專利名稱：使用甲硫醇和二甲硫醚的混合物增加蛋氨酸產(chǎn)率的方法
使用甲硫醇和二甲硫醚的混合物增加蛋氨酸產(chǎn)率的方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及提高L-蛋氨酸和有機(jī)酸的產(chǎn)率的方法。相關(guān)技術(shù)描述蛋氨酸是人體必需的氨基酸之一并廣泛用作動(dòng)物飼料和食物添加劑以及用于醫(yī)藥產(chǎn)品的藥物水性溶液和其它原材料的組分。蛋氨酸充當(dāng)膽堿(卵磷脂)和肌酸的前體， 并還用作合成半胱氨酸和牛磺酸的原材料。此外，其充當(dāng)硫供體。S-腺苷-蛋氨酸衍生自 L-蛋氨酸并充當(dāng)身體內(nèi)的甲基供體，并且其與大腦中各種神經(jīng)遞質(zhì)的合成有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)能預(yù)防肝臟和動(dòng)脈中的類脂積聚并且有效地治療抑郁癥、炎癥、肝疾病和肌肉疼痛(Jeon BR等人，JH印atol.，2001年三月；34(3) :395-401)。為了化學(xué)合成蛋氨酸，通過5_(β -甲基巰乙基)-乙內(nèi)酰脲的水解制備L-蛋氨酸。然而，不利地是化學(xué)合成的蛋氨酸以L-型和D-型的混合物形式存在。因此，本發(fā)明者開發(fā)了選擇性合成L-蛋氨酸的生物方法并已申請(qǐng)專利(W0 2008/103432)。所述方法簡(jiǎn)稱為“兩步法”，其包括發(fā)酵制備L-蛋氨酸前體和將L-蛋氨酸前體酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸。L-蛋氨酸前體優(yōu)選包含0-乙酰高絲氨酸和0-琥珀酰高絲氨酸。根據(jù)克服常規(guī)方法所遭受的問題來評(píng)價(jià)兩步法，所述問題諸如硫化物毒性、蛋氨酸和SAMe的菌株反饋調(diào)節(jié)以及胱硫醚Y 合酶、0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的中間體降解。另外， 與制備D-蛋氨酸和L-蛋氨酸的常規(guī)化學(xué)合成方法相比，兩步法具有僅對(duì)L-蛋氨酸有選擇性和伴隨產(chǎn)生有機(jī)酸的優(yōu)點(diǎn)，更具體地，伴隨產(chǎn)生作為有用副產(chǎn)物的琥珀酸和乙酸。將琥珀酸用作涂料、化妝品或醫(yī)藥產(chǎn)品的原材料，且乙酸在工業(yè)領(lǐng)域是非常有用的，包括制備乙酸乙烯基酯、染色劑、諸如阿司匹林的醫(yī)藥產(chǎn)品和攝影定影液。在兩步法的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，使用具有胱硫醚Y合酶、0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性的酶，并將作為L(zhǎng)-蛋氨酸前體的0-乙酰高絲氨酸或 0-琥珀酰高絲氨酸與甲硫醇混合以通過酶反應(yīng)制備L-蛋氨酸和有機(jī)酸。甲硫醇在室溫下以氣體形式存在并微溶于水，且在堿性溶液中具有高溶解度。 L-蛋氨酸制備的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)在水溶液中發(fā)生。因此，如果甲硫醇在水溶液中具有較高的溶解度，則有希望顯著提高蛋氨酸產(chǎn)率。鑒于上述問題，本發(fā)明者嘗試增加甲硫醇在酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的溶解度以使L-蛋氨酸制備最大化。因此，其發(fā)現(xiàn)以合適的比混合的甲硫醇和二甲硫醚混合物能提高L-蛋氨酸前體至L-蛋氨酸和有機(jī)酸的轉(zhuǎn)化率，因此與常規(guī)方法相比能以高收率制備L-蛋氨酸，由此完成本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供通過使用混合物來提高將L-蛋氨酸前體、0-乙酰高絲氨酸或O-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率的方法，所述混合物為硫化合物、二甲硫醚和甲硫醇的混合物，其為用作酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)底物的另一硫化合物。
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發(fā)明效果與在轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中單獨(dú)使用甲硫醇相比，通過使用本發(fā)明的方法能提高L-蛋氨酸和有機(jī)酸的生產(chǎn)率和純度。此外，通過提高蛋氨酸產(chǎn)率能獲得節(jié)約反應(yīng)設(shè)備成本的經(jīng)濟(jì)效益。附圖簡(jiǎn)述

圖1是pH變化的曲線圖，其表示在IL間歇反應(yīng)器中根據(jù)供給甲硫醇溶液或供給甲硫醇和二甲硫醚溶液混合物的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)率；圖2為表示隨著甲硫醇溶液(SMM)和二甲硫醚(DMS)的混合比而不同的相對(duì)活性的曲線圖。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了制備蛋氨酸的方法，其包括1)制備反應(yīng)溶液，其包含為0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸的蛋氨酸前體、 具有將蛋氨酸前體轉(zhuǎn)化為蛋氨酸活性的酶以及甲硫醇和二甲硫醚的混合物；以及2)在攪拌所述反應(yīng)溶液時(shí)進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“兩步法”是指WO 2008/013432公開的制備L-蛋氨酸的方法，其包括使用根據(jù)所述方法制備的發(fā)酵菌株通過葡萄糖發(fā)酵制備0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸的步驟；以及通過酶轉(zhuǎn)化將0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸連同甲硫醇轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，由此制備L-蛋氨酸。 在下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明一方面提供了制備蛋氨酸的方法，其包括1)制備反應(yīng)溶液，其包含為0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸的蛋氨酸前體、 具有將蛋氨酸前體轉(zhuǎn)化為蛋氨酸活性的酶以及甲硫醇和二甲硫醚的混合物；以及2)在攪拌所述反應(yīng)溶液時(shí)進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)?？稍?500rpm 至 lOOOrpm，優(yōu)選在 600rpm 至 900rpm 且更優(yōu)選在 700rpm 至 800rpm 下進(jìn)行步驟幻的攪拌。本發(fā)明的方法還可包括終止酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，并且在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，使用 2N HCl終止反應(yīng)。此外，本發(fā)明的方法還可包括純化反應(yīng)溶液中存在的蛋氨酸。特別地，蛋氨酸的純化步驟可包括1)從所述酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)溶液中分離微生物；2)將去除微生物的反應(yīng)溶液脫色和過濾；以及3)從所述濾液中結(jié)晶。可使用高速離心機(jī)或膜過濾器進(jìn)行分離微生物的步驟?？墒褂没钚蕴窟M(jìn)行將去除微生物的溶液脫色和過濾的步驟，但不局限于此。在制備蛋氨酸的兩步法中，使用O-乙酰高絲氨酸或O-琥珀酰高絲氨酸作為L(zhǎng)-蛋氨酸前體以及使用甲硫醇(CH3SH)作為底物通過酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備蛋氨酸(W02008/013432)。 對(duì)此，將甲硫醇用作能與底物、O-乙酰高絲氨酸或O-琥珀酰高絲氨酸反應(yīng)的硫來源以制備蛋氨酸，從而通過甲硫醇的反應(yīng)性可顯著影響蛋氨酸的生產(chǎn)效率。然而，甲硫醇在中性水溶液具有非常低的溶解度并為揮發(fā)性的，從而從溶液中迅速蒸發(fā)。因此，如果開發(fā)能夠提高甲硫醇反應(yīng)性的方法，則在甲硫醇蒸發(fā)之前能夠盡可能使最大量的甲硫醇反應(yīng)，從而提高蛋氨酸的制備產(chǎn)率。因此，本發(fā)明者意圖通過向包含甲硫醇的反應(yīng)溶液添加另外的物質(zhì)來提高甲硫醇反應(yīng)性。因此，其發(fā)現(xiàn)當(dāng)將二甲硫醚(DMS)作為另一物質(zhì)與甲硫醇混合來引發(fā)反應(yīng)時(shí)，能提高轉(zhuǎn)化率。在本發(fā)明的特定實(shí)例中，當(dāng)單獨(dú)使用二甲硫醚時(shí)轉(zhuǎn)化反應(yīng)不發(fā)生。然而，當(dāng)使用甲硫醇與二甲硫醚的混合物時(shí)，與單獨(dú)使用甲硫醇相比轉(zhuǎn)化率增加(參見表1和4以及圖2)。 此外，根據(jù)由乙酸導(dǎo)致的PH下降率，酶的反應(yīng)速率高于單獨(dú)使用甲硫醇的反應(yīng)速率，所述乙酸為與二甲硫醚混合制備的副產(chǎn)物(參見圖1)。此外，當(dāng)進(jìn)行混合物的連續(xù)供應(yīng)時(shí)(參見表幻或進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)時(shí)(參見表幻，與單獨(dú)使用甲硫醇相比轉(zhuǎn)化率也提高。因此， 本發(fā)明的方法能有效用于提高0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)化至L-蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率。在下列反應(yīng)方案中示出使用具有轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的活性的酶將蛋氨酸前體轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
曱硫醇(CH3SH)+ O-琥珀酰-L-高絲氨酸η琥珀酸酯+L-蛋氨酸
曱硫醇(CH3SH)+ O-乙酰-L-高絲氨酸η乙酸酯+L-蛋氨酸在上述反應(yīng)方案中，使用0-琥珀酰高絲氨酸或0-乙酰高絲氨酸的琥珀酸酯或乙酸酯殘基取代甲硫醇的CH3S-殘基以制備蛋氨酸。基于所述反應(yīng)，可以各種形式添加甲硫醇(CH3SH)。優(yōu)選地，可以甲硫醇?xì)怏w的形式添加甲硫醇，或還可以將甲硫醇鈉溶液用作液體類型，因?yàn)榧琢虼尖c溶液和甲硫醇?xì)怏w在水性反應(yīng)溶液中顯示相同的反應(yīng)性質(zhì)。因此，可直接或以通過將其溶解在氫氧化鈉溶液中的甲硫醇鈉溶液的形式使用甲硫醇。然而，由于甲硫醇在室溫下以氣體形式存在，因此優(yōu)選使用通過將甲硫醇溶解在氫氧化鈉溶液中制備的甲硫醇鈉溶液。在本發(fā)明中，具有轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的活性的酶可包含選自胱硫醚Y合酶、0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶中的一種或多種。在上述反應(yīng)中，用于制備蛋氨酸且具有轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的活性的酶可為源自微生物菌株的酶，所述微生物菌株屬于埃希氏菌屬(Escherichia sp)、假單胞菌屬(I^eudomonas sp)、鉤端螺旋體(Leptospira sp)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp)、酵母菌屬 (Saccharomyces sp)、色桿菌屬(Chromobacterium sp)、諾卡氏菌屬(Nocardia sp)、根瘤菌屬(Bradyrhizobium sp)、生絲單胞菌屬(Hyphomonas sp)、甲基球菌屬(Methylococcus sp)、甲基菌屬(Methylobacillus sp)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas sp)、克雷伯氏菌屬 (Klesiella sp)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp)、志賀氏菌屬(Shigella sp)、科爾韋爾氏菌屬 (Colwellia sp)、沙門氏菌屬(Salmonella sp)、酵母或真菌。在上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，當(dāng)使用O-琥珀酰高絲氨酸作為底物時(shí)，酶可包含選自胱硫醚Y合酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶中的一種或多種，其優(yōu)選源自屬于假單胞菌屬O^seudomonas sp)、諾卡氏菌屬(Nocardia sp)和色桿菌屬(ChromcAacterium sp)的微生物菌株，且更優(yōu)選源自屬于綠膿桿菌(I^seudomonas aurogenosa)、皮疽諾卡氏菌(Nocardia Farcinica)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) 和青紫色桿菌(Chromobacterium Violaceum)的微生物菌株。
在上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，當(dāng)使用0-乙酰高絲氨酸作為底物時(shí)，酶可包含選自胱硫醚Y 合酶、0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶中的一種或多種，其優(yōu)選源自屬于鉤端螺旋體(Leptospira sp)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp)和生絲單胞菌屬(Hyphomonas sp)的微生物菌株，且更優(yōu)選源自屬于邁氏鉤端螺旋體(Leptospira meyeri)、綠胺桿菌(Pseudomonas aurogenosa)、海王生絲單胞菌(Hyphomonas Neptunium) 和青紫棒狀桿菌(Corynebacterium Violaceum)的微生物菌株。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，按照WO 2008/013432所述方法制備的微生物菌株通過發(fā)酵制備0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸，其在制備L-蛋氨酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中作為底物使用，并通過甲醇沉淀從發(fā)酵的溶液中純化0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸底物。此外，從源自青紫色桿菌(ChromcAacterium violaceum)的0_琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas Neptunium)的0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的基因獲得制備L-蛋氨酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的酶，其中按照WO 2008/013432所述方法將包含所述基因的菌株發(fā)酵、回收然后分解。將為上述方法所回收的底物的0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸與具有轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的活性的酶進(jìn)行混合來制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)溶液。以合適的比將其它底物、甲硫醇與二甲硫醚混合并添加至轉(zhuǎn)化反應(yīng)溶液，并比較各個(gè)情況下的得自0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸的蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示當(dāng)甲硫醇二甲硫醚比為1 0. 0. 5(mol mol)至1 1 (mol mol)時(shí)，甲硫醇和二甲硫醚的混合比最佳，其中比優(yōu)選為1 0. 20(mol mol)至1 1 (mol mol)，且更優(yōu)選為 1 0. 25 (mol mol)至1 0.5(mol mol)。同時(shí)，基于甲硫醇的摩爾濃度，優(yōu)選以5% 至25%且更優(yōu)選為20%至25%的比使用二甲硫醚。本發(fā)明的另一方面提供了通過上述方法制備的蛋氨酸。氨酸可為干粉末形式或溶解在水溶液中的液體形式，其通過純化過程而純化。根據(jù)本發(fā)明，使用甲硫醇和二甲硫醚的混合物，將L-蛋氨酸前體轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸的方法能以高于常規(guī)方法的收率制備L-蛋氨酸，因此，能將制備的蛋氨酸應(yīng)用于多種領(lǐng)域，其包括動(dòng)物飼料、食物添加劑、醫(yī)藥和其它的醫(yī)藥產(chǎn)品原材料。在下文中，參考實(shí)施例將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的方法和效果。然而，這些實(shí)施例僅出于例示性的目的，并且本發(fā)明不意圖受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1 根據(jù)甲硫醇和二甲硫醚的混合比來比較得自0-乙酰高絲氨酸的蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率基于轉(zhuǎn)化反應(yīng)，以合適的比將二甲硫醚與甲硫醇溶液混合，并將上述混合物添加至轉(zhuǎn)化反應(yīng)溶液中以便檢測(cè)得自0-乙酰高絲氨酸的蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率。甲硫醇在室溫下以氣體形式存在，并可以通過將其添加至氫氧化鈉溶液而以甲硫醇鈉溶液(甲硫醇鈉，CH3S-Na, 2. 14M, 15%, Tokyo Chemical industry, Japan)的形式存在。在本實(shí)施例中，使用2. 14M的甲硫醇鈉溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在下文中，指定2. 14M的甲硫醇鈉溶液作為甲硫醇溶液。將甲硫醇溶液和二甲硫醚溶液(13. 38M，99%，arkema，F(xiàn)rance)以合適的摩爾比(mol mol)混合，并攪拌以制備混合溶液。通過將50 μ 1的轉(zhuǎn)化酶溶液和0. ImM的作為輔因子的吡哆醛5’-磷酸酯(Sigma，USA)添加至Iml的0-乙酰高絲氨酸溶液(500mM)來制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)溶液。通過將從發(fā)酵液中純化的0-乙酰高絲氨酸溶解在磷酸緩沖溶液(pH 7. 5)中來制備0-乙酰高絲氨酸溶液。將按照WO 2008/013432公開的方法而制備的CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL菌株作為發(fā)酵菌株。在5L的發(fā)酵罐中接種CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL菌株，并通過分批補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)行50至100小時(shí)的培養(yǎng)。通過甲醇沉淀從發(fā)酵液中純化0-乙酰高絲氨酸。從使用源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas Neptunium)的pCJ_MetZ_CL而轉(zhuǎn)化的Ε. coli W3110菌株中獲得轉(zhuǎn)化酶，其中按照WO 2008/013432公開的方法將菌株發(fā)酵，然后回收和分解。將甲硫醇和二甲硫醚的混合物添加至制備的轉(zhuǎn)化反應(yīng)溶液以誘發(fā)酶反應(yīng)。對(duì)此，調(diào)整甲硫醇和二甲硫醚的混合物的加入量直至甲硫醇的最終量變?yōu)?. 04mM。在33°C的溫度和SOOrpm的攪拌下進(jìn)行10分鐘的反應(yīng)。對(duì)于反應(yīng)的終止，加入0.2N的HCl溶液以終止所述反應(yīng)。通過 HPLC分析最終產(chǎn)物蛋氨酸的濃度。在W02008/013432公開的條件下進(jìn)行分析。以反應(yīng)中所用的制備的蛋氨酸的摩爾數(shù)與底物的摩爾數(shù)(mol/L)的百分比(％ ) 來計(jì)算得自0-乙酰高絲氨酸的蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率(％)。當(dāng)從Imol的0-乙酰高絲氨酸和甲硫醇制備Imol的蛋氨酸時(shí)，將轉(zhuǎn)化率(％ )視為100%。在下列表1中示出分析結(jié)果。[表 1]比較不同混合比的甲硫醇溶液(SMM)和二甲硫醚(DMS)之間的0-乙酰高絲氨酸的轉(zhuǎn)化率
權(quán)利要求
1.制備蛋氨酸的方法，其包括1)制備反應(yīng)溶液，其包含為0-乙酰高絲氨酸或0-琥珀酰高絲氨酸的蛋氨酸前體、具有將所述蛋氨酸前體轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的活性的酶以及甲硫醇和二甲硫醚的混合物；以及2)在攪拌所述反應(yīng)溶液的同時(shí)進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的制備蛋氨酸的方法，其中所述甲硫醇為甲硫醇?xì)怏w或甲硫醇鈉溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的制備蛋氨酸的方法，其中甲硫醇和二甲硫醚的混合比為 1 0. 05至1 1的甲硫醇二甲硫醚比。
4.如權(quán)利要求3所述的制備蛋氨酸的方法，其中甲硫醇和二甲硫醚的混合比為 1 0. 20至1 1的甲硫醇二甲硫醚比。
5.如權(quán)利要求4所述的制備蛋氨酸的方法，其中甲硫醇和二甲硫醚的混合比為 1 0.25至1 0. 5的甲硫醇二甲硫醚比。
6.如權(quán)利要求1所述的制備蛋氨酸的方法，其中所述具有將蛋氨酸前體轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的活性的酶為選自胱硫醚Y合酶、0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶中的一種或多種。
7.如權(quán)利要求1所述的制備蛋氨酸的方法，其還包括終止所述酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求1所述的制備蛋氨酸的方法，其還包括將由酶轉(zhuǎn)化制備的并包含在反應(yīng)溶液中的蛋氨酸純化的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的制備蛋氨酸的方法，其中所述蛋氨酸純化步驟包括1)從所述酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)溶液中分離微生物；2)將所述去除微生物的反應(yīng)溶液脫色和過濾；以及3)從所述濾液中結(jié)晶。
10.通過權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的方法而制備的蛋氨酸。
11.如權(quán)利要求10所述的蛋氨酸，其中所述蛋氨酸為粉末形式或溶液形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高L-蛋氨酸產(chǎn)率和有機(jī)酸產(chǎn)率的方法。更具體地，本發(fā)明涉及方法，其包括以合適的比向O-乙酰高絲氨酸或O-琥珀酰高絲氨酸以及向具有將蛋氨酸前體轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸活性的酶添加包含甲硫醇和二甲硫醚的混合物以便進(jìn)行酶反應(yīng)，由此提高得自所述L-蛋氨酸前體的L-蛋氨酸和有機(jī)酸的轉(zhuǎn)化率，從而與常規(guī)方法相比增加了L-蛋氨酸收率。
文檔編號(hào)C12P13/12GK102333881SQ201080009632
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者全成*, 孫晟光, 徐昌一, 李漢珍, 李相穆, 申容旭, 羅光鎬, 許仁庚, 金日出, 金朱恩, 金泰影, 金賢雅 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社