專利名稱：N-端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)是涉及蛋白質(zhì)修飾領(lǐng)域，而且，更具體地說(shuō)是涉及對(duì)蛋白質(zhì)及其類似物附著水溶性多聚物的領(lǐng)域(本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”與“多肽”或“肽”這些術(shù)語(yǔ)，如未作其它說(shuō)明均指同一意思)。本發(fā)明還涉及用于N端修飾蛋白質(zhì)或其類似物的新方法和所得的組合物。另一方面，本發(fā)明涉及新N端化學(xué)修飾的G-CsF組合物和有關(guān)制備方法。本發(fā)明還涉及化學(xué)修飾的共有的干擾素。
背景技術(shù)：
目前，治療用蛋白質(zhì)之所以能以適當(dāng)?shù)男问郊俺渥愕臄?shù)量獲得主要是由于重組DNA技術(shù)的進(jìn)展。重組蛋白質(zhì)的可用性導(dǎo)致蛋白質(zhì)配方及化學(xué)修飾方面的進(jìn)展。這種化學(xué)修飾的目的之一就是蛋白質(zhì)保護(hù)?；瘜W(xué)附著可有效地阻止蛋白水解酶與蛋白質(zhì)骨架本身的接觸，從而阻止了蛋白質(zhì)的降解。其它的優(yōu)勢(shì)包括在特定環(huán)境條件下，增加治療蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及循環(huán)時(shí)間并且減小其免疫原性。描述蛋白質(zhì)修飾及融合蛋白質(zhì)的綜述性文章是Francis Focus on Growth Factors，34-10(1992年5月)(由Mediscript，Morntview Court，F(xiàn)riern BarnetLand，London N20，OLD，UK出版)。
聚乙二醇(“PEG”)就是一種這類化學(xué)修飾部分，它用來(lái)制備治療用蛋白質(zhì)產(chǎn)品(動(dòng)詞“PEG化”(pegylate)意指附著至少一個(gè)PEG分子)。例如Adagan即為腺苷脫氨酶的PEG修飾形式，已被獲準(zhǔn)用于治療嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷疾??；PEG化的起氧歧化酶已進(jìn)入治療頭部損傷的臨床試用階段；PEG化的α-干擾素已在治療肝炎的I期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試；另?yè)?jù)報(bào)導(dǎo)PEG化的葡萄糖腦苷脂酶和PEG化的血紅蛋白也已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)階段。附著聚乙二醇對(duì)蛋白水解的保護(hù)作用已見報(bào)道(Sada，等J.Fermentation Bioengineering 71137-139，1991)，附著特定的聚乙二醇部分的方法參見美國(guó)專利No.4,179,337,Davis et al.，“無(wú)免疫原性多肽”，于1979年12月18日公布。以及美國(guó)專利No.4,002,531，Royer，“聚乙二醇對(duì)酶的修飾及其生產(chǎn)的產(chǎn)品”，1977年1月11日公布。如果想對(duì)此領(lǐng)域有更全面的了解，可參見Abuchowski等“Enzymes as Drugs”(J.S.Holcerbergand J.Roberts，eds.pp.367-383頁(yè)(1981))。
已使用的其它水溶性多聚物如乙二醇、丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊環(huán)(poly-1，3-dioxolane)，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯馬來(lái)酸酐共聚物，多聚氨基酸(或者是單一聚體或者是隨機(jī)共聚體)。
對(duì)于聚乙二醇分子來(lái)說(shuō)，可通過(guò)多種方法將其加到蛋白質(zhì)上?？偟膩?lái)說(shuō)，聚乙二醇分子是通過(guò)一個(gè)在蛋白質(zhì)分子上發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)基團(tuán)而聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上的。氨基，如賴氨酸殘基上的或N-末端上的氨基通常用于這類附著。例如，Royer(美國(guó)專利號(hào)4,002,531，見上述)認(rèn)為可利用還原性烷基化反應(yīng)將聚乙二醇分子附著到酶上。Wright于1993年4月28日公開的EP0539167，“Peg Imidates and ProteinDerivates Thereof”中認(rèn)為帶有自由氨基的肽及有機(jī)復(fù)合物可被PEG的直接衍生物或有關(guān)的水溶性有機(jī)多聚體所修飾。Shaw在1990年2月27日公開的美國(guó)專利號(hào)4,904,584中涉及修飾蛋白質(zhì)中用于通過(guò)反應(yīng)性氨基基團(tuán)附著聚乙二醇分子的賴氨酸殘基的數(shù)目。
“G-CSF”，粒細(xì)胞集落刺激因子即為一種經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的具體治療用蛋白質(zhì)。G-CSF誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞的快速增殖并釋放到血液中，從而在抗感染中提供治療效應(yīng)。
歐洲專利公開EP0401384于1990年12月12日公開的題為“化學(xué)修飾的粒細(xì)胞集落刺激因子”中描述了用于制備附著有聚乙二醇分子的G-CSF的材料和方法。
1992年3月4日公開的題為“連續(xù)性釋放包含一個(gè)多肽分子共價(jià)結(jié)合上一水溶性多聚體的藥用組合物”的EP0473268中報(bào)道了修飾的G-CSF及其類似物，描述了各種G-CSF及其共價(jià)結(jié)合上一水溶性顆粒多聚體如聚乙二醇所產(chǎn)生的衍生物的使用。
于1989年10月4日公開的EP0335423報(bào)道了一種修飾的具有人類粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽。
另一個(gè)例子是PGE化的IL-6，在題為“修飾的hIL-6”(參見共同未決的U.S.S.N.07/632,070)的EP0442724中公開了將聚乙二醇分子附著到IL-6分子上。
于1985年9月11日公開的EP0154316報(bào)道了一淋巴細(xì)胞活素(Lymphokine)與一聚乙二醇的醛發(fā)生反應(yīng)。
許多給蛋白質(zhì)分子附著多聚物的方法涉及使用某一部分作為聯(lián)接基團(tuán)。然而這些部分往往具有抗原性。可進(jìn)行一種不涉及聯(lián)接基團(tuán)的tresylchloride法，但由于tresyl chloride的使用會(huì)產(chǎn)生毒副產(chǎn)品，故很難用該方法生產(chǎn)治療用產(chǎn)品。參見Francis等蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性體內(nèi)的降解途徑及蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的策略(Eds.Ahern.，T.and Manning，M.C.)(plenum，New York，1991)。同時(shí)還可參見Delgado等.，“通過(guò)Tresyl chloride激活偶聯(lián)PEG到蛋白質(zhì)在免疫親合細(xì)胞制備中的應(yīng)用”。Fisher等eds.，水相系統(tǒng)分離在細(xì)胞生物學(xué)及生物技術(shù)中的應(yīng)用，Plenum Press，N.Y.N.Y.，1989 pp.211-213。
Chamow等(Bioconjugate Chem.5133-140(1994))報(bào)道了CD4免疫吸附素(immanoadhesin)通過(guò)與單甲氧基多聚乙二醇醛發(fā)生還原性烷化作用進(jìn)行修飾。作者報(bào)道50％的CD4-Ig在PEG化反應(yīng)程度可控的條件下進(jìn)行MePEG修飾。出處同上，見137頁(yè)。作者還報(bào)道了在體外，修飾的CD4-Ig結(jié)合(對(duì)蛋白gp120)的能力與其MePEG化的程度呈負(fù)相關(guān)。出處同上，同樣也可參見Rose et al.，Bioconjugate Chemistry 2154-159(1991)，文中報(bào)道了連接基團(tuán)卡巴肼(carbohydrazide)選擇性地附著到蛋白質(zhì)底物(胰島素)的C-末端羧基上。
然而，在整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)或涉及特定蛋白質(zhì)的領(lǐng)域內(nèi)還沒(méi)有一種方法能夠讓水溶性多聚物選擇性地附著到蛋白質(zhì)如G-CSF的N-末端上。更有甚者，目前存在的方法在任何反應(yīng)基團(tuán)上提供非選擇性附著反應(yīng)，無(wú)論這些基團(tuán)是在蛋白質(zhì)內(nèi)(例如，賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán))，還是在N-末端上。這將會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的不均一。例如，PEG化的G-CSF分子，有些分子中含有數(shù)目不同于其它分子的聚乙二醇部分。比如一個(gè)含5個(gè)賴氨酸殘基的分子在上述反應(yīng)中可能會(huì)形成一種不均一混合物，一些分子含有6個(gè)聚乙二醇分子，一些分子中具有5個(gè)，一些分子中具有4個(gè)，一些分子中具有3個(gè)，一些分子中具有2個(gè)，以及具有1個(gè)甚至一個(gè)聚乙二醇分子也沒(méi)有。并且在帶有一些聚乙二醇的分子中，聚乙二醇分子在不同的分子中可能不會(huì)附著于相同的位置。
以上這些都是開發(fā)治療用PEG化蛋白質(zhì)產(chǎn)品不中利因素。開發(fā)這類藥物時(shí)，產(chǎn)品生物活性的可預(yù)見性顯得分外重要。例如，在超氧化物歧化酶非選擇性地與聚乙二醇分子結(jié)合的情況下，一部分修飾的酶完全喪失活性(P.McGoff et al.Chem.Pharm.Bull.363079-3091(1988))。如果這些治療性蛋白質(zhì)在組合物中各批量間有區(qū)別，人們將無(wú)法對(duì)其生物活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。不同位點(diǎn)結(jié)合的聚乙二醇分子穩(wěn)定性不同，這一情況可能導(dǎo)致這些分子從蛋白質(zhì)中解離出來(lái)。當(dāng)然，如果這些分子是隨機(jī)附著而因此隨機(jī)解離，那么治療用蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)就不可能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。從消費(fèi)者的角度考慮，不同批量的循環(huán)時(shí)間不盡相同，因此劑量上也可能是不準(zhǔn)確的。從生產(chǎn)者角度考慮，獲準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)的治療用蛋白質(zhì)的保存將增添麻煩。此外，上述方法沒(méi)有一個(gè)提供無(wú)連接部分(蛋白質(zhì)和多聚體之間)的選擇性N-末端化學(xué)修飾。如果合用連接部分，由于可能的抗原性，可能產(chǎn)生不利影響。
因此，仍需要能選擇性N端化學(xué)修飾蛋白質(zhì)及其類似物，包括G-CSF及共有干擾素(以下就以這兩種化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)為例加以說(shuō)明)的方法本發(fā)明從諸多方面闡述了這一需要。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及N-端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)的基本上均一的制品及其所用的方法。出乎意料的是N-末端化學(xué)修飾的G-CSF顯示出在該分子的另一位點(diǎn)上含一個(gè)化學(xué)修飾的其它G-CSF各類所未發(fā)現(xiàn)的在穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢(shì)。更出人意料的是在用于制備N-末端化學(xué)修飾的G-CSF的本方法中，發(fā)現(xiàn)使用還原性烷基化反應(yīng)能夠提供選擇性地修飾N-末端的條件，并且該方法可廣泛地應(yīng)用于其它蛋白質(zhì)(或其類似物)以及G-CSF。令人驚奇的是，利用還原性烷基化反應(yīng)，其終產(chǎn)物-以胺鍵與水溶性多聚體結(jié)合的蛋白質(zhì)，要比具有酰胺鍵(amide link age)的相同多聚物/蛋白質(zhì)連接物穩(wěn)定得多。另外一個(gè)這樣修飾的蛋白質(zhì)(如下就以此為實(shí)施例加以描述)是共有干擾素(consensus interferon)。因此，正如上面所要詳述的，本發(fā)明具有涉及化學(xué)修飾蛋白質(zhì)(或其類似物)以及特定蛋白質(zhì)的特殊修飾的諸多方面的內(nèi)容。
一方面，本發(fā)明涉及N-末端化學(xué)修飾的G-CSF(或其類似物)的基本上均一的制品及有關(guān)方法。在下面實(shí)施例中說(shuō)明了N-末端單個(gè)PEG化的mono-PEG的G-CSF要較其它類型的單個(gè)PEG化的G-CSF更穩(wěn)定。另外，由于G-CSF分子的N-末端在反應(yīng)過(guò)程中較易與聚乙二醇分子接近，N-末端PEG化比例較高，因此該方法操作起來(lái)比較具有優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明還涉及一種還原性烷基化反應(yīng)類型。該反應(yīng)可選擇性地激活蛋白質(zhì)或其類似物N-末端殘基的氨基基團(tuán)，從而使水溶性多聚體部分選擇性附著到N端。這樣提供了多聚體/蛋白質(zhì)結(jié)合分子的基本上均一的制品以及(如果應(yīng)用聚乙二醇的話)具有聚乙二醇部分直接偶聯(lián)到蛋白質(zhì)部分上的PEG化蛋白質(zhì)分子的制品。下面描述了用于G-CSF及共有干擾素的這一方法，這些內(nèi)容提供了本發(fā)明的其它方面。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A為一PEG化的G-CSF離子交換色譜峰的色譜圖復(fù)制品。
圖1B各種類型單PEG化G-CSF的SDS-PAGE圖。
圖2線A為重組人類甲二磺酰G-CSF標(biāo)準(zhǔn)樣的SEC-HPLC圖；線B為SCM-PEG-GCSF反應(yīng)混合物；線C為N-末端PEG化的G-CSF；線D為35賴氨酸單個(gè)PEG化的G-CSF；線E為賴氨酸41單個(gè)PEG化的G-CSF。
圖3A、3B及3C為經(jīng)內(nèi)蛋白酶(endoproteinase)SV8肽酶切后的HPLC圖，3A為N-末端PEG化的G-CSF；3B為35賴氨酸單個(gè)PEG化的G-CSF；3C為賴氨酸41單個(gè)PEG化的G-CSF。
圖4是一條形圖，圖示在體外，單個(gè)PEG化的G-CSF種類與未PEG化的標(biāo)準(zhǔn)樣生物活性的比較。
圖5A及5B顯示了在體內(nèi)單個(gè)PEG化的G-CSF衍生物生物活性的分析結(jié)果，圖5A顯示倉(cāng)鼠經(jīng)皮下注射N-末端PEG化的G-CSF，35賴氨酸單個(gè)PEG化的G-CSF或賴氨酸41單個(gè)PEG化的G-CSF后白血球計(jì)數(shù)的平均值，圖5B顯示經(jīng)單次皮下注射上述各種單個(gè)PEG化的G-CSF衍生物后曲線下的最終平均白血球數(shù)面積。
圖6A、6B及6C為研究N-末端PEG化的G-CSF或35賴氨酸單個(gè)PEG化的G-CSF的穩(wěn)定性所得的SEC-HPLC圖。圖6A為在pH6.0，4℃條件下研究N-末端單個(gè)PEG化的G-CSF穩(wěn)定性的SEC-HPLC圖，圖6B為相同條件下35賴氨酸單個(gè)PEG化的G-CSF圖。圖6C顯示在pH6.0及4℃下進(jìn)一步對(duì)35賴氨酸單個(gè)PEG化的G-CSF穩(wěn)定性研究結(jié)果。時(shí)間(“T”)表示天。
圖7顯示了rh-G-CSF與甲氧聚乙二醇醛(MW6kDa)發(fā)生還原性烷基化反應(yīng)的過(guò)程中反應(yīng)混合物的篩析(size exclusion)HPLC分析結(jié)果。
圖8顯示了用MPEG(也在MW＝6kDa)N-羥基琥珀酰酯的反應(yīng)混合物篩析(size exclusion)HPLC分析圖。
圖9為單次皮下注射劑量的單N-末端MPEG-GCSF接合物(由rh-G-CSF不同分子量的MPEG醛經(jīng)過(guò)還原性烷化反應(yīng)制得，其中MPEG的分子量為6kDa、12kDa以及20kDa)后總的白血球反應(yīng)情況。
詳細(xì)描述本發(fā)明涉及N-末端化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的基本上均一的制品及其所用的方法。
一方面，本發(fā)明涉及N-末化學(xué)修飾的G-CSF的組合物及其所用的方法。
本方法(用于N-末端修飾G-CSF以及還原性烷基化反應(yīng)法)提供了單聚體/蛋白質(zhì)連接物的基本上均一的混合物。本文所用的“基本上均一的”意指觀察到的每個(gè)聚合物/蛋白質(zhì)連接物分子中均只含一個(gè)聚合物部分。制品中也許會(huì)包含未反應(yīng)(即缺乏聚合物部分)的蛋白質(zhì)。在下面的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)肽圖譜(peptide mapping)及N-末端測(cè)序證實(shí)，制備出的制品中至少含90％的單聚體/蛋白質(zhì)連接物，未反應(yīng)蛋白質(zhì)含量最多不超過(guò)10％。優(yōu)選的是，N-末端單個(gè)PEG化物質(zhì)含量至少應(yīng)達(dá)到制品的95％(正如在下面實(shí)施例中所述)，最優(yōu)選的是，N-末端單個(gè)PEG化物質(zhì)占制品的99％或更高。這種單聚體/蛋白質(zhì)連接物具有生物活性。本文提供的“基本上均一”的N-末端PEG化的G-CSF制品意指這些制品的均一性足以能夠顯示出均一制品所具有的優(yōu)越性，例如，易于在臨床應(yīng)用中預(yù)測(cè)不同批量的藥物動(dòng)力學(xué)。
人們可以選擇制備聚合物/蛋白質(zhì)連接物分子混合物，本文提供的優(yōu)勢(shì)在于，人們可以選擇單聚體/蛋白質(zhì)連接物在混合物中的比例。這樣，如果需要的話，人們便可以制備出帶有不同數(shù)目附著的聚合物分子(比如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)等等)的各種蛋白質(zhì)混合物，并與利用本發(fā)明方法制備出的單聚體/蛋白質(zhì)連接物結(jié)合，便可得到預(yù)定單聚體/蛋白質(zhì)連接物比例的混合物。
下面提供使用G-CSF的實(shí)施例，如上所述，G-CSF是用于治療造血障礙的治療用蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明實(shí)施中有用的G-CSF可以是從哺乳動(dòng)物有機(jī)體中分離的，或者作為選擇是化學(xué)合成方法的產(chǎn)品，或者是通過(guò)原核生物或真核生物宿主表達(dá)外源性DNA序列而得到的產(chǎn)品，其中這些DNA可從基因組或cDNA克隆或通過(guò)DNA合成得到。合適的原核生物宿主包括各種細(xì)菌(如，E.coli)；合適的真核生物宿主包括酵母(如S.cerevisiae)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，猴細(xì)胞)。依據(jù)所用的宿主的不同，G-CSF表達(dá)產(chǎn)物可能會(huì)被哺乳動(dòng)物或其它真核細(xì)胞中的碳水化合物所糖基化，或非糖基化。G-CSF表達(dá)產(chǎn)物中也可以包括一個(gè)起始的甲硫氨酸殘基(在第-1位)。雖然優(yōu)選重組G-CSF(特別是來(lái)自E.coli)，本發(fā)明預(yù)測(cè)了使用任意或全部其它生物中G-CSF的這類形式的最大商業(yè)實(shí)用性。
已有報(bào)道一些G-CSF類似物具有生物學(xué)功能，這些分子也可以是化學(xué)修飾的，例如，添加上一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子。G-CSF類似物在美國(guó)專利No.4,810,643中已有報(bào)道。具報(bào)道有生物活性的其它G-CSF類似物的例子有AU-A-76380/91，EP0459630，EP0272703，EP0473268以及EP0335423中所描述的那些，雖然文中沒(méi)提供報(bào)道公開的每種類似物的活性。還可參見AU-A-10948/92，PCTUS94/00913以及EP0243153。
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明中有用的G-CSF及其類似物可以通過(guò)進(jìn)行本文提供的化學(xué)修飾程序以選擇性地修飾N-末端α-氨基，試驗(yàn)所得產(chǎn)品的所需生物學(xué)特征，例如本文提供的生物活性試驗(yàn)來(lái)確定。當(dāng)然，如果需要對(duì)非人類哺乳動(dòng)物進(jìn)行這類治療，可以使用重組非人類的G-CSF，如重組鼠、牛及犬等的G-CSF產(chǎn)品。例如，參見PCT WO 9105798及PCT WO 8910932。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面包括N-末端化學(xué)修飾的G-CSF類似物的組合物。如上所述，G-CSF類似物可包括具有氨基酸添加、缺失和/或替代(與下面實(shí)施例1中所述的G-CSF氨基酸序列相比較而言)的產(chǎn)物。那些當(dāng)N-末端被PEG化時(shí)預(yù)期發(fā)揮功能以選擇性刺激中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生的G-CSF類似物是為結(jié)合到G-CSF受體上并非必要的N-末端的類似物，見Hill et al.，PNAS-USA 905167-5171(1993)；也可參見PCT US 94/00913。
使用的聚合物分子可選自水溶性多聚體。(對(duì)于本文描述的還原性烷基化方法，多聚體應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)醛基)。選擇性聚合物分子應(yīng)是水溶性的，使其要結(jié)合的蛋白質(zhì)分子在水環(huán)境中不會(huì)發(fā)生沉淀現(xiàn)象，例如生理環(huán)境中。從還原性烷基化反應(yīng)角度考慮，選擇的聚合物分子應(yīng)具有一個(gè)反應(yīng)醛基，這樣就可以根據(jù)本發(fā)明方法對(duì)聚合程度進(jìn)行控制。多聚體可以是分枝或不分枝的。對(duì)于終產(chǎn)物制品的治療用途，優(yōu)選的聚合分子應(yīng)是藥用上可接受的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能夠根據(jù)該聚合物/蛋白質(zhì)連接物是否在治療上使用來(lái)選擇所需的聚合物，如果是在治療上使用，則應(yīng)考慮其劑量，循環(huán)時(shí)間，對(duì)蛋白水解的抵抗力以及其它一些因素。對(duì)于G-CSF來(lái)說(shuō)，可用本文中提供的測(cè)試手段加以探知，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)針對(duì)其它治療性蛋白質(zhì)選擇合適的測(cè)試手段。水溶性多聚體可選自如上面所列出的(背景部分)各種分子以及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化丙烯/氧化乙烯(prolypropylene oxide/ethylene oxide)共聚物，聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。
出于下面所述的最優(yōu)化考慮，聚合物的分子量可以是任意大小，并且可以是帶有分枝或不分枝的。對(duì)于聚乙二醇來(lái)說(shuō)，最優(yōu)選的分子量是約為2kDa到大約100kDa之間(術(shù)語(yǔ)“大約”意指聚乙二醇制品中，一些分子大于所述分子量，另一些分子小于所述分子量)。下面的實(shí)施例1及實(shí)施例2涉及PEG6000，其選擇便于純化及提供一個(gè)合適的模式系統(tǒng)。其它大小的使用取決于所需的治療方案(情況例如所需的緩釋持續(xù)時(shí)間，效力如果在生物活性方面有效的話，處理的方便性，抗原性大小或缺乏以及其它一些PEG對(duì)治療性蛋白質(zhì)及其類似物的已知效應(yīng)。
本發(fā)明的一個(gè)具體方面就是N-末端單個(gè)PEG化的G-CSF分子，它由一個(gè)聚乙二醇部分和一個(gè)G-CSF部分組成。對(duì)于該組合物，人們可從多種聚乙二醇分子(以分子量及有無(wú)分枝等)，反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子對(duì)G-CSF蛋白質(zhì)分子的比例，所進(jìn)行的PEG化反應(yīng)的類型，獲得選擇性N-末端PEG化的G-CSF的方法及所要使用的G-CSF的類型等方面進(jìn)行選擇。此外，本組合物及方法還包括藥用組合物的配方，藥劑的治療和生產(chǎn)方法。
聚乙二醇分子對(duì)蛋白質(zhì)分子的比例與它們?cè)诜磻?yīng)混合物中的濃度一樣，可以改變。一般來(lái)說(shuō)，最佳比例(是指反應(yīng)效率而言，即反應(yīng)混合物中沒(méi)有多余未反應(yīng)的蛋白質(zhì)及聚合物分子)將根據(jù)所選聚乙二醇分子量進(jìn)行測(cè)定。此外，正如本方法的一個(gè)實(shí)施例中涉及的非特異性PEG化反應(yīng)和隨后的N-末端單個(gè)PEG化產(chǎn)物的純化，比例取決于可參加反應(yīng)的可得到的反應(yīng)基團(tuán)數(shù)(典型的是∝或з氨基)。本文的一個(gè)實(shí)施例中涉及的蛋白質(zhì)PEG分子的反應(yīng)比例相當(dāng)?shù)鸵垣@得基本上為單個(gè)PEG化的產(chǎn)品(每個(gè)蛋白質(zhì)分子對(duì)1.5個(gè)PEG分子)。
為了獲得N-末端PEG化的G-CSF，也有多種如上所述的或者在下面實(shí)施例2中所述的還原性烷基化反應(yīng)的PEG化反應(yīng)方法可供選擇。有關(guān)聚乙二醇部分與蛋白質(zhì)部分之間無(wú)連接基團(tuán)的聚合方法在Franciset al在蛋白質(zhì)藥品的穩(wěn)定性體內(nèi)降解途徑及使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的策略(Eds.Ahern.，T.and Manning，M.C.Plenum，New York，1991)中已有過(guò)描述。另外，Delgado et al.，“通過(guò)TresylChloride激活方法偶聯(lián)PEG到蛋白質(zhì)在免疫親合細(xì)胞制品中的應(yīng)用”及Fisher et al.，eds.，水相系統(tǒng)分離在細(xì)胞生物學(xué)及生物技術(shù)中的應(yīng)用，Plenum Press，N.Y.N.Y.，1989 pp.211-213中涉及利用tresyl chloride，從而使聚乙二醇部分和蛋白質(zhì)部分間沒(méi)有連接基團(tuán)存在。該方法由于會(huì)產(chǎn)生毒副產(chǎn)品，故很難用于生產(chǎn)治療周產(chǎn)品。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中涉及使用羧甲基甲氧聚乙二醇的N-羥基琥珀酰脂。正如下面將會(huì)更為詳細(xì)地講座的另一實(shí)施例涉及使用還原性烷基化反應(yīng)方法。
獲取N-末端PEG化的G-CSF制品的方法(即，如有必要，把該部分從其它單個(gè)PEG化的部分中分離出來(lái))可以經(jīng)過(guò)從PEG化的G-CSF分子群體中純化N-末端PEG化的產(chǎn)物。例如，在下面的實(shí)施例中，PEG化的G-CSF首先通過(guò)離子交換色譜分離以獲得具有電荷特征的單個(gè)PEG化物質(zhì)(可能存在含有相同的表觀電荷的其它多個(gè)PEG化的物質(zhì))，然后使用分子篩層析(size exclusion chromatography)分離單個(gè)PEG化的產(chǎn)品。通過(guò)這種方法，將N-末端單個(gè)PEG化的G-CSF從其它類型的單個(gè)PEG化的物質(zhì)及其它多個(gè)PEG化的物質(zhì)中分離出來(lái)。其它方法已見報(bào)道。例如，PCT WO 90/04606，(1990年5月3日公開)中報(bào)道了一種分離PEG-蛋白質(zhì)加合物混合物的方法，其中包括用含PEG的水性兩相系統(tǒng)PEG/分離(partitioning)蛋白質(zhì)加合物。
在另一方面，本發(fā)明還提供了選擇性獲得N-末端化學(xué)修飾蛋白質(zhì)(或其類似物)的方法。下述為一種利用還原性烷基化反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾的方法，它利用可獲得的一價(jià)氨基(primaryamino group)(賴氨酸對(duì)N末端)的不同類型的特異性反應(yīng)來(lái)進(jìn)行特定蛋白質(zhì)的修飾。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，成功地用帶有聚合物的羰基將蛋白質(zhì)的N-末端進(jìn)行了選擇性的修飾。在能夠利用賴氨酸殘基上ε-氨基和蛋白質(zhì)N-末端α-氨基的pKa差異的pH下進(jìn)行該反應(yīng)。通過(guò)這種選擇性修飾，控制水溶性聚合物附著到蛋白質(zhì)上聚合物的連接主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的N-末端，而其它反應(yīng)基團(tuán)(如賴氨酸殘基上的側(cè)鏈氨基)則沒(méi)有明顯的修飾發(fā)生。
更為重要而且令人驚奇的是，本發(fā)明提供了一種制備單聚體/蛋白質(zhì)連接物分子的基本上均一的制品的方法，不需使用其它化學(xué)修飾化學(xué)方法所需的進(jìn)一步純化。此外，具有胺鍵的產(chǎn)物出乎意料地比以酰胺鍵形成的產(chǎn)物更穩(wěn)定。這一點(diǎn)將會(huì)在下面的詳細(xì)研究中得到證明。更具體地說(shuō)，如果使用聚乙二醇，本發(fā)明還提供了沒(méi)有可能的抗原性連接基團(tuán)，并具有直接偶聯(lián)到蛋白質(zhì)部分的聚乙二醇部分而無(wú)毒副產(chǎn)品的N-末端PEG化的蛋白質(zhì)。
反應(yīng)可見下圖描述(圖中氰基硼氫鈉為舉例性還原劑) 因此，本發(fā)明的一方面內(nèi)容是制備聚合物/蛋白質(zhì)連接物的方法，包括(a)在還原性烷基化反應(yīng)條件下，將含多于一個(gè)氨基的蛋白質(zhì)分子與水溶性聚合物分子反應(yīng)，反應(yīng)液的pH應(yīng)適于選擇激活所說(shuō)蛋白質(zhì)分子氨基末端的α-氨基，所以所述水溶性聚合物附著于所述α-氨基基團(tuán)，以及；(b)獲取反應(yīng)產(chǎn)物。可從任選從未反應(yīng)的分子中分離反應(yīng)產(chǎn)物，但對(duì)于治療用產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，這是優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容是這種還原性烷基化反應(yīng)，它能夠?qū)⒕酆衔锓肿舆x擇性地附著到任意在N-末端具有α-氨基的蛋白質(zhì)上，并提供了一種單聚體/蛋白質(zhì)連接物的基本上均一的制品。這里所用的術(shù)語(yǔ)“單聚體/蛋白質(zhì)連接物”意指由一個(gè)聚合物部分附著到一個(gè)蛋白質(zhì)部分上組成的組合物(也包括本文所述的使用蛋白質(zhì)類似物的那些連接物)。單聚體/蛋白質(zhì)連接物具有位于N-末端而不是側(cè)鏈氨基上(如賴氨酸側(cè)鏈的氨基)的一個(gè)聚合物部分。制品優(yōu)選含大于80％的單聚體/蛋白質(zhì)連接物，更優(yōu)選大于95％的單聚體/蛋白質(zhì)連接物。
對(duì)于基本均一的單聚體/蛋白質(zhì)連接物分子群體，其反應(yīng)條件應(yīng)是讓水溶性聚合物分子選擇性地附著到所需蛋白質(zhì)的N-末端上。這種反應(yīng)條件一般造成賴氨酸氨基與N-末端α-氨基的pKa差異(pK是指氨基質(zhì)子化和非質(zhì)子化各占50％時(shí)的pH)。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，可使用不同的pH以使N-末端α-氨基得到最佳修飾。
pH往往也會(huì)影響所用的聚合物分子與蛋白質(zhì)分子的比例。一般來(lái)說(shuō)，如果反應(yīng)液pH低于pK，聚合物分子比例應(yīng)大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子為宜(即N-末端的α-氨基反應(yīng)性越少，達(dá)到最佳條件所需的聚合物越多)。如果pH高于pK，則聚合物蛋白質(zhì)分子的比例不必要太大(即得到的反應(yīng)基團(tuán)越多，所需的聚合物分子越少)。
另一個(gè)需要考慮的重要條件是聚合物的分子量。一般來(lái)說(shuō)，聚合物的分子量越大，結(jié)合到蛋白質(zhì)上的聚合物分子數(shù)越少。同樣，在優(yōu)化這些參數(shù)時(shí)，聚合物分子是否有分枝也應(yīng)加以考慮?？傊?，聚合物分子量越高(或分枝越多)，聚合物蛋白質(zhì)的比例亦應(yīng)越高。
對(duì)于這個(gè)還原性烷基化反應(yīng)，其還原劑在水溶液應(yīng)該比較穩(wěn)定，最好僅能還原在還原性烷化反應(yīng)初始階段所形成的西佛堿(Schiffbase)。優(yōu)選的還原劑可選自硼氫化鈉，氰基硼氫鈉，硼酸二甲胺，硼酸三甲胺以及硼酸吡啶。在下面實(shí)施例中使用的是氰基硼氫鈉。
水溶性聚合物分子可以是上面描述的類型，其分子中應(yīng)具備單個(gè)反應(yīng)醛基使其偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上。對(duì)于聚乙二醇，使用用于與G-CSF偶聯(lián)及PEG12000用于和共有干擾素偶聯(lián)在下面描述。值得一提的是對(duì)于G-CSF，本方法中，PEG12000，20000及25000均被成功地使用過(guò)。聚乙二醇丙醛(見美國(guó)專利No.5,252,714)由于其在水中有較好的穩(wěn)定性而具有一定優(yōu)勢(shì)。
如上所述，本方法廣泛適用于具有N-末端α-氨基的任何蛋白質(zhì)及其類似物。例如，由細(xì)菌表達(dá)外源性DNA而獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，由于細(xì)菌表達(dá)的結(jié)果，其N-末端的甲硫氨酸(methionyl)殘基上帶有一個(gè)α-氨基。如上所述，包括肽在內(nèi)，均是一些肽類似物及其它的修飾蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)類似物，如上所述的G-CSF類似物及非天然存在的共有干擾素均適用于此方法。
因此，對(duì)于該N-末端化學(xué)修飾的G-CSF，本文所述的任意G-CSF或其類似物均合用(例如，出處同上的文章所描述的那些)。下面實(shí)施例中所用的是細(xì)菌中產(chǎn)生的重組G-CSF，具有174個(gè)氨基酸殘基及一額外的甲硫氨基酸殘基。如本文所述，化學(xué)修飾可使用本文描述的任何水溶性聚合物分子進(jìn)行，下面的實(shí)施例中使用的是聚乙二醇。
共有干擾素是本實(shí)施例中所用的另一種蛋白質(zhì)。下面要描述的是用本發(fā)明中的還原性烷化的反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)N-末端的單個(gè)PEG化修飾，從而制備出化學(xué)修飾的共有干擾素。因此，本發(fā)明的另一方面涉及這些制品。正如本文所用的，共有人淋巴細(xì)胞干擾素在此稱為“共有干擾素”，或“IFN-con”，意即為一個(gè)非天然多肽，它主要包括所有天然人白細(xì)胞干擾素亞型序列共有的那些氨基酸殘基，而且它還包括在所有亞型無(wú)共同氨基酸的一個(gè)或多個(gè)位置上，主要發(fā)生于該位置一個(gè)氨基酸，并且在任何情況下，不包括在至少一個(gè)天然存在的亞型中不出現(xiàn)于該位置的任意氨基酸殘基。IFN-con包括三個(gè)氨基酸序列，分別命名為IFN-con1、IFN-con2及IFN-con3，它在共同擁有的美國(guó)專利4,695,623及4,897,471中公開，本文引用其全文以供參考。(美國(guó)專利Nos.4,897,471及4,695,623中使用“α”命名，而本文未用)。編碼IFN-con的DNA序列可按上述專利或其它標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行合成。IFN-con多肽最好是通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合成的DNA序列到細(xì)菌宿主中，尤其是E.coli表達(dá)產(chǎn)生。即IFNcon是重組IFN-con。以本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法和在Klein et al.，J.Chromatog.454205-215(1988)中描述的用于IFN-con1的方法可純化優(yōu)選在E.coli中生產(chǎn)出的IFN-con。純化的IFN-con可能包括其異構(gòu)體的混合物，如純化的IFN-con1中可能包含有甲硫酰IFN-con1，去甲硫氨酰IFN-con1及N-末端封閉的去甲硫氨酰IFN-con1(Keinet al.，Arc.Biochem.Biophy s.276531-537(1990))。作為選擇，IFN-con可包括特異性分離的異構(gòu)體，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的諸如等電點(diǎn)聚焦的技術(shù)來(lái)彼此分離IFN-con的異構(gòu)形式。
因此，本發(fā)明的另一方面內(nèi)容是化學(xué)修飾的共有干擾素，其中所說(shuō)的共有干擾素是選自IFN-con1，IFN-con2，及IFN-con3?；瘜W(xué)修飾時(shí)用本文所述的水溶性聚合物例如PEG，以及用于N-末端選擇性化學(xué)修飾的還原性烷基化方法。本文的實(shí)施例3中描述了IFN-con1的化學(xué)修飾，包含將IFN-con1分子在N-末端與聚乙二醇分子(PEG12000)相結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明方法生產(chǎn)出的PEG化蛋白質(zhì)是聚乙二醇部分直接與蛋白質(zhì)部分相連接，沒(méi)有聯(lián)接基團(tuán)存在，也不產(chǎn)生任何毒副產(chǎn)品。實(shí)施例中包括G-CSF及本文所述的共有干擾素。對(duì)于PEG化G-CSF蛋白質(zhì)分子的群體，其中聚乙二醇部分是直接偶聯(lián)到G-CSF蛋白質(zhì)部分上(但并不一定是N-末端PEG化的G-CSF分子的群體)，還原性烷基化反應(yīng)可以在酸性或非酸性環(huán)境中進(jìn)行。
本發(fā)明還有一方面是關(guān)于上述有關(guān)藥用組合物。這種藥用組合物可適于注射，或者是口服，作用于肺、鼻腔以及其它形式的施用。一般來(lái)說(shuō)，包含于本發(fā)明中的藥用組合物包含有效量的本發(fā)明的單聚體/蛋白質(zhì)連接物產(chǎn)物以及藥用上可接受的稀釋劑，保存劑，增溶劑，乳化劑，佐劑及/或載體。這類組合物中包括各種緩沖液組份(如Tris-HCl，醋酸鹽，磷酸鹽)，pH及離子強(qiáng)度的稀釋劑；添加劑諸如去污劑及增溶劑(如Tween 80，多聚山梨醇酯80)，抗氧化劑(如抗壞血酸，偏亞硫酸氫鈉)，保存劑(如水楊乙汞，苯甲醇)以及填充物質(zhì)(如乳糖，甘露醇)；將這些物質(zhì)摻入聚合物分子如聚乳酸(polylacticacid)，聚乙二醇酸等做成的顆粒狀制品中或摻入脂質(zhì)體中。這些組合物可能會(huì)影響本發(fā)明的N-末端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)的物理狀態(tài)穩(wěn)定性，在體內(nèi)的釋放速度及體內(nèi)清除速度。例如參見Remington’s《藥物學(xué)》第18版。(1990，Mack出版公司.，Easton，PA18042)pp.1435-1712。本文引用以供參考。
本發(fā)明再有一個(gè)方面是涉及藥品的治療和生產(chǎn)方法。施用本發(fā)明生產(chǎn)的聚合物/G-CSF連接物(或具有天然G-CSF的促血細(xì)胞生成活性的類似物)來(lái)緩和或調(diào)理的癥狀的典型特征在于，造血或免疫功能的減退，而且更具體地說(shuō)是中性粒細(xì)胞數(shù)的減少。這些癥狀也許是因?yàn)橹委熎渌膊∵^(guò)程中(例如化療或放療)引起的。這也可能是由于患感染性疾病，比如細(xì)菌、病毒、真菌或其它一些感染疾病。例如，由于細(xì)菌感染所致敗血癥。或者，這種癥狀由遺傳或環(huán)境因素造成的，如嚴(yán)重慢性嗜中性粒細(xì)胞減少癥或白血病。年齡因素也很重要，在老年病學(xué)中，病人的嗜中性白細(xì)胞數(shù)目會(huì)減少或嗜中性白細(xì)胞活動(dòng)性降低。一些這類癥狀見Filgrastim(r-met HuG-CSF)in clinical Practice，Morstyn，G.及T.M.Dexter編.，Marcel Dedder Inc.，N.Y.(1993)，pp.351。其它一些研究不多的可經(jīng)過(guò)施用本發(fā)明的聚合體/G-CSF連接物來(lái)緩和和調(diào)節(jié)的癥狀還有血液中脂類(或膽固醇)的減少，一些心血管癥狀，因?yàn)镚-CSF可誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活因子。截止目前，G-CSF(或類似物)在這些情況中的激活模式還不十分清楚。水溶性聚合物分子(如聚乙二醇)的添加，可給施用的病人帶來(lái)好處，因?yàn)樯锘钚缘难泳彍艨稍试S每個(gè)療程的G-CSF注射次數(shù)更少。
一般來(lái)說(shuō)，施用本發(fā)明生產(chǎn)的聚合物/共有干擾素可緩解和調(diào)理的癥狀是那些可應(yīng)用干擾素的癥狀，包括細(xì)胞增殖紊亂，病毒感染及自體免疫紊亂，如綜合性血管硬化癥。參考McManus Balmer，DICP，“藥物治療年鑒”24761-767(1990)(具有生物活性的修飾因子在癌癥治療中的應(yīng)用回顧。第一部分，干擾素)。用共有干擾素治療細(xì)胞增殖紊亂的方法及其組合物可參見1992年4月30日公開的PCT WO92/06707，本文引用以供參考。例如，肝炎(A、B、C、D、E型)可用本發(fā)明生產(chǎn)的PEG化共有干擾素分子來(lái)治療。在下面的實(shí)施例中證明在體外，化學(xué)修飾的共有干擾素活性為非化學(xué)修飾的共有干擾素的20％。
上述的各種分子，由于進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，因而獲得了有關(guān)不同病人中不同的癥狀的治療時(shí)所用的合適劑量水平的資料。普通技術(shù)人員在考慮治療方案，病人年齡及健康狀況后，可確定合適的劑量。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于注射或灌注劑量應(yīng)在每千克體重0.01μg至100μg之間(只計(jì)算蛋白質(zhì)部分的重量，沒(méi)有計(jì)算化學(xué)修飾部分的重量)。
下面的實(shí)施例將說(shuō)明以上提及各方面。在實(shí)施例1中，通過(guò)N-末端PEG化的G-CSF與35賴氨酸或41賴氨酸(為met＋174氨基酸G-CSF變體)單個(gè)PEG化的G-CSF相比較來(lái)證實(shí)前者的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例2中描述了在N-末端PEG化G-CSF過(guò)程中的還原性烷基化反應(yīng)。本方法能夠制備N-末端PEG化G-CSF的基本均一的制品。實(shí)施例3中討論了在共有干擾素N-末端PEG化中的還原性烷基化反應(yīng)。
實(shí)施例1A.重組人類met-G-CSF制備重組人類met-G-CSF(本文有時(shí)稱為“rh-G-CSF”或“r-met-hu-G-CSF”)按照Souza專利，美國(guó)專利No.，4,810,643(本文引用以供參考)的。方法合用的rhG-CSF是來(lái)自E.coli的重組表達(dá)產(chǎn)物其氨基酸序列(由DNA序列編碼)所示如下(SEQ.ID.NO.1和2)ATG ACT CCA TTA GGT CCT GCT TCT TCT CTG CCG CAA AGC TTT CTGMTPLGPASSLPQSFLCTG AAA TGT CTG GAA CAG GTT CGT AAA ATC CAG GGT GAC GGT GCTLKCLEQVRKIQGDGAGCA CTG CAA GAA AAA CTG TGC GCT ACT TAC AAA CTG TGC CAT CCGALQEKLCATYKLCHPGAA GAG CTG GTA CTG CTG GGT CAT TCT CTT GGG ATC CCG TGG GCTEELVLLGHSLGIPWACCG CTG TCT TCT TGT CCA TCT CAA GCT CTT CAG CTG GCT GGT TGTPLSSCPSQALQLAGCCTG TCT CAA CTG CAT TCT GGT CTG TTC CTG TAT CAG GGT CTT CTGLSQLHSGLFLYQGLLCAA GCT CTG GAA GGT ATC TCT CCG GAA CTG GGT CCG ACT CTG GACQALEGISPELGPTLDACT CTG CAG CTA GAT GTA GCT GAC TTT GCT ACT ACT ATT TGG CAATLQLDVADFATTIWQCAG ATG GAA GAG CTC GGT ATG GCA CCA GCT CTG CAA CCG ACT CAAQMEELGMAPALQPTQGGT GCT ATG CCG GCA TTC GCT TCT GCA TTC CAG CGT CGT GCA GGAGAMPAFASAFQRRAGGGT GTA CTG GTT GCT TCT CAT CTG CAA TCT TTC CTG GAA GTA TCTGVLVASHLQSFLEVSTAC CGT GTT CTG CGT CAT CTG GCT CAG CCG TAA TAGYRVLRHLAQP**(這也是用于對(duì)照動(dòng)物的非PEG化的組合物)。作為選擇，也可選用市場(chǎng)上的Neupogen進(jìn)行下面的PEG化反應(yīng)(本文引用其包裝說(shuō)明書以供參考)。
B.PEG化的G-CSF的制備100mM pH8.0的N-二羥乙基甘氨酸，內(nèi)含10mg/ml的上述rh-G-CSF的溶液，加入到平均分子量為6000道爾頓的固態(tài)SCM-MPEG中(羧甲氧聚乙二醇N-羥琥珀酰酯)(Union Carbide)。這里的SCM-MPEG要比rh-G-CSF多1.5摩爾。輕輕攪動(dòng)1小時(shí)后，混合物以無(wú)菌水稀釋至2mg/ml，pH以稀鹽酸調(diào)至4.0。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。此時(shí)反應(yīng)混合物主要由三種形式的單個(gè)PEG化rh-G-CSF，一些雙PEG化的rh-G-CSF和未修飾的rh-G-CSG及反應(yīng)副產(chǎn)品(N-羥琥珀酰亞胺)組成。
C.N-末端PEG化rh-G-CSF的制備三種形式的單個(gè)PEG化的rh-G-CSF可用離子交換色譜加以分離。反應(yīng)混合物上樣于(1mg蛋白質(zhì)每毫升樹脂)Pharmacza SSepharose FF柱(Pharmacia XK50/30庫(kù)，柱床體積440ml)，以緩沖液A(20mM的醋酸鈉，pH4.0)加以平衡。然后以3倍于柱床體積的緩沖液A清洗。蛋白質(zhì)樣品用15倍于柱床體積的緩沖液B(20mM醋酸鈉，pH4.0，1MNaCl)，其濃度梯度從0～23％進(jìn)行線形梯度洗脫。洗脫后柱床以等體積100％的緩沖液B加以清洗再以3體積的緩沖液A重新平衡。整個(gè)過(guò)程的流速應(yīng)維持在8ml/min。洗脫液在280nm處加以監(jiān)測(cè)，以5ml每管分部收集。按照?qǐng)D1A合并含各單PEG化rh-G-CSF種類的餾分。將這些合并物用帶YM10 76mm膜350mL Amicon攪拌室(stirred cell)濃縮。
將來(lái)自離子交換色譜的合并液進(jìn)行分子篩層析，以使雙PEG化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物從單PEG化的蛋白質(zhì)得以分離。大多數(shù)情況下，2-5ml溶液中含5-10mg樣品的混合物上柱，柱為120ml Pharmacia Superdex75HR 16/60，以20mM的pH4.0的醋酸鈉將柱平衡。以1，5ml/min流速洗脫100分鐘。以2ml每管分部收集。洗脫液中蛋白質(zhì)含量在280nm處加在監(jiān)測(cè)。合并不同峰的餾分并進(jìn)行下一步的分析。下表中比較每個(gè)峰處產(chǎn)量的相對(duì)比例。
表1相對(duì)產(chǎn)量和修飾位點(diǎn)修飾位點(diǎn) 參考圖1A 相對(duì)產(chǎn)量N-末端 峰1A3Lys-35 峰2A2Lys-41 峰3A1在這種反應(yīng)條件下，17及24位的賴氨酸可能不會(huì)發(fā)生明顯的PEG化反應(yīng)。
D.特征描述為了鑒定每個(gè)樣品的特征，從五個(gè)方面加以分析(1)SDS-Page(圖1B)，(2)分子篩層析HPLC(“SEC HPLC”)(圖2)，(3)肽(酶切)分離圖譜分析(圖3A、3B及3C)，(4)在體外對(duì)G-CSF生物活性的測(cè)試(圖4)及(5)在體內(nèi)(倉(cāng)鼠體內(nèi))對(duì)其生物活性的測(cè)試(圖5A及5B)。
對(duì)于每個(gè)樣品組合物，結(jié)果顯示，對(duì)于N-末端單個(gè)PEG化G-CSF來(lái)說(shuō)，樣品中被PEG化的比例已超過(guò)95％，余下的也許是未PEG化的物質(zhì)(盡管樣品中余下的低于試驗(yàn)檢測(cè)極限)。至于三種形式單個(gè)PEG化產(chǎn)物(N-末端、賴氨酸41和賴氨酸35)的各自百分含量，結(jié)果顯示，N-末端及賴氨酸41PEG化產(chǎn)物已超過(guò)單個(gè)PEG化總產(chǎn)物的97％，PEG化的賴氨酸35產(chǎn)率較低，可能是由于其在被測(cè)試條件中不穩(wěn)定造成的。
表2N-末端PEG化G-CSF組合物的百分比非還性SDS PAGE SEC HPLD N-末端測(cè)序*單個(gè)PEG化的G-CSF 97.44 99.43 96.6未修飾的G-CSF 2.56 0.573.4*下面討論的N-末端測(cè)序在此不能認(rèn)為是定量試驗(yàn)，因?yàn)樵谶M(jìn)行N-末端測(cè)序時(shí)，可能會(huì)造成聚乙二醇分子從蛋白質(zhì)分子N-末端脫落下來(lái)。
表3三種形式的單個(gè)PEG化產(chǎn)物百分比N-末端PEG-Lys35PEG- Lys41PEG-GSCF GSCF料 GSCF(RI/UV＝.96)*(RI/UV＝.72) (RI/UV＝1.12)非還原性97.44 77.41 100.00SDS-PAGESEC HPLC99.43 93.38 99.96*RI/UV為折射光與紫外光吸收比例的指數(shù)，其主要用來(lái)估計(jì)每個(gè)蛋白質(zhì)分子中含有聚乙二醇的分子數(shù)。應(yīng)用聚乙二醇分子的折射和反映蛋白質(zhì)分子的紫外光吸收的指數(shù)，從SEC HPLC數(shù)據(jù)計(jì)算。
**料這種形式G-CSF在測(cè)試條件下不穩(wěn)定。
方法1.SDS-PAGE.SDS-PAGE使用的是ISS Daiichi PureChemicals，Co.，Tokyo，Japan生產(chǎn)的非還原性4～20％的微膠，并以考馬斯亮藍(lán)染色。凝膠以分子動(dòng)態(tài)顯像密度計(jì)(molecularDynamics Densitometer with Image Quant)加以掃描。結(jié)果如圖1B所示。1號(hào)泳道(左手一邊為一標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(Novex Mork 12分子量標(biāo)準(zhǔn)品)。2道為3μg rh-G-CSF標(biāo)準(zhǔn)；3道為上樣10μgSCM-PEG-GCSF反應(yīng)混合物電泳結(jié)果；4道內(nèi)加的是10μg N-末端單個(gè)PEG化的G-CSF；5道內(nèi)為10μg從N-末端met數(shù)起，第35位賴氨酸殘基單個(gè)PEG化的G-CSF；6道為10μg從N端甲硫氨酸起第41位賴氨酸單個(gè)PEG化的G-CSF。從圖可以看出，3道中含有N-末端單個(gè)PEG化產(chǎn)物，并顯示出單條帶。
2.分子篩層析-高壓液相色譜SEC-HPLC使用的是Biosep SEC 3000柱，在水相HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行的，并使用100mM磷酸鈉，在pH 6.9條件下，以1ml/min流速洗脫20min。監(jiān)測(cè)280nm處的信號(hào)。結(jié)果如圖2所示，線“C”，因?yàn)橹缓琋-末端單個(gè)PEG化的rh-G-CSF，故只有一個(gè)峰，線“D”(賴氨酸35單個(gè)PEG化產(chǎn)物)和“E”(賴氨酸41單個(gè)PEG化產(chǎn)物)情況相同。這也顯示單個(gè)PEG化G-CSF在不同收集管中是基本上純的。
3.肽酶切分離圖譜。使用下述方法，對(duì)三種樣品(稱為“Mono-PEG-1”、“Mono-PEG-2”及Mono-PEG-3“)加以分析。(a)還原性烷基化反應(yīng)。500μg的單個(gè)PEG化G-CSF等分樣品進(jìn)行快速真空干燥，將其在含6M鹽酸胍及1mM EDTA的0.3M Tris-HCl中配制成1mg/950μl濃度，緩沖液pH8.4。樣品中加碘乙酸進(jìn)行S-羧甲基化，并在37℃孵育反應(yīng)20分鐘。樣品然后用Sephadex G-25快速旋轉(zhuǎn)蛋白分離柱(Quick Spin Protein Columns)進(jìn)行脫鹽處理，后更換緩沖液。經(jīng)脫鹽和更換緩沖液后，樣品濃度用增加的緩沖液將其稀釋至0.5mg/ml。(b)蛋白質(zhì)內(nèi)切酶SV8消化。樣品以SV8(酶與底物比為1∶25)在25℃消化處理26小時(shí)。(c)HPLC肽酶切分離圖譜。消化后的蛋白質(zhì)裝入Vydac C4柱(4.6×250mm，顆粒直徑5μ，孔徑300)，以0.1％TFA中乙腈的線性梯度進(jìn)行洗脫，經(jīng)HPLC作肽圖。肽段人工收集后置快速真空干燥器(Speed Vac)中將其干燥后以備測(cè)序之用。結(jié)果與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣相比，(i)(圖3A)為“Mono-PEG-1”(即N-末端單個(gè)PEG化產(chǎn)物)，57.3分鐘時(shí)峰值減小而在77.5分鐘時(shí)出現(xiàn)一新峰；(ii)(圖3B)為“Mono-PEG-2”，(賴氨酸35PEG化產(chǎn)物)，在30.3分鐘時(shí)峰的高度有所下降并在66.3分鐘時(shí)出現(xiàn)一新的洗脫峰；(iii)(圖3C)為“Mono-PEG-3”(賴氨酸41 PEG化產(chǎn)物)，30.3分鐘時(shí)的峰消失，而在66.4分鐘時(shí)出現(xiàn)一新的洗脫峰。這些肽段在分離圖譜中都顯示出顯著的差異。從圖還可以看出由于微小的消化差異在86.1分鐘肽的兩側(cè)出現(xiàn)一些小的不完全裂解物。(d)N-末端測(cè)序分析。上面圖譜中每個(gè)“新”肽段都要經(jīng)過(guò)N-末端序列分析來(lái)鑒定。干燥后的肽段溶于0.1％TFA，在ABI蛋白質(zhì)測(cè)序儀中進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于“Mono-PEG-1”(N-末端PEG化產(chǎn)物)，60％的“新”峰產(chǎn)物(77.5分鐘時(shí))進(jìn)行了10個(gè)循環(huán)的測(cè)序。起始得率5％，這意味著N-末端的甲硫氨酸殘基被聚乙二醇分子。封閉。必須注意到，象這種起始肽應(yīng)該引起0起始得率，這里的小于5％值可能是由于在測(cè)序分析過(guò)程中造成聚乙二醇分子從N-末端甲硫氨酸上脫落下來(lái)所致。N-末端肽段序列測(cè)定結(jié)果為M-T-P-L-G-P-A-S-S。對(duì)于“Mono-PEG-2”(賴氨酸35PEG化產(chǎn)物)，收集了66.3分鐘處峰值總體積的80％，并對(duì)其進(jìn)行9輪循環(huán)測(cè)序。賴氨酸35的回收率相當(dāng)?shù)?，意味著PEG化發(fā)生在35位賴氨酸上。而41位的賴氨酸回收率與其它氨基酸殘基一樣，說(shuō)明該殘基未發(fā)生修飾。肽在30.3分鐘處的峰高比相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參照?qǐng)D要低，肽在30.3分鐘處的峰面積只為相應(yīng)肽的57.5％，對(duì)其序列測(cè)定結(jié)果為K-L-C-A-T-Y-K-L。對(duì)于“Mono-PEG-3”(賴氨酸41PEG化產(chǎn)物)，對(duì)于在66.4分鐘洗脫的肽收集了峰總體積80％的樣品，并對(duì)其進(jìn)行9個(gè)循環(huán)的測(cè)序，檢測(cè)的序列為K-L-C-A-T-Y-K-L，其中含35和41賴氨酸殘基。35位賴氨酸的回收率與其它殘基回收率一致，41位的賴氨酸的回收率相當(dāng)?shù)?，意味著PEG化在該處發(fā)生。結(jié)果“Mono-PEG-1”為N-末端單個(gè)PEG化產(chǎn)物；“Mono-PEG-2”為35賴氨酸部分PEG化產(chǎn)物；“Mono-PEG-3”為41賴氨酸PEG化產(chǎn)物。通過(guò)比較對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣(非PEG化G-CSF)和單個(gè)PEG化的G-CSF 1、2和3的圖譜，可以看出“Mono-PEG-2”(Lys35)和“Mono-PEG-3”(Lys41)二者圖譜N-末端肽峰高都略微有所下降。這說(shuō)明賴氨酸35和賴氨酸41的產(chǎn)物中均混雜有少量的N-末端PEG產(chǎn)物，或者N-末端的甲硫氨酸有少部分被PEG化。
4.體外活性。該物質(zhì)有活性。圖4顯示的為體外分析結(jié)果。從圖可以看出，N-末端單個(gè)PEG化產(chǎn)物具有未修飾的rhG-CSF活性的68％。方法G-CSF體外生物測(cè)定是合用鼠32D細(xì)胞G-CSF依賴性克隆的促有絲分裂試驗(yàn)。細(xì)胞以含5％FBS和20ng/ml rhG-CSF的Iscoves培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在加樣品之前，細(xì)胞用不含rhG-CSF的生長(zhǎng)培養(yǎng)基沖洗2次。以48至0.5ng/ml濃度范圍(相當(dāng)于4800～50IU/ml)作12個(gè)點(diǎn)的rhG-CSF標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線嘗試范圍內(nèi)每份樣品制備估計(jì)落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線型部分內(nèi)(1000到3000IU/ml)的4種稀釋液，并以一式三份。由于這些樣品顯然在體外活性較低，PEG化rhG-CSF樣品一般稀釋不到4～10倍。每份40μl體積的樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣稀釋液加到含10,000細(xì)胞/孔的96孔微滴度板的合適小孔中。在5.5％CO2，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入0.5μmCi甲基-3H-胸腺嘧啶。18小時(shí)后，收獲平板細(xì)胞并計(jì)數(shù)，作出劑量反應(yīng)曲線(logrhG-CSF濃度對(duì)CPM-背景)并對(duì)落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線型部分范圍內(nèi)的點(diǎn)進(jìn)行線性回歸分析。用所得的線性方程及稀釋系數(shù)校正來(lái)測(cè)定未知試驗(yàn)樣品的濃度。結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，三種單個(gè)PEG化形式中，N-末端單個(gè)PEG化G-CSF在體外顯示最高生物活性。
5.體內(nèi)活性。體內(nèi)測(cè)定也證實(shí)了N-末端PEG化的G-CSF的活性。體內(nèi)測(cè)定是給金黃地鼠皮下一次注射0.1mg/kg體重劑量的樣品而進(jìn)行的。每組4只動(dòng)物在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)尾部抽血。收集的血樣當(dāng)天進(jìn)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算出白細(xì)胞平均數(shù)目。從圖5 A及5B可以看出，在皮下單次注射0.1mg/kg體重劑量樣品1天后出現(xiàn)作用高峰。兩種單個(gè)PEG化產(chǎn)物(N-末端及賴氨酸35)顯示出延長(zhǎng)的反應(yīng)，而對(duì)賴氨酸41PEG化的蛋白質(zhì)的反應(yīng)在體內(nèi)并沒(méi)顯示出比未修飾的rhG-CSF活性增強(qiáng)(從圖5B可看出，其實(shí)活性還更差一些)。這些結(jié)果表明在蛋白質(zhì)分子上附著聚乙二醇分子能顯著改變蛋白質(zhì)的治療效果并且PEG化蛋白質(zhì)的益處還取決于修飾位點(diǎn)。(單次皮下注射后曲線下的WBC凈平均面積(根據(jù)CRC標(biāo)準(zhǔn)數(shù)學(xué)表，26th Ed.(Beyer，W.H.，Ed.)CRC PressInc.，Boca Raton，F(xiàn)L 1981.p.125來(lái)計(jì)算)與Lys-35及N-末端單個(gè)PEG化產(chǎn)物一致)。
E.穩(wěn)定性研究另外，對(duì)上面制備的N-末端及3 5賴氨酸單個(gè)PEG化G-CSF穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。(41賴氨酸PEG化產(chǎn)物未被研究是因?yàn)橐炎C實(shí)其沒(méi)有超出未修飾的G-CSF的額外活性)。研究表明N-末端PEG化的G-CSF在貯存時(shí)出人意料地要比單個(gè)PEG化的G-CSF的其它形式賴氨酸35單個(gè)PEG化產(chǎn)物更穩(wěn)定。穩(wěn)定性是以SEC-HPLC監(jiān)測(cè)到產(chǎn)物裂解來(lái)測(cè)定的。方法N-末端PEG化G-CSF及賴氨酸35單個(gè)PEG化G-CSF研究在4℃2個(gè)pH條件下完成的，即pH4.0和pH6.0，每個(gè)周期16天。將pH升至6.0是為了使穩(wěn)定性研究得以更快地進(jìn)行。pH6.0時(shí)，上述所得的N-末端單個(gè)PEG化G-CSF和賴氨酸35單個(gè)PEG化G-CSF置于含20mM磷酸鈉、5mM醋酸鈉、2.5％甘露醇、0.005％Tween-80，pH為6.0的緩沖液中至蛋白質(zhì)終濃度為0.25mg/ml。每毫升等份液貯于3ml無(wú)菌注射瓶中。每個(gè)注射瓶于4℃及29℃各保存16天。由SEC-HPLC繪圖來(lái)分析其穩(wěn)定性。如果后來(lái)的測(cè)量結(jié)果與最初測(cè)量結(jié)果(時(shí)間＝0)保持一致(由肉眼觀察確定)，則樣品在那段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是穩(wěn)定的。結(jié)果如圖6A-6C所示。(a)4℃pH6.0條件下比較。圖6A顯示pH6.0，4℃條件下N-末端單個(gè)PEG化G-CSF經(jīng)過(guò)一定時(shí)間段后的SEC-HPLC圖；圖6B所示為賴氨酸35單個(gè)PEG化G-CSF在pH6.0，4℃條件下經(jīng)過(guò)一定時(shí)間段后的SEC-HPLC圖。有一種解釋認(rèn)為賴氨酸35PEG化產(chǎn)物的裂解物中，有的分子量正好與未修飾的G-CSF相近。(b)pH4.0，4℃條件下期限延長(zhǎng)。pH4.0，4℃條件下提供了的控制條件是一個(gè)相當(dāng)穩(wěn)定的條件，在該條件下N-末端PEG化G-CSF不降解。對(duì)于賴氨酸35PEG化產(chǎn)物，仍發(fā)生產(chǎn)物的降解，但其速率要緩慢得多。(c)pH4.0，4℃條件下的穩(wěn)定性比較。圖6C顯示在這些條件下，延長(zhǎng)時(shí)間期限時(shí)，G-CSSF的單個(gè)PEG化產(chǎn)物的SEC-HPLC圖。從圖可以看出，在pH6.0，4℃條件下，PEG化的賴氨酸35在16天或35天時(shí)的去PEG水平增加不高于6天時(shí)所見水平(見圖6B)。這意味著去PEG化水平(不穩(wěn)定性)有6天后，該條件下一直保持未變。
實(shí)施例2本實(shí)施例陳述了一種利用還原性烷基化反應(yīng)來(lái)制備單個(gè)PEG化G-CSF的基本上均一的群體的方法，和該群體的特征鑒定。在此使用了上面實(shí)施例所述的重組G-CSF?？梢钥闯?，此方法不僅在制備N-末端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)方面具有優(yōu)越性，而且本還原性烷基化反應(yīng)過(guò)程中的胺鍵產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上更穩(wěn)定的產(chǎn)物，正如在貯存時(shí)聚集程度的較大差異所顯示的。
A.在N-末端α-氨基殘基上附著的單甲氧聚乙二醇-GCSF連接物的制備。
制備rhG-CSF反應(yīng)溶液(1ml，濃度為5mg/ml，如上面實(shí)施例中所述)，內(nèi)含100mM磷酸鈉，pH5.0，還含有2 0mM NaCNBH3，將其充分?jǐn)嚢枥鋬?4℃)后，加入摩爾數(shù)超出5倍的甲氧聚乙二醇醛(MPEG)(平均分子量為6kDa)。反應(yīng)混合物在相同溫度下持續(xù)攪拌。
反應(yīng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的修飾程度用SEC-HPLC來(lái)對(duì)其監(jiān)測(cè)，SEC-HPLC使用的是Bio-Sil SEC 250-5柱(BIO-RAD)，在pH6.8條件下，用0.05M NaH2PO4，0.05M Na2HPO4，0.15M NaCl，0.01MNaN3，緩沖液以1ml/min流速進(jìn)行洗脫。
10小時(shí)后SEC HPLC分析結(jié)果顯示，已有92％的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成mono-MPEG-GCSF衍生物。這從圖7可以看出，其中記錄了蛋白質(zhì)濃度(以在A280處的吸光率測(cè)得)，顯示了在8.72分鐘時(shí)出現(xiàn)的單個(gè)PEG化G-CSF產(chǎn)物的洗脫峰，在9.78分鐘出現(xiàn)的未發(fā)生反應(yīng)的G-CSF的較小洗脫峰。
作為比較圖8顯示了用MPEG的N-羥琥珀酰脂所得的峰。其分子量也為6kDa。從圖可以看出，在反應(yīng)混合物中有tri-MPEG-GCSF連接物(峰肩均在7.25分鐘)，di-MPEG-GCSF連接物(峰值在7.62min)，mono-MPEG-GCSF連接物(峰值在9.87min)。
在10小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，92％的蛋白質(zhì)已被轉(zhuǎn)化成單個(gè)PEG化產(chǎn)品，其反應(yīng)混合物的pH以100mM HCl調(diào)至pH4.0，并用1mM HCl將反應(yīng)混合物稀釋5倍。
mono-MPEG-GCSF衍生物用離子交換色譜法合用以20mM的醋酸鈉緩沖液pH為4.0平衡的HiLoad 16/10 S Sepharose HP柱(Pharmacia)進(jìn)行純化。反應(yīng)混合物以1ml/min流速裝柱，未反應(yīng)的MPEG以3倍于柱體積的相同緩沖液進(jìn)行洗脫。然后進(jìn)行400分鐘的線性梯度洗脫，20mM醋酸鈉濃度從0％～45％，pH4.0，內(nèi)含1M NaCl，在4℃洗脫蛋白質(zhì)-聚合物連接物。
將含mono-MPEG-GCSF衍生物的收集管合并，濃縮和過(guò)濾滅菌。
用不同平均分子量(12、20和25kDa)的MPEG醛修飾rh-G-CSF而得到的各種形式mono-MPEG-GCSF連接物以相似方法制備。
B.單個(gè)PEG化G-CSF的分析1.分子量利用SDS-PAGE，凝膠過(guò)濾，基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜分析(matrix assisted laser desorption)，以及平衡離心法測(cè)定單個(gè)PEG化連接物的分子量。結(jié)果如下表4所示。
表4N-束端烷基化Mono-MPEG-GCSF連接物分子量連接物估計(jì)的凝膠過(guò)濾質(zhì)譜測(cè)超離心測(cè)分子量測(cè)分子量分子量分子量MPEG-(6kDa)- 24800 53024 24737 25548G-CSFMPEG-(12kDa)- 30800 124343 30703 29711GCSFMPEG-(20kDa)- 38800221876 38577 38196GCSFMPEG-(25 kDa)- 43800333266N/D N/DGCSF制備的N-末端mono-MPEG-GCSF連接物結(jié)構(gòu)以N-末端蛋白質(zhì)序列分析和肽酶切圖譜法加以證實(shí)。N-末端用硫氨酰殘基的溴化氰裂解導(dǎo)致聚乙二醇分子的除去。
2.生物活性PEG化MPEG-GCSF連接物的體外生物活性經(jīng)過(guò)測(cè)定刺激鼠骨髓細(xì)胞對(duì)3H胸腺嘧啶的吸收來(lái)測(cè)定。
體內(nèi)生物活性經(jīng)過(guò)將MPEG-GCSF連接物或rhG-CSF(100mg/克體重劑量)皮下注射倉(cāng)鼠后測(cè)量其總白細(xì)胞數(shù)目來(lái)測(cè)定。與未修飾的G-CSF相比，PEG化G-CSF生物活性的計(jì)算是以WB/時(shí)間曲線下面積減去載體對(duì)照曲線下面積而得到的。MPEG-GCSF衍生物的相對(duì)活性的表示是以其與未修飾的G-CSF相比的百分活性加以描述的。
如圖9所示，顯示了對(duì)用不同分子量(6kDa、12kDa及20kDa)的MPEG醛經(jīng)還原性烷基反應(yīng)而制得的mono-N-末端MPEG-GCSF連接物的總白細(xì)胞數(shù)目反應(yīng)。從圖可以看出，所有單個(gè)PEG化產(chǎn)物均誘導(dǎo)反應(yīng)。除了12kDa的PEG在第二天白細(xì)胞數(shù)目較20kDa PEG產(chǎn)物作用后白細(xì)胞數(shù)目稍大外，所用的聚乙二醇分子量越大，獲得的白細(xì)胞數(shù)目會(huì)越多。
3.穩(wěn)定性研究比較了用兩種不同的化學(xué)方法(這里指胺及酰胺的還原性烷基化反應(yīng))制備的N-末端PEG化G-CSF的聚合程度。出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)以胺鍵形成的N-末端PEG化G-CSF要比以酰胺鍵(實(shí)施例1中所述的NHS法)形成的N-末端PEG化G-CSF穩(wěn)定得多。
方法兩種形式的N-末端PEG化G-CSF產(chǎn)物置于pH4.0的10mMNaOac中，其中含5％的山梨醇，蛋白質(zhì)分子終濃度為每ml溶液中含1mg蛋白質(zhì)。G-CSF都用PEG6000PEG化。酰胺鍵連接物制備按實(shí)施例1，胺鍵連接物制備按實(shí)施例2進(jìn)行。每種形式的6等份樣品在45℃保存8周。8周后，以分子篩層析及離子交換色譜測(cè)定聚集程度。
結(jié)果結(jié)果表明本發(fā)明的還原性烷基化反應(yīng)產(chǎn)物要比乙?；a(chǎn)物優(yōu)越得多，因?yàn)?，令人吃驚的是，在升高的溫度條件下產(chǎn)物經(jīng)8周后，前者的聚集程度要比后者的要小得多。下表為兩種形式產(chǎn)物經(jīng)分子篩層析(SEC)或離子交換色譜(IE)分析后各自未發(fā)生聚集的百分?jǐn)?shù)表5樣本45℃下8周 ％主峰SEC/IE胺鍵產(chǎn)物 82％/84％酰胺鍵產(chǎn)物 37％/65％**該值相對(duì)較高是因?yàn)殡x子交換色譜不能夠進(jìn)行聚集程度的徹底分析。
實(shí)施例3該實(shí)施例描述化學(xué)修飾的共有干擾素。更具體地說(shuō)，該實(shí)施例描述了一種制備單個(gè)PEG化IFN-con1的基本上均一的群體的方法，及該群體的特征鑒定。
應(yīng)該注意到，雖然本實(shí)施例中用的是IFN-con1，但上述的任一共有干擾素均可被化學(xué)修飾。盡管本實(shí)施例中使用了聚乙二醇進(jìn)行修飾，但象這種化學(xué)修飾可用上述任一水溶性聚合物進(jìn)行。對(duì)于PEG化作用，雖然本實(shí)施例中使用的是PEG12000，但其它任何形式的水溶性PEG均可使用(此處使用PEG12000是為了和易于處理和方便)。同樣，這里也有很多種化學(xué)修飾方法(諸如乙?；磻?yīng))，但對(duì)于選擇性N-末端化學(xué)修飾(如N-末端PEG化反應(yīng))來(lái)說(shuō)，最好還是用該實(shí)施例中所述的還原性化反應(yīng)。
A.共有干擾素的制備干擾素IFN-αcon1(在這里指IFN-con1(可參見美國(guó)專利No.4,695,623圖2中的描述(引用其全文以供參考)它勝于制備單個(gè)PEG化共有干擾素。IFN-con1是在細(xì)菌中表達(dá)外源性DNA而產(chǎn)生的，其N-末端具有一個(gè)甲硫氨酰殘基。
B.共有干擾素的PEG化IFN-con1溶液(3.45mg/ml，含35.25％的N-末端封閉形式)溶于磷酸鈉濃度為100mM，pH4.0內(nèi)含20mM NaCNBH3的溶液中，4℃冷卻后充分混勻，加入超出8倍摩爾量的甲氧聚乙二醇醛(MPEG)(平均分子量為12kDa)。
在反應(yīng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的修飾程度用反相HPLC來(lái)監(jiān)測(cè)，HPLC以多聚(苯乙烯/二乙烯基苯)進(jìn)行裝柱，如PLRP-S(PL SeperationSciences Polymer Labaratories)。
10小時(shí)后，反相HPLC分析結(jié)果表明，80％的N-末端具有未封閉的α氨基的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成MPEG-IFN-con1衍生物。
在10小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，反應(yīng)混合物用水稀釋5倍，mono-MPEG-IFN-con1衍生物的純化用離子交換層析來(lái)完成，其所用的柱為Hiload16/10 S Sepharose HP柱(Pharmacia)，以20mM的醋酸鈉緩沖液pH 4.0加以平衡。反應(yīng)混合物以1ml/min的流速裝入柱內(nèi)，未反應(yīng)的MPEG醛以3倍于柱體積的相同緩沖液加以洗脫。然后在4℃條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)-聚合物連接物分子的洗脫，以0％～75％的20mM醋酸鈉緩沖液進(jìn)行線性洗脫420分鐘。緩沖液pH為4.0，含有1M NaCl。
合并含mono-MPEG-IFN-con1衍生物的餾分，經(jīng)濃縮后再過(guò)濾滅菌。
C.單個(gè)PEG化共有干擾素的分析1.均一性純化的mono-MPEG-IFN-con1連接物均一性通過(guò)SDS-PAGE加以檢測(cè)，SDS-PAGE用的是10-20％或4-20％的預(yù)制梯度膠(Integrated Separation System)。凝膠顯示主要帶在分子量為35kDa處。
各種形式mono-MPEG-IFN-con1的有效半徑(流體動(dòng)力學(xué)半徑)測(cè)定用的是Superose 6HR 10/30(Pharmacia)凝膠過(guò)濾柱。在280nm處經(jīng)紫外吸收測(cè)定蛋白質(zhì)。BIO—RAD凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)品作為球狀蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記。
純化的N-末端mono—MPEG—IFN—con1連接物結(jié)構(gòu)采用N-末端蛋白質(zhì)測(cè)序及肽酶切圖譜來(lái)加以證實(shí)。
在這里必須注意該IFN—con1制品中含有一些N-末端封閉物質(zhì)，它們未發(fā)生PEG化。然而，PEG化的物質(zhì)勻?yàn)镹-末端單個(gè)PEG化。因而，在這種情況下，可考慮能用其它方法將末端封閉和未封閉的產(chǎn)物分開，如用離子交換層析或分子篩分析法。
2.生物活性mono-MPEG-IFN con1連接物體外生物活性是經(jīng)過(guò)測(cè)定其抗病毒活性來(lái)測(cè)定的。mono-MPEG-IFN con1連接物的體外生物活性經(jīng)過(guò)測(cè)定其在人(Hela)細(xì)胞中的抗病毒生物活性來(lái)確定。
發(fā)現(xiàn)mono-MPEG(12kDa)-IFN-conl連接物體外生物活性(U/mg蛋白質(zhì)為未修飾IFN-con1活性的20％。正如前面所述的PEG化G-CSF，體外分析雖然對(duì)了解生物活性有一定作用，但由于特征性緩慢釋放，常測(cè)得的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)活性很低。體內(nèi)生物活性要比體外高。
D.N-末端封閉分子去除后化學(xué)修飾的共有干擾素。
前面所述的IFN—con1經(jīng)預(yù)先去除其中的N-末端封閉分子部分之后，也進(jìn)行本發(fā)明的還原性烷基化反應(yīng)。在上面所述的還原性烷基化反應(yīng)。在上面所述的還原性烷基化方法中使用了PEG12000和PEG20000兩種分子。
該分子的表觀分子量如下連接物凝膠過(guò)濾測(cè)得的SDS—PAG測(cè)得表觀分子量的表觀分子量monoMPEG(12kDa) 104.0kDa 35.6kDaIFN-con1monoMPEG(20kDa) 175.1kDa 55.4kDaIFN-con1IFN-con1 20kDa PEG連接物的FPLC離子交換色譜分析結(jié)果中出現(xiàn)3個(gè)峰MonoMPEG-IFN-con1占總面積的66％(洗脫至265.93ml)。
蛋白質(zhì)聚集物(aggregate)及寡聚MPEG-IFN-con1連接物占總面積的24％(洗脫至238.42ml)以及未反應(yīng)的IFN-con1占10％的總面積(洗脫至328.77ml)。
該條件尚未進(jìn)一步優(yōu)化，可用色譜或其它方法進(jìn)一步分離單個(gè)PEG化的物質(zhì)。
盡管用優(yōu)選的實(shí)施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)明白對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言可進(jìn)行變動(dòng)和修改。因此，在所附的權(quán)利要求書中試圖覆蓋所有落在所要求的本發(fā)明范圍內(nèi)的等價(jià)變化。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人AMGEN INC(ii)發(fā)明題目N-末端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組合物及方法。(iii)序列個(gè)數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)地址Amgen Inc.
(B)街道1840 Dehavilland Drive(C)城市Thousand Daks(D)州California(E)國(guó)家USA(F)郵政區(qū)號(hào)91320(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)貯存介質(zhì)軟磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，#1.25.版(vi)當(dāng)前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)柎a(B)申請(qǐng)日(C)分類(viii)代理人/代理信息(A)姓名Pessin，Karol M.
(B)參考/摘要號(hào)A-286(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度531堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)特征線形(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGACTCCAT TAGGTCCTGC TTCTTCTCTG CCGCAAAGCT TTCTGCTGAA ATGTCTGGAA 60CAGGTTCGTA AAATCCAGGG TGACGGTGCT GCACTGCAAG AAAAACTGTG CGCTACTTAC 120AAACTGTGCC ATCCGGAAGA GCTGGTACTG CTGGGTCATT CTCTTGGGAT CCCGTGGGCT 180CCGCTGTCTT CTTGTCCATC TCAAGCTCTT CAGCTGGCTG GTTGTCTGTC TCAACTGCAT 240TCTGGTCTGT TCCTGTATCA GGGTCTTCTG CAAGCTCTGG AAGGTATCTC TCCGGAACTG 300GGTCCGACTC TGGACACTCT GCAGCTAGAT GTAGCTGACT TTGCTACTAC TATTTGGCAA 360CAGATGGAAG AGCTCGGTAT GGCACCAGCT CTGCAACCGA CTCAAGGTGC TATGCCGGCA 420TTCGCTTCTG CATTCCAGCG TCGTGCAGGA GGTGTACTGG TTGCTTCTCA TCTGCAATCT 480TTCCTGGAAG TATCTTACCG TGTTCTGCGT GATCTGGCTC AGCCGTAATA G 531(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度175氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)特征線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu1 5 10 15Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu20 25 30Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu35 40 45Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser50 55 60Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His65 70 75 80Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile85 90 95Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala100 105 110Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala115 120 125Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala130 135 140Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser145 150 155 160Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170 17權(quán)利要求
1.N-末端化學(xué)修飾的G-CSF或其類似物的基本上均一制品，任選存在于藥用上可接受的稀釋劑、載體或佐劑中。
2.權(quán)利要求1的制品，其中所說(shuō)的G-CSF用選自葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚體、聚氧化丙烯/氧化乙烯(prolypropylene oxide/ethyleneoxide)共聚體、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyols)及聚乙烯醇的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾。
3.權(quán)利要求2的制品，其中所說(shuō)的G-CSF或其類似物用聚乙二醇進(jìn)行化學(xué)修飾。
4.權(quán)利要求3的制品，其中所說(shuō)的聚乙二醇具有在大約2kDa到100kDa之間的分子量。
5.權(quán)利要求4的制品，其中所說(shuō)的聚乙二醇具有約在6kDa與25kDa之間的分子量。
6.權(quán)利要求1的制品，其中所說(shuō)的制品由至少90％N-末端單個(gè)PEG化的G-CSF或其類似物及至多10％的未發(fā)生PEG化的G-CSF或其類似物組成。
7.權(quán)利要求6的制品，其中所說(shuō)的制品由至少95％N-末端單個(gè)PEG化的G-CSF或其類似物及至多5％的未發(fā)生PEG化的G-CSF或其類似物組成。
8.權(quán)利要求1的制品，其中所說(shuō)的G-CSF具有在SEQ ID NO.1中鑒定的序列。
9.N-末端單個(gè)PEG化的G-CSF的基本上均一的制品，任選存在于藥用上可接受的稀釋劑、載體或者佐劑中，其中(a)所說(shuō)的G-CSF具有在SEQ ID NO.1中鑒定的氨基酸序列；(b)所說(shuō)的G-CSF用分子量為大約12kDa的聚乙二醇部分單個(gè)PEG化。
10.一種藥用組合物包括(a)單個(gè)PEG化的G-CSF的基本上均一的制品，所說(shuō)的單個(gè)PEG化的G-CSF由具有分子量約12kDa的聚乙二醇部分通過(guò)胺鍵僅在其N-末端連接到G-CSF部分上組成；(b)不到5％的非PEG化G-CSF分子及(c)藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。
11.治療造血紊亂疾病的方法，包括施用治療上有效量的權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的制品。
12.一種將水溶性聚合物分子附著到蛋白質(zhì)或其類似物上的方法，其中所說(shuō)的水溶性聚合物具有單個(gè)反應(yīng)醛基，所說(shuō)的方法包括(a)在還原性烷基化條件下，在足夠酸性以選擇性激活所說(shuō)蛋白質(zhì)部分氨基末端α-氨基基團(tuán)，以便使水溶性聚合物選擇性地附著到所說(shuō)α-氨基上的pH值下將蛋白質(zhì)部分與水溶性聚合物部分反應(yīng)；和(b)獲得反應(yīng)混合物和(c)任選從未發(fā)生反應(yīng)的部分中分離反應(yīng)產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的聚合物是藥用上可接受的。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的水溶性聚合物選自葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚體、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的多聚體是聚乙二醇。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)的還原性烷基化反應(yīng)涉及使用選自硼氫化鈉、氰基硼氫鈉，硼酸二甲胺、硼酸三甲胺及硼酸吡啶的還原劑。
17.一種將聚乙二醇分子附著到G-CSF分子上的方法，其中所說(shuō)的聚乙二醇分子含有單個(gè)反應(yīng)醛基，所說(shuō)的方法包括(a)在還原性烷基化反應(yīng)條件下，足夠酸性以選擇性地激活所說(shuō)G-CSF氨基末端α-氨基基團(tuán)的pH值下，使所說(shuō)的G-CSF與所說(shuō)的聚乙二醇分子反應(yīng)；和(b)獲得PEG化的G-CSF和(c)任選從非PEG化G-CSF中分離出PEG化G-CSF。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的聚乙二醇分子量為大約6kDa到大約25kDa。
19.以權(quán)利要求17的方法生產(chǎn)的PEG化G-CSF產(chǎn)品。
20.化學(xué)修飾的共有干擾素，由共有干擾素蛋白質(zhì)部分連接到至少一個(gè)水溶性聚合物部分上組成。
21.權(quán)利要求20的化學(xué)修飾的共有干擾素，其中所說(shuō)的共有干擾素部分選自IFN-con1、IFN-con2及IFN-con3。
22.權(quán)利要求21的化學(xué)修飾的共有干擾素，其中所說(shuō)的水溶性聚合物是藥用上可接受的。
23.權(quán)利要求20的化學(xué)修飾的共有干擾素，其中所說(shuō)的水溶性聚合物選自葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚體、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚體、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的化學(xué)修飾的共有干擾素，其中所說(shuō)的水溶性聚合物部分是聚乙二醇。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的化學(xué)修飾的共有干擾素，其中所說(shuō)的水溶性聚合物部分不用另外的連接基團(tuán)直接連接到所說(shuō)的共有干擾素部分上。
26.一種化學(xué)修飾的共有干擾素由IFN-con1連接到至少一個(gè)聚乙二醇部分上組成。
27.PEG化的共有干擾素。
28.一種向共有干擾素上附著水溶性聚合物的方法，其中所說(shuō)的水溶性聚合物具有單個(gè)反應(yīng)醛基，所說(shuō)的方法包括(a)在還原性烷基化條件下，在足夠酸性以選擇性激活所說(shuō)的共有干擾素部分氨基末端α-氨基基團(tuán)的pH值下，使共有干擾素部分與水溶性多聚體部分反應(yīng)；(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物和(c)可任選地從未發(fā)生反應(yīng)的部分中分離反應(yīng)產(chǎn)物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所說(shuō)的聚合物是藥用上可接受的。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所說(shuō)的水溶性聚合物選自葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚體、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚體、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所說(shuō)的聚合物為聚乙二醇。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所說(shuō)的還原性烷基化反應(yīng)涉及使用選自硼氫化鈉、氰基硼氫鈉、硼酸二甲胺、硼酸三甲胺及硼酸吡啶的還原劑。
33.一種向共有干擾素分子上附著聚乙二醇分子的方法，其中所說(shuō)的聚乙二醇分子具有單個(gè)反應(yīng)醛基，所說(shuō)的方法包括(a)在還原性烷基化條件下，在足夠酸性以選擇性激活所說(shuō)的共有干擾素末端α-氨基基團(tuán)的pH值下，使所說(shuō)的共有干擾素與所說(shuō)的聚乙二醇分子反應(yīng)；(b)獲得PEG化的共有干擾素和(c)可任選地從未發(fā)生PEG化的共有干擾素中分離出PEG化的共有干擾素。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所說(shuō)的聚乙二醇分子具有大約2kDa到大約100kDa的分子量。
35.以權(quán)利要求33的方法所生產(chǎn)的PEG化共有干擾素產(chǎn)品。
36.單個(gè)PEG化的共有干擾素的基本均一的制品。
37.權(quán)利要求36的制品，包括大約90％單個(gè)PEG化的共有干擾素及大約10％的末PEG化的共有干擾素。
38.一種藥用組合物，包括(a)單個(gè)PEG化的共有干擾素的基本上均一的制品，所說(shuō)的單個(gè)PEG化的共有干擾素由一個(gè)聚乙二醇部分連接到共有干擾素部分上組成，該連接通過(guò)胺鍵并僅在其N末端；(b)少于5％的未PEG化的共有干擾素分子；和(c)一種藥用上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。
全文摘要
本文提供了涉及給蛋白質(zhì)附著水溶性多聚物的方法及組合物。提供了用于N端修飾蛋白質(zhì)或其類似物的新方法及新得的組合物，包括新N端化學(xué)修飾的G-CSF組合物和相關(guān)制備方法。提供了化學(xué)修飾的共有干擾素。
文檔編號(hào)C07K14/53GK1139932SQ95191454
公開日1997年1月8日 申請(qǐng)日期1995年2月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月12日
發(fā)明者O·B·金斯勒, N·E·加布里爾, C·E·發(fā)拉, R·B·迪普林斯 申請(qǐng)人:安姆根有限公司