專利名稱：一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 68)是一類能夠水解α _1，6葡萄糖苷鍵的淀粉脫支酶，該酶能夠水解糖原、支鏈淀粉、α-極限糊精和β-極限糊精，水解產(chǎn)物為線性麥芽寡糖。盡管植物和微生物都能夠產(chǎn)生異淀粉酶，但是由于微生物具有生長迅速、操作簡單及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，所以商業(yè)化的異淀粉酶一般是由微生物生產(chǎn)的。異淀粉酶產(chǎn)生菌株研究的最多的是假單胞菌O^eudomonas. sp.)，其次是其它細(xì)菌和真菌。不同來源的異淀粉酶具有不同的底物特異性、水解產(chǎn)物、最適PH、最適溫度等。異淀粉酶主要用于水解淀粉生產(chǎn)食品添加劑，如高葡萄糖漿、麥芽糖、海藻糖、環(huán)糊精和抗性淀粉等。由于異淀粉酶在淀粉水解中的巨大應(yīng)用潛力，國內(nèi)外都對異淀粉酶進(jìn)行了大量的研究。Harada等研究發(fā)現(xiàn)I^seudomonas. sp.來源的異淀粉酶的最適pH在5到6之間。 Olemposka-Beer等報道了 Pseudomonas amyloderaosa來源的異淀粉酶最適pH在3到5之間。而芽孢桿菌來源的異淀粉酶的最適PH差異較大，有的最適pH是酸性的在PH 5.0，有的是堿性的PH9.0.酵母來源的異淀粉酶最適pH—般在6. O到7. O。在熱穩(wěn)定性方面，不同來源的異淀粉酶也有較大差異。酵母來源的異淀粉酶熱穩(wěn)定性較差，而假單胞菌來源的異淀粉酶一般具有較好的熱穩(wěn)定性，Yokobayashi等報道了一種來源于假單胞菌的異淀粉酶在 45°C具有較好的穩(wěn)定性，但是當(dāng)溫度達(dá)到60°C時就會迅速失活。工業(yè)上淀粉水解過程往往在酸性和較高溫度(50到60°C)下進(jìn)行。而同時具有在酸性和較高溫度下具有較好活性的異淀粉酶往往更少。目前唯一商業(yè)化的異淀粉酶是由日本林原株式會社生產(chǎn)的，其生產(chǎn)菌種是經(jīng)過誘變改良的I3Seudomonas amyloderaosa，該菌株發(fā)酵單位達(dá)到5100U/mL。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的異淀粉酶在大腸桿菌或酵母中得到了成功表達(dá)，但是目前發(fā)酵水平較低、成本較高，無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。如Chen等將來源于I^seudomonas amyloderaosa的異淀粉酶編碼基因在釀酒酵母中成功表達(dá)，發(fā)酵4天酶活達(dá)到86U/mL。環(huán)糊精(Cyclodextrins，通常簡稱為⑶)，是一類由淀粉或多糖在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵首尾相連的環(huán)狀化合物的總稱，常見的有6、7和8個葡萄糖單元的分子，分別稱為α-、β-和Y-環(huán)糊精。由于 α -環(huán)糊精溶解度較大，所以化學(xué)法制備比較困難，而且會對環(huán)境造成較大污染，生物法目前被認(rèn)為是極具應(yīng)用潛力的方法。目前生物法生產(chǎn)α-環(huán)糊精的工藝一般是采用α-淀粉酶對淀粉進(jìn)行部分液化，然后加入α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)制備α-環(huán)糊精。由于淀粉中原料含有75-85%的支鏈淀粉，支鏈淀粉是高度分支的多糖，其結(jié)構(gòu)中每隔 1718個葡萄糖單位就有一個由α _1，6糖苷鍵構(gòu)成的分支點(diǎn)。而α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶沒有α-1，6糖苷鍵水解活性，其難以越過α _1，6糖苷鍵，導(dǎo)致周期長、淀粉利用率不高， 目前采用這種工藝時α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率往往在50%左右。由于淀粉脫支酶能夠切斷淀粉中的分支點(diǎn)，加速后續(xù)酶的反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間，提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，從而增加產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本。Rendleman等報道先采用脫支酶(包括普魯蘭酶和異淀粉酶)對蠟質(zhì)玉米支鏈淀粉進(jìn)行脫支，再加入α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在 15°C反應(yīng)5天，可以使轉(zhuǎn)化率達(dá)到76%。Ivan Pishtiyski等采用普魯蘭酶對馬鈴薯淀粉、 玉米淀粉等進(jìn)行脫支后再采用酶轉(zhuǎn)化20小時制備環(huán)糊精，發(fā)現(xiàn)玉米淀粉濃度為2. 5%時轉(zhuǎn)化率最高，為65%。然而這些工藝存在原料太貴或底物濃度太低，反應(yīng)周期較長等嚴(yán)重問題，因此難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌，是以攜帶重組質(zhì)粒表達(dá)耐熱異淀粉酶基因的大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述基因工程菌的方法，通過克隆 Tfu_1891 編碼基因(Genbank 登錄號 NC_007333. 1)到 pT7_7 載體，以 E. coli BL21 (DE3) 為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了酸性耐熱異淀粉酶的高效表達(dá)。所述重組質(zhì)粒為pUC系列，pET系列，ρΤ7_7，或pGEX中的任意一種。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種α -環(huán)糊精的生產(chǎn)的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟按照5-20%的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在50-90°C條件下保溫5-15分鐘；調(diào)節(jié)溫度 300C -60°C，調(diào)pH5. 0-6. 0后，按照每克淀粉加入2-100U的異淀粉酶和10-100個單位的 α -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，加入5%體積的有機(jī)溶劑后，充分反應(yīng)4-10小時；回收有機(jī)溶劑，采用結(jié)晶方法得到α-環(huán)糊精。所述異淀粉酶是與α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶同步添加，二種酶同時作用于淀粉達(dá)到脫支、環(huán)化同步進(jìn)行。此外，異淀粉酶可以先添加先對淀粉進(jìn)行部分脫支，再添加α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。所述的有機(jī)溶劑為乙醇，異丙醇，正丁醇，正癸醇中任一種。本發(fā)明提供的基因工程菌產(chǎn)酶活性高，達(dá)到3185U/mL，其應(yīng)用于α _環(huán)糊精的制備酸性耐熱異淀粉酶具有淀粉支鏈水解活性，最適溫度為50°C，最適ρΗ 5. 5，在50°C下保溫30h，酶活仍達(dá)50%以上。按照5-20%的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在50-90°C條件下保溫5_15 分鐘；調(diào)節(jié)溫度30°C -60°C，調(diào)pH5. 0-6. 0后，按照每克淀粉加入2-100U的酸性耐熱異淀粉酶和10-100個單位的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，加入5% (ν/ν)的有機(jī)溶劑后，充分反應(yīng) 4-10小時，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率達(dá)到76. 95%，為目前國內(nèi)外文獻(xiàn)公開報道最高水平。


圖1酸性耐熱異淀粉酶分離純化SDS-PAGE圖。1、Sephadex G50純化后樣品；2、DEAE-Sepharose純化后樣品；Μ、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。圖2酸性耐熱異淀粉酶最適溫度。圖3酸性耐熱異淀粉酶最適ρΗ。圖4酸性耐熱異淀粉酶熱穩(wěn)定性。圖5酸性耐熱異淀粉酶ρΗ穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 基因工程菌的構(gòu)建1、根據(jù)NCBI上登錄的Tfu_1891的基因序列(Genbank號NC_007333. 1)，采用化學(xué)全合成方法合成耐熱異淀粉酶基因序列，克隆到PMD18-T simple載體(商業(yè)化工具載體)， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。經(jīng)37°C 培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8 IOh后提取質(zhì)粒，命名為Tfu_1891/pMD18-T simple，將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明插入片段為一個21Mbp的DNA片段，編碼一個含有708個氨基酸的蛋白質(zhì)。2、用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pT7-7，帶有T7啟動子。將pT7_7質(zhì)粒和 Tfu_1891/pMD18-T simple分別進(jìn)行Nde I和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用 T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37°C培養(yǎng)他，挑轉(zhuǎn)化子在含有 100mg/L氨芐青霉素液體的LB中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證得到表達(dá)質(zhì)粒Tfu_1891/ pT7-7。3、將質(zhì)粒Tfu_1891/pT7_7轉(zhuǎn)化Ε. coliBL21(DE3)宿主菌，涂布含氨芐青霉素 (100mg/L)的LB平板上，37°C培養(yǎng)他。挑單菌落至液體LB中，37°C培養(yǎng)過夜，保存甘油管。實(shí)施例2 發(fā)酵生產(chǎn)異淀粉酶將甘油管菌株轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基中37°C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB (甘油5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 Mg/L，K2HPO412. 54g/L, KH2P042. 31g/L)發(fā)酵液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至 OD 達(dá) 0. 6后用終濃度0. 01 μ M異丙基硫代- β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)，恒溫或降溫至25°C培養(yǎng)36到 48小時，離心菌體，用pH5. 50. IM磷酸-檸檬酸緩沖液懸浮細(xì)胞，超聲破碎，離心后測定上清液中異淀粉酶活力，重組異淀粉酶發(fā)酵活力達(dá)到3185U/mL。實(shí)施例3 重組異淀粉酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)將超聲破碎的上清液于4°C，40000Xg離心20min除去細(xì)胞碎片。向上清液中加入20 %固體硫酸銨鹽析過夜，4°C，40000 X g離心20min，取沉淀物用適量pH 5. 5，20mM磷酸-檸檬酸緩沖液溶解，通過0.4μπι膜過濾后制成上樣樣品。經(jīng)過DEAE-kpharose陰離子交換樹脂純化后樣品再加G50純化后得到電泳純的異淀粉酶，純化過程中蛋白SDS-PAGE電泳圖見圖1。將重組異淀粉酶進(jìn)行不同底物水解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它可水解糯玉米支鏈淀粉，不能水解糖原和普魯蘭多糖，結(jié)果表明重組異淀粉酶編碼基因?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)。酸性耐熱異淀粉酶的最適溫度為50°C (圖2)，最適pH5. 5 (圖3)，在50°C條件下，半衰期可達(dá)30h (圖4)。實(shí)施例4 α -環(huán)糊精的生產(chǎn)本實(shí)施例采用酸性耐熱異淀粉酶對淀粉先部分脫支再加入α -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行環(huán)化。按照5-20%的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在50-90°C條件下保溫5_15分鐘；調(diào)節(jié)溫度 300C -600C，調(diào)pH5. 0-6. 0后，按照每克淀粉加入2-100U的酸性耐熱異淀粉酶，反應(yīng)2_6小時。然后按每克淀粉加入10-100個單位的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，加入5% (ν/ν) 的正癸醇后，再充分反應(yīng)4-10小時，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率達(dá)到74.5%，其中α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率 59. 6%。
實(shí)施例5 α -環(huán)糊精的生產(chǎn)本實(shí)施例采用酸性耐熱異淀粉酶和α -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶同時轉(zhuǎn)化淀粉制備α-環(huán)糊精。按照5-20%的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在50-90°C條件下保溫5_15分鐘；調(diào)節(jié)溫度 300C -60°C，調(diào)pH5. 0-6. 0后，按照每克淀粉加入2-100U的酸性耐熱異淀粉酶和10-100個單位的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，再加入5% (ν/ν)的正癸醇后，充分反應(yīng)4-10小時，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率達(dá)到76. 9%，其中α -環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率61. 7%。
權(quán)利要求
1.一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌是以攜帶重組質(zhì)粒表達(dá)耐熱異淀粉酶基因的大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述重組質(zhì)粒為PUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一種。
3.構(gòu)建權(quán)利要求1或2所述基因工程菌的方法，其特征在于克隆Tfu_1891編碼基因， Genbank登錄號NC_007333. 1到pT7_7載體，以Ε. coli BL21(DE3)為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了酸性耐熱異淀粉酶的高效表達(dá)。
4.權(quán)利要求1所述基因工程菌應(yīng)用于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)，其特征在于按照5-20%的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在50-90°C條件下保溫5-15分鐘；調(diào)節(jié)溫度30°C -60°C，調(diào)pH5. 0-6. 0后， 按照每克淀粉加入2-100U的異淀粉酶和10-100個單位的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，加入5%體積的有機(jī)溶劑后，充分反應(yīng)4-10小時；回收有機(jī)溶劑，采用結(jié)晶方法得到α-環(huán)糊 Ib ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述異淀粉酶是與α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶同步添加，二種酶同時作用于淀粉達(dá)到脫支、環(huán)化同步進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的異淀粉酶可以先添加先對淀粉進(jìn)行部分脫支，再添加α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為乙醇，異丙醇，正丁醇，正癸醇中任一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用化學(xué)合成獲得異淀粉酶Tfu_1891編碼基因序列，以pT7-7為表達(dá)載體，以E.coli BL21(DE3)為表達(dá)宿主，在工業(yè)級發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過誘導(dǎo)重組異淀粉酶發(fā)酵活力達(dá)到3185U/mL。該重組酶具有淀粉α-1，6葡萄糖苷鍵水解活性，最適溫度為40～50℃，最適pH 5.5，在50℃下保溫30h，酶活仍保留50％以上。重組酶具有淀粉脫支活性，能水解淀粉中支鏈淀粉形成直鏈淀粉，該酶與α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)配使用可以顯著提高環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率，適合環(huán)糊精的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/56GK102559568SQ20111045913
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者吳敬, 段緒果, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學(xué)