明實(shí)施例1提供的靈芝多糖或購自市場的靈芝多糖，添加藥學(xué)上可接受的輔料，按照常規(guī)方法制得藥物。制得的藥物的劑型可以為片劑、顆粒劑、膠囊劑、散劑、丸劑、口服液、糖漿劑、沖劑、滴丸劑或湯劑。實(shí)施例6制得保健食品的檢驗(yàn)取本發(fā)明實(shí)施例4制得的保健食品，按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB16740-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)保健食品》進(jìn)行檢測，結(jié)果如下：3.1原料和輔料原料和輔料符合相應(yīng)食品標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)規(guī)定。3.2感官要求感官要求符合表7的規(guī)定。表7感官要求3.3理化指標(biāo)理化指標(biāo)符合相應(yīng)類屬食品的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。3.4污染物限量污染物限量符合GB2762中相應(yīng)類屬食品的規(guī)定，無相應(yīng)類屬食品的符合表8的規(guī)定。表8污染物限量項(xiàng)目指標(biāo)檢驗(yàn)方法鉛a(Pb)/(mg/kg)2.0GB5009.12總砷b(As)/(mg/kg)1.0GB/T5009.11總汞c(Hg)/(mg/kg)0.3GB/T5009.17a袋泡茶劑的鉛≤5.0mg/kg；液態(tài)產(chǎn)品的鉛≤0.5mg/kg；嬰幼兒固態(tài)或半固態(tài)保健食品的鉛≤0.3mg/kg；嬰幼兒液態(tài)保健食品的鉛≤0.02mg/kg。b液態(tài)產(chǎn)品的總砷≤0.3mg/kg；嬰幼兒保健食品的總砷≤0.3mg/kg。c液態(tài)產(chǎn)品(嬰幼兒保健食品除外)不測總汞；嬰幼兒保健食品的總汞≤0.02mg/kg。3.5真菌毒素限量真菌毒素限量符合GB2761中相應(yīng)類屬食品的規(guī)定和(或)有關(guān)規(guī)定。3.6微生物限量微生物限量符合GB29921中相應(yīng)類屬食品和相應(yīng)類屬食品的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，無相應(yīng)類屬食品規(guī)定的符合表9的規(guī)定。表9微生物限量3.7食品添加劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑3.7.1食品添加劑的使用符合GB2760的規(guī)定。3.7.2營養(yǎng)強(qiáng)化劑的使用符合GB14880和(或)有關(guān)規(guī)定。綜合上述檢測結(jié)果，本發(fā)明制得的保健食品符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB16740-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)保健食品》的規(guī)定。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3