專利名稱：人參皂甙Rg3、多糖及靈芝多糖的組合物制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥衛(wèi)生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及獲得具有較高純度人參、靈芝多糖，較好藥理活性的人參皂甙提取物的制備方法，以及該多糖皂甙組合物用于免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人參，是一種半遮陰型多年生五加科植物，作為一種名貴藥材，廣泛應(yīng)用于全世界89個(gè)國(guó)家和底物，受惠人口超過(guò)十億。現(xiàn)代科學(xué)證明，人參當(dāng)中的多種人參皂甙和人參多糖是主要活性成分，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、延緩衰老、抗輻射等功能，對(duì)心腦血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等具有良好的調(diào)節(jié)作用。其中，人參皂甙Rg3被認(rèn)為生物活性最為顯著，多種人參處理工藝都以提高Rg3含量為目標(biāo)[J Agric Food Chem 2006,54:9936-9942]。其中，新鮮人參經(jīng)九次蒸熟與九次熟成工序，制成黑參[CN 101442913]，其低糖皂甙Rg2、Rg3、Rh2和CK均有顯著增加[J Pharm Biomed Anal 2009，51:15-22]。金鳳燮等采用淀粉酶、纖維素內(nèi)切酶、霉菌浸出液作為酶源，浸泡人參提取物后，再利用水、乙醇或甲醇提取皂甙，提高了皂甙的總回收率[ZL96115151]。然而，這類處理工藝僅局限于人參提取物，而沒有擴(kuò)展到整只鮮人參、生曬參、紅參等初加工原材料來(lái)直接處理的過(guò)程。同時(shí)，也忽視了對(duì)另一種重要藥用成分，人參多糖的提取。該成分是一種高分子酸性多糖，主要成分為半乳糖醒酸，具有增強(qiáng)人體免疫力的功效[Pharmaceutical Research 1996, 13:1196-1200]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥認(rèn)為靈芝具有補(bǔ)氣安神、平咳固喘等療效，現(xiàn)代研究表明靈芝多糖是其主要藥理活性成分，并被中國(guó)藥典列為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。靈芝多糖大多為異多糖，除葡萄糖外，還含有少量木糖、巖藻糖、半乳糖等等。其中，最主要的葡聚糖是由三股單糖鏈構(gòu)成的，呈螺旋狀立體結(jié)構(gòu)，大多為β型結(jié)構(gòu)，少數(shù)為α型沒有藥理活性的結(jié)構(gòu)。近期研究表明，靈芝多糖成分能刺激淋巴細(xì)胞高表達(dá)IL-2、IL-10、以及TNF-α，具有免疫調(diào)節(jié)作用[Planta Med 2010, 76: 223 - 227]。另一項(xiàng)研究表明巖藻糖是人體免疫受體識(shí)別細(xì)菌和真菌的標(biāo)記，免疫受體會(huì)與這種微糖綁定來(lái)對(duì)抗感染。人體內(nèi)葡萄糖水平一旦過(guò)高，其就會(huì)代替巖藻糖綁定免疫受體，從而妨礙免疫受體識(shí)別感染性細(xì)菌和真菌。如果能通過(guò)適當(dāng)?shù)纳镛D(zhuǎn)化技術(shù)，提高靈芝多糖產(chǎn)品中可吸收巖藻糖含量，勢(shì)必有助于增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)活性。一般而言，多糖的提取方法局限于水提醇沉的生產(chǎn)工藝，即利用多糖在熱水中溶解度高，但在高濃度的乙醇中會(huì)析出沉淀的特性來(lái)提純。然而，這種方法存在著多糖提取效率低，提取物中含有大量雜蛋白和色素等缺陷[CN 1241947]。周考文等人采用人參粉碎后超聲的方法，節(jié)省了提取時(shí)間，多糖提取效率比傳統(tǒng)方法提高了兩倍[CN 101250234. B]。為了通過(guò)適當(dāng)提取工藝，同時(shí)得到人參皂甙提取物和人參多糖提取物，劉莉等人采用乙醇抽提后，對(duì)殘余料渣水提的方法，分別獲得兩種具有重要藥用價(jià)值的物質(zhì)[CN 1821275]。然而，該工藝并沒有使得重要人參皂甙活性成分Rg3含量明顯提升。在靈芝多糖提取方面，張勁松等采用靈芝實(shí)體為原料，通過(guò)水提后直接超濾的方法，脫色后凍干獲得高純度靈芝多糖[CN 10193358]。由于靈芝屬于珍稀藥材,近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者逐漸把目光轉(zhuǎn)向通過(guò)微生物發(fā)酵的方式，獲得靈芝多糖等要用活性成分。楊志堅(jiān)等人采用肉靈芝發(fā)酵的方法，通過(guò)向發(fā)酵液中加入乙醇，獲得靈芝多糖[CN 100506996C]。毛健等人利用靈芝菌種發(fā)酵，發(fā)酵液中加入乙醇，告訴離心醇沉液，獲得靈芝多糖[CN 102021212]。這些方法均沒有涉及通過(guò)糖苷酶水解，輔助提取多糖的工藝技術(shù)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單、高效、低成本將大批量天然人參、靈芝產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為具有免疫調(diào)節(jié)活性的藥用組合物的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的人參多糖及高含量人參皂甙Rg3提取物的制備方法按照以下工序來(lái)進(jìn)行
(I)原料清洗在保持人參外型完整的情況下，保留老皮將其水洗干凈，去除表面泥沙及其它附著物。(2)糖苷酶水解完整人參經(jīng)排針扎孔，浸沒于含有pH3. (Til. 0的緩沖液的培養(yǎng)鍋中，以每千克原料0.廣100個(gè)酶活單位的比例，加P-D-木糖苷酶反應(yīng)，該pH值范圍內(nèi)可以保持3-D-木糖苷酶活性維持在較高的水平；同時(shí)，由于糖苷酶酶解工序中使得大量人參皂甙從多糖成分中剝離出來(lái)，減少了沸水加工過(guò)程中對(duì)皂甙成分的破壞。(3)水提人參多糖將人參與水按照重量比I: f 1:6的比例加水，煮沸f 3小時(shí)，過(guò)濾后，將人參實(shí)體按照重量比1:3 1:10的比例加水，煮沸廣3小時(shí)，過(guò)濾后合并兩次濾液；加熱過(guò)程中有助于提高Rg3在人參制品中的含量，采用兩次煮制過(guò)程是為了避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致副反應(yīng)大量產(chǎn)生。(4)醇沉法制備人參多糖采用95%的乙醇將上一步獲得的濾液中乙醇含量調(diào)至6(T90%，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置廣3小時(shí)，過(guò)濾后取醇不溶物為人參多糖粗品。(5)超聲法提取人參皂甙取上一步獲得的濾液與步驟(3)獲得的人參實(shí)體合并，采用功率15(T200瓦的超聲提取3(T75分鐘，過(guò)濾后取上清；由于制備人參多糖所采用的醇沉法乙醇濃度較高，在超聲輔助條件下，促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，同時(shí)，由于人參多糖已經(jīng)在上一步中提取完畢，該步驟無(wú)需擔(dān)心超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)斷裂多糖大分子，可以徹底提取人參中殘余皂甙。(6)高Rg3含量人參皂甙提取物對(duì)上一步獲得的上清液在4(T60°C的條件下，減壓蒸餾獲得高Rg3含量人參皂甙提取物。該步驟可選用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等方式操作，此溫度范圍內(nèi)高生物活性的人參皂甙不會(huì)發(fā)生分解。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，靈芝多糖提取物的制備方法按照以下工序來(lái)進(jìn)行
(I)原料清洗及粉碎將靈芝實(shí)體水洗，去除表面附著泥沙，粉碎后，經(jīng)100目篩網(wǎng)獲得靈芝粉末。由于靈芝本身的稀缺性，徹底粉碎有助于多糖成分的充分提取，提高效率。(2)糖苷酶水解靈芝粉浸沒于含有pH3. (TlO. 0的緩沖液的培養(yǎng)鍋內(nèi)內(nèi)，以每千克原料0.廣10個(gè)酶活單位的比例，加a-L-巖藻糖苷酶反應(yīng)。該步驟有助于斷裂巖藻糖苷鍵，促進(jìn)其在終產(chǎn)品經(jīng)小腸吸收。(3)水提靈芝多糖將酶解后的靈芝粉與水按照重量比1:3 1:10的比例加水，采用功率15(T200瓦的超聲提取3(T75分鐘，煮沸廣3小時(shí)，采用100目的濾布過(guò)濾后取濾液。超聲輔助可通過(guò)空化效應(yīng)，使得靈芝多糖盡可能多的溶于水中。
(4)醇沉法制備靈芝多糖采用95%的乙醇將上一步獲得的濾液中乙醇含量調(diào)至6(T90%，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置廣3小時(shí)，9000g離心后取沉淀部分為靈芝多糖粗品。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，人參多糖及靈芝多糖提取物的精制法按照以下工序來(lái)進(jìn)行
(I)將權(quán)利要求I所述人參多糖粗品與權(quán)利要求2所述靈芝多糖粗品，按照重量比1:1的比例混合。兩種重要藥用活性成分混合在一起，經(jīng)樹脂柱除蛋白，脫色，有助于簡(jiǎn)化操作流程，提高效率。(2)采用717型陰離子交換樹脂對(duì)上一步獲得的多糖混合物進(jìn)行脫色處理，樹脂與多糖的重量比為1:20，裝柱，多糖樣品溶于水后濕法上樣。
(3)采用pH9. 0濃度為0. IM的碳酸氫鈉-碳酸鈉緩沖液作為洗脫液，收集洗脫液超濾，冷凍干燥，粉碎后獲得混合人參多糖及靈芝多糖純品。堿性洗脫液存在的情況下，多糖提取中的雜蛋白質(zhì)呈陰離子狀態(tài)，容易被陰離子交換樹脂吸附，該層析方法可通過(guò)一步操作達(dá)到脫雜蛋白，脫色的目的。本發(fā)明還公開了一種藥用組合物的配比，其中包含權(quán)利要求I所述高Rg3含量人參皂甙提取物以及權(quán)利要求3所述人參多糖及靈芝多糖純品，其質(zhì)量比為1:廣1:30。該組合物經(jīng)細(xì)胞、動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)研究表明，三種提取物免疫調(diào)節(jié)效果具有協(xié)同作用，能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫力。本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是
(1)將整棵人參粗原料經(jīng)過(guò)酶解、沸水、超聲等多種提取技術(shù)整合后的優(yōu)化方案，可以在獲得稀有皂甙含量高、總皂甙損失少的高Rg3人參皂甙提取物(Rg3含量0. 5%以上)的同時(shí)，高效獲取人參多糖產(chǎn)品，半乳糖醛酸含量可達(dá)35%以上；
(2)采用本發(fā)明所公開的靈芝多糖提取技術(shù)，抽提時(shí)間比傳統(tǒng)水溶醇提法節(jié)省60%以上，提取效率提高100%以上，同時(shí)，所獲得的多糖產(chǎn)品中巖藻多糖成份更易吸收，有助于免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮。(3)采用本發(fā)明所公開的高Rg3含量人參皂甙提取物、人參多糖及靈芝多糖按一定比例混合制成藥物組合物，在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制之間存在協(xié)調(diào)效應(yīng)，有助于增強(qiáng)機(jī)體免疫力。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
以未經(jīng)加工過(guò)的I千克鮮水參為原料，利用清水將粘附在其表皮上的雜質(zhì)清洗干凈之后，將其浸沒于I升左右磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀配置0. IM的pH7. 4緩沖液內(nèi)，加入I個(gè)酶活單位的P-D-木糖苷酶，在37°C恒溫孵育I小時(shí)后取出。向人參產(chǎn)品中加入3升水，力口熱煮沸回流，維持2小時(shí)后取出人參，沸水收集待用。再加入3升水，加熱煮沸回流I小時(shí)后，取出人參制品。共得含有人參多糖的水6升左右，加入95%的無(wú)水乙醇10升，在玻璃反應(yīng)釜中充分?jǐn)嚢韬?，室溫下靜置3小時(shí)，過(guò)濾后得到淺黃色膏狀沉淀物為人參多糖粗產(chǎn)品，其中半乳糖醛酸含量35%左右。所得到的濾液16升含有乙醇60%左右，將人參制品浸入，在150W超聲功率下，超聲提取60分鐘，過(guò)濾除去人參殘?jiān)?，所得濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在45°C條件下濃縮蒸干，得到白色顆粒為人參皂甙提取物73克，其中人參皂甙Rg3含量為35. I毫克。實(shí)施例二
將I千克靈芝實(shí)體研磨成細(xì)粉過(guò)100目，細(xì)粉加入PH5. O左右的O. IM醋酸-醋酸鈉緩沖液I升內(nèi)，加入O. 5個(gè)酶活單位的a -L-巖藻糖苷酶，在37°C恒溫孵育I小時(shí)后，采用濾布100目過(guò)濾，收集濾渣后，加入3升水，在150W超聲功率下，超聲提取60分鐘，隨后加熱煮沸回流3小時(shí)，采用100目的濾布過(guò)濾后得到含有靈芝多糖的濾液3升左右。向其中加入95%的無(wú)水乙醇10升，在玻璃反應(yīng)釜中充分?jǐn)嚢韬螅覝叵蚂o置3小時(shí)，9000g離心后得到淺黃色膏狀沉淀物為靈芝多糖粗產(chǎn)品。實(shí)施例三
采用717型陰離子交換樹脂20克裝柱，用6%的鹽酸小量淋洗至流出液呈酸性，浸泡3小時(shí)，放盡酸液后用去離子水漂洗至中性。接著用4%的氫氧化鈉溶液小量淋洗至流出液呈堿性，浸泡3小時(shí)，放盡堿液后用去離子水漂洗至中性待用。各稱取人參多糖粗品和靈芝多糖粗品O. 5克,加入2暈升去尚子水后濕法上陰尚子交換樹脂柱。米用pH9. O濃度為O. IM的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液作為洗脫液，在I. O ml/min的流速下收集流出液，采用苯酚硫酸法在490nm下測(cè)定多糖含量。將濾液采用UF-3530超濾膜截留分子量I萬(wàn)Da超濾濃縮后，冷凍干燥得到人參靈芝多糖精品(多糖含量90%以上)?；旌细呷藚⒃磉癛g3提取物人參靈芝多糖精品(不同比例O. 5g 0. 5g，0. 5g:5g,
O.5g:15克)，采用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基溶解，配置成lmg/ml, O. 5mg/ml,
O.25mg/ml三個(gè)濃度。另分別配制lmg/ml的人參皂甙提取物以及人參靈芝多糖。采用3%巰基乙醇酸鈉刺激的方法，獲取Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1*106個(gè)/ml，加Iml/孔至24孔平底培養(yǎng)板中，加入Iml不同濃度的藥物組合物及皂甙/多糖單成分共培養(yǎng)，以不含藥物的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。5% 二氧化碳37°C條件下溫箱孵育24小時(shí)后，取上清液，利用ELISA方法測(cè)定TNF-α表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)隨著皂甙多糖組合物濃度上升，TNF-α表達(dá)量明顯增加(Ρ〈0. 01)，而單獨(dú)使用皂甙提取物或單獨(dú)使用多糖提取物效果并不顯著，提示該藥物組合物對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制之間存在協(xié)同效應(yīng)。表人參皂甙、人參多糖、及靈芝多糖提取物及其組合物誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生量
權(quán)利要求
1.一種人參多糖及高Rg3含量人參皂甙提取物的制備方法，其特征在于，加工工藝為 原料清洗在保持人參外型完整的情況下，將其水洗干凈。
2.糖苷酶水解完整人參經(jīng)排針扎孔，浸沒于PH7.(Til. O的緩沖液體系中，以每千克原料0. rioo個(gè)酶活單位的比例，加^ -D-木糖苷酶反應(yīng)； 水提人參多糖將人參與水按照重量比I:廣1:6的比例加水，煮沸f 3小時(shí)，過(guò)濾后，將人參實(shí)體按照重量比1:3 1:10的比例加水，煮沸廣3小時(shí)，過(guò)濾后合并兩次濾液； 醇沉法制備人參多糖采用95%的乙醇將上一步獲得的濾液中乙醇含量調(diào)至60、0%，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置廣3小時(shí)，過(guò)濾后取醇不溶物為人參多糖粗品； 超聲法提取人參皂甙取上一步獲得的濾液與步驟(3)獲得的人參實(shí)體合并，采用功率150 200瓦的超聲提取3(T75分鐘，過(guò)濾后取上清； 高Rg3含量人參皂甙提取物對(duì)上一步獲得的上清液在4(T60°C的條件下，減壓蒸餾獲得高Rg3含量人參皂甙提取物。
3.一種靈芝多糖的制備方法，其特征在于，加工工藝為 原料清洗及粉碎將靈芝實(shí)體水洗，去除表面附著泥沙，粉碎后，經(jīng)100目篩網(wǎng)獲得靈芝粉末； 糖苷酶水解靈芝粉浸沒于pH3. (Te. 0的緩沖液體系內(nèi)，以每千克原料o. no個(gè)酶活單位的比例，加a-L-巖藻糖苷酶反應(yīng)； 水提靈芝多糖將酶解后的靈芝粉與水按照重量比1:3 1:10的比例加水，采用功率150^200瓦的超聲提取3(T75分鐘，煮沸f 3小時(shí)，采用100目的濾布過(guò)濾后取濾液； 醇沉法制備靈芝多糖采用95%的乙醇將上一步獲得的濾液中乙醇含量調(diào)至60、0%，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置f 3小時(shí)，9000g離心后取沉淀部分為靈芝多糖粗品。
4.一種人參多糖及靈芝多糖組合物精制方法，其特征在于，加工工藝為 將權(quán)利要求I所述人參多糖粗品與權(quán)利要求2所述靈芝多糖粗品，按照重量比1:1的比例混合； 采用717型陰離子交換樹脂對(duì)上一步獲得的多糖混合物進(jìn)行脫色處理，樹脂與多糖的重量比為1:20，裝柱，多糖樣品溶于水后濕法上樣； 采用pH9. 0濃度為0. IM的碳酸氫鈉-碳酸鈉緩沖液作為洗脫液，收集洗脫液I萬(wàn)分子量超濾，冷凍干燥后獲得人參多糖及靈芝多糖純品。
5.按照權(quán)利要求I及權(quán)利要求2所述多糖制備方法，其特征在于，所述糖苷酶酶解工序中孵育反應(yīng)的溫度為25 45°C. 按照權(quán)利要求I及權(quán)利要求2所述多糖制備方法，其特征在于，所述糖苷酶酶解工序所采用緩沖液為醋酸-醋酸鈉、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉或枸櫞酸鹽水溶液。
6.一種藥用組合物，其中包含權(quán)利要求I所述高Rg3含量人參皂甙提取物以及權(quán)利要求3所述人參多糖及靈芝多糖純品，其質(zhì)量比為I: f 1:30。
7.權(quán)利要求廣6所述藥用組合物在調(diào)節(jié)免疫力的藥物或保健品種的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有人參多糖、高Rg3含量人參皂甙提取物及靈芝多糖的藥用組合物制備方法及其作為免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。將整棵人參經(jīng)過(guò)酶解、沸水回流、醇提、超聲等手段可同時(shí)獲得高Rg3含量的人參皂甙提取物以及人參多糖提取物。將靈芝經(jīng)過(guò)粉碎、酶解、沸水回流、超聲、醇提等手段高收率獲得靈芝多糖提取物。在此基礎(chǔ)上，混合獲得的人參多糖及靈芝多糖，經(jīng)一步陰離子交換層析除雜蛋白及色素，并按一定比例組合人參皂甙獲得藥用組合物。本方法所制備的藥用組合物具有工藝簡(jiǎn)單、免疫調(diào)節(jié)活性高、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/715GK102617893SQ20121009797
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者馮濤, 劉揚(yáng), 劉莉, 張延延, 金愛玉 申請(qǐng)人:吉林省宏久生物科技股份有限公司