專利名稱：從人類早期流產(chǎn)的胎兒組織分離純化和培養(yǎng)增殖全能干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化干細胞的方法，具體的說，該方法能夠從早期 流產(chǎn)的胎兒組織，包括胎兒的臍帶或腸組織中分離純化和培養(yǎng)增殖全能干細 胞。
背景技術(shù)：
對因各種因素所造成的人體組織器官缺損和功能障礙的疾病，如帕金森 氏病、糖尿病、外傷性脊髓損傷、細胞變性病、燒傷、心肌病和骨損傷等， 現(xiàn)代醫(yī)學尚無有效的治療方法。但隨著干細胞的發(fā)現(xiàn)和近年來對干細胞研究 的不斷深入和發(fā)展，為治愈這些疾病帶來了新的希望。因此，人類干細胞的 研究己成為繼人類基因組計劃后，生命科學中最活躍的研究領(lǐng)域；也將是人 類疾病治療模式劃時代的革新(Guillot etal. 2007; Bajada et al. 2008)。
干細胞是一種來自胚胎、胎兒或成人組織器官中具有持久或終身自我更 新能力的細胞。它能產(chǎn)生特異的細胞類型，形成人體組織和器官。根據(jù)個體 發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細胞可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells)和成體干細胞(adult stem cell)。根據(jù)干細胞分化的能力又可將干 細胞分為全能干細胞(pluripotent stem cell),全能干細胞(multipotent stem cell)禾口專會b干細胞 (unipotent stem cell)。
成體干細胞是指從兒童和成人組織中存在的全能干細胞和專能干細胞 (Young and Black . 2004)。成體千細胞可從患者自身獲得，從而不存在組 織相容性的問題。但成體干細胞的增殖能力和向多系分化的效率很不理想。 比如，從新生兒臍帶血收集的造血干細胞在體外無法大量增殖，其數(shù)量僅能 用于兒童的治療(Rogers and Casper .2003)。
人胚胎干細胞則是一種全能干細胞。體內(nèi)和體外的研究都表明胚胎干 細胞能分化成人體的絕大多數(shù)細胞類群，諸如神經(jīng)細胞、心肌、骨骼肌、內(nèi) 皮細胞、胃腸組織、肝細胞、胰島e—細胞、骨、軟骨、造血細胞等。與成 體干細胞相比，胚胎干細胞具有無限的增殖能力，能為細胞、組織或器官的 移植治療提供無限的來源(Pera and Trounson. 2004)。但從胚泡僅能獲得 200-250個細胞；而且，胚胎干細胞的研究受阻于倫理、道德、法律等問題。 最近，美國和日本的兩組科學家分別宣稱利用"再程序化"技術(shù)成功地誘導(dǎo)人皮膚細胞生成胚胎樣干細胞系。研究人員認為這.一發(fā)明最終會解決干細胞
的來源，結(jié)束胚胎干細胞倫理學之爭(Takahashi and Yamanaka . 2006; Yu etal. 2007)。但是，從成體細胞來源的干細胞與胚胎干細胞有顯著的不同。 這些誘導(dǎo)多效性干細胞系只是具有人胚胎干細胞的基因表達特點，在體外小 規(guī)模增殖幾個月，能誘導(dǎo)生成幾種功能細胞。但在很多特性上與胚胎干細胞 相去甚遠(Chan and Harris. 2008)。因此，從新的途徑尋找新的自然全能 干細胞來源，同時又避免干細胞倫理學之爭，是現(xiàn)今干細胞研究和臨床應(yīng)用 的發(fā)展方向之一。
間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是具有自我更新能力且 能向多個方向分化的干細胞。MSC最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中。當前用于基礎(chǔ)和臨床 研究的MSC主要來源于骨髓。但是，成人骨髓中MSC的含量極低(0.01% 0.001%)，并且其數(shù)量隨人的年齡增長而下降。進一步的研究證實除骨髓外， 在外周血、羊膜液、胎盤、臍帶血、脂肪、關(guān)節(jié)滑膜、骨骼肌和皮膚的結(jié)締 組織等多種組織中均發(fā)現(xiàn)有MSC的存在(Anker etal. 2003; et al. Romanov et al 2003; Lee et al. 2004; McElreavey et a1.1991)。石開究還表明: 這類干細胞像其它成人干細胞一樣，可以自身增殖，能夠分化成間質(zhì)細胞系， 而且可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經(jīng)元等(Wang et al.2004; Mitchell et al. 2003)。但這類干細胞不表達胚胎干細胞特有 的細胞表面標志物，也無形成胚胎體(embryonic bodies, EB)的能力。因 此，不完全具有胚胎干細胞的特點。
從胚胎著床到懷孕第十二周，稱之為妊娠第一周期。在此期間，胎兒各 種組織器官基本成型，但仍處于早期發(fā)育階段。不管科技如何發(fā)達，也不管 人們?nèi)绾握J識，自然流產(chǎn)或人工流產(chǎn)總是難以避免，我們假設(shè)從早期流產(chǎn) 的胎兒組織分離純化出的干細胞比從出生后分離出的干細胞可能具有全能干 細胞的潛力。早期流產(chǎn)的胎兒組織是一種醫(yī)源性廢棄物，從早期流產(chǎn)的胎兒 組織尋找自然全能干細胞則是利用已經(jīng)死亡的胎兒，不存在摧毀活體胚胎的 問題，即所謂的干細胞的倫理學問題。
關(guān)鍵是，如何找到一種方法，可以比較方便地從妊娠一期人工流產(chǎn)的胎 兒組織中成功地分離純化出干細胞并且穩(wěn)定保持干細胞的未分化狀態(tài)。當這 種方法能夠方便可靠地從不同的早期流產(chǎn)胎兒組織中分離純化、冷凍保存和 復(fù)蘇全能干細胞時，建立全能千細胞庫就成為可能，也就為干細胞移植治療 各種人體組織器官缺損和功能障礙的疾病，如帕金森氏病、糖尿病、外傷性 脊髓損傷、細胞變性病、燒傷、心肌病和骨損傷等，帶來希望。

發(fā)明內(nèi)容
5為此，我們釆用一種相對簡單的方法從妊娠一期人工流產(chǎn)的胎兒組織成 功地分離純化出干細胞。
本發(fā)明分離純化來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細胞的方法包括a、 收集妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品；b、從步驟a的樣品中分離獲 得胎兒臍帶或腸組織；c、從步驟b的胎兒臍帶或腸組織中得到胎兒臍帶或腸 組織細胞；d、從步驟c得到的胎兒臍帶或腸組織細胞中分離純化表達胚胎干 細胞標志物OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81的干細胞，這些 干細胞可以形成胚胎體。
本發(fā)明的方法還包括e、凍存步驟d得到的純化干細胞；f、復(fù)蘇凍存 的純化干細胞。 ^
本發(fā)明方法還包括維持這些干細胞處于未分化狀態(tài)。
本發(fā)明方法首先是收集妊娠一期流產(chǎn)的各種胎兒組織。組織的收集是通 過人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)的方法。然后從收集到的這些醫(yī)源性廢物中找尋胎兒 臍帶或腸組織。找到這些組織后，對這些組織進行處理。其步驟包括用膠原 酶消化這些組織來獲取這些組織的細胞。然后用生理鹽水洗滌分離的細胞。 任何類型的膠原酶如果能消化這些組織來獲取這些組織的細胞均可采用；比 如lmg/ml的I型膠原酶。
更具體的，本發(fā)明方法步驟a所述的妊娠第一周期流產(chǎn)胎兒組織為妊娠 8周至12周人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織。
在步驟c中，先將胎兒臍帶或腸組織用滅菌的生理鹽水洗滌，再剪成小 塊，用膠原酶消化至細胞成分離狀態(tài)后，離心獲得細胞沉淀，用生理鹽水洗 滌備用。
步驟d中分離純化干細胞時，可以采用層析柱純化的方式，先用免疫磁 珠技術(shù)將表達OCT—4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60禾卩/或TRA-1-81的干細胞 純化(Durcova et al. 1998)，再將洗脫的干細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)， 得到純化的干細胞株。
也可以采用體外傳代培養(yǎng)的方式純化干細胞，將步驟c得到的胎兒臍帶 或腸組織細胞用干細胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)條件為，在.37°C 和5%0)2的條件下培養(yǎng)3-7天或細胞增殖約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積的70% 以上，轉(zhuǎn)移傳代至少5次，得到純化的干細胞。
所述的干細胞培養(yǎng)液由體積百分含量88X的a-MEM培養(yǎng)基，10%的胎牛 血清或bFGF(O. lng/ml)， 1%的100 X青/鏈霉素，1%的100X 二性酶素B 組成。其它的培養(yǎng)液或培養(yǎng)條件，如能維持細胞的活力亦可采用。
干細胞是具有持久或終身自我更新能力的細胞；而其它組織細胞在體外 培養(yǎng)一段時間后將自然死亡。細胞體外培養(yǎng)換代的方法包括首先將已增殖至約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積70%以上的細胞用磷酸緩沖液洗滌；然后用胰
蛋白酶-EDTA溶液處理，將生長時粘貼在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部的細胞懸浮； 將這些懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至離心管，離心分離；再用新鮮的培養(yǎng)液將細胞重新 懸浮并稀釋；最后將稀釋的胎兒組織細胞重新放置到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿， 用干細胞培養(yǎng)液在5%的C02和37°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每3-5天換新鮮培 養(yǎng)液一次，直至細胞增殖至約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積的70%以上。再重復(fù) 上述步驟到培養(yǎng)中的細胞顯示一致的類似纖維細胞形態(tài)學特征。其它的培養(yǎng) 液或培養(yǎng)條件，如能維持細胞的活力亦可采用。
維持這些干細胞處于未分化狀態(tài)的方法包括上述的干細胞培養(yǎng)液，或在 無血清的干細胞培養(yǎng)液中加入某些細胞因子，如堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF)，在5%的C02和37。C的條件下 培養(yǎng)。其它的培養(yǎng)液或培養(yǎng)條件，如能維持細胞的未分化狀態(tài)亦可采用。
冷凍儲藏分離純化后并培養(yǎng)增殖的干細胞的方法則是首先將已增殖至約 占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積70%以上的細胞用磷酸緩沖液洗滌；然后用胰蛋白 酶-EDTA溶液處理，將生長時粘貼在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部的細胞懸浮；將這 些懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至離心管，離心分離。再將分離的干細胞放置4°C，然后 用干細胞儲藏液重新懸浮，轉(zhuǎn)移至冷凍儲藏管。將裝有千細胞的冷凍儲藏管 放置于-70°C， 24小時，最后將裝有干細胞的冷凍儲藏管轉(zhuǎn)移至液氮罐長期儲 藏。干細胞儲藏液含有40%的胎牛血清，5(F。的a-MEM培養(yǎng)基和1CF。的DMS0。 其它的干細胞儲藏液如能維持細胞的活力亦可采用。
解凍儲藏干細胞的方法是將裝有干細胞的冷凍儲藏管從液氮罐取出，立 即放置在37。C解凍；然后離心分離；并用磷酸緩沖液洗滌。再將解凍的細胞 放置在培養(yǎng)瓶或培，養(yǎng)皿用干細胞培養(yǎng)液，在5%的C02和37°C的條件下培 養(yǎng)24小時。然后，置換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)在5%的C02和37C。的條件下培 養(yǎng)；每3-5天換新鮮培養(yǎng)液一次。其它的培養(yǎng)液或培養(yǎng)條件，如能恢復(fù)儲藏 干細胞的活力亦可采用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細胞， 是由權(quán)利要求1所述的方法分離得到的。這些分離純化的干細胞能夠表達未 分化的胚胎干細胞表達的胚胎干細胞標志物，如0CT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-和TRA-1-81;以及某些轉(zhuǎn)錄因子，如OCT-4 ， Telemerase和Nanog; 并能形成胚胎體。
這些分離純化的干細胞能夠在一定的體外培養(yǎng)條件下定向分化成各種不 同類型的細胞，如心肌細胞，神經(jīng)細胞，胰島P-細胞或骨細胞。
這些能夠定向分化的全能干細胞有可能對因各種因素所造成的人體組織 器官缺損和功能障礙的疾病，如心肌病、帕金森氏病、外傷性脊髓損傷、糖尿病和骨損傷等提供細胞移植的來源。
基于本發(fā)明分離純化、凍存復(fù)蘇來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細胞 的方法，本發(fā)明的再一個目的是提供一種建立全能干細胞庫的方法，包括
a、 對收集的早期流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織樣品做必要的傳染病學檢查；
b、 按照權(quán)利要求1所述的方法從不同的胎兒一胎盤組織中分離純化干細
胞；
C、對步驟b得到的干細胞株的組織相容性抗原進行分類鑒定；
d、 根據(jù)步驟C的分類鑒定結(jié)果建立干細胞株目錄；
e、 將步驟b得到的干細胞株按權(quán)利要求10所述的方法冷凍儲藏。 本發(fā)明還包括按照上述方法建立的全能干細胞庫。
采用胚胎干細胞進行細胞移植，同異體器官和骨髓移植一樣，面臨病人 對供體組織器官因組織相容抗原的不同而產(chǎn)生免疫排斥的問題。也關(guān)系到胚
胎干細胞臨床治療的成敗的關(guān)鍵的問題。解決這個問題可能有兩種途徑一
是采用分子生物學方法對干細胞進行改造，產(chǎn)生能夠移植到不同個體的干細
胞系；二是建立類似現(xiàn)今已有的骨髓庫和嬰兒臍帶血庫的胚胎干細胞庫。前 一種途徑還有很長的路要走；而后一種途徑在我們所發(fā)明技術(shù)從醫(yī)源性廢棄
物中分離純化出全能干細胞使之成為可能。
全能干細胞庫的建立使采用細胞移植治療因各種因素所造成的人體組織 器官缺損和功能障礙的疾病，如心肌病、帕金森氏病、外傷性脊髓損傷、糖 尿病和骨損傷等成為一種可以預(yù)期的潛在手段。


圖1、免疫組化檢測孕娠第一周期流產(chǎn)胎兒腸組織中表達OCT-4(圖1A)， TRA-1-60 (圖1B)， TRA-1-81 (圖1C)， SSEA-1 (圖ID), SSEA-3 (圖1E)和 SSEA-4 (圖1F)，等胚胎干細胞標志物的干細胞。
圖2、免疫組化檢測孕娠第一周期流產(chǎn)胎兒臍帶組織中表達0CT-4 (圖 2A)， TRA-1-60 (圖2B)， TRA+81 (圖2C)， SSEA-1 (圖2D)， SSEA-3 (圖 2E)和SSEA-4 (圖2F)，等胚胎干細胞標志物的干細胞。
圖3、從胎兒臍帶或腸組織分離純化的干細胞培養(yǎng)時顯示的細胞形態(tài)特 征，圖3A為第3代細胞，而圖3B則為第12代細胞。
圖4、從胎兒臍帶或腸組織分離純化的干細胞均具有形成胚胎體的能力。 圖4A和B顯示在培養(yǎng)過程中自然形成的細胞集群。圖4A圖像放大為40倍， 圖4B則為200倍。圖4C和D顯示將培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)移至低粘附的培養(yǎng)皿，用 胚胎體培養(yǎng)液培養(yǎng)形成的胚胎體。圖4C圖像放大為40倍，圖4D則為100 倍。時形成的胚胎體所表達的三個胚層標志
物，圖5B為Nestin (外胚層)，圖5C為AFP (內(nèi)胚層)，圖5D為SAM(中胚 層)及對照(圖5A)。
圖6、從胎兒臍帶或腸組織分離純化的干細胞的生長特性。
圖7、免疫組化檢測培養(yǎng)的第3代干細胞表達SSEA-1 (圖7A)， OCT-4 (圖 7B)， SSEA-3 (圖7C)， SSEA-4 (圖7E)， TRA-1-60 (圖7D)禾口TRA-1-81 (圖7F) 等胚胎千細胞標志物。
圖8、免疫組化檢測培養(yǎng)的第12代干細胞表達SSEA-1 (圖8A)， OCT-4 (圖8B)， SSEA-3 (圖8C)， SSEA-4 (圖8E)' TRA-1-60 (圖8D)和TRA-1-81 (圖8F)等胚胎干細胞標志物。
圖9、 RT-PCR檢測培養(yǎng)的第1至第12代的干細胞表達的OCT-4， Nanog， Telemerase等胚胎干細胞標志物的mRNA。
圖10、從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成胰島p-細胞的形態(tài)學特征。圖10A 和圖10B為誘導(dǎo)過程中的第III階段的胰島細胞團的形態(tài)學特征；圖10A圖 像放大100倍，圖10B圖像放大400倍。圖10C和圖10D為誘導(dǎo)過程中的第 IV階段的胰島細胞團的形態(tài)學特征；圖10C圖像放大100倍，圖10D圖像放 大400倍。
圖11、免疫組化檢測定向誘導(dǎo)分化成胰島P-細胞表達胰島l3-細胞特異性 標志物(圖IIA為Insulin,圖11B為Nestin)。圖像放大200倍。
圖12、定向誘導(dǎo)分化成胰島p-細胞能夠在體外對葡萄糖濃度變化反應(yīng)， 分泌胰島素。
圖13、從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成心肌細胞的形態(tài)學特征。圖13A圖 像放大100倍；圖13B圖象放大200倍
圖14、免疫組化檢測定向誘導(dǎo)分化的細胞表達心肌細胞的特異性標志物 (圖14A為P-MHC，圖14B為cTNI)。
圖15、 RT-PCR檢測定向誘導(dǎo)分化的心肌細胞表達a-MHC， ANF， MLC2v和 Nkx2. 5的m腿。
圖16、從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細胞的形態(tài)學特征。圖16A圖 像放大100倍，圖16B圖像放大400倍。
圖17、免疫組化檢測定向誘導(dǎo)分化的細胞表達神經(jīng)細胞的特異性標志物 (圖17A為Nestin,圖17B為卩-tubulin,圖17C為MAP-2和圖17D為MPB)。
圖18、 RT-PCR檢測定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細胞表達Bfl， NF， Noggin的 mRNA。
圖19、從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成骨細胞的形態(tài)學特征。圖19A和B 為在培養(yǎng)第14天的骨細胞的形態(tài)學特征，圖19A圖像放大400倍；圖19B
9放大100倍。圖19C和D為在培養(yǎng)第22天的骨細胞的形態(tài)學特征；圖像放大 100倍。
圖20、 von Kossa染色檢測定向誘導(dǎo)分化的骨細胞中骨小結(jié)的形成。圖 20A圖像放大100倍；圖20B圖像放大200倍。
圖21、免疫組化檢測誘導(dǎo)分化的骨細胞表達后期骨生成標志物(ONC)。 圖21A圖象放大100倍；圖21B圖象放大200倍
上述附圖均為黑白圖片，為了更清楚地說明本發(fā)明方法得到的干細胞特 征，發(fā)明人同時提交圖1 圖8、圖10 圖14、圖16、圖17、圖19 圖21
的彩色圖片作為參考。
具體實施例方式
實施例1:來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細胞的分離純化，培養(yǎng)增 殖和鑒定
1. 1材料和方法 1. 1-1.試劑
a-MEM培養(yǎng)基(a-MEM)，胎牛血清(FCS)和胰蛋白酶-EDTA( trypsin-EDTA) 溶液購自Invirogen (美國)。青/鏈霉素和二性酶素B， I型膠原酶和羊抗鼠 抗體-HRP復(fù)合物購自Sigma (美國)?？筄CT-4， SSEA-1， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81的單克隆抗體購自R&D System(美國)?？笰FP， Nestin 和SMA的單克隆抗體購自Sigma (美國)和Dako (丹麥)。反轉(zhuǎn)錄(RT)試 劑盒購自Promega(美國)；DNATaq酶試劑盒購自Qiogen (德國)。用于RT-PCR 的引物則由Invirogen合成。
1. 1-2.收集樣品和分離胎兒組織細胞
收集妊娠第一周期(>8周〈12周)通過人工流產(chǎn)手術(shù)獲得的胎兒-胎盤組 織。將組織收集于高壓滅菌后的器皿中，并立即送到細胞培養(yǎng)實驗室處理。 先將組織放置在100 X 15 mm的培養(yǎng)盤，用鑷子和外科手術(shù)剪從胎兒-胎盤組 織中仔細地尋找胎兒的臍帶或腸等組織。然后棄去其余組織。 將尋找到的胎兒臍帶或腸等組織用高壓滅菌的生理鹽水洗滌3次。再用外科 手術(shù)剪將洗滌過的組織剪碎并轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管。用I型膠原酶(lmg/ml) 在37。C水浴鍋內(nèi)消化1小時。然后將樣品用離心機在4°C以800 rpm離心 15分鐘，棄去上清液，獲得細胞沉淀。再將細胞用高壓滅菌的生理鹽水洗滌兩次。
1. 1-3.細胞培養(yǎng)
將洗滌的胎兒組織細胞用干細胞培養(yǎng)液懸浮，并轉(zhuǎn)移至75 cm的細胞培 養(yǎng)瓶。50 ml的干細胞培養(yǎng)液由44 ml的a-MEM培養(yǎng)基，5 ml的胎牛血清，0. 5 ml的100X青/鏈霉素和0. 5 ml的100X 二性酶素B組成。 1. 1-4.細胞體外換代培養(yǎng)
將細胞培養(yǎng)瓶置于C02培養(yǎng)箱，在37°C和5%C02的條件下培養(yǎng)3-7天或 細胞增殖約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿庫面積的70%以上，視為一代。然后將細胞培 養(yǎng)液棄去，.用磷酸緩沖液洗滌細胞兩次。再用0. 25。/。的胰蛋白酶-EDTA溶液將 生長時粘貼在培養(yǎng)瓶底部的細胞懸浮，并將這些懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至離心管， 室溫下800 rpm離心分離。最后用干細胞培養(yǎng)液將細胞懸浮，并將約10%的 細胞轉(zhuǎn)移至另一個75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。該過程至少重復(fù)5至7 次。
1. 1-5.干細胞未分化狀態(tài)的維持
維持這些干細胞處于未分化狀態(tài)的方法包括使用上述的干細胞培養(yǎng)液， 或以bFGF (0.1pg/ml)代替上述干細胞培養(yǎng)液中的胎牛血清，在5%的C02 和37。C的條件下培養(yǎng)。
1.1-6.干細胞的凍存
在每次細胞培養(yǎng)換代的過程中，將室溫下800 rpm離心分離的細胞用干 細胞儲藏液(40%的胎牛血清，50%的01-MEM培養(yǎng)基和1(F。的DMS0)懸浮，轉(zhuǎn)移 至冷凍儲藏管并放置-70°C過夜，于第二天轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存。
1.卜7.干細胞的解凍和細胞活力的復(fù)蘇
將裝有干細胞的冷凍儲藏管從液氮罐取出，立即放置在37。C解凍；然后 離心分離，并用磷酸緩沖液洗滌一次。再將解凍的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，用干 細胞培養(yǎng)液在5%的C02和37°C的條件下培養(yǎng)24小時。置換新鮮的培養(yǎng)液繼 續(xù)在5%的C02和37°C的條件下培養(yǎng)，并且每3-5天換新鮮培養(yǎng)液一次。
1. 1-8.免疫組織化學和細胞免疫化學
將尋找到的胎兒臍帶或腸組織一部分用10%福爾馬林固定。然后石臘包 埋，制備成4 p厚的切片。免疫組化分析時，對石蠟包埋的切片，按標準 操作進行直接免疫過氧化物酶染色(Bullock Gr and Petrusz P. 1982)。首 先，組織內(nèi)源性過氧化物酶活性和非特異蛋白結(jié)合位點分別用1%過氧化氫處 理及含10%正常山羊血清的溶液封閉30分鐘。然后加入OCT-4， SSEA-1， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81單抗，于4°C保溫過夜。第二天， 用PBS洗滌切片后與1:2000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP復(fù)合物室溫下保溫1 小時。PBS洗片，用二氨基聯(lián)苯胺.(DAB)使結(jié)合抗體顯色5分鐘。特異性 質(zhì)控對照包括用PBS或正常小鼠IgG (Sigma公司產(chǎn)品)替換特異性抗體。
細胞免疫化學檢測按標準操作進行直接免疫過氧化物酶染色.(Javois 1999)。首先將培養(yǎng)的胚胎體或細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)載片上，37°C， 5%0)2條 件下培養(yǎng)2-3天。然后將載片在-20。C丙酮中固定10分鐘。內(nèi)源性過氧化物
ii酶活性和非特異蛋白結(jié)合位點分別用1%過氧化氫處理及含10%正常山羊血清 的溶液封閉30分鐘。然后與OCT-4， SSEA-1， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60 和TRA-1-81單抗于4。C保溫過夜。第二天用PBS洗滌后，與1:2000稀釋的 羊抗小鼠IgG-HRP復(fù)合物室溫下保溫1小時。PBS洗片，用二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)使結(jié)合抗體顯色5分鐘。特異性質(zhì)控對照包括用PBS或正常小鼠IgG (Sigma公司產(chǎn)品)替換特異性抗體。 1. 1-9. RT-PCR
將培養(yǎng)的每一代部分細胞轉(zhuǎn)移儲藏在-70。C待用。檢測時，采用Trizon 試劑(Invirogen)提取樣品的總RNA。 cDNA的合成則采用Promega公司的反 轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒，按說明書進行。OCT-4, Nanog和端粒酶的PCR引物分別 為OCT-4 ( gagcaaaacccggaggagt ( sense ) ， ttctctttcgggcctgcac (antisense ) 5310bp ) ;Nanog( gcttgccttgctttgaagca (sense ) , ttcttgactgggaccttgtc ( antisense ) ; 225 bp ) ; hTERT (cagctcccatttcatcagca (sense) ， cgacatccctgcgttcttg (antisense); 114 bp); (3-actin (cgcaccactggcattgtcat (sense), ttctccttgatgtcacgcac (antisense), 207 bp)(Beattie et al. 2005)。0CT-4的PCR的條件為94。C， 30 秒，55。C， l分鐘，72。C， l分鐘35個循環(huán);Nanog的PCR的條件為94°C， 30秒，57。C， l分鐘，72。C， l分鐘35個循環(huán);Telomease的PCR的條件為 94°C， 30秒，53°C， l分鐘，72°C， 1分鐘35個循環(huán)；P-actin的PCR的條 件為94。C， 30秒，54°C， l分鐘，72°C， 1分鐘35個循環(huán)；，PCR的產(chǎn)物則釆 用Golden染色的2°/。瓊脂檢測，并以卩-actin的RT-PCR產(chǎn)物作為內(nèi)標準。 1.2結(jié)果
1. 2-1.免疫組化確定胎兒組織中的類胚胎干細胞
圖1顯示用免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒腸組織中有 表達早期胚胎干細胞標志物的干細胞。其中0CT-4， SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60 和TRA-1-81等標志物均為陽性，而SSEA-1 (為鼠胚胎干細胞的標志物)則 為陰性。表達OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81陽性的細胞位 于腸粘膜細胞的周圍。該發(fā)現(xiàn)證明在早期流產(chǎn)的胎兒腸組織中存在具有胚胎
干細胞特征的干細胞。圖像放大為ioo倍。
圖2顯示用免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶組織中 有表達早期胚胎干細胞標志物的干細胞。其中OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81等標志物均為陽性，而SSEA-1 (為鼠胚胎干細胞的標 志物)則為陰性。表達OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-l-60和TRA-1-81陽性 的細胞主要位于臍帶膠質(zhì)。該發(fā)現(xiàn)證明在早期流產(chǎn)的胎兒臍帶組織中存在具 有胚胎干細胞特征的干細胞。圖像放大為IOO倍。1. 2-2.類胚胎干細胞的形態(tài)學特征
圖3顯示從孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶或腸組織分離純化和培養(yǎng)后的
類胚胎干細胞的細胞形態(tài)特征。這些細胞顯示出均勻的類似成纖維細胞的細
胞形態(tài)。圖3A為第3代細胞，而圖3B則為第12代細胞。圖3A和圖3B的圖 像放大均為100倍。
1.2-3.分離純化的干細胞能形成胚胎體
圖4顯示從孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶或腸組織分離純化和培養(yǎng)的干 細胞均具有形成胚胎體的能力。圖4A和B顯示在培養(yǎng)過程中自然形成的細胞 集群。圖4A圖像放大為40倍，圖4B則為200倍。圖4C和D顯示將培養(yǎng)的 細胞轉(zhuǎn)移至低粘附的培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液培養(yǎng)形成的胚胎體。圖4C圖像 放大為40倍，圖4D則為100倍。
圖5顯示用免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)用這些分離純化和培養(yǎng)干細胞所形成 的胚胎體能夠表達內(nèi)胚層(a-fetoprotein, ， AFP，甲胎蛋白，圖5C)，中胚 層(smooth muscle actin, SMA，平滑肌細胞特異性蛋白，圖5D)和外胚層 (Nestin，神經(jīng)元特異性烯醇化酶，圖5B)三個胚層細胞表達特異性標志物。 圖5A則為陰性對照(在免疫組化檢測中未加抗AFP ， SMA或Nestin的特異 性抗體)。圖像放大為100倍。
1. 2-4.分離純化的類胚胎干細胞的生長特性
圖6顯示從孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶或腸組織分離純化和培養(yǎng)的干 細胞的生長曲線。在培養(yǎng)3天內(nèi)，四個不同個體分離純化的細胞數(shù)目平均增 長約100倍。
1. 2-5.對分離純化培養(yǎng)后的干細胞免疫組化的鑒定
圖7和圖8分別顯示細胞免疫組化檢測培養(yǎng)的第3和第12代干細胞表達 早期胚胎干細胞標志物。如腸組織和臍帶組織的免疫組化的結(jié)果一樣(圖1 和圖2)，其中OCT-4, SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81等標志物均 為陽性，而SSEA-1則為陰性。表明這些干細胞在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下一直 處于未分化狀態(tài)。圖像放大為IOO倍。
1. 2-6.對分離純化的干細胞分子生物學的鑒定
圖9顯示RT-PCR檢測培養(yǎng)的第3至第12代的干細胞持續(xù)地表達的早期 轉(zhuǎn)錄基因OCT-4， Nanog和端粒酶的mRNA。以|3-actin的RT-PCR產(chǎn)物作為內(nèi) 標準，同時顯示這些早期轉(zhuǎn)錄基因和端粒酶表達的量從第3至第12代相近， 表明這些干細胞在該發(fā)明的培養(yǎng)條件下一直處于未分化狀態(tài)。
1.3.結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織成功地分離純化出具有 胚胎干細胞特性的千細胞。該種干細胞(1)能夠在體外培養(yǎng)中形成胚胎體；
13(2)具有無限的增殖能力3天就有100個倍增，并且這種增殖能力傳代一
年半后仍然保持這種增殖能力；(3)免疫組織化學，細胞組織化學和分子生
物學檢測均發(fā)現(xiàn)這些細胞表達所有的人胚胎干細胞特有的細胞表面標志物和
表達維持胚胎干細胞增殖能力和全能性的早期轉(zhuǎn)錄基因0ct4， Nanog和端粒 酶。表明這些干細胞可能具有類似全能干細胞潛力。
實施例2:干細胞的體外分化----胰島卩-細胞 2. 1材料和方法
2. l-l.試劑:從Invitrogen公司購置磷酸緩沖液(PBS); oc-minimal essential medium (ot-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FCS); knockout血清；青/鏈霉素；二性霉素B; L-glutamin; 0. 25% Trypsin-EDTA; B27-s叩plement， bFGF。從Sigma公司 貝勾置 insulin, transferrin, selenium chloride, fibronectin 禾口 putrescine?？笽nsulin和Nestin抗特異性抗體購自Dako (丹麥)。Insulin 酶聯(lián)免疫試劑盒購自Abbott (美國)。
2-1-2.方法胰島p-細胞的定向分化的方法主要參考Lumelsky等人發(fā) 表的文獻(Lumeksky et al. 2006)。該方法將體外分化過程分為五個階段。 在階段I，將未分化的干細胞培養(yǎng)擴增。在第n階段，讓擴增的干細胞形成 胚胎體。在第III階段將胚胎體定向分化成類似胰島的細胞團。第IV和第V
階段將胰島細胞團進一步分化成具有功能的p-細胞。詳述如下
2. 1-2-l.將凍存的干細胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)10分鐘，棄去上清液；再將細胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml 的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心800轉(zhuǎn)10分鐘洗滌一次。
2-1-2-2.棄去上清液；將細胞沉淀用lml的千細胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
2-1-2-3. 4-5天培養(yǎng)后，細胞增殖覆蓋70-90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37°C下孵化5分鐘。
2. 1-2-4.將懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
2.1-2-5.將洗滌的細胞轉(zhuǎn)移至低粘附的6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液 (80%的knockout dMEM， 20%胎牛血清，1 mM的L-glutamine， 0. 1M的 f3-mercaptoethano1和1%非必須氨基酸)在細胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37°C條件 下培養(yǎng)6-7天；培養(yǎng)第二天這些干細胞既形成胚胎體。每3天換液一次。
2. 1-2-6.將胚胎體轉(zhuǎn)移至10-cm2的培養(yǎng)皿，用1: 1 DMEM/F12培養(yǎng)液加insulin (10mg/L) -Transferrin (6. 7ng/L) -Selenium (5.5mg/L) (ITS) 和1 mM的L-glutamine及5 |ig/L的Fivronectin培養(yǎng)7天。
2. 1-2-7.將細胞用0. 25% Trypsin-EDTA懸浮并轉(zhuǎn)移至10-cm2培養(yǎng)皿， 用1: 1 dMEM/F12培養(yǎng)液加N2補充液(500 |ag/ml的Insulin, 10 mg/ml的 Transferrin, 0. 63 pg/ml的孕酮，1611 |iig/ml的Putrascine和0. 52 pg/ml 的Selenium)以及B27培養(yǎng)液，1 mM的L-glutamine及10 ng/ml的bFGF 形成類胰島細胞團。培養(yǎng)6-7天，每3天換液一次。
2. 1-2-8.第6-7天，將bFGF換成10 mM的Nicotimide，并在低糖條件 下培養(yǎng)4天。將胰島細胞團轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板用上述培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4天。
2. 1-2-9.將培養(yǎng)液換成不含血清的高糖或低糖培養(yǎng)液，觀察分化的胰島 p-細胞對葡萄糖濃度變化產(chǎn)生的insulin分泌。
2. 1-2-10.用倒置光學顯微鏡進行形態(tài)學觀察。
2. 1-2-ll.在分化第V階段，采用特異性抗Insulin和Nestin抗體按 1. 1-8所描述的細胞免疫組化方法鑒定分化的胰島(3-細胞。
2. 1-2-12.收集2. 1-2-9的培養(yǎng)液，采用Insulin酶聯(lián)免疫檢測試劑盒按 試劑盒的說明書檢測培養(yǎng)液中的Insulin濃度。
2.2結(jié)果
圖10顯示從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成胰島細胞團的形態(tài)學特征。圖 10A和圖10B為誘導(dǎo)過程中的第III階段的胰島細胞團的形態(tài)學特征；圖10A 圖像放大100倍，圖10B圖像放大400倍。圖IOC和圖10D為誘導(dǎo)過程中的 第IV階段的胰島細胞團的形態(tài)學特征；圖10C圖像放大100倍，圖10D圖像 放大400倍。
圖11顯示用免疫組化檢測分化的胰島細胞團表達f3-細胞的特異性標志 物。圖IIA為Insulin,圖llB為Nestin。圖像放大200倍。
圖12顯示定向誘導(dǎo)分化的胰島p-細胞團對高濃度的葡萄糖能分泌較高 濃度的胰島素。比較低濃度的葡萄糖培養(yǎng)液有顯著的統(tǒng)計學意義(P=0.036)。 說明這些分化的胰島P-細胞具有調(diào)節(jié)糖代謝的功能。
2. 3結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎
干細胞特性的干細胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為具有調(diào)節(jié)糖代謝的功 能的胰島(3-細胞。
實施例3:干細胞的體外分化--一心肌細胞
3. 1材料和方法
3.1-1試劑從Invitrogin公司購置磷酸緩沖液(PBS); a-minimalessential medium (a-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); 胎牛血清(FCS); knockout血清；青/鏈霉素；二性霉素B; L-glutamin; 0. 25% Trypsin-EDTA; (3-mercaptoethanol;非必須氨基酸；抗卩-肌球蛋白重鏈 (P-myosin heavy chain, MHC)抗體禾口抗肌拷蛋白I (cardiac troponin I ， cTnl)抗體購自Chemicon (美國)；RT-PCR的引物a-肌凝蛋白重鏈 (myosin light chain ventricular, oc-MHC) (ggggacagtggtaaaagcaa (sense ) ， tccctgcgttccactatctt ( antisense ) ; 512bp ) ， Nkx2. 5 (ggtggagctggagaagacaga (sense), cgacgccgaagttcacgaagt (smtisense) 536bp) (Passier et al. 2005)。心鈉素(Atrial natriuretic factor, ANF ) (gaaccagaggggagagacagag(senseX ccctcagcttgctttttaggag(antisense)， 406bp)和心肌肌凝蛋白輕鏈2v (myosin light chain 2v， MLC2v) (first round : gcgccaactccaacgtgttct ( sense ) ; gtgatgatgtgcaccaggttc
(antisense ) ; nested PCR : aggaggccttcactatcatgg ( sense ); gtgatgatgtgcaccaggttc (antisense); 444 bp) (Mummery et al. 2003)。 a-MHC的PCR的條件為94°C， 1分鐘，55°C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35個循 環(huán)；Nkx2. 5的PCR的條件為94。C， 1分鐘，57°C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35 個循環(huán)；ANF的PCR的條件為94°C， 1分鐘，53°C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35 個循環(huán)；MLC2v的第一次PCR的條件為94°C， 1分鐘，62°C， 1分鐘，72°C， 1 分鐘35個循環(huán)；巢式PCR的條件為94°C， 1分鐘，62°C， 1分鐘，72°C， 1 分鐘35個循環(huán)；(3-actin的PCR的條件為94。C， 30秒，60。C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35個循環(huán)；PCR的產(chǎn)物則采用GOLDEN染色的2%瓊脂檢測，并以p-actin 的RT-PCR產(chǎn)物作為內(nèi)標準。
3. 1-2方法心肌細胞的定向分化的方法主要參考He JQ等人發(fā)表的文 獻(He JQ et al. 2003)。
3. 1-2-l.將凍存的干細胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)10分鐘，棄去上清液；再將細胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml 的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心800轉(zhuǎn)10分鐘洗滌一次。
3. 1-2-2.棄去上清液；將細胞沉淀用1 ml的干細胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
3.1-2-3. 4-5天培養(yǎng)后，細胞增殖覆蓋70-90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37。C孵化5分鐘。
3. 1-2-4.將懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
3.1-2-5.將洗滌的細胞轉(zhuǎn)移至6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液(Dulbecco， s modified Eagle， s培養(yǎng)基力口 20%的knockout血清，1 mM 的L-glutamine， 0. 1M的(3-mercaptoethanol和非必須氨基酸)在細胞培 養(yǎng)箱中5%0)2， 37。C條件下培養(yǎng)形成胚胎體。
3. 1-2-6.培養(yǎng)4-6天后，胚胎體的大小可達300-2000 pm。然后將胚胎 體轉(zhuǎn)移至10-cm2培養(yǎng)皿，用分化培養(yǎng)液(DMEM加15%的FCS，2 mM L-glutamine和1%的非必須氨基酸)培養(yǎng)，每天換液一次。 3. 1-2-7.用倒置光學顯微鏡觀察形態(tài)學的變化。
3. 1-2-8.免疫組化鑒定采用P-MHC和cTnl抗體按1.卜8所描述的細胞 免疫組化方法鑒定分化的心肌細胞。P-MHC為心肌細胞中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)和收縮 蛋白的成分，而cTnl則為心肌的特異性蛋白， 一種心肌細胞的特異性標志 物(Aubin JE. 1998)。
3. 1-2. 9. RT-PCR檢測a-MHC ， Nkx2. 5， ANF和MLC2v的mRNA的表達.。 Nkx2. 5是一同源盒區(qū)塊的轉(zhuǎn)錄因子，在早期心臟發(fā)育起著重要的作用。ANF 由心肌細胞分泌一種調(diào)節(jié)電介質(zhì)平衡的蛋白，為心肌細胞的早期標志物。 a-MHC是在心肌細胞發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)和收縮的成分。在成人心肌細胞表達。MLC2v 僅在有收縮的心肌細胞表達(Segev et al. 2005)。
3. 3結(jié)果
圖13顯示從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成心肌細胞的形態(tài)學特征。圖13A 圖像放大100倍；圖13B圖象放大200倍。
圖14顯示免疫組化檢測定向誘導(dǎo)分化心肌細胞表達特異性標志物。圖 14A為p-MCH，圖14B為cTnl。圖像放大200倍。
圖15顯示RT-PCR檢測定向誘導(dǎo)分化的心肌細胞表達特異性標志物的 m隱o
3.4結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎 干細胞特性的干細胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為心肌細胞。
實施例4:干細胞的體外分化----神經(jīng)細胞
4. 1材料和方法
4. 1-l.試劑從Invitrogen公司購置磷酸緩沖液(PBS); a-minimal essential medium (a-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FCS); knockout血清；青/鏈霉素；二性霉素B; L-glutamin; 0. 25% Trypsin—EDTA; B27-supplement, bFGF。從SIGMA公司 購置 insulin, "transferrin, selenium chloride, fibronectin， putrescine。抗神經(jīng)元微管木目關(guān)蛋白一2 (mcrotubul—associated ptotein—2,MAP-2)抗體，抗髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein, MPB)抗體，抗Nestin 抗體和抗p微管蛋白，p-tubulin)抗體購自Sigma (美國)。RT-PCR的引物 Bfl: (actcaaaactcgctgggcaac (sense) , cgtgggggaaaaagtaactgg, 226 bp) ■(Yan et al. 2005); Noggin: (taatggatccatggagcgctgccccagcctag(sense)， gcagaagcttctagcacgagcacttgcactcg (antisense) ， 771 bp); 神經(jīng)絲蛋白 (Neurofilament ， . NF):gagtgaaatggcacgataccta( sense ) ， ttcctctccttcttcaccttc (antisense) ， 473 bp) (Kim et al. 2005)。 Bfl 的PCR的條件為94°C， 30秒，57。C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35個循環(huán);Noggin 的PCR的條件為94。C， l分鐘，57°C， l分鐘，72°C， 2分鐘35個循環(huán);NF 的PCR的條件為94°C， l分鐘，55°C， l分鐘，72°C， l分鐘35個循環(huán)。 4. 1-2.方法
4. 1-2-l.將凍存的干細胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)10分鐘，棄去上清液；再將細胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml 的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心800轉(zhuǎn)10分鐘洗滌一次。
4. 1-2-2.棄去上清液；將細胞沉淀用1 ml的干細胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
4.1-2-3. 4-5天培養(yǎng)后，細胞增殖覆蓋70_90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37。C孵化5分鐘。
4. 1-2-4.將懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
4.1-2-5.將洗滌的細胞轉(zhuǎn)移至6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液 (Dulbecco， s modified Eagle， s培養(yǎng)基力口 20%的knockout血清，1 mM 的L-glutamine， 0. 1M的j3-mercaptoethanol和非必須氨基酸)在細胞培 養(yǎng)箱中59&C02, 37。C條件下培養(yǎng)形成胚胎體。
4. 1-2-6.將胚胎體轉(zhuǎn)移至10 cm2培養(yǎng)皿，在DMEM-10%FCS培養(yǎng)液中讓 胚胎體展開。
4. 1-2-7.第二天將培養(yǎng)液換成含有ITSFn (insulin 5 |ig/ml ， transferring 50|ig/ml， selenium chloride 30 nM， fibronectin 5|ig/ml) 的DMEM/F12 (1: 1)培養(yǎng)液，培養(yǎng)6-8天；每兩天換一次液。以選擇Nestin 陽性細胞。
4. 1-2-8.將細胞用0. 259&Trypsin-EDTA懸浮，洗滌；然后轉(zhuǎn)移至另一個 10 cm2培養(yǎng)皿，用含有N2的DMEM/F12培養(yǎng)液和bFGF以增殖Nestin陽性細 胞。
4. 1-2-9.用倒置光學顯微鏡觀察分化成神經(jīng)細胞的形態(tài)學。4. 1-2-10.采用特異性抗MAP-2， MPB， Nestin和]3-tubulin抗體按 1. 1-8所描述的細胞免疫組化方法鑒定分化的神經(jīng)細胞(Aubin JE. 1998)。 MAP-2是樹狀突神經(jīng)細胞特異性神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白；MPB是由分化完全的少 突膠質(zhì)細胞(oligodendrocytes)表達的髓鞘堿性蛋白；Nestin是神經(jīng)組細 胞表達的中間絲蛋白(Intermediate filament structural protein); 卩-tubulin為神經(jīng)元重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是神經(jīng)元分化的標志物。
4.1-2-11. RT-PCR檢測基因表達，鑒定分化的神經(jīng)細胞。Noggin是在神 經(jīng)元發(fā)育過程中表達的神經(jīng)細胞特異基因。NF是神經(jīng)細胞重要的結(jié)構(gòu)蛋白， 用以鑒定已經(jīng)分化的神經(jīng)細胞.Bfl是前腦細胞表達的轉(zhuǎn)錄因子.
4. 3結(jié)果
圖16顯示從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細胞的形態(tài)學特征。圖16A 圖像放大100倍，圖16B圖像放大400倍.。
圖17顯示免疫組化檢測從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化神經(jīng)細胞的特異性 標志物(Nestin (A) ， (3-Tubulin (B)， MAP-2 (C)和MPB (D))，圖像放 大200倍。
圖18顯示RT-PCR檢測分化成神經(jīng)細胞定向誘導(dǎo)分化神經(jīng)細胞時(12天， 24天和36天)的特異性標志物的mRNA。
4. 4結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎 干細胞特性的干細胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞。
實施例5:干細胞的體外培養(yǎng)分化一--骨細胞
5. 1材料和方法
5. 1-l.試劑:從Invitrogen公司購置磷酸緩沖液(PBS); a-minimal essential medium (a-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); 胎牛血清(FCS); 0. 25%Trypsin-EDTA;青/鏈霉素;二性霉素B; knockout 血清；L-glutamin;非必須氨基酸禾口(3-me:rcaptoe1:hanol; 從Sigma公司 購置L-asorbic acid (AA); dexamethasome (DEX) ; hexamethyldisilazane (HMDS) 禾口 sodium-p-glycerophosphate ((3gp); vonKossa染色試劑盒 購自Polysciences Inc (美國),抗骨鈣素(osteocacin， 0CN)單克隆抗 體購自腿D System (美國)。
5. 1-2.方法骨組織的定向分化的方法主要參考Karp JM等人發(fā)表的文 獻(Karp et al. 2006)。
5. 1-2-l.將凍存的干細胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)，10分鐘，棄去上清液；再將細胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心洗滌一次(S00轉(zhuǎn)，10 分鐘)。
5. 1-2-2.棄去上清液；將細胞沉淀用lml的千細胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
5. l-2-3.4-5天培養(yǎng)后，細胞增殖覆蓋70-90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37。C孵化5分鐘。
5. 1-2-4.將懸浮的細胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
5.1-2-5.將洗滌的細胞轉(zhuǎn)移至低粘附的6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液 (DMEM培養(yǎng)基加20%的knockout血清，1 mM的L-glutamine， 0. 1M的 P-mercaptoethanol和1%的非必須氨基酸)在細胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37°C條
件下培養(yǎng)形成胚胎體。
5. 1-2-6.培養(yǎng)4-6天后，胚胎體的大小可達300-2000 )am。然后將胚胎 體轉(zhuǎn)移至10-cm2培養(yǎng)皿，用分化培養(yǎng)液(oc-MEM加10%的FCS， 10-8M的DEX， 50嗎/ml的AA和5 mM的pgp)培養(yǎng)，每2 - 3天換液一次。
5. 1-2-7.用倒置光學顯微鏡觀察形態(tài)學的變化分化的組織中有無礦物 化區(qū)域。
5. 1-2-8.組織學鑒定采用von Kossa染色確定骨小結(jié)的形成(Purpura KA et al. 2004)。
5-1-2-9.免疫組化鑒定采用0CN特異性抗體按1. 1-8所描述的細胞免 疫組化方法鑒定確定骨組織的形成(Aubin JE. 1998)。
5.2結(jié)果
在加入分化培養(yǎng)液培養(yǎng)的第14天左右，用倒置光學顯微鏡觀察大約90% 以上的胚胎體分化形成骨細胞。圖19顯示從這些干細胞定向誘導(dǎo)分化成骨細 胞的形態(tài)學特征。圖19A和B為在培養(yǎng)第14天的骨細胞的形態(tài)學特征，圖 19A圖像放大400倍；圖19B放大100倍。圖19C和D為在培養(yǎng)第22天的骨 細胞的形態(tài)學特征；圖像放大100倍。顯微鏡下可見分化的組織中有礦物化 區(qū)域。分化第22天的骨組織比分化第14天的較大，礦物化區(qū)域也較明顯。
采用von kassa染色顯示定向誘導(dǎo)分化第22天的骨細胞有骨小結(jié)的形成 (圖20，圖20A圖像放大100倍；圖20B圖像放大200倍)。圖21則顯示免 疫組化檢測定向誘導(dǎo)分化第22天的骨細胞有OCN的表達。0CN是骨生成的后 期標志物；與骨細胞的礦物化一致。圖21A圖象放大100倍；圖21B圖象放 大200倍。
5.3結(jié)論.從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎 干細胞特性的干細胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為骨細胞。
實施例6全能干細胞庫的建立 ，
1、 對要建庫收集的妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品進行各種傳
染性疾病包括HIV， HBC， HCV， HTLV等按常規(guī)方法進行檢測；
2、 按照實施例1的方法從不同的胎兒一胎盤組織中分離純化干細胞；
3、 對分離純化的干細胞按常規(guī)方法進行染色體檢測；
4、 采用MTT的方法對分離純化的干細胞株活性進行檢測；
5、 采用PCR的方法對各干細胞株的組織相容性抗原類型進行分類鑒定；
6、 用上述分類鑒定數(shù)據(jù)建立凍存干細胞的數(shù)據(jù)庫；
7、 按照實施例1的方法凍存分離純化的干細胞株。
本發(fā)明的方法可以比較方便地從妊娠一期人工流產(chǎn)的胎兒組織中成功地 分離純化出全能干細胞并且穩(wěn)定保持全能干細胞的未分化狀態(tài)，進而建立了 全能干細胞庫，為干細胞移植治療各種人體組織器官缺損和功能障礙的疾病， 如帕金森氏病、糖尿病、外傷性脊髓損傷、細胞變性病、燒傷、心肌病和骨 損傷等提供了一種新途徑。
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權(quán)利要求
1、一種分離純化來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細胞的方法，包括a、收集妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品；b、從步驟a的樣品中分離獲得胎兒臍帶或腸組織；c、從步驟b的胎兒臍帶或腸組織中得到胎兒臍帶或腸組織細胞；d、從步驟c得到的胎兒臍帶或腸組織細胞中分離純化表達胚胎干細胞標志物OCT-4，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81的干細胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括e、凍存步驟d得到的純化干 細胞；f、復(fù)蘇凍存的純化干細胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟a所述的妊娠第一周期 流產(chǎn)胎兒組織為妊娠8周至12周人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟c中，先將胎兒臍帶或 腸組織用滅菌的生理鹽水洗滌，再剪成小塊，用膠原酶消化至細胞成分離狀 態(tài)后，離心獲得細胞沉淀，用生理鹽水洗滌備用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟d中，先用免疫磁珠分 離技術(shù)將表達OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和/或TRA-1-81的干細胞 純化，再將洗脫的干細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，得到純化的干細胞。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟d中，將步驟c得到的 胎兒臍帶或腸組織細胞用干細胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)條件為， 在37°C和5%0)2的條件下培養(yǎng)3-7天或細胞增殖約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積 的70%以上，轉(zhuǎn)移傳代至少5次，得到純化的干細胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的干細胞培養(yǎng)液由體積 百分含量88X的a-MEM培養(yǎng)基，10%的胎牛血清或0. l|ug/ml的bFGF， 1%的 100X青/鏈霉素，1X的100X 二性酶素B組成。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是轉(zhuǎn)移傳代時，將細胞培養(yǎng)液 棄去，用磷酸緩沖液洗滌細胞；再用胰蛋白酶-EDTA溶液將生長時粘貼在培 養(yǎng)瓶底部的細胞懸浮，室溫下離心分離得到細胞；用干細胞培養(yǎng)液將細胞懸 浮，并將約1096的細胞轉(zhuǎn)移至另一個細胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征是所述的純化干細胞能夠 形成胚胎體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是凍存干細胞時，先用干細 胞儲藏液懸浮傳代過程中離心分離的細胞，然后轉(zhuǎn)移至冷凍儲藏管并放置 _70°C過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存；所述干細胞儲藏液由體積百分含量 4Qo/o的胎牛血清，509&的a-MEM培養(yǎng)基和10°/。的DMSO組成。
11、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是復(fù)蘇干細胞時，將裝有干 細胞的冷凍儲藏管從液氮罐取出，放置在37。C解凍；然后離心分離，并用磷酸緩沖液洗滌，再將解凍的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，用干細胞培養(yǎng)液在5%的C02 和37°C的條件下培養(yǎng)24小時，置換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)在5%的C02和37°C的 條件下培養(yǎng)，并且每3-5天換新鮮培養(yǎng)液一次。
12、 一種來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細胞，是由權(quán)利要求l所述 的方法分離純化得到的。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的干細胞，其表達的胚胎干細胞標志物為 OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81。 、
14、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的干細胞，其表達一種或多種胚胎干細胞特異 性轉(zhuǎn)錄因子。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的干細胞，其表達的胚胎干細胞特異性轉(zhuǎn)錄因 子為0CT-4， Nanog或Telemerase。
16、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的干細胞，其能夠形成胚胎體。
17、 權(quán)利要求12所述的干細胞，其誘導(dǎo)分化為胰島P —細胞、心肌細胞、 神經(jīng)細胞、骨細胞的用途。
18、 一種建立全能干細胞庫的方法，包括a、 對收集的早期流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織樣品做必要的傳染病學檢查；b、 按照權(quán)利要求1所述的方法從不同的胎兒一胎盤組織中分離純化干細胞；c、 對步驟b得到的干細胞株的組織相容性抗原進行分類鑒定；d、 根據(jù)步驟c的分類鑒定結(jié)果建立干細胞株目錄；e、 將步驟b得到的干細胞株按權(quán)利要求10所述的方法冷凍儲藏。
19、 一種由權(quán)利要求18的方法建立的全能干細胞庫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離純化來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的多能干細胞的方法，包括a.收集妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品；b.從步驟a的樣品中分離獲得胎兒臍帶或腸組織；c.從步驟b的胎兒臍帶或腸組織中得到胎兒臍帶或腸組織細胞；d.從步驟c得到的胎兒臍帶或腸組織細胞中分離純化表達OCT-4，Nanog，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81等胚胎干細胞標志物，并能夠形成胚胎體的干細胞。本發(fā)明方法獲得的干細胞一直處于未分化狀態(tài)。同時，本發(fā)明還公開了將這些干細胞分化成不同人體細胞，如心肌，神經(jīng)，胰島β-細胞或骨細胞的應(yīng)用。該方法避免了從胚胎獲取全能干細胞所面臨的干細胞倫理學之爭，并且能夠獲取比從胚泡更多的干細胞。
文檔編號C12N5/08GK101538553SQ20091005829
公開日2009年9月23日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者葉尚勉 申請人:葉尚勉