一種非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中醫(yī)和西醫(yī)動(dòng)物模型領(lǐng)域，具體涉及一種非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸 道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國的中醫(yī)理論著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》中指出："勞則喘息汗出，外內(nèi)皆越，故氣耗矣"。 即是，過度疲勞可致氣虛?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中又指出："今脾病不能為胃行其津液，四肢不得稟 水谷氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉，皆無氣以生，故不用焉。"即，脾主肌肉及四肢，脾的 功能低下，則表現(xiàn)為四肢困倦、乏力。另外，脾氣虛的臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹脹、便溏、疲乏 等。
[0003] 腸道菌群是人體正常的微生物，健康人群的胃腸道內(nèi)寄居有種類繁多的腸道菌 群。腸道菌群按一定的比例組合，各菌間互相拮抗，互相協(xié)同，在質(zhì)和量上形成一種生態(tài)平 衡，一旦機(jī)體內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化，敏感腸菌被抑制，未被抑制的細(xì)菌便乘機(jī)繁殖，從而引起 菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)在中醫(yī)上主要屬于腹痛、泄瀉范疇，內(nèi)因主要以脾虛為主，脾失健 運(yùn)，腸不能分清泌濁傳化糟柏，從而造成腸道菌群紊亂。
[0004] 中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本，氣血生化之源，與機(jī)體的免疫功能等密切相關(guān)。脾氣虛腹 瀉時(shí)，腸蠕動(dòng)加快，腸道中的有益菌增殖減少，有害菌增加，正常菌群的生理作用減弱，加重 腹瀉。另外脾氣虛時(shí)機(jī)體免疫力下降，當(dāng)機(jī)體遇急性冷刺激時(shí)，加快有害菌的侵入和繁殖， 加重腸道菌群失調(diào)，由此形成惡性循環(huán)。由此可見，腸道菌群失調(diào)與脾氣虛互為因果，兩者 之間存在著密切關(guān)系。近年來，學(xué)者對(duì)脾氣虛和腸道菌群失調(diào)動(dòng)物模型的制作做出了有益 的探索，產(chǎn)生了一些原創(chuàng)性的造模方法。例如，有學(xué)者采用精神刺激法制備肝郁脾虛型動(dòng)物 模型，實(shí)驗(yàn)中夾住大鼠尾巴讓其相互撕咬，且實(shí)驗(yàn)過程中引誘禁食。但此法制備的脾虛模型 不能表征大鼠腸道菌群紊亂狀態(tài)。另外，有學(xué)者將乙酸注入大鼠結(jié)腸，然后以〇. 9%氯化鈉 溶液沖洗模擬結(jié)腸炎，該方法只涉及腸道菌群紊亂狀態(tài)，不能兼顧脾氣虛狀態(tài)。也有學(xué)者用 5%乙酸灌注大鼠結(jié)腸加高濃度大黃灌胃法同時(shí)制備結(jié)腸炎肝郁脾虛癥模型，但是給藥會(huì) 對(duì)機(jī)體的自身特異性和耐受性差異產(chǎn)生干預(yù)，與非藥物誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂狀態(tài)存在一定 的本質(zhì)差異。因此，需要一個(gè)新的非藥物誘導(dǎo)的模型來表征脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂狀態(tài)， 為相關(guān)代謝通路的探討提供可靠的動(dòng)物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛及腸道菌群紊亂模型的制備方法。 通過基于UPLC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法和基于16SrRNART-PCR技術(shù)的腸道菌群組成和豐 度表征方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終驗(yàn)證了模型造模成功，為研宄中醫(yī)脾氣虛伴隨腸道菌群 紊亂和中藥干預(yù)研宄提供合適的動(dòng)物模型。
[0006] 本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0007] -種非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛及腸道菌群紊亂模型的制備方法，采用大鼠負(fù)重游泳加 冰水刺激方法，得到動(dòng)物模型。
[0008] 1.模型制備
[0009] 在本發(fā)明中，用于造模的大鼠體重為180-250g。用于造模大鼠采用如下飼養(yǎng)條件： 動(dòng)物飼養(yǎng)于SPT環(huán)境。室溫20-30°C，相對(duì)濕度30-60 %，每天12h光照，12h黑暗，自由飲 食。
[0010] 在本發(fā)明中，隨機(jī)將大鼠分為空白和模型組，模型組大鼠尾部懸掛自身體重 2% -10%的重物。將負(fù)重大鼠放入水溫為20-30°C的容器中強(qiáng)迫其游泳，每天進(jìn)行1-4次， 間隔0?l-3h，每次游泳至力竭為止。連續(xù)力竭游泳7-20天，第10-20天將游泳水溫降為 〇-5°C，即模型建立?？瞻捉M動(dòng)物正常飼養(yǎng)，不參與游泳。
[0011] 優(yōu)選的方案為：隨機(jī)將大鼠分為空白和模型組，模型組大鼠尾部懸掛自身體重 5%的重物。將負(fù)重大鼠放入水溫為25±5°C的容器中強(qiáng)迫其游泳，每天進(jìn)行2次，間隔 0. 5h，每次游泳至力竭為止。連續(xù)力竭游泳14天，第14天將游泳水溫降為0°C，即模型建 立?？瞻捉M動(dòng)物正常飼養(yǎng)，不參與游泳。
[0012] 造模結(jié)束后，眼眶取血。收集新鮮糞便，代謝籠收集尿樣。樣品于-80°c冰箱保存， 待分析。
[0013] 2?樣品分析
[0014] (1)基于UPLC-MS的代謝組學(xué)分析
[0015] 采用UPLC-Q-TOF-MS分析收集到的血漿和尿樣。
[0016] 色譜條件：WatersACQUITYHSST3 色譜柱（2.ImmXIOOmm，I.D.，1. 8ym);流 動(dòng)相A-0. 1 %甲酸水，B-含0. 1 %甲酸的乙腈，梯度洗脫：5-50%B(2-8min)，50-95 % B(8-8. 2min)，95%B(8. 2-llmin);流速0? 4mL"化-1;柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器溫度分別為35， l〇°C;進(jìn)樣量1yL。
[0017] 質(zhì)譜條件：WatersSYNAPTG2-SQ-TOF質(zhì)量分析器；電噴霧離子源，正負(fù)離子模式 掃描；Q-TOF采集率0. 2s;質(zhì)量掃描范圍50~900Da;毛細(xì)管電壓3000V;錐孔電壓35V;離 子源溫度l〇〇°C;去溶劑化溫度450°C，流速800L?h-1;錐孔氣流速50L?h一1。
[0018] 數(shù)據(jù)處理：多變量數(shù)據(jù)分析采用EZinfosoftware2. 8(Waters Corp.，Milford，USA)，數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘辨別分析（PLS-DA)，根據(jù)載荷圖 (loading-plot)和S-plot來篩選差異代謝物。
[0019] (2)基于16SrRNART-PCR的腸道菌群組成表征分析
[0020] 采用InviMagStoolDNA試劑盒提取糞便樣品中的基因組DNA，PCR擴(kuò)增的焦磷酸 測(cè)序，主要針對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因V3-V4區(qū)。
[0021] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
[0022] (1)基于UPLC-MS的代謝組學(xué)分析結(jié)果
[0023] 通過對(duì)空白組和模型組血漿樣品進(jìn)行偏最小二乘辨別分析（PLS-DA)，在得分圖 (圖1A)上2組樣品得到很好的區(qū)分，表明其血漿存在明顯差異。根據(jù)Loading-plot(圖 1B)和S-plot(圖1C)尋找貢獻(xiàn)較大的生物標(biāo)志物，并鑒定了 13個(gè)化合物，結(jié)果如表1所示， 其中有9個(gè)代謝物含量發(fā)生顯著性的變化。與空白組相比，模型組大鼠血漿中的色氨酸、苯 丙氨酸、丁酰肉堿、LPC16:0等含量顯著性降低，而膽酸、LPC18:2含量顯著性升高。同時(shí) 他們參與了體內(nèi)的能量代謝、卵磷脂代謝等，與脾氣虛密切相關(guān)，他們的含量變化，揭示了 相關(guān)代謝通路的異常，表明了脾氣虛模型造模成功。
[0024] 表1血漿樣品中生物標(biāo)志物的鑒別。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于非 藥物誘導(dǎo)和強(qiáng)迫大鼠連續(xù)負(fù)重游泳加冰水刺激，同時(shí)得到脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模 型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于非藥物誘導(dǎo)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于模型表現(xiàn)出疲勞、腹瀉癥狀。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于強(qiáng)迫大鼠負(fù)重游泳，負(fù)重自身體重的2-10%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于強(qiáng)迫大鼠連續(xù)負(fù)重游泳加冰水刺激。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于強(qiáng)迫大鼠每天負(fù)重游泳1-4次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于負(fù)重游泳每次間隔0. l-3h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于冰水刺激為負(fù)重游泳的第10-20天水浴改為冰水浴。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法， 其特征在于冰水浴溫度為0-5 °C。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非藥物誘導(dǎo)的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方 法，其特征在于模型的評(píng)價(jià)同時(shí)采用代謝組學(xué)分析和腸道菌群組成表征分析方法。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種非藥物誘導(dǎo)脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法，涉及中醫(yī)及西醫(yī)動(dòng)物模型。所述非藥物誘導(dǎo)脾氣虛及腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法，強(qiáng)迫大鼠連續(xù)負(fù)重游泳7-20天后，第10-20天為冰水浴游泳，得到脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型。本發(fā)明提供的脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型的制備方法，經(jīng)代謝組學(xué)分析和腸道菌群組成及豐度表征分析，驗(yàn)證了脾氣虛伴隨腸道菌群紊亂動(dòng)物模型造模成功。
【IPC分類】A01K67-027
【公開號(hào)】CN104621048
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510021828
【發(fā)明人】李松林, 周姍姍, 朱賀, 沈紅
【申請(qǐng)人】江蘇省中醫(yī)藥研究院
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年1月15日