專利名稱:一種耐酸高溫淀粉酶菌株及其生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法
一種耐酸高溫淀粉酶菌株及其生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法
發(fā)明領(lǐng)域
一種耐酸高溫淀粉酶菌株及其生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
高溫淀粉酶是最成功工業(yè)化應(yīng)用的酶制劑品種之一，這是由于酶促水解可在更大 程度上控制淀粉水解、反應(yīng)特異性和產(chǎn)物的穩(wěn)定性。溫和的反應(yīng)條件包括較低的反應(yīng)溫度、 接近中性的PH等，由此減少生產(chǎn)中能源的消耗、降低生產(chǎn)成本和環(huán)境污染，可提高產(chǎn)量并 帶來(lái)有益經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益等多種優(yōu)勢(shì)。
淀粉酶已被廣泛應(yīng)用于紡織行業(yè)的退漿、造紙行業(yè)淀粉漿的處理、食品行業(yè)如飴 糖、啤酒、黃酒、葡萄糖、味精、抗生素等行業(yè)；在洗滌劑工業(yè)中，與蛋白酶、脂肪酶一起添加 于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等，具有極廣泛的用途。
目前商品生產(chǎn)的中溫和高溫淀粉酶中，一般都在pH 4. 9-7. 5左右有效，在超出該 范圍后，活力下降很快。在食品行業(yè)，紡織行業(yè)以及造紙等行業(yè)由于不同發(fā)酵階段的PH變 化，使得淀粉酶的效率降低。目前根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)和專利總結(jié)如下
細(xì)菌菌株B-9545，最適酶解條件為50°C，pH 9. 0 (閆浩林、張惠麗等〈堿性淀粉酶 產(chǎn)生菌的篩選和產(chǎn)酶條件研究 >，微生物學(xué)雜志，1996，1 26 30)；
Bacillus subtilis 14140&14141，最適酶解條件為60 70°C、ρΗ 6·0(管斌、 謝來(lái)蘇、丁友芳、隆言泉，< 枯草芽胞桿菌A-淀粉酶高產(chǎn)菌株的選育 > 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 1997，23 (5) 88 92)；
耐堿芽袍桿菌9-Α2，最適酶解條件為50°C，pH 8. 0(賈士儒、趙樹(shù)欣、Frznco G · Tevec, <耐堿芽袍桿菌堿性淀粉酶研究1_菌種的分離與篩選 > 天津輕紡工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào) 1994,2 :1 6)；
芽袍桿菌(Bacillus) ZX99，最適酶解條件為60°C、pH 6. 0 (張應(yīng)玖、朱學(xué)軍、關(guān) 鍵、李吉平、薛雁，< 一種新型淀粉酶的鑒定及其產(chǎn)酶菌株的篩選 > 微生物學(xué)通報(bào)2002， 29(5) 38 41)；
嗜堿芽袍桿菌SX212，最適酶解條件為55°C，PH 9. 0 (馬曉軍、張曉君、楊玲、馮 清平，〈支鏈淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的研究〉蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2001， 37(6) 80 85)；
諾卡氏菌株Nocarlda sp 82，最適酶解條件為60°C，pH 7.0(王銀定、楊秀琴、 王建平，< 諾卡氏菌胞外β “淀粉酶的分離和鑒定 > 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)1997， 17(2) 41 45)；
Asp. oryzaevar. 30103，最適酶解條件為60°C，pH 5. 0 ；Rhi. niveus 4810，最適 酶解條件為60°C，pH 5. 0(管斌、謝來(lái)蘇、丁友芳、隆言泉，〈枯草芽胞桿菌A-淀粉酶高產(chǎn) 菌株的選育〉浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)1997，23 (5) :88 92)；
地衣芽袍桿菌A. 404，最適酶解溫度高于90°C ；(楊傻豪、胡學(xué)智，< 地農(nóng)芽袍桿菌A. 4041耐高溫淀粉酶的研究 > 維普資訊1997 286 289)；
地衣芽袍桿菌(Bacillus licheni/ormis) Js_S，最適酶解條件為90°C;(李佑紅、 吳衍庸，< 地衣芽袍桿菌JS-5 —淀粉酶的研究 > 微生物學(xué)報(bào)1998，29 (4) :314 316)；
枯草芽袍桿菌Bacillus subtilise 8631，其最適酶解條件為65C，pH5. 6 (姜涌 明、史永、隋德新，〈枯草芽袍桿菌86315 α-淀粉酶的研究II.分離提純、性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)〉江 蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)1992，13 (2) :47 5)；
米曲霉(Aspergillus oryzae)突變株6-193，其最適酶解條件為60°C，pH 5. 0
6.0 (孔顯良、王傻英、崔雅潔、姜面萍，< 米曲霉6-193 α -淀粉酶的純化和性質(zhì)的研究 > 微 生物學(xué)報(bào) 1991，31 (4) 274 280)；
嗜堿芽袍桿菌ΝΤ-3，其最適酶解條件為50°C，pH 9. 0 (田小群，〈嗜堿性芽袍桿菌 (Bacillus sp)NT-39及其所產(chǎn)堿性淀粉酶的初步研究〉武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)1992， 2 105 111)；
嗜堿單胞菌(alkalomonas amylolytics) N-10產(chǎn)生的α -淀粉酶，其最適酶解條 件為50°C，pHIO (馬延和、薛燕芬、竇岳坦，< 一種堿性α -淀粉酶、其編碼基因及用途 > 專 利公開(kāi)號(hào)CN1500870A)；
古細(xì)菌芝田硫化葉茵B(yǎng)i，其最適酶解條件為60°C (劉莉、吳襟、陳煒、張樹(shù)政，〈芝 田硫化葉菌新型α-淀粉酶基因工程菌表達(dá)條件的優(yōu)化〉中國(guó)生物工程雜志2003，23(1) 70 74)；
古細(xì)菌Pyrococcus furious，其最適酶解條件為95°C，pH 5. 0(沈微、王正祥，< 古細(xì)菌pyrococcus furious嗜熱α -淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達(dá) > 食品與發(fā)酵工業(yè) 2002，29 (3) 10 14)；
Thermomucor indicae—seudaticae，最適酶解條件為60 °C、pH
7.O(SanjeevKumar and Τ. Satyanarayana Purification and Kinetics of a Raw Starch-HydroIyzing, Thermostab le, and Neutral Clucoamylase of the Thermophilic Mold Thermomucorindicae-seudaticae Biotechnol. Prog. 2003,19,936 944)；
Bacteroides amylophiIus 70，最適酶解條件為43 "C pH 6. 3 (Steven J.Mcwethy Paul A.Hartman Purification and Some Properties of an Ext-racelIularAlpha-AmyIase from Bacteroides amylophiIusl Journal of Bacteriology, Mar. 1977, p.1537 1544)；
Thermomonospora curvata,最適酶角軍條件為65°C,pH 6· O (FredStutz-enberger Rick Carnel Amylase Production by Thermomonospora curvataApplied and Enyromental Microbiology, Aug. 1977,p.234 236)；
B. stearothermophilusl518，最適酶解條件為60°C ；B. coagulans 43P 最適酶解 條件為70°C ;Bacillus stearothermophilus ATCC 7954，最適酶解條件為90°C (Paul A. Hartman Ralph ffellerson, JR. P. A. Tetrault BacilIusStearothermophilusl. -Therma 1 and pH Stability of the Amylase July 16,1954)；
Bcillus subtilis strain W23&B. Amyloliquefaciens strain F, M Bl I 條件為 65 "C (N. Ε. WELTER ' AND L.LEON CAMPBELL Comparison of the a Amylase ofthe α-Amylase of Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens JOURNAL
4OFBACTERIOLOGY，Oct. 1967，p.1131 1135)；
Bacillus species NRRLB-3881，最適酶解條件為 50°C，pH 9. 5 (Ε. W. BO-YERAND Μ. B.INGLE Extracellular Alkaline Amylase from a Bacillus SpeciesJOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 1972，p.992 1000)；
Thermomonospora curvata,最適酶解 條件為 65 °C，pH 6. O (J. L. GLYMPHAND. J.STUTZENBERGER Production, Purification, and Characterizat-ion of α -Amylase from Thermomonospora curvata APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY, Oct. 1977， P. 391 397)；
Halobacteriumhalobium，最適酶解條件為 55°C，pH 6. 6 (WENDYA. GOODAND PAUL A. HARTMAN Properties of the Amylase from Halobacteriumha-Iobium JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Oct. 1970，p.601 603)；
利用芽袍桿菌NCIMB40916的淀粉酶基因構(gòu)建的基因工程生產(chǎn)菌，產(chǎn)生的堿性淀 粉酶最適酶解條件為55°C，pH 9. 5(赫勒·奧特拉普比賈恩· R ·尼爾森，< 堿性芽抱桿菌 淀粉酶 > 專利公開(kāi)號(hào)CN1399676A)；
而耐酸pH 3. 8-6. 5有效的菌種以及酶制劑尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耐酸高溫淀粉酶菌株及其生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法， 通過(guò)對(duì)原有地衣芽孢桿菌系統(tǒng)的復(fù)合誘變，保藏、復(fù)壯，及選育，得到一株產(chǎn)耐酸高溫淀粉 酶的細(xì)菌，再經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基配方優(yōu)化及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，建立了生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方 法，生產(chǎn)出的高溫淀粉酶具有良好的耐酸活性。
本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的細(xì)菌，分類命名為地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)BL-mut 08，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M 207193。
利用所述菌種生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法，采用地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)BL-mut 08為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)和后處理 以后得到耐酸高溫淀粉酶溶液，
斜面培養(yǎng)基以g/L計(jì)為牛肉汁3-6，蛋白胨5-15，酵母粉1-5，NaCl 1_5，淀粉 5-15，葡萄糖20-80，瓊脂15-25 ；培養(yǎng)溫度30_40°C，培養(yǎng)時(shí)間20_40h ；
搖瓶培養(yǎng)基以g/L計(jì)為豆餅粉20-50，棉籽餅粉20-50，(NH4)2SO4I-IO, CaCl2O. 2-1. 0，玉米漿15-40，乳糖100-200，檸檬酸鈉1-10，磷酸氫二鉀10-20，磷酸二氫鉀 5-10 ；培養(yǎng)溫度30-42°C，培養(yǎng)時(shí)間20-40h ；
種子培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)基以g/L計(jì)為葡萄糖50-100，酵母粉10_50，棉籽餅粉 5-20，硫酸銨2-6，檸檬酸鈉2-10，CaCl2O. 2-0. 9，聚醚消泡劑0. 2-0. 8，磷酸氫二鉀4_10， 磷酸二氫鉀1-10 ；培養(yǎng)條件種子罐體積500L，60%裝料量；發(fā)酵溫度30-4(TC ；通風(fēng)量 0. 2-1. Ovvm ；罐壓0. 2 1. Okg/cm2 ；時(shí)間 20_40h ；
液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)基以g/L計(jì)為葡萄糖50-100，酵母粉10_50，棉籽餅 粉5-20，硫酸銨2-6，檸檬酸鈉2-10，CaCl2O. 2-0. 9，玉米漿15-50，聚醚消泡劑0. 2-0. 8，磷 酸氫二鉀4-10，磷酸二氫鉀1-10 ；培養(yǎng)條件使用5噸發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，60%裝料量，發(fā)酵 溫度 30-400C，通風(fēng)量 0. 2-1. Ovvm,罐壓 0. 2 1. Okg/cm2,時(shí)間 40_80h。[0039]后處理過(guò)程為液態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過(guò)絮凝，壓濾，濾液超濾濃縮，收集濃縮液，即為耐酸 高溫淀粉酶溶液；
(1)絮凝液態(tài)發(fā)酵后加入放罐發(fā)酵液重量35% -45%的水，加入放罐發(fā)酵液重 量5% -10%的CaCl2，用含12%質(zhì)量濃度的NaOH溶液和7%質(zhì)量濃度的石灰水溶液調(diào)pH 9. 5-10.0，加入陽(yáng)離子聚丙烯酰氨，使體系中陽(yáng)離子聚丙烯酰氨濃度為50mg/kg，加入放罐 發(fā)酵液重量的糊精，加熱到60°C，保溫?cái)嚢?0min ；
(2)壓濾板框過(guò)濾；
(3)濾液超濾濃縮濾液用截留分子量為IOOOODa的中空纖維管式超濾膜濃縮，濃 縮至放罐發(fā)酵液重量的50%，經(jīng)測(cè)定，酶活為10000-25000u/mL。測(cè)定方法QB/T 2306-97 耐高溫α-淀粉酶制劑的測(cè)定方法。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)BL-mut 08，保藏編號(hào)為 CCTCC NO. M207193，通過(guò)對(duì)原有地衣芽 孢桿菌系統(tǒng)的的復(fù)合誘變，保藏、復(fù)壯，及選育方法而獲得，再經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基配方優(yōu)化及發(fā)酵 工藝條件優(yōu)化，建立了生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法，于37°C，空氣培養(yǎng)72小時(shí)左右達(dá)到產(chǎn) 酶高峰，經(jīng)過(guò)絮凝處理，壓濾，超濾濃縮得到濃縮酶液或通過(guò)其他后處理加工方式得到不同 的淀粉酶制劑，如微丸，顆粒和粉劑。生產(chǎn)的高溫淀粉酶具有良好的耐酸活性，可廣泛用于 食品、醫(yī)藥行業(yè)，特別如酒精發(fā)酵、味精、抗生素等行業(yè)以及紡織、造紙業(yè)。
生物材料樣品保藏
地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BL-mut 08，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏單位簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏日期為2007年12月6日，保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 207193。


圖1耐酸高溫淀粉酶產(chǎn)品使用時(shí)不同pH條件下的相對(duì)酶活(％ )。 具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施，不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1
斜面配方(以g/L計(jì)算)牛肉汁4、蛋白胨10、酵母粉3、NaC13、淀粉10、葡萄糖 50、瓊脂15-25 ；培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)時(shí)間:30h ；
搖瓶配方(以g/L計(jì)算)豆餅粉40、棉籽餅粉30、(NH4) 2S045、CaCl2O. 5、玉米漿 30、乳糖150、檸檬酸鈉5、磷酸氫二鉀15、磷酸二氫鉀7、培養(yǎng)溫度40°C、培養(yǎng)時(shí)間30h ；
種子罐配方(以g/L計(jì)算)葡萄糖75、酵母粉30、棉籽餅粉15、硫酸銨5、檸檬酸 鈉8、CaCl2O. 5、P. P. E.(聚醚消泡劑)0. 5、磷酸氫二鉀7、磷酸二氫鉀7、發(fā)酵溫度35°C，通 風(fēng)量0. 8vvm，罐壓0. 8kg/cm2，時(shí)間36h，種子罐體積:500L，60%裝料量。
生產(chǎn)罐配方(以g/L計(jì)算)葡萄糖75、酵母粉30、棉籽餅粉15、硫酸銨4、檸檬酸 鈉8、CaCl2O. 7、玉米漿40、P. P. E.(聚醚消泡劑)0. 6、磷酸氫二鉀6、磷酸二氫鉀8、發(fā)酵溫 度35°C，通風(fēng)量0. 8vvm，罐壓0. 8kg/cm2時(shí)間60h，使用5噸發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，60%裝料 So
液態(tài)發(fā)酵后加入放罐發(fā)酵液重量40. 5%水，加入放罐發(fā)酵液重量8%的CaCl2，用 含12%質(zhì)量濃度的NaOH溶液和7%質(zhì)量濃度的石灰水溶液調(diào)pH 9. 85，加入陽(yáng)離子聚丙烯酰氨，使體系中陽(yáng)離子聚丙烯酰氨濃度為50mg/kg，加入放罐發(fā)酵液重量1. 5%的糊精， 加熱到60°C，保溫?cái)嚢?0min，然后板框過(guò)濾，濾液用截留分子量為IOOOOD a的中空纖維管 式超濾膜濃縮，濃縮至放罐發(fā)酵液重量的50%左右，經(jīng)測(cè)定，酶活為19553U/mL，測(cè)定依據(jù) QB/T 2306-97耐高溫α -淀粉酶制劑的測(cè)定方法。
權(quán)利要求
一株產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的細(xì)菌，分類命名為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BL mut 08，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 207193。
專利摘要
一種耐酸高溫淀粉酶菌株及其生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BL-mut 08，保藏編號(hào)為CCTCC NOM207193，通過(guò)對(duì)原有地衣芽孢桿菌系統(tǒng)的復(fù)合誘變，保藏、復(fù)壯，及選育方法而獲得，再經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基配方優(yōu)化及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，建立了生產(chǎn)耐酸高溫淀粉酶的方法，于37℃，空氣培養(yǎng)72小時(shí)左右達(dá)到產(chǎn)酶高峰，經(jīng)過(guò)絮凝處理，壓濾，超濾濃縮得到濃縮酶液或通過(guò)其他后處理加工方式得到不同的淀粉酶制劑，如微丸，顆?；蚍蹌?。生產(chǎn)的高溫淀粉酶具有良好的耐酸活性，可廣泛用于食品、醫(yī)藥行業(yè)，特別如酒精發(fā)酵、味精、抗生素等行業(yè)以及紡織、造紙業(yè)。
文檔編號(hào)C12N1/20GKCN101514327 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810020635
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2008年2月19日
發(fā)明者周偉峰, 王清聲, 陶丁偉, 魏晨飛 申請(qǐng)人:無(wú)錫德冠生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2),