專利名稱：用于進(jìn)行樣品和探針單獨變性的雜交的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于雜交應(yīng)用的組合物和方法，其涉及靶標(biāo)和探針的單獨變性。在一個實施方案中，本發(fā)明可以用于DNA和RNA的體內(nèi)、體外和原位的分子檢測。特別是，本發(fā)明可以在細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中用于DNA和RNA分子檢測。在其它實施方案中，本發(fā)明可以用于原位雜交(ISH)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙鏈核酸分子(即DNA (脫氧核糖核酸)、DNA/RNA (核糖核酸)和RNA/RNA)以雙螺旋構(gòu)型結(jié)合。該雙螺旋結(jié)構(gòu)由堿基以特定方式(A+T/U或G+C)配對時的相對鏈上堿基是的氫鍵結(jié)合和堆疊堿基是的疏水鍵合穩(wěn)定化?；パa堿基配對(雜交)是涉及核酸的所有處理的核心。在雜交的基礎(chǔ)實例中，核酸探針或引物經(jīng)設(shè)計與靶標(biāo)核酸例如樣品中的DNA或 RNA結(jié)合或“雜交”。一種類型的雜交應(yīng)用，原位雜交(ISH)，包括與標(biāo)本中的靶標(biāo)雜交，其中該標(biāo)本可以在體內(nèi)、原位或體外，例如固定或粘附到載玻片上?？梢詷?biāo)記探針以使得可能使用熒光或明視野顯微鏡/掃描儀識別探針-靶雜合體。核酸雜交測定的效率和準(zhǔn)確度主要取決于以下3個因素中的至少一個a)變性條件，b)復(fù)性條件，和c)雜交后的洗滌條件。為了使探針或引物與樣品中的靶標(biāo)核酸結(jié)合，必須分離核酸的互補鏈。該鏈分離步驟稱為“變性”，通常需要積極條件以破壞雙螺旋中的氫鍵和疏水鍵。探針和靶標(biāo)分子可以單獨地變性或一起變形(共變性)。已有人提出，單獨變性可更好地保持形態(tài)學(xué)，而共變性可減少實際操作步驟的數(shù)目。出于這些理由，單獨變性步驟最常用在分子細(xì)胞遺傳學(xué)應(yīng)用中，且共變性最常用在分析組織切片時。傳統(tǒng)的雜交實驗，例如ISH測定，使用含甲酰胺的溶液以使雙鏈核酸變性。甲酰胺通過置換松散而均勻結(jié)合的水合分子并通過造成Watson-Crick結(jié)合位點的“甲酰胺化”來破壞堿基配對。因此，甲酰胺對雙鏈核酸和類似物具有去穩(wěn)定效應(yīng)?！┖怂岬幕パa鏈已分離，“復(fù)性”或“重新退火”步驟就允許引物或探針與樣品中的靶標(biāo)核酸結(jié)合。該步驟有時也稱為“雜交”步驟。雖然甲酰胺促進(jìn)雙鏈核酸和類似物的變性，但與不含甲酰胺的含水變性溶液相比，甲酰胺還會顯著延長復(fù)性時間。事實上，重新退火步驟在傳統(tǒng)的雜交應(yīng)用中是最耗時間的。傳統(tǒng)雜交時間的實例見

圖1和圖2。另外，甲酰胺在長時間處理中具有缺點。甲酰胺是有毒有害物質(zhì)，其使用和廢料都受到嚴(yán)格的法規(guī)管制。此外，使用高濃度甲酰胺會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)、核結(jié)構(gòu)和/或染色體結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)上的破壞，在檢測期間產(chǎn)生高背景信號。因此，存在克服現(xiàn)有技術(shù)雜交應(yīng)用相關(guān)缺點的需要。針對該需要，本發(fā)明提供相比現(xiàn)有技術(shù)雜交應(yīng)用的若干潛在優(yōu)勢
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供方法和組合物，其得出相比現(xiàn)有技術(shù)雜交應(yīng)用具有至少一個下述優(yōu)勢的雜交應(yīng)用更低的背景、更均勻的背景、樣品形態(tài)學(xué)的保持、更容易的自動化、更快的過程和更安全(較低毒性)的試劑。本發(fā)明實現(xiàn)這些目的的一種方式是提供用于探針和靶標(biāo)的單獨變性的方法和組合物。本發(fā)明的組合物和方法適用于任何雜交技術(shù)。本發(fā)明的組合物和方法還適用于使用堿基配對進(jìn)行雜交或結(jié)合的任何分子系統(tǒng)，例如DNA、RNA、PNA、LNA和其合成或天然類似物。本發(fā)明的核酸雜交方法和組合物可以用于基因組DNA、染色體、染色體片段、基因和染色體畸變的體內(nèi)、體外或原位分析，例如與正常條件或疾病相關(guān)的易位、缺失、擴增、插入、突變或倒位。此外，該方法和組合物有助于檢測感染原以及RNA的表達(dá)水平變化，例如， mRNA 及其互補 DNA (cDNA)。其它用途包括對下述進(jìn)行的體內(nèi)、體外或原位分析信使RNA(mRNA)、病毒RNA、 病毒 DNA、小干擾 RNA(siRNA)、小核 RNA(snRNA)、非編碼 RNA(ncRNA，例如 tRNA 和 rRNA)、 轉(zhuǎn)運信使RNA (tmRNA)、微小RNA (miRNA)、PIffI相互作用RNA (piRNA)、長鏈非編碼RNA、 小核RNA(SnoRNA)、反義RNA、雙鏈RNA(dsRNA)，甲基化和其它堿基修飾、單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)、拷貝數(shù)變異(CNVs)，和單獨或與未標(biāo)記核酸組合的用例如放射性同位素、熒光分子、生物素、地高辛(DIG)或抗原標(biāo)記的核酸。本發(fā)明的核酸雜交方法和組合物可用于核酸的體內(nèi)、體外或原位分析，使用例如 RNA印跡(northern blot)、DNA印跡(Southern blot)、流式細(xì)胞術(shù)、放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)、化學(xué)發(fā)光、免疫組織化學(xué)、虛擬核型(virtual karyotype)、基因測定、DNA微陣列(例如陣列比較基因組雜交(陣列CGH))、基因表達(dá)譜、基因ID、疊瓦陣列(Tiling array)、凝膠電泳、毛細(xì)管電泳和原位雜交例如FISH、SISH、CISH的技術(shù)。本發(fā)明的方法和組合物可用于體外和體內(nèi)樣品例如骨髓涂片、血涂片、石蠟包埋的組織制備物、酶解的組織樣品、骨髓、羊水細(xì)胞、細(xì)胞離心(cytospin)制備物、印跡(imprint)等。在一個實施方案中，本發(fā)明提供方法和組合物，其用于對分子和靶標(biāo)使用單獨變性步驟，將至少一種分子(例如，探針)與靶標(biāo)(例如，生物樣品)雜交。在其它實施方案中，本發(fā)明可以不使用甲酰胺，或減少在這種變性步驟中對甲酰胺的依賴性，例如將傳統(tǒng)變性緩沖液中70%的甲酰胺降低到本發(fā)明的組合物和方法中的50%、25 %、15%、10 %、5%、 2%、1%或0% ν/ν的甲酰胺，。因此，在某些方面，本發(fā)明克服了與傳統(tǒng)雜交測定相關(guān)的若干缺點，包括與在這種傳統(tǒng)雜交測定中使用甲酰胺相關(guān)的主要毒性問題和耗時的復(fù)性步馬聚ο本發(fā)明的一方面提供用于在雜交應(yīng)用中單獨變性探針和靶標(biāo)的組合物或溶液。用于變性靶標(biāo)的組合物可以包括與用于變性探針的組合物相同的成分，或兩種組合物可以包括不同成分。本發(fā)明中使用的組合物可以包括含水組合物，其含有足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑。足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量是允許雜交的量。例如，用于測定極性非質(zhì)子溶劑的量是否對雜交有效的一種方式是，確定極性非質(zhì)子溶劑當(dāng)用在本文所述的雜交方法和組合物中例如實施例1中時是否產(chǎn)生可檢測信號和/或擴增的核酸產(chǎn)物。極性非質(zhì)子溶劑有效量的非限制性實例包括例如約至約95% (ν/ν)。在某些實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃度為5%至60% (ν/ν) 0在其它實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃度為10%至60% (ν/ν) 0在再一些實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃度為30%至 50% (ν/ν)。至 5%、5% 至 10%、10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、或50%至60%、或60%至70% (ν/ν)的濃度也是合適的。在某些實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃度可以是0. 1%、0. 25%、0. 5%、1%、2%、3%、4%或5% (ν/ν)。在其它實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃度可以是7%、7. 5%,8%,8. 5%,9%,9. 5%U0%U0. 5%, 11%U1. 5%,12%,12. 5%,13%,13. 5%,14%,14. 5%,15%,15. 5%,16%,16. 5%,17%, 17. 5%U8%U8. 5%,19%U9. 5%或 20% (ν/ν)。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，含水組合物包括具有降低的毒性的極性非質(zhì)子溶劑。例如，在雜交應(yīng)用中使用的比傳統(tǒng)溶液毒性低的組合物可以包括一種組合物，前提條件是該組合物不含甲酰胺，或前提條件是該組合物含有少于25%、或少于10%、或少于5%、或少于2 %、或少于1%、或少于0.5%、或少于0.1%、或少于0.05%、或少于0. 01 %的甲酰胺。 毒性較低的組合物在一個實施方案中還可以包括一種組合物，前提條件是該組合物不含二甲亞砜(DMSO)，或前提條件是該組合物含有少于25 %、10 %、5 %、2 %、或少于1 %、或少于 0. 5%、或少于0. 1%、或少于0. 05%、或少于0. 01%的DMS0。在本發(fā)明的一方面，可根據(jù)極性非質(zhì)子溶劑的Hansen溶度參數(shù)，來選擇用于本發(fā)明的合適極性非質(zhì)子溶劑。例如，合適的極性非質(zhì)子溶劑可具有的分散溶度參數(shù)介于 17. 7-22. OMPa172之間，極性溶度參數(shù)介于13_23MPa"2之間，氫鍵溶度參數(shù)介于3-13MPa"2 之間。依據(jù)本發(fā)明的一方面，用于本發(fā)明的合適極性非質(zhì)子溶劑是環(huán)狀化合物。環(huán)狀化合物具有環(huán)狀基本結(jié)構(gòu)。實例包括本文所公開的環(huán)狀化合物。在其它實施方案中，所述極性非質(zhì)子溶劑可選自下式1-4:
權(quán)利要求
1.一種雜交核酸序列的方法，包括-混合第一核酸序列與第一含水組合物，所述第一含水組合物含有足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑；-混合第二核酸序列與第二含水組合物，所述第二含水組合物含有足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少變性劑；和-混合所述第一核酸序列和所述第二核酸序列，其時間至少足以使所述第一核酸序列和所述第二核酸序列雜交；其中所述極性非質(zhì)子溶劑不是二甲亞砜(DMSO)。
2.一種雜交核酸序列的方法，包括-混合第一核酸序列與第一含水組合物，所述第一含水組合物含有足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑，和-混合所述第一核酸序列與第二含水組合物，所述第二含水組合物包括第二核酸序列和足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種變性劑，其時間至少足以使所述第一核酸序列和所述第二核酸序列雜交，其中所述極性非質(zhì)子溶劑不是二甲亞砜(DMSO)。
3.一種雜交核酸序列的方法，包括-混合第一核酸序列與第一含水組合物，所述第一含水組合物含有足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑；和-混合所述第一核酸序列與第二核酸序列，其時間至少足以使所述第一核酸序列和所述第二核酸序列雜交，其中所述極性非質(zhì)子溶劑不是二甲亞砜(DMSO)。
4.實施方案1或2的方法，其中所述第二含水組合物中的變性劑是極性非質(zhì)子溶劑。
5.實施方案1至4中任一項的方法，其中所述第一核酸序列在生物樣品中。
6.實施方案5的方法，其中所述生物樣品是細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)樣品。
7.實施方案1-6中任一項的方法，其中所述第一核酸序列是單鏈序列，所述第二核酸序列是雙鏈序列。
8.實施方案1-6中任一項的方法，其中所述第一核酸序列是雙鏈序列，所述第二核酸序列是單鏈序列。
9.實施方案1-6中任一項的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列都是雙鏈序列。
10.實施方案1-6中任一項的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列都是單鏈序列。
11.實施方案1-10中任一項的方法，其中提供足夠量的能量以使所述第一核酸和第二核酸雜交。
12.實施方案1-11中任一項的方法，其中提供足夠量的能量以使所述第一核酸變性。
13.實施方案1-12中任一項的方法，其中提供足夠量的能量以使所述第二核酸變性。
14.實施方案11-13的方法，其中通過加熱所述組合物來提供能量。
15.實施方案14的方法，其中通過使用微波、熱浴、加熱板、加熱線、珀耳帖元件、感應(yīng)加熱或加熱燈來執(zhí)行所述加熱步驟。
16.實施方案12-15中任一項的方法，其中用于使所述第一核酸變性的溫度為70°C至 85 "C。
17.實施方案12-16中任一項的方法，其中用于使所述第二核酸變性的溫度為70°C至 85 "C。
18.實施方案12-15中任一項的方法，其中用于使所述第一核酸變性的溫度是60°C至 75 °C。
19.實施方案12-15或18中任一項的方法，其中用于使所述第二核酸變性的溫度是 60°C至 75°C。
20.實施方案12-15中任一項的方法，其中用于使所述第一核酸變性的溫度是62°C、 67°C、72°C或 82°C。
21.實施方案12-15或20中任一項的方法，其中用于使所述第二核酸變性的溫度是 62°C、67°C、72°C或 82°C。
22.實施方案1-21中任一項的方法，其中提供足夠量的時間以使所述第一核酸變性。
23.實施方案1-22中任一項的方法，其中提供足夠量的時間以使所述第二核酸變性。
24.實施方案22或23的方法，其中所述時間是1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、 10分鐘、15分鐘或30分鐘。
25.實施方案I-M中任一項的方法，其中所述雜交步驟包括加熱和冷卻所述組合物的步驟。
26.實施方案1-25中任一項的方法，其中所述雜交步驟需要不到8小時。
27.實施方案的方法沈，其中所述雜交步驟需要不到1小時。
28.實施方案27的方法，其中所述雜交步驟需要不到30分鐘。
29.實施方案觀的方法，其中所述雜交步驟需要不到15分鐘。
30.實施方案四的方法，其中所述雜交步驟需要不到5分鐘。
31.實施方案1-30中任一項的方法，還包括封閉步驟。
32.實施方案1-31中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑濃度以體積計為至95%。
33.實施方案32的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑的濃度以體積計為5%至10%。
34.實施方案32的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑的濃度以體積計為10%至20%。
35.實施方案32的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑的濃度以體積計為20%至30%。
36.實施方案1-35中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑是無毒的。
37.實施方案1-36中任一項的方法，前提條件是所述含水組合物不包含甲酰胺。
38.實施方案1-36中任一項的方法，前提條件是所述含水組合物含有少于10%甲酰胺。
39.實施方案38的方法，前提條件是所述含水組合物含有少于2%甲酰胺。
40.實施方案39的方法，前提條件是所述含水組合物含有少于甲酰胺。
41.實施方案1-40中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑具有內(nèi)酯、砜、腈、亞硫酸和/或碳酸官能團。
42.實施方案1-41中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑的分散溶度參數(shù)范圍為17. 7至22. OMPa172,極性溶度參數(shù)范圍為13至23MPa1/2，氫鍵溶度參數(shù)范圍為 3 至 13MPa1/2。
43.實施方案1-42中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑具有環(huán)狀基本結(jié)構(gòu)。
44.實施方案1-43中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑選自
45.實施方案1-44中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑選自 乙酰苯胺、乙腈、N-乙酰基吡咯烷酮、4-氨基吡啶、苯甲酰胺、苯并咪唑、1，2，3_苯并三唑、 二氧化丁二烯、碳酸2，3- 丁二醇酯、Y - 丁內(nèi)酯、己內(nèi)酯(O、氯馬來酸酐、2-氯環(huán)己酮、碳酸氯代乙二醇酯、氯硝甲烷、檸康酸酐、巴豆酸內(nèi)酯、5-氰基-2-硫尿嘧啶、環(huán)丙腈、硫酸二甲酯、二甲砜、1，3-二甲基-5-四唑、1，5-二甲基四唑、1，2-二硝基苯、2，4-二硝基甲苯、 二苯砜、1，2- 二硝基苯、2，4- 二硝基甲苯、二苯砜、ε -己內(nèi)酰胺、乙磺酰氯、亞膦酸二乙酯、 N-乙基四唑、碳酸亞乙酯、三硫代碳酸亞乙酯、硫酸乙二醇酯、亞硫酸乙二醇酯、糠醛、2-呋喃甲腈、2-咪唑、靛紅、異噁唑、丙二腈、4-甲氧基芐腈、1-甲氧基-2-硝基苯、α -溴代特窗酸甲酯、1-甲基咪唑、N-甲基咪唑、3-甲基異噁唑、N-甲基嗎啉-N-氧化物、苯甲砜、N-甲基吡咯烷酮、甲基環(huán)丁砜、4-甲苯磺酸甲酯、3-硝基苯胺、硝基苯并咪唑、2-硝基呋喃、1-亞硝基-2-吡咯烷酮、2-硝基噻吩、2-噁唑烷酮、9，10-菲醌、N-苯基悉尼酮、鄰苯二甲酸酐、 皮考啉腈(2-氰基吡啶)、1，3_丙磺酸內(nèi)酯、-丙醇酸內(nèi)酯、碳酸異丙二醇酯、4Η-吡喃-4-硫酮、4Η-吡喃-4-酮(γ -吡喃酮)、噠嗪、2-吡咯烷酮、糖精、琥珀腈、對氨基苯磺酰胺、環(huán)丁砜、2，2，6，6-四氯環(huán)己酮、四氫噻喃氧化物、四亞甲基砜(環(huán)丁砜)、噻唑、2-硫尿嘧啶、3，3， 3-三氯丙烯、1，1，2_三氯丙烯、1，2，3-三氯丙烯、硫雜環(huán)丁烷-二氧化物和硫雜環(huán)丁烷。
46.實施方案1-44中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑選自
47.實施方案1-44中任一項的方法，其中所述含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑是
48.實施方案1-47中任一項的方法，其中所述含水組合物還包括至少一種選自以下的額外組分緩沖劑、鹽、促進(jìn)劑、螯合劑、去垢劑和封閉劑。
49.實施方案48的方法，其中所述促進(jìn)劑是硫酸葡聚糖，所述鹽是氯化鈉和/或磷酸鹽緩沖液。
50.實施方案49的方法，其中所述硫酸葡聚糖存在的濃度是5%至40%，所述氯化鈉存在的濃度是OmM至1200mM，和/或所述磷酸鹽緩沖液存在的濃度是OmM至50mM。
51.實施方案50的方法，其中所述硫酸葡聚糖存在的濃度是10%至30%，所述氯化鈉存在的濃度是300mM至600mM，和/或所述磷酸鹽緩沖液存在的濃度是5mM至20mM。
52.實施方案48的方法，其中所述促進(jìn)劑選自甲酰胺、DMSO、甘油、丙二醇、1，2_丙二醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇，所述緩沖劑是檸檬酸緩沖劑。
53.實施方案52的方法，其中所述甲酰胺存在的濃度是0.1-5%，所述DMSO存在的濃度是0.01%至10%，所述甘油、丙二醇、1，2-丙二醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇存在的濃度是0. 至10%，所述檸檬酸緩沖劑存在的濃度是ImM至50mM。
54.實施方案48的方法，其中所述封閉劑選自人類總DNA、鯡魚精子DNA、鮭魚精子 DNA和小牛胸腺DNA。
55.實施方案M的方法，其中所述人類總DNA、鯡魚精子DNA、鮭魚精子DNA和小牛胸腺 DNA存在的濃度是0. 01至10 μ g/ μ L。
56.實施方案48的方法，其中所述含水組合物包括40%的至少一種極性非質(zhì)子溶劑、 10%的硫酸葡聚糖、300mM的氯化鈉和/或5mM的磷酸鹽緩沖液。
57.實施方案48的方法，其中所述含水組合物包括15%的至少一種極性非質(zhì)子溶劑、 20%的硫酸葡聚糖、600mM的氯化鈉和/或IOmM的磷酸鹽緩沖液。
58.實施方案48的方法，其中所述含水組合物包括15%的至少一種極性非質(zhì)子溶劑、 20%的硫酸葡聚糖、600mM的氯化鈉、和IOmM的檸檬酸緩沖劑，pH 6. 2。
59.實施方案1-58中任一項的方法，其中所述含水組合物在室溫下包含一相。
60.實施方案1-58中任一項的方法，其中所述含水組合物在室溫下包含多相。
61.實施方案60的方法，其中所述含水組合物在室溫下包含兩相。
62.實施方案60或61的方法，其中所述含水組合物的各相混合在一起。
63.一種含水組合物，其用于在雜交應(yīng)用中執(zhí)行靶標(biāo)的單獨變性，所述組合物包括足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑，其中所述極性非質(zhì)子溶劑不是二甲亞砜(DMSO)。
64.實施方案63的含水組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑的濃度由實施方案32至35 中任一項定義。
65.實施方案63或64的含水組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑由實施方案36或41至 47中任一項定義。
66.實施方案61至65中任一項的含水組合物，其中所述含水組合物由實施方案37至 40或48至62中任一項定義。
67.一種組合物的用途，所述組合物包括以體積計在1至95%之間的至少一種極性非質(zhì)子溶劑，用于在雜交應(yīng)用中執(zhí)行靶標(biāo)的單獨變性。
68.實施方案67的組合物的用途，其中所述極性非質(zhì)子溶劑的濃度由實施方案32至 35中的任一項定義。
69.實施方案67或68的組合物的用途，其中所述極性非質(zhì)子溶劑由實施方案36或41 至47中的任一項定義。
70.實施方案67至69中的任一項的組合物的用途，其中所述含水組合物由實施方案 37至40或48至62中的任一項定義。
71.一種用于執(zhí)行雜交測定的試劑盒，包括-實施方案63-66中任一項的第一含水組合物；和-包含至少一種核酸序列的第二含水組合物。
72.實施方案71的試劑盒，其中所述第二含水組合物還包含足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種變性劑。
73.實施方案72的試劑盒，其中所述第二含水組合物中的變性劑是極性非質(zhì)子溶劑。
74.實施方案73的試劑盒，其中所述第二含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑的濃度由實施方案32至35中任一項定義。
75.實施方案73或74的試劑盒，其中所述第二含水組合物中的極性非質(zhì)子溶劑由實施方案36或41至47中任一項定義。
76.實施方案71到75中任一項的試劑盒，其中所述第二含水組合物由實施方案37至 40或48至62中任一項定義。
全文摘要
本發(fā)明提供用于在雜交應(yīng)用中單獨變性探針和靶標(biāo)的方法和組合物。本發(fā)明可以例如在雜交應(yīng)用中不使用甲酰胺或減少對甲酰胺的依賴性。用于本發(fā)明的組合物包括含水組合物，該含水組合物含有足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑。
文檔編號C12Q1/68GK102369295SQ201080009539
公開日2012年3月7日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者S·H·馬希森 申請人:丹麥達(dá)科有限公司