專利名稱：一種結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù)生產(chǎn)多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽的制備方法，尤其涉及一種結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂 解技術(shù)生產(chǎn)多肽的方法。
背景技術(shù)：
多肽是化學(xué)學(xué)科研究的一項重要內(nèi)容，在生化，醫(yī)藥，免疫和基因科學(xué)等學(xué)科 和領(lǐng)域都起了巨大的推動作用。長期以來，幾乎所有多肽合成的研究都是以氨基酸為原 料通過化學(xué)合成方法來進(jìn)行的。這種方法步驟麻煩、成本較高，使得多肽類材料的應(yīng)用 受到限制。隨著科技的發(fā)展，生產(chǎn)肽的方法也在不斷發(fā)展。五六十年代，主要是從動物臟 器獲取肽。后來又發(fā)展到液相合成法。1963年，R.B.Merrifield創(chuàng)立了將多肽羧基端的 氨基酸固定在不溶性樹脂上，然后在此樹脂上依次偶聯(lián)氨基酸，延長肽鏈、合成多肽的 固相合成法。多肽固相合成技術(shù)的發(fā)明促進(jìn)了肽合成的自動化，但只能用于小規(guī)模的實 驗室合成，并且對有些序列的多肽，如多個疏水氨基酸，連續(xù)的大側(cè)鏈基團(tuán)的胺基酸， 合成非常困難。隨著蛋白表達(dá)技術(shù)的成熟，多肽也應(yīng)用到這種技術(shù)。然而，直接在大腸桿菌中 表達(dá)多肽都不能成功，主要是由于多肽是線性不折疊的小分子，在大腸桿菌中容易被降 解。由于多肽分子量較小，難以通過常規(guī)的電泳技術(shù)來檢測。為了解決這個問題，人 們嘗試著將多肽融合到一個載體蛋白的C端。這種融合多肽可以在大腸桿菌中表達(dá)、純 化，利用蛋白酶將多肽切下。但這種方法主要存在以下缺點(diǎn)融合蛋白比較大，導(dǎo)致多 肽的表達(dá)量比較低；切割時，會發(fā)生非特異性切割，由此而產(chǎn)生一些雜肽，增加純化的 難度；所使用的酶，價格比較貴；無法對沉淀的包涵體蛋白進(jìn)行切割。由于以上缺點(diǎn)也 造成這種技術(shù)不能得到廣泛利用。為克服這些缺點(diǎn)，我們發(fā)明了一種結(jié)合蛋白的生物表 達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù)生產(chǎn)多肽的新方法。本方法產(chǎn)量高、成本低、易于純化，重組多肽即 使以包涵體的形式表達(dá)，也可以進(jìn)行切割。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù)生產(chǎn) 多肽的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，按本發(fā)明方法制備的多肽產(chǎn)量高，成本低，環(huán)境 污染少，且易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù) 生產(chǎn)多肽的方法，該方法以葡萄球菌核酸酶為載體蛋白，將目的多肽融合在葡萄球菌核 酸酶的C端，在葡萄球菌核酸酶和目的多肽之間有一個半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多 肽的融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并純化；然后多肽通過化學(xué)裂解技術(shù)從葡萄球菌核酸 酶-多肽融合蛋白上切割下來；該方法具體包括如下步驟(1)基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease -Peptide)的堿基序列，經(jīng)過雙酶切該堿基序列和表達(dá)載體序列，純化雙酶切的兩個序列，將堿基序列與表 達(dá)載體序列進(jìn)行連接，這就是構(gòu)建的表達(dá)載體；通過酶切、測序鑒定構(gòu)建的表達(dá)載體是 否準(zhǔn)確；(2)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到表達(dá)宿主細(xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組多肽；(3)收集、破碎細(xì)菌，純化表達(dá)的重組多肽；(4)以乙醇為溶劑，沉淀并收集純化的重組多肽；(5)將沉淀的重組多肽重溶于鹽酸胍緩沖液，加入DTT和NTCB ；(6)溶液pH調(diào)至9.0-9.5進(jìn)行切割；(7)將切割混合物過柱進(jìn)行純化。本方法的關(guān)鍵創(chuàng)新是如下3點(diǎn)(1)引入葡萄球菌核酸酶基因作為重組蛋白_多肽的載體。葡萄球菌核酸酶的表達(dá)產(chǎn)率非常高，純化非常簡單。只需過一次SP-Sepharose(SP瓊脂 糖凝膠)層析柱，就可達(dá)到95%以上的純度。(2)利用半胱氨酸的氰基化反應(yīng)，重組蛋白_多肽的切割采用特異性化學(xué)裂解 法，這種切割法具有較高的特異性.它只能特異的切割x-Cys之間的化學(xué)鍵，χ可以為任 何殘基，切割產(chǎn)物為葡萄球菌核酸酶、少量未被切割的葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白 及目的多肽。多肽可以通過過一次SP瓊脂糖凝膠層析柱得到純化。(3)這種切割要在尿素或鹽酸胍條件下進(jìn)行，因此即使載體蛋白_多肽的融合蛋 白以包涵體形式表達(dá)，切割也不受影響。本發(fā)明的以上特點(diǎn)解決了其它方法所存在的主要問題，這是一種高產(chǎn)量、低成 本的生產(chǎn)多肽方法。在本發(fā)明中，重組表達(dá)載體可以用本領(lǐng)域熟知的方法引入宿主細(xì)胞，這些方法 包括電轉(zhuǎn)化法，氯化鈣法，基因槍法等。將外源重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程稱為
“轉(zhuǎn)化”。通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)所需蛋白的表達(dá)，并通過本領(lǐng)域所熟知的蛋白分離 技術(shù)，如柱層析等得到所需的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞如 大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或各種動植物細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選 的表達(dá)宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明的有益效果在于采用生物學(xué)方法結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù) 制備多肽，產(chǎn)量高，成本低，易于純化，環(huán)境污染少。重組多肽即使以包涵體的形式表 達(dá)，也可以進(jìn)行切割。本發(fā)明的方法便于工業(yè)化實施，具有較大的產(chǎn)業(yè)化前景。


圖1是本發(fā)明實施例2中重組多肽的誘導(dǎo)表達(dá)示意圖，其中，1表示重組 多肽表達(dá)菌株BL21 (DE3)/SNase-peptide_pET2Ia誘導(dǎo)前；2表示重組多肽表達(dá)菌株 BL21 (DE3) /SNase-peptide-pET21a, 0.4mM IPTG 誘導(dǎo) 4 小時后。圖2是本發(fā)明實施例5中重組多肽經(jīng)NTCB (2_硝基_5_硫氰苯甲酸)切割為目 的多肽的示意圖，其中，1表示表達(dá)的重組多肽切割前；2表示表達(dá)的重組多肽切割后。圖3是本發(fā)明實施例6中切割混合物過C18柱后的示意圖，其中第一個峰即為舉例的多肽峰。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實施例僅 用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1構(gòu)建表達(dá)載體基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease-Peptide)的堿基序列(如
SEQ ID NO 1所示的序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成)；基因合成葡萄球菌 核酸酶_多肽的堿基序列的方法按常規(guī)的基因合成方法，如根據(jù)葡萄球菌核酸酶_多肽 (Staphlococcal nuclease -Peptide)的堿基序列合成一組引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后拼 接為整段目的基因。之后，采用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切合成的堿基 序列(SEQ ID NO 1)、pET21a表達(dá)載體序列(購自Novagen)，通過DNA快速連接試劑 盒(GK6001)(購自上海捷瑞生物工程有限公司)連接兩個酶切的序列，這就是構(gòu)建的表 達(dá)載體。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到DH5a菌株(購自上海捷瑞生物工程有限公司)，涂 平板，37°C培養(yǎng)過夜。第二天挑取單菌落培養(yǎng)過夜，通過質(zhì)粒小量制備試劑盒(離心柱 型，GK2001)(購自上海捷瑞生物工程有限公司)抽提質(zhì)粒，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Nde I和Xho I雙酶切鑒定。并送雙酶切檢測正確的菌落到測序公司(上海美季生物技術(shù)有限 公司)進(jìn)行測序鑒定。實施例2轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到表達(dá)宿主，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組多肽通過熱激法(參考分子克隆)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3) (購自上海捷瑞生物工程有限公司)，獲得重組基因工程表達(dá)菌株BL21(DE3)/ SNase-peptide-pET21a0 在 37 °C 培養(yǎng)表達(dá)菌株 BL2I (DE3) /SNase-peptide-pET21a 至 OD700nm約為1.0，加入終濃度為0.4mM IPTG(異丙基-β _D_硫代半乳糖苷，購自上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，37°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時，誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果見圖1。實施例3收集、破碎細(xì)菌，純化表達(dá)的重組多肽通過離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌株BL21(DE3)/SNase-peptide_pET21a，超聲波破碎 細(xì)菌，13000rpm離心20分鐘。收集沉淀重懸于50mM tirs，8MUrea，pH8.0緩沖液，室 溫攪拌1小時，13000rpm離心20分鐘。上清液過SP-sepharose(SP-瓊脂糖凝膠)柱。
具體步驟如下1，3-5 倍體積 50mM tirs, 8M Urea, pH8.0 緩沖液平衡 SP-sepharose ；2，上清液上柱；3，3-5 倍體積 50mM tirs, 8M Urea, pH8.0 緩沖液洗滌 SP-sepharose ；4，0.05mMNaCl, 50mMtirs, 8M Urea, pH8.0 緩沖液洗滌 SP-sepharose ；5，0.08mM NaCl, 50mM tirs, 8M Urea, pH8.0 緩沖液洗脫 Staphlococcal nuclease-Peptid(葡萄球菌核酸酶-多肽)重組多肽。實施例4收集純化的重組多肽用乙醇來沉淀純化的重組多肽，乙醇與重組多肽溶液混合的體積比為3 1，4°C放置過夜，13000rpm離心20分鐘，收集沉淀。實施例5切割重組多肽將乙醇沉淀的重組多肽重懸于6M鹽酸胍，50mMtris (三羥甲基氨基甲烷)，pH 8.0的溶液中，室溫，攪拌重溶1小時，13000rpm離心20分鐘。取上清，計算重組多肽 溶液中巰基濃度，加入3倍于巰基濃度的DTT量，37°C攪拌放置1小時。再加入10倍 于此時重組多肽溶液中巰基濃度(包括半胱氨酸和DTT)的NTCB (2-硝基-5-硫氰苯甲 酸，購自sigma)量，37°C攪拌20分鐘。將上述混合物pH值調(diào)至9.0-9.5，37°C攪拌切 割16-20小時，切割結(jié)果見圖2，重組多肽經(jīng)NTCB切割為目的多肽。實施例6純化切割的重組多肽將實施例5的切割混合物過C18柱(購自北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)進(jìn)行純 化，具體步驟如下1，5%乙腈溶液平衡C18柱(250*3.2mm)30分鐘；
2，將實施例5的切割混合物過0.45um膜過濾，再上C18柱；
3，去離子水洗柱30分鐘；
4，再用不同濃度的乙腈水溶液，洗脫重組多肽。
實驗結(jié)果見圖3，其中第一個峰即為舉例的多肽峰。
序列表
<110>上海立凱德生物技術(shù)有限公司
<120> 一種結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù)生產(chǎn)多肽的方法
<130>NP-09-13412
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>480
<212>DNA
<213> 葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease-Peptide)
<400>1
catatggcaa cttcaacttt aattaaagcg attgatggtg atacggttaa attaatgtac60
aaaggtcaac caatgacatt cagactatta ttggttgata cacctgaaac aaagcatcct120
aaaaaaggtg tagagaaata tggtcctgaa gcaagtgcat ttacgaaaaa aatggtagaa180
aatgcaaaga aaattgaagt cgagtttgac aaaggtcaaa gaactgataa atatggacgt240
ggettagcgt atatttatgc tgatggaaaa atggtaaacg aagctttagt tcgtcaaggc300
ttggctaaag ttgcttatgt ttacaaacct aacaatacac atgaacaaca tttaagaaaa360
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gtgaccctgg cgcagcatat tagcgaagtg attacccagg attatacccg ttgactcgag480
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù)生產(chǎn)多肽的方法，其特征在于，該方法 以葡萄球菌核酸酶為載體蛋白，將目的多肽融合在葡萄球菌核酸酶的C端，在葡萄球菌 核酸酶和目的多肽之間有一個半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多肽的融合蛋白在大腸桿菌 中表達(dá)，并純化；然后多肽通過化學(xué)裂解技術(shù)從葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白上切割 下來；該方法具體包括如下步驟(1)基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽的堿基序列，經(jīng)過雙酶切該堿基序列和表達(dá)載體 序列，純化雙酶切的兩個序列，將堿基序列與表達(dá)載體序列進(jìn)行連接，這就是構(gòu)建的表 達(dá)載體；通過酶切、測序鑒定構(gòu)建的表達(dá)載體是否準(zhǔn)確；(2)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到表達(dá)宿主細(xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組多肽；(3)收集、破碎細(xì)菌，純化表達(dá)的重組多肽；(4)以乙醇為溶劑，沉淀并收集純化的重組多肽；(5)將沉淀的重組多肽重溶于鹽酸胍緩沖液，加入DTT和NTCB；(6)溶液pH調(diào)至9.0-9.5進(jìn)行切割；(7)將切割混合物過柱進(jìn)行純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)具體為以葡萄球菌核酸酶 為融合多肽片段的載體，采用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切合成的堿基序 列、pET21a表達(dá)載體序列，通過連接試劑盒連接兩個酶切的序列，這就是構(gòu)建的表達(dá)載 體；通過酶切、測序鑒定構(gòu)建的表達(dá)載體是否準(zhǔn)確。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)通過熱激法轉(zhuǎn)化表達(dá)載體到表 達(dá)宿主菌 BL21 (DE3) 37 °C 培養(yǎng)表達(dá)菌株 BL21 (DE3) /SNase-peptide-pET21a 至 OD700nm 為1.0，加入終濃度為0.4mM IPTG，37°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)通過超聲波破碎細(xì)菌，過SP 瓊脂糖凝膠純化表達(dá)的葡萄球菌核酸酶重組多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中用乙醇來沉淀純化的重組多 肽，乙醇與重組多肽溶液混合的體積比為3 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中將乙醇沉淀的重組多肽重懸 于6M鹽酸胍，50mMtris，pH 8.0的溶液中，室溫，攪拌重溶1小時，13000rpm/min離 心20分鐘；取上清，計算重組多肽溶液中巰基濃度，加入3倍于巰基濃度的DTT量， 37°C攪拌放置1小時；再加入10倍于此時重組多肽溶液中巰基濃度的NTCB量，37°C攪 拌20分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)中將溶液pH值調(diào)至9.0-9.5， 37°C攪拌切割16-20小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)合蛋白的生物表達(dá)和化學(xué)裂解技術(shù)生產(chǎn)多肽的方法，該方法以葡萄球菌核酸酶為載體蛋白，將目的多肽融合在葡萄球菌核酸酶的C端，在葡萄球菌核酸酶和目的多肽之間有一個半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多肽的融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并純化；然后多肽通過化學(xué)裂解技術(shù)從葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白上切割下來。本發(fā)明采用生物學(xué)方法制備多肽，產(chǎn)量高，成本低，環(huán)境污染少，且便于工業(yè)化實施，具有較大的產(chǎn)業(yè)化前景。
文檔編號C12R1/19GK102021193SQ20091005792
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者周建忠, 汪弋, 涂桂云 申請人:上海立凱德生物技術(shù)有限公司