專利名稱：基于基因表達(dá)特征的Ⅱ型糖尿病的藥物鑒別方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物鑒別與評價(jià)以及治療最優(yōu)化領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明提供一項(xiàng)用于鑒別能有效治療TNFa相關(guān)糖尿病或基于基因組或蛋白組表達(dá)的特征的糖尿病相關(guān)癥狀的化合物的方案(protocol)。有關(guān)糖尿病及其相關(guān)癥狀的診斷和預(yù)后的方案也屬于本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還包含治療干預(yù)的最優(yōu)化。
背景技術(shù)：
本說明書引用的出版物書目明細(xì)以字母表順序列于說明書末尾部分。本說明書中所參考的任何先有技術(shù)并不是，也不應(yīng)被認(rèn)為是作為任何國家的公共常識或任何形式提示的先有技術(shù)?；虮磉_(dá)特征(gene expression signature GES)和相應(yīng)的蛋白組表達(dá)特征 (Proteomic expression signature PES)提供協(xié)調(diào)表達(dá)的基因簇信息(Alizadeh et al. Nature 403 :503_511，2000)并且可用于描述不同的生物學(xué)或生理學(xué)狀態(tài)(van de Vijver et al. N Engl J Med 347 1999-2009，2002)?；虮磉_(dá)特征在腫瘤生物學(xué)中的使用是輔助腫瘤分類、預(yù)后及患者的治療干預(yù)應(yīng)答(Cooper et al. Nat Clin Pract Urol 4 677-687,2007 ；Nuyten and van de Vijver Semin Radiat Oncol 18:105-114,2008)。當(dāng)基于單一基因表達(dá)的篩選方法用于鑒別可調(diào)節(jié)代謝基因靶標(biāo)(例如PGC-I α)的藥物時(shí) (Arany et al. Proc Natl Acad Sci USA 105 :4721_4726，2008)，GES 代表一組基因，其 mRNA的表達(dá)有益于細(xì)胞對其環(huán)境的整體應(yīng)答。因此，無論簇中的基因?yàn)楹?，同樣可以獲得 GES0所以，這些基因雖然不會直接調(diào)節(jié)已改變的代謝狀態(tài)，但卻是上述代謝狀態(tài)的典型標(biāo)志。因此，設(shè)計(jì)有益試驗(yàn)時(shí)，則無需歸因于基因的功能。作為一種流行病，II型糖尿病(T2D)是全球范圍內(nèi)的重要健康問題。這類疾病的關(guān)鍵性特征是胰島素耐受性。胰島素耐受性的成因包含多種因素循環(huán)系統(tǒng)中非酯化脂肪酸含量較高、所有潛在作用的慢性炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和氧化應(yīng)激(Mlinar，et al. Clin Chim Acta 375:20-35,2007)。促炎細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子α (TNFa)與肥胖癥及II型糖尿病中的胰島素耐受性的發(fā)病傾向有關(guān)，提高自分泌及旁分泌中的TNFa的含量水平使得包含脂肪組織的多種組織中胰島素敏感性降低(Hotamisiigil，Nature 444 =860-867,2006 ； Ruan and Lodish Cytokine Growth Factor Rev 14 :447-455,2003) oTNFa 通過脂肪細(xì)胞分泌且能夠通過多種機(jī)理(包含脂類分解和脂肪酸釋放作用、減少胰島素信號傳遞以及降低GLUT4水平)降低胰島素敏感性，(Ruan and Lodish 2003 supra)。TNFa的活性由包含 P38MAP和Jun-N-末端激酶的多種激酶、蛋白激酶C(PKC)、核因子κ B(NFkB)活化作用和過氧化物酶增殖激活受體Y (ΡΡΑΤ y )下調(diào)作用所介導(dǎo)and Pekala Proc Soc Exp Biol Med 223:128-135,2000 ；Tang et al. Proc Natl Acad Sci USA 103 :2087_2092，2006)。阿司匹林(ASA)和噻唑烷二酮類曲格列酮(TGZ)等藥物可以提高體內(nèi)胰島素敏感性(Miles et al. Diabetes 46 :1678-1683,1997 ；Yuan et al. Science 293 1673-1677，2001)；在體外，它們可以通過多種途徑抵消TNF α的影響(Gao et al. J Biol Chem 278:24944-24950，2003 ；Ohsumi et al.Endocrinology 135 :2279-2282,1994 ；Peraldi and Spiegelman J Clin Invest 100 1863-1869，1997)。因此，能夠在脂肪細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)TNF α作用效果的藥物
具有提高整體胰島素敏感性的潛能。由于社會上糖尿病發(fā)病率與日俱增，對鑒別用于治療或緩解糖尿病癥狀，同時(shí)診斷和監(jiān)測糖尿病及其相關(guān)癥狀(例如肥胖癥、失明、腎病和/或心血管疾病)的藥物存在迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，使用基因組/蛋白組方法可以確證與糖尿病，如T2D(特別是TNF α 相關(guān)胰島素耐受T2D)相關(guān)的生物學(xué)或生理學(xué)狀態(tài)。特別地，通過構(gòu)建基因表達(dá)特征來反映與腫瘤壞死因子α (TNFa)相關(guān)的胰島素耐受性或細(xì)胞敏感性狀態(tài)，目的在于篩選胰島素敏化劑以及鑒定或監(jiān)測受試者體內(nèi)TNFa相關(guān)II型糖尿病。在實(shí)施例中，由于TNFa使得胰島素耐受性細(xì)胞中產(chǎn)生基因表達(dá)特征，隨后使用ASA和TGZ進(jìn)行后處理使得“胰島素再敏化”。這個(gè)模型與人體患病后經(jīng)診斷采用特定藥物進(jìn)行經(jīng)典治療的情況一致。聯(lián)用ASA和 TGZ確保在逆轉(zhuǎn)胰島素耐受性的過程中能夠激活多重信號通路。使用基因表達(dá)分析法鑒定的GES包含兩種或更多種的基因生物標(biāo)記物ΡΚΜ2、Skpla,⑶63、STEAP4、ACSU CS和/或 CLU，其表達(dá)在胰島素耐受性狀態(tài)對胰島素再敏化狀態(tài)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。這些基因的mRNA表達(dá)是保證從化合物庫中篩選出潛在的胰島素敏化劑的基礎(chǔ)。經(jīng)GES鑒別的化合物及其藥物類別在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均被證實(shí)具有胰島素敏化功能。這里所說的“GES” 是指通過相應(yīng)地蛋白組表達(dá)特征或PES來檢測基因表達(dá)水平。蛋白檢測試驗(yàn)用于檢測PES。因此，本發(fā)明提供了一種包含2個(gè)或更多，尤其是2至7個(gè)，基因生物標(biāo)記物的平板，其用于產(chǎn)生與T2D中以及特別是TNFa相關(guān)T2D胰島素敏感性或耐受性的生物學(xué)或生理學(xué)狀態(tài)相關(guān)的GES (或相應(yīng)地PEQ。GES對于T2D的發(fā)病趨勢或可能引發(fā)的與T2D相關(guān)的癥狀，例如肥胖癥、失明、腎病和/或心血管疾病，特別是TNFa相關(guān)T2D等具有預(yù)測作用。 一方面，本發(fā)明的2個(gè)或更多生物標(biāo)記物的平板具有不同的表達(dá)方式，使得在TNFa相關(guān) T2D受試者中或?qū)a(chǎn)生TNF α相關(guān)胰島素耐受性的受試者中，ΡΚΜ2、Skpla、⑶63、STEAP4和 CLU的基因表達(dá)水平增加，ACSl和CS的水平降低。對誘導(dǎo)與胰島素敏感性有關(guān)的GES(或相應(yīng)的PES)的藥物進(jìn)行鑒別。因此，本發(fā)明提供表征II型糖尿病或其癥狀的基因表達(dá)特征(gene expression signature, GES)或相應(yīng)的蛋白組表達(dá)特征(PES)，所述GES或PES包含至少2種選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品的表達(dá)水平。通過檢測基于含有2至7個(gè)基因的平板(penal)上的GES (或相應(yīng)的PEQ，對 TNFa相關(guān)T2D及其發(fā)病傾向以及相關(guān)癥狀發(fā)病率的實(shí)施診斷和預(yù)后同樣屬于本發(fā)明的一部分。對TNF α相關(guān)T2D及其發(fā)病傾向以及相關(guān)癥狀發(fā)病率的診斷和預(yù)后的能力對于治療和/或控制患者病情，例如醫(yī)療方案監(jiān)控，具有重要意義。本發(fā)明GES中涉及的基因或相應(yīng)的蛋白指的是生物標(biāo)記物。本發(fā)明涉及采自GES 中2個(gè)或更多基因表達(dá)的共同信息，而不依賴于單一基因的表達(dá)。所提及的“生物標(biāo)記物”指的是TNF α相關(guān)T2D、糖尿病發(fā)病傾向、其相關(guān)癥狀發(fā)病率或TNFa相關(guān)T2D發(fā)病傾向的標(biāo)記物。通過檢測2至7個(gè)基因或其表達(dá)產(chǎn)物在平板上的表達(dá)水平來形成GES。在篩選基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)了蛋白組表達(dá)特征或PES。因此， 本發(fā)明包含基于2個(gè)或更多基因(PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl、CS和/或CLU)的與胰島素耐受性或敏感性有關(guān)的GES或PES。所提及的“2個(gè)或更多”或“2至7個(gè)”包含2、3、 4、5、6或7個(gè)上述基因。所提及的“TNFa相關(guān)T2D”或“TNFa相關(guān)胰島素耐受性或敏感性”或“TNF α相關(guān)胰島素耐受性T2D”包含在T2D癥狀范圍之內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步能夠優(yōu)化T2D的治療干預(yù)，通過首先使受試者分組在一個(gè)基于GES 或相應(yīng)的PES的特定組中，然后選擇并施用含有相同或相似GES/PES的藥物。在一定時(shí)間內(nèi)監(jiān)控GES/PES且基于維持受試者GES/PES和已選藥物GES/PES的相似性關(guān)聯(lián)的原因，變化藥物。因此，本發(fā)明探究使受試者分組以便在治療II型糖尿病時(shí)簡化治療干預(yù)的方法， 所述方法包含檢測受試者的GES或相應(yīng)的PES，該受試者包含選自PKM2、SkplaU⑶63、 ACSl (FACL2)、CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PES，以及使用用于使受試者分組的GES或PES相同或大體相似的GES或相應(yīng)的PES來選擇認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步提供治療具有II型糖尿病或其癥狀的受試者的方法，所述方法包含檢測受試者的GES或相應(yīng)的PES，該受試者包含選自PKM2、Skplal、CD63、ACSl (FACL2)、 CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PES，以及通過使用與在所述受試者中檢測到的GES或PES相同或相似的GES或相應(yīng)的PES來使用認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物。本發(fā)明的另一方面涉及治療具有II型糖尿病或其癥狀的受試者的方法，所述方法包含檢測受試者的GES或相應(yīng)的PES，該受試者包含選自PKM2、SkplaU⑶63、 ACSl (FACL2)、CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PES，以及通過使用與在所述受試者中檢測到的GES或PES相同或相似的GES或相應(yīng)的PES來使用認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物且在一定時(shí)間內(nèi)監(jiān)控GES或相應(yīng)的PES并調(diào)節(jié)藥物以使藥物具有與最終檢測到的受試者GES或PES相同或大體相似的GES或相應(yīng)的PES。本發(fā)明探究TNFa相關(guān)胰島素耐受性或敏感性的GES或PES在制備用于治療 TNFa相關(guān)T2D或其癥狀的藥物中的用途。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供在特定的TNFa相關(guān)胰島素耐受性或敏感性水平下的GES或相應(yīng)的PES，所述GES或相應(yīng)的PES包含2個(gè)或更多選自PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (即FACU)、CS和CLU的基因或其同源物，其中當(dāng)細(xì)胞中PKM2、Skpla, CD63、 STEAP4和/或CLU的表達(dá)較對照組增加和/或ACSl和/或CS的表達(dá)較對照組減少，說明產(chǎn)生胰島素耐受性。文中“對照組”包括胰島素敏感細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明探究在特定的TNFa相關(guān)胰島素耐受性或敏感性水平下的GES或相應(yīng)的PES，所述GES或相應(yīng)的PES包含2個(gè)或更多選自PKM2、Skpla、⑶63、 STEAP4、ACSUCS和CLU的基因或其同源物，其中當(dāng)細(xì)胞中PKM2、Skpla, CD63、STEAP4和/ 或CLU的表達(dá)較對照組減少和/或ACSl和/或CS的表達(dá)較對照組增加，說明產(chǎn)生TNF α 相關(guān)胰島素敏感性。
這里的“對照組”包括胰島素耐受細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。本發(fā)明可就地實(shí)施或在源自受試者的生物樣品上進(jìn)行。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供對TNF α相關(guān)T2D、TNF α相關(guān)T2D發(fā)病傾向或受試者體內(nèi)TNF α相關(guān)T2D并發(fā)癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，所述方法包含(a)從受試者中獲取生物樣品；(b)檢測生物樣品中基于2 個(gè)或更多 PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl、CS 和 / 或 CLU 的 GES 或相應(yīng)的 PES ； (c)比較生物樣品中的GES和統(tǒng)計(jì)學(xué)確證的閾值，其中GES或其相應(yīng)的PES有益于TNF α相關(guān)T2D的胰島素敏感性或耐受性。因此，這里所說的TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性或敏感性的生物學(xué)或生理學(xué)狀態(tài)下的GES作為知識庫。在制劑或藥物存在的條件下，通過比較不同知識庫的GES或相應(yīng)的PES可以鑒別出有效的藥物或TNF α相關(guān)T2D的治療方法。因此，本發(fā)明進(jìn)一步探究鑒別能夠降低細(xì)胞中TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性的化合物的方法，所述方法包含接觸具有有益于TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性(第一知識庫)的第一 GES或相應(yīng)的PES的TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性細(xì)胞，然后篩選有益于 TNFa相關(guān)T2D的胰島素敏感性(第二知識庫)的第二 GES或相應(yīng)的PES，其中能夠促進(jìn)第二 GES發(fā)展的化合物選作所需化合物。第一和第二知識庫可通過試驗(yàn)檢測或成為統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證控制(validated control) 的一部分。特別地，本發(fā)明涉及鑒別治療人類TNF α相關(guān)T2D的藥物。使用GES比使用T2D單基因指示劑更加有效，尤其適用于監(jiān)控治療方案和篩選具有胰島素敏化性質(zhì)的潛在藥物。


某些圖片包含顏色表示或?qū)嶓w。應(yīng)要求，可以從專利權(quán)人或者從合適的專利局獲得彩色照片。如果從專利局獲得，可能要繳納一定費(fèi)用。圖1是使用基于TNF的GES進(jìn)行小分子庫篩選的結(jié)果概要圖示。Α.含有10個(gè)或更多成員的每個(gè)化合物組群的平均值打分結(jié)果如圖所示。胰島素再敏化TNFa力卩TGZ 和ASA(TTA)共處理及胰島素耐受性TNF α的治療(TNF)控制如圖所示(TNF*p < 0. 05并且 TTA"ρ < 0. 05 ；η = 10-62)。圖加和2b是3T3-L1脂肪細(xì)胞中HA標(biāo)記的GLUT4在接受化合物刺激后向漿膜移位的圖示。脂肪細(xì)胞分別和10 μ M的每種化合物共孵20小時(shí)后，用0. 5ηΜ的胰島素對脂肪細(xì)胞產(chǎn)生急性刺激，隨后測定HA標(biāo)記的GLUT4向漿膜的移位。a.與TNF α加ASA和TGZ的共孵樣品的GES屬性(見圖1)最相近的化合物在HA標(biāo)記的GLUT4移動(dòng)中的效果。與0. 5ηΜ 胰島素單獨(dú)設(shè)置為1.0相比，數(shù)據(jù)以差異倍數(shù)形式表示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤；η = 12-40/組。 b.個(gè)別CAI成員對GLUT4移動(dòng)的影響。與0.5ηΜ胰島素值(設(shè)定為'1')相比，每個(gè)柱狀物代表重復(fù)樣本的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差，并以差異倍數(shù)形式表示。與僅含0. 5ηΜ胰島素比較， *Ρ < 0. 003。陰性和陽性對照組包含OnM(ρ = 1. 51X10-13,η = 32)和急性最大200ηΜ的胰島素(Ρ = 2. 55χ 10-9，η = 32)，僅與 0. 5ηΜ 胰島素相比，將 10 μ M TGZ (η = 8)禾口 5mM ASA(η = 8)分別孵化20小時(shí)。圖3a至!Be是醋甲唑胺對DIO及db/db小鼠代謝參數(shù)的影響圖示。A.經(jīng)過腹膜內(nèi)葡萄糖耐受測試的DIO小鼠分別接受給藥劑量為50mg/kg/天的每種相應(yīng)藥物連續(xù)給藥 14天的處理后血糖的曲線下面積(AUC)變化(以空白對照的百分比計(jì))?？s略語2-氨基苯磺酰胺OABS)、氯噻酮(CTD)、呋塞米(FUR)、二氯苯磺胺(DCP)、醋甲唑胺(MTZ)和N-甲基-醋甲唑胺(MMTZ)。B. MTZ對DIO小鼠體內(nèi)血糖(上圖)和血漿胰島素水平(下圖)的劑量依賴性影響。除空白對照組(n = 6)以外，動(dòng)物用指示劑量(分別為50mg/kg(n = 5) 和100mg/kg(n = 5))的MTZ處理14天(*~p < 0. 05)。C. MTZ對db/db小鼠空腹血糖水平的劑量依賴性影響。小鼠經(jīng)空白溶劑(n = 24)或50mg/kg的MTZ (n = 23)處理8天(0天時(shí)，< 0. 05 ；相應(yīng)空白對照組，"ρ < 0. 05)。D.經(jīng)50mg/kg的MTZ處理28天后，MTZ對 db/db小鼠糖化血紅蛋白(HblAc)的劑量依賴性影響。柱狀圖表示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤，η = 5-12?？瞻讓φ战M< 0. 05。Ε. MTZ和二甲雙胍聯(lián)用對db/db小鼠空腹血糖水平的影響。 經(jīng)空白溶劑、20mg/kg MTZ、300mg/kg 二甲雙胍或20mg/kg MTZ與300mg/kg 二甲雙胍聯(lián)用處理8天后小鼠血糖水平的變化。空白對照組、< 0. 05，單用二甲雙胍組~p < 0. 05。發(fā)明詳述除文義另有所指外，說明書中通篇出現(xiàn)的“包含”應(yīng)理解為其中含有規(guī)定的元素、 整體、元素組或整體組，而不應(yīng)認(rèn)為其中不含任何一種其它的元素、整體、元素組或整體組。應(yīng)注意的是，除非文中清晰地說明，在說明書中出現(xiàn)的“一(a\an\the)”等單數(shù)形式包含相應(yīng)的復(fù)數(shù)概念。因此，例如文中所述的“GES”既包含單一 GES，也包含兩種或更多種GES ；所述的“藥劑”既包括單一藥劑，也包括兩種或更多種藥劑；所述的“該發(fā)明”包括發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面的內(nèi)容等等。本發(fā)明鑒別一組基因，這些基因的集體表達(dá)表征GES (或相應(yīng)地PEQ。GES描述與糖尿病，特別是TNFa相關(guān)T2D，相關(guān)的生物學(xué)或生理學(xué)狀態(tài)并對該狀態(tài)有益。更特別的是， 這種生物學(xué)或生理學(xué)狀態(tài)就是細(xì)胞內(nèi)TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性或敏感性水平。這里提及的GES或PES決定TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性或敏感性的特殊狀態(tài)作為知識庫。 因此，TNFa相關(guān)T2D由胰島素敏感性向胰島素耐受性的前進(jìn)產(chǎn)生了不同的知識庫。在各種藥劑存在的條件下比較這些知識庫能夠鑒別出誘導(dǎo)受試者體內(nèi)產(chǎn)生TNFa相關(guān)T2D的胰島素敏感性的試劑。GES 包含 2 個(gè)或更多選自 ΡΚΜ2、Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (即 FACL2)、CS 和 CLU 的基因的表達(dá)信息。所提及的“2個(gè)或更多”或“2至7個(gè)”包括2、3、4、5、6或7個(gè)上述基因。2個(gè)或更多上述基因的任意或全部組合也包含在本發(fā)明中。在具體實(shí)施方案中，第一知識庫定義為TNFa相關(guān)T2D的胰島素耐受性，其中ΡΚΜ2、Skpla,⑶63、STEAP4和CLU的表達(dá)增加而ASCl和CS的表達(dá)降低。第二知識庫定義為TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性，其中ΡΚΜ2、Skpla, CD63、STEAP4和CLU的表達(dá)降低而ASCl和CS的表達(dá)增加。因此，本發(fā)明也提供在TNF α相關(guān)T2D的胰島素耐受性或敏感性水平下的GES或相應(yīng)的PES，所述GES或相應(yīng)的PES包含2個(gè)或更多選自PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl (即 FACL2)、CS和CLU的基因或其同源物，其中細(xì)胞中PKM2、Skpla、CD63、STEAP4和/或CLU的表達(dá)較對照組增加和/或ACSl和/或CS的表達(dá)較對照組減少，說明產(chǎn)生胰島素耐受性。因此，本發(fā)明提供表征II型糖尿病或其癥狀的基因表達(dá)特征(GEQ或相應(yīng)的蛋白組表達(dá)特征(PES)，所述GES或PES至少包含2個(gè)選自PKM2、Skpla, CD63、STEAP4、 ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品的表達(dá)水平。
上述“對照組”包括胰島素敏感細(xì)胞中的表達(dá)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明探究TNFa相關(guān)T2D的胰島素耐受性或敏感性水平下的GES或相應(yīng)的PES，所述GES或相應(yīng)的PES包含2個(gè)或更多選自PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACS1、CS和CLU的基因或其同源物，其中細(xì)胞中PKM2、Skpla、CD63、STEAP4和/或 CLU的表達(dá)較對照組減少和/或ACSl和/或CS的表達(dá)較對照組增加，說明產(chǎn)生TNF α相關(guān)胰島素敏感性。這方面的“對照組”包括胰島素耐受細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。本發(fā)明進(jìn)一步提供對TNFa相關(guān)T2D、TNFa相關(guān)T2D發(fā)病傾向、受試者體內(nèi)TNF a 相關(guān)T2D并發(fā)癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，所述方法包含(a)從受試者中獲取生物樣品；(b) 檢測生物樣品中基于2個(gè)或更多PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl、CS和/或CLU的GES或相應(yīng)的PES ； (c)比較生物樣品的GES 和統(tǒng)計(jì)學(xué)確證的閾值，其中GES或其相應(yīng)的PES有益于TNF α相關(guān)T2D。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化T2D的治療干預(yù)，首先使受試者分組在基于GES或相應(yīng)PES的特定組中，然后選擇并施用含有相同或相似GES/PES的藥物。在一定時(shí)間內(nèi)監(jiān)控GES/PES 且基于維持受試者GES/PES和已選藥物GES/PES的相似性關(guān)聯(lián)的原因，變化藥物。相應(yīng)地，本發(fā)明探究使受試者分組以便在治療II型糖尿病時(shí)簡化治療干預(yù)的方法，所述方法包含檢測受試者的GES或相應(yīng)的PES(即選自PKM2、SkplaU⑶63、 ACSl (FACL2)、CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PES)以及使用與使受試者分組所用GES或PES相同或大體相似的GES或相應(yīng)的PES來選擇認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步提供治療II型糖尿病或其癥狀的方法，所述方法包含檢測受試者的GES或相應(yīng)的PES(即包含選自PKM2、Skplal、CD63、ACSl (FACL2)、CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PEQ以及使用具有與上述受試者的GES或PES相同或相似的GES或相應(yīng)的PES施用認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物。本發(fā)明的另一方面涉及治療具有II型糖尿病或其癥狀的受試者的方法，所述方法包含檢測受試者的GES或相應(yīng)的PES(即包含選自PKM2、Skplal、⑶63、ACSl (FACL2)、 CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PEQ以及使用具有與上述受試者的GES或PES相同或相似的GES或相應(yīng)的PES施用認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物且在一定時(shí)間內(nèi)監(jiān)控GES或相應(yīng)的PES并調(diào)節(jié)藥物以使藥物與最終檢測到的受試者GES或PES相同或大體相似的GES或相應(yīng)的PES。所提及的“糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑”包括逆轉(zhuǎn)糖尿病，特別是II型糖尿病的藥劑?！吧飿悠贰卑ㄉ镆后w樣品，例如但不限于全血、血漿、血清、黏液、尿液、分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、精液、糞便、膽汁、細(xì)胞提取物、呼吸道分泌物、灌洗液、淋巴液、唾液以及其他組織分泌物或液體。特別的生物液體是全血、血漿和血清。因此，生物樣品可以是基于液態(tài)的樣品或細(xì)胞，包括附著在固相載體上的細(xì)胞。物理化將生物樣品從受試者中移除不是必需的，盡管生物樣品的移除和后續(xù)生物標(biāo)記物的分析實(shí)驗(yàn)是實(shí)施“即時(shí)法”最簡便的方法。生物液體可經(jīng)歷富集過程或?qū)⒖赡芨深A(yù)分析實(shí)驗(yàn)的高豐度分子移除。本發(fā)明在一定程度上預(yù)測生物標(biāo)記物的鑒別，其中2個(gè)或更多生物標(biāo)記物的共同表達(dá)有益于TNF α相關(guān)T2D及其并發(fā)癥，例如肥胖癥、失明、腎病和/或心血管疾病，或TNFa相關(guān)T2D發(fā)病率。所提及的“鑒別”包括對2個(gè)或更多的用于說明胰島素耐受性/敏感性的已選生物標(biāo)記物或源自其的并發(fā)癥進(jìn)行排列、分組及分析。排列、分組及分析均包含在術(shù)語“表達(dá)特征”的范疇中。本發(fā)明的適用范圍擴(kuò)展至GES或相應(yīng)PES的基因衍生物和同源物。因此，本發(fā)明的生物標(biāo)記物除上述以外，還包括具有如下特征的基因其核苷酸序列具有70%同一性； 或在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，能夠與其序列或互補(bǔ)配對形式雜交；或編碼與基因編碼氨基酸序列具有至少70%相似性的氨基酸序列。所提及的“至少70%”包括 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100%。特定的百分比相似性或同一性是至少約80%、至少約90%或至少約95%。所述的術(shù)語“相似性”包括所比較的序列間在核苷酸或氨基酸水平上精確的同一性。當(dāng)核苷酸水平上沒有同一性時(shí)，其“相似性”包括能夠產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)、功能、生化和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)的氨基酸的序列間的差異。當(dāng)氨基酸水平上沒有同一性時(shí)，其“相似性” 則包括在結(jié)構(gòu)、功能、生化和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)的氨基酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，核苷酸和序列的比較建立在同一性水平上，而并非相似性水平上。用于描述2個(gè)或更多多聚核苷酸或多肽之間序列關(guān)系的術(shù)語包括“參考序列”、“對照窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“基本上相似”和“基本同一”?！皡⒖夹蛄小睘橹辽?2個(gè)，通常為15至18個(gè)，有時(shí)至少含有25個(gè)或更多(例如30個(gè))包括核苷酸及氨基酸殘基在內(nèi)的單元結(jié)構(gòu)，長度方面，例子包括12個(gè)、 13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)和25個(gè)單元結(jié)構(gòu)。由于兩條多聚核苷酸各自包含(1)在兩條多聚核苷酸間具有相似性的序列(抑或多聚核苷酸完整序列的一部分)及( 在兩條多聚核苷酸間存在分歧的序列，兩條(或更多) 多聚核苷酸間的序列比較通常是通過相對“對照窗”比較兩條多聚核苷酸來鑒別和比較局部區(qū)域序列的相似性?！皩φ沾啊笔桥c參考序列相比通常具有12個(gè)連續(xù)殘基的概念上的片段。對照窗可包括為了實(shí)現(xiàn)兩條序列的最佳排列，對大約20%或更少的殘基做出添加或刪除(即缺口)，相比而言，參考序列則不包括添加和刪除。為了排列對照窗而采用的序列最佳排列可通過電腦計(jì)算法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison, WLUSA)或任何已選方法產(chǎn)生的檢驗(yàn)和最佳排列方法(即引起相對對照窗的最高百分比同源物)得以實(shí)現(xiàn)。也可參考例如Altschul等公開的(Nucl Acids Res 25 =3389,1997)有關(guān)基礎(chǔ)局部排列搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)家族的方案。序列分析的詳細(xì)討論參見Ausubel等人論著中的19. 3單元部分(“Current Protocols in Molecular Biology”，John ffiley&Sons Inc，第 15 章，1994-1998)?！案叨葒?yán)謹(jǐn)條件”是指在該條件下，探針與目標(biāo)序列進(jìn)行特異性雜交的數(shù)量明顯高于非特異性雜交。此外，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件是可以辨別具有精確完整序列的多聚核苷酸或辨別僅含有的源自具有與探針相匹配的一些小區(qū)域(例如3至10個(gè)堿基)的隨機(jī)序列的分散不匹配性的多聚核苷酸的條件。與含有14至17個(gè)或更多堿基的標(biāo)準(zhǔn)長度的互補(bǔ)體相比，這些互補(bǔ)的小區(qū)域更易融化，并且高度嚴(yán)謹(jǐn)條件雜化可使其容易辨別。相關(guān)的高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括如低鹽和/或高溫條件，例如大約0. 02至大約0. IOMNaCl或等價(jià)物，大約50°C至 70°C。如果上述高度嚴(yán)謹(jǐn)條件幾乎不能忍受探針與模板或目標(biāo)序列的不匹配性，那么它將極其適合于檢測特定生物標(biāo)記物的表達(dá)。通常認(rèn)為，隨著甲酰胺加入量的增加，條件也會更加嚴(yán)格。所提及的高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括和包含至少大約0至大約15% (ν/ν)的甲酰胺； 至少大約IM至大約2Μ的雜交用鹽；至少大約31%至大約50% (ν/ν)的甲酰胺，例如 31 32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41 42%,43%,44%,45%, 46%、47%、48%、49%和50% (ν/ν)的甲酰胺以及至少大約0. 01至大約0. 15Μ的雜交用鹽，例如 0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、0. 09、0. 10、0. 11、0. 12、0. 13、 0. 14和0. 15Μ ；和至少大約0. 01至大約0. 15Μ的漂洗用鹽，例如0. 01,0. 02,0. 03,0. 04、 0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 10,0. 11,0. 12,0. 13,0. 14 和 0. 15Μ。通常，漂洗按照 Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) % (Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5 109，1962)施行。然而，在 1°C條件下，不匹配的堿基對數(shù)目每增加1%，雙螺旋Tm值會相應(yīng)降低(Bonner and Laskey, Eur J Biochem 46:83,1974)。在上述雜交條件中，甲酰胺是可選擇的。因此，高度嚴(yán)謹(jǐn)被定義為溫度至少在65°C，含有0. IX枸櫞酸鈉緩沖液(Saline Sodium Citrate buffer, SSC buffer)和 0. (w/v)十二燒基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)的條件。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供診斷TNFa相關(guān)糖尿病、TNFa相關(guān)糖尿病并發(fā)癥及TNFa相關(guān)糖尿病發(fā)病傾向的方法，所述方法包含篩選蛋白質(zhì)或編碼所述蛋白質(zhì)(其中蛋白質(zhì)均是表3中列出的從受試者得到的生物樣品中的生物標(biāo)記物)的mRNA或其同源物的水平，其中與統(tǒng)計(jì)學(xué)確證的閾值相比得到的蛋白質(zhì)水平上的差異表示為TNFa相關(guān)糖尿病、其并發(fā)癥及其發(fā)病傾向。表達(dá)水平(或PES的蛋白水品)提供有關(guān)包含7個(gè)生物標(biāo)記物中的2個(gè)或更多的生物學(xué)或生理學(xué)狀態(tài)的統(tǒng)計(jì)學(xué)確證的公認(rèn)定義。除另有清晰說明以外，本申請中詳細(xì)說明的不同量程范圍內(nèi)數(shù)值的使用依照以下規(guī)定近似值采用在規(guī)定范圍內(nèi)的最小值和最大值前面冠以“大約”一詞來表示。因此，規(guī)定范圍上下的輕微浮動(dòng)基本上也可以達(dá)到范圍內(nèi)部數(shù)值所能產(chǎn)生的效果。同理，范圍的公開可認(rèn)為是包括最小值與最大值之間每一個(gè)數(shù)值的連續(xù)范圍。另外，特征的范疇延伸至2 個(gè)或更多生物標(biāo)記物水平的比值，其以數(shù)值的形式反映產(chǎn)生胰島素耐受性的風(fēng)險(xiǎn)水平。對2個(gè)或更多生物標(biāo)記物水平或濃度的測定有助于建立基于統(tǒng)計(jì)學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法的使用的診斷規(guī)則。該算法利用樣本數(shù)據(jù)(伴隨著已知的胰島素耐受性和敏感性)中觀察到的生物標(biāo)記物與胰島素耐受性或敏感性間的關(guān)系來推斷隨后用于預(yù)測未知狀態(tài)患者的狀態(tài)的關(guān)系。這個(gè)算法提供有關(guān)患者罹患TNF α相關(guān)胰島素耐受性或TNF α相關(guān)胰島素耐受性發(fā)病傾向以及TNF α相關(guān)T2D的概率指標(biāo)。因此，本發(fā)明探究樣本數(shù)據(jù)的知識庫的應(yīng)用，該樣本數(shù)據(jù)包含取自TNFa相關(guān)胰島素耐受性受試者的此處所述的2個(gè)或更多生物標(biāo)記物的水平進(jìn)而產(chǎn)生一種算法，該算法在包含取自胰島素耐受情況不明受試者的相同生物標(biāo)記物水平的第二知識庫數(shù)據(jù)輸入的基礎(chǔ)之上，提供預(yù)測胰島素耐受性或敏感性與TNFa是否相關(guān)的概率指標(biāo)?！笆茉囌摺蓖ǔＶ溉梭w。然而，本發(fā)明擴(kuò)展至獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，受試者也可以是非人的哺乳動(dòng)物，諸如?？?、馬科、羊亞科、豬科、犬科、貓科或非人的靈長目動(dòng)物。 雖然，本發(fā)明更加適用于檢測人類TNFa相關(guān)T2D。所提及的“TNFa相關(guān)T2D”包括術(shù)語 “T2D”或“II型糖尿病”所包含的全部T2D癥狀。術(shù)語“樣本數(shù)據(jù)”包括相對于對照組的2個(gè)或更多生物標(biāo)記物的水平的知識?！皩φ战M”包括對胰島素耐受性或敏感性已知的或癥狀得到治療的受試者的生物標(biāo)記物水平的比較，或是基于實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)測定水平。術(shù)語“水平”同樣包含生物標(biāo)記物水平的比值?！皹颖緮?shù)據(jù)”也包括 PMK2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl、CS 和 / 或 CLU 中的 1 個(gè)或更多的生物標(biāo)記物的集合。本發(fā)明進(jìn)一步探究用于測定受試者TNF α相關(guān)T2D胰島素耐受性和敏感性的生物標(biāo)記物平板，該平板包含與生物標(biāo)記物進(jìn)行特異性結(jié)合的試劑以檢測2個(gè)或更多生物標(biāo)記物的水平且然后使該水平符合源自第一知識庫數(shù)據(jù)的算法(algorithm)(對于其中算法提供受試者是否具有TNF α相關(guān)T2D胰島素耐受性或敏感性的概率指數(shù)的情況，上述數(shù)據(jù)包含采自未知狀態(tài)受試者的相同生物標(biāo)記物水平)，所述生物標(biāo)記物選自ΡΚΜ2、Skpla、⑶63、 STEAP4、ACS1、CS和/或CLU中的2個(gè)或更多個(gè)。與生物標(biāo)記物進(jìn)行“特異性結(jié)合”的試劑通常包括交互免疫分子(例如抗體、雜化物以及包括重組體或其改良物及其抗原結(jié)合片段的衍生物)。試劑也可以是受體或其他配體。這些試劑能夠輔助檢測生物標(biāo)記物的水平。在某些方面，本申請涉及通過比較源自受試者的生物樣品中的GES(或相應(yīng)的 PES)對TNFa相關(guān)T2D、TNFa相關(guān)T2D胰島素耐受性或敏感性狀態(tài)，或相關(guān)并發(fā)癥及TNF a 相關(guān)T2D發(fā)病傾向進(jìn)行診斷及預(yù)后的方法。GES或PES也可以和統(tǒng)計(jì)學(xué)確證的閾值相比較。 源自對照組(例如普通組或人類受試者選擇組)的可比較樣品中的統(tǒng)計(jì)學(xué)確證的閾值基于生物標(biāo)記物的水平。例如，選擇組可以由表觀健康者組成。這里所述的“表觀健康”是指以前沒有任何TNF α相關(guān)T2D發(fā)病征兆和癥狀(包括一個(gè)或更多糖尿病家族史)，沒有與TNF a 相關(guān)T2D有關(guān)因素的發(fā)病跡象(包括一個(gè)或更多的低活性水平，匱乏的飲食，超重(尤其是腰部)，年齡超過45周歲，高血壓，高水平的甘油三酯，高密度脂蛋白膽固醇低于35，預(yù)先鑒定的受損葡萄糖不耐癥、妊娠期及嬰兒體重超過9磅時(shí)的預(yù)先糖尿病等因素)的個(gè)體。表現(xiàn)健康個(gè)體同樣不表現(xiàn)出糖尿病的癥狀。換言之，這些經(jīng)醫(yī)務(wù)人員診斷過的個(gè)體的特征在于健康以及沒有疾病癥狀。因此，所選對照值可以考慮到檢驗(yàn)受試者所屬的類別。以不逾越本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用手段選擇適宜的類別。統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值與用來描述生物標(biāo)記物(源自受試者的核酸或多肽)水平的值密切相關(guān)。因此，如果生物標(biāo)記物核苷酸或多肽的水平是絕對值(例如特定轉(zhuǎn)錄的復(fù)制數(shù)或每毫升血液中蛋白質(zhì)水平或細(xì)胞數(shù)目)，那么對照值的確定也會基于特定轉(zhuǎn)錄的復(fù)制數(shù)或每毫升血液中蛋白質(zhì)水平或細(xì)胞數(shù)目。統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值可采用多種形式。統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值可以是單一臨界值(例如中間值或平均值)。統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值可基于比較組(例如，一個(gè)定義組內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)是另一個(gè)定義組內(nèi)風(fēng)險(xiǎn)的2倍的組)建立。統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值可以被平均(或不平均)分配到低風(fēng)險(xiǎn)組、中風(fēng)險(xiǎn)組或高風(fēng)險(xiǎn)組，或被分入不同象限(最低象限代表具有最低風(fēng)險(xiǎn)者，最高象限代表具有最高風(fēng)險(xiǎn)者)，且受試者是否有糖尿病或發(fā)病征兆的風(fēng)險(xiǎn)則取決于他或她的檢驗(yàn)值落入的組。
所得生物標(biāo)記物的統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值(如例如平均水平、中間水平或“臨界”水平)是通過分析普通組或選擇組中大量的個(gè)體樣品并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)模型(例如，用于選擇正性標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測值的方法或用于定義最適宜特異性(最高真陰性比率)或敏感性(最高真陽性比率)的接受者操作特征曲線)而得到的，其描述于Knapp R.G.和Miller Μ. C.于1992年出版的《臨床流行病學(xué)與生物統(tǒng)計(jì)學(xué)》(Clinical Epidemiology and Biostatistics. 1992， William and Wilkins，HarualPublishing Co. Malvern，Pa.，)，其特別包含于此作為參考。 每一個(gè)經(jīng)過分析的生物標(biāo)記物均能測定其“臨界”值。受試者的生物樣品中的每一選擇的生物標(biāo)記物核酸(基因組或核酸組標(biāo)記物)或多肽(蛋白組標(biāo)記物)可與單一對照值或一系列對照值作比較。如果受試者的生物樣品中的生物標(biāo)記物水平與統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值不同，那么，和那些與統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值相當(dāng)?shù)膫€(gè)體相比，這些檢驗(yàn)受試者將面臨發(fā)展成或患有TNFa相關(guān)T2D、或其相關(guān)癥狀或其發(fā)病傾向的更大風(fēng)險(xiǎn)。受試者GES/PES生物標(biāo)記物水平和統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值之間的差異程度能夠有效地描繪TNF α相關(guān)T2D胰島素耐受性和敏感性的風(fēng)險(xiǎn)程度以及檢測哪些個(gè)體會從特定的治療中獲益最大。在這些情況中，既然統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值范圍已經(jīng)被分到一系列組中(例如高風(fēng)險(xiǎn)、平均風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體組的統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值范圍)，比較包括檢測受試者的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)水平預(yù)測落入的組。本預(yù)測性檢驗(yàn)有助于檢測是否以及何時(shí)應(yīng)該或不應(yīng)該為個(gè)人開具或?qū)衔餀z驗(yàn)組選擇旨在預(yù)防TNF α相關(guān)T2D，或延緩TNF α相關(guān)T2D進(jìn)程，或治療TNF α相關(guān)T2D癥狀的治療藥物。例如，具有與統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)的閾值不同的GES(或PES)值或在“正常范圍”內(nèi)有較高三分位數(shù)或四分位數(shù)的受試者可被鑒定出需要接受糖尿病治療干預(yù)、改變生活方式寸。在具體實(shí)施方案中，可以使用與特異性作用于上述生物標(biāo)記物的mRNA整體互補(bǔ)的核酸片段或使用與mRNA部分互補(bǔ)的較小片段。這些較小片段全長可能是大約14個(gè)、大約15個(gè)、大約16個(gè)、大約17個(gè)、大約18個(gè)、大約19個(gè)、大約20個(gè)、大約21個(gè)、大約22個(gè)、 大約23個(gè)、大約M個(gè)、大約25個(gè)、大約25個(gè)、大約30個(gè)、大約50個(gè)、大約75個(gè)、大約100 個(gè)或甚至幾百個(gè)堿基且可以包含在發(fā)揮其他功能(例如激活子、限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)以及其他表達(dá)、信息處理或答復(fù)功能)的較大片段之中。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針被設(shè)計(jì)用于和上面列舉的生物標(biāo)記物或其蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行選擇性雜交。同理，被設(shè)計(jì)用于和含有選自 PKM2、Skpla, CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU的序列的核酸片段進(jìn)行選擇性雜交的探針或引物也是有用的。本發(fā)明的方法還包括雜交產(chǎn)物的數(shù)量測定。該測定方法可以借助于示蹤雜交探針的直接測定(例如應(yīng)用含有放射性、熒光性或其他標(biāo)記的探針)或可以應(yīng)用目標(biāo)序列擴(kuò)增， 及擴(kuò)增產(chǎn)物的定量化方法。這里所述的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)就是有效的擴(kuò)增方法。在該方法的具體操作中，擴(kuò)增可以包含使目標(biāo)核糖核酸與用于擴(kuò)增生物標(biāo)記物中 mRNA的一對擴(kuò)增引物接觸，甚至還包含使核糖核酸與用于擴(kuò)增包含核酸序列或其補(bǔ)碼(該序列選自PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl、CS和/或CLU或其補(bǔ)碼)的核酸片段的一對擴(kuò)增引物接觸。診斷和預(yù)后的方法建立在如下步驟的基礎(chǔ)之上從受試者或患者中獲取生物樣品，在有利于基本互補(bǔ)的核酸進(jìn)行雜交的條件下，使生物樣品中的核酸和對生物標(biāo)記物(PKM2、Skpla, CS63、STEAP4、ACSU CS和/或CLU中的2個(gè)或更多)特異的獨(dú)立的核酸接觸，且測定，且任選進(jìn)一步表征由此形成的雜交的互補(bǔ)核酸。該方法可以包括位于樣品細(xì)胞中的核酸樣品的原位測定。樣品核酸也可以在接觸之前從細(xì)胞中分離得到。樣品核酸可以是DNA或RNA。同源物是指源自另一動(dòng)物物種的生物標(biāo)記物基因。本發(fā)明延伸至源自靈長目動(dòng)物 (包括人類、絨猴、猩猩和大猩猩)、家畜(例如牛、羊、豬、馬、驢)、實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物(例如小鼠、 大鼠、豚鼠、倉鼠、兔子)、寵物(例如貓和狗)以及捕獲的野生動(dòng)物(例如嚙齒類、狐貍、鹿、 袋鼠)并通過核苷酸序列和/或氨基酸序列和/或功能測定的同源基因。作為診斷或預(yù)后工具，抗體特別有利于測定TNF α相關(guān)T2D的PES。例如，特定抗體能用來篩選生物標(biāo)記物蛋白質(zhì)。后者例如作為篩選源自細(xì)胞提取物或其他生物液體(如血清、血液、尿液或唾液)的一個(gè)或更多生物標(biāo)記物水平的手段是非常重要的。其中包括的分析技術(shù)為業(yè)內(nèi)所熟知，例如三明治分析法和ELISA法。從最簡單和最直觀的角度講，免疫分析法就是結(jié)合分析法。不同類型的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)和放射免疫分析法(RIA)是業(yè)內(nèi)熟知的首選免疫分析法。應(yīng)用組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測也是非常有用的。然而，“檢測方法不限于上述技術(shù)”這一論點(diǎn)很容易被公眾理解且蛋白免疫印跡法(Western blotting)、點(diǎn)免疫印跡法(dot blotting)、 流式細(xì)胞儀分析法(FACS)以及其他方法也同樣得到使用。在一項(xiàng)典型的ELISA實(shí)驗(yàn)中，與本發(fā)明中的編碼蛋白質(zhì)相結(jié)合的抗體被固定在抑制蛋白質(zhì)親和力的選定表面上(例如聚苯乙烯微量滴定板中的微孔)。然后，將疑似含有糖尿病生物標(biāo)記物抗原的待測組合物(例如臨床樣品)加入到微孔中。經(jīng)過結(jié)合作用并且清洗掉非特異性結(jié)合免疫復(fù)合物以后，便可以檢測到結(jié)合的抗原。通常，通過加入可與目標(biāo)蛋白質(zhì)發(fā)生特異性作用(與可檢測的標(biāo)記結(jié)合)的第二抗體來完成檢測過程。該類型的ELISA 法是一種簡單的“三明治式ELISA”。另外，上述檢測過程也可以通過加入第二抗體后，再加入對第二抗體具有結(jié)合親和力的第三抗體來完成，而這種第三抗體則結(jié)合在可檢測的標(biāo)記上。在另一種典型ELISA法中，疑似含有生物標(biāo)記物抗原的樣品被固定在微孔的表面之后，與本發(fā)明中的抗體接觸。經(jīng)過結(jié)合作用并且清洗掉非特異性結(jié)合免疫復(fù)合物以后，便可以檢測到結(jié)合的抗原。因?yàn)樽畛醯目贵w已經(jīng)結(jié)合可檢測的標(biāo)記，所以可直接檢測免疫復(fù)合物。此外，免疫復(fù)合物的檢測也可以通過加入對第一抗體具有結(jié)合親和力的第二抗體來完成，而這種第二抗體則結(jié)合在可檢測的標(biāo)記上。另外一種固定化蛋白質(zhì)或多肽的ELISA法包括在檢測中使用抗體競爭試驗(yàn)。在這種ELISA法中，將已標(biāo)記的抗體加入到微孔中，使其與生物標(biāo)記物蛋白質(zhì)結(jié)合，并通過其標(biāo)記進(jìn)行檢測。然后，未知樣品中標(biāo)記抗原的數(shù)量可通過將覆膜微孔中的樣品與已標(biāo)記抗體在培養(yǎng)之前或培養(yǎng)期間混合來測定。樣品中標(biāo)記抗原的存在降低了能夠與微孔有效結(jié)合的抗體數(shù)量，進(jìn)而降低最終信號。該方法適合于測定未知樣品中與抗原覆膜微孔結(jié)合的未標(biāo)記抗體以及降低能夠有效結(jié)合已標(biāo)記抗體的抗原數(shù)量。不論采用的具體形式如何，ELISA法同樣具有某些共同特征，例如，覆膜、培養(yǎng)或結(jié)合、清洗掉非特異性結(jié)合物種以及測定結(jié)合免疫復(fù)合物。本發(fā)明還涉及使用作用于PES蛋白質(zhì)的單克隆抗體對TNFa相關(guān)T2D或其臨床前表現(xiàn)成像的體內(nèi)方法。特別地，該方法涉及給予受試者成像有效量的標(biāo)記可檢測的生物標(biāo)記物單克隆抗體或其片段以及藥用上有效的載體，且檢測已標(biāo)記的單克隆抗體與病變的結(jié)合情況或上調(diào)或下調(diào)標(biāo)記基因，健康組織。術(shù)語“體內(nèi)成像”是指本發(fā)明中任何允許與受試者體內(nèi)病變組織特定結(jié)合的已標(biāo)記單克隆抗體或其片段進(jìn)行檢測的方法?！俺上裼行Я俊?是指具體結(jié)合到位于受試者的身體的病變組織的標(biāo)記單克隆抗體的檢測方法。“成像有效量”是指為了足以檢測到單克隆抗體或其片段與病變組織的結(jié)合或單克隆抗體或其片段與健康組織(相對于病變組織，健康組織的含量比例較高)的結(jié)合而給予的標(biāo)記可檢測的單克隆抗體或其片段的劑量。試劑盒既是本發(fā)明的一部分也是此處鑒定的用于治療TNFa相關(guān)T2D的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述GES(或相應(yīng)的PES)在制備用于II型糖尿病的診斷實(shí)驗(yàn)或用于降低細(xì)胞中胰島素耐受性或提高胰島素敏感性的化合物的藥劑中的用途。后續(xù)的非限制性實(shí)例將進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 胰島素耐受性GES的測定如前所述，首先在3T3-L1脂肪細(xì)胞中建立TNFa誘導(dǎo)的胰島素耐受性模型 (Sartipy and Loskutoff J Biol Chem 278 :52298-52306,2003) 隨后將 3T3-L1 暴露在 3ng/ml TNFa中72h，胰島素耐受性通過應(yīng)答胰島素的細(xì)胞對2-脫氧葡萄糖Q-D0G)的攝取能力來測定。與胰島素刺激對照組(P < 0. 0001)相比，TNFa導(dǎo)致2-D0G攝入量減少37% (表1)。為了逆轉(zhuǎn)TNFa的影響，在72h TNFa處理的最后Mh內(nèi)采用5mMASA和 10 μ M TGZ的后處理，且發(fā)現(xiàn)其能夠修復(fù)TNF α損傷(TNFa處理細(xì)胞組，ρ = 0. 0053)。個(gè)別地，ASA和TGZ也可以完全逆轉(zhuǎn)TNF α的影響(TNF a +TGZ的TNF α處理組，ρ = 0. 0035 ； TNF a +ASA 的 TNF α 處理組，ρ = 0. 0011)。在這些條件下，整體基因表達(dá)被研究用于鑒定表現(xiàn)每種生物學(xué)狀態(tài)(“胰島素耐受性”和“胰島素再敏感性”)的GES。對照組、TNF α組及TNF a +ASA與TGZ共處理組3T3-L1 脂肪細(xì)胞樣品的微陣列分析實(shí)驗(yàn)通過采用每項(xiàng)處理20份樣品進(jìn)行來簡化聯(lián)合預(yù)測的統(tǒng)計(jì)性估計(jì)。總的說來，與對照組處理的脂肪細(xì)胞相比(名義上，P < 0.01)，應(yīng)用魯棒線性模型(基于多元t分布)伴隨獲得的似然率檢驗(yàn)，3325個(gè)基因的表達(dá)受到TNF α處理的影響。 其中1022個(gè)基因經(jīng)過ASA和TGZ的處理后(名義上，ρ < 0. 01)，表達(dá)得到逆轉(zhuǎn)。這1022 個(gè)基因經(jīng)歷貝葉斯模型選拔程序(Blangero et al. Hum Biol 77 541-559，2005)，在該程序中，將產(chǎn)生至多7個(gè)基因的模型并以此獲得充當(dāng)GES的貝葉斯平均回歸方程。由7個(gè)基因組成的模型被發(fā)現(xiàn)具有98%的預(yù)測能力以可以區(qū)別胰島素耐受性和胰島素再敏化狀態(tài)， 被選為基于TNF α的GES。經(jīng)鑒定，這些基因是乙酰輔酶A合成酶1 (acyl-CoA synthetase 1/ACS1)、fr歹胃月莫4(six transmembrane epithelial antigen of the prostate 4/STEAP4) >lA(S-phase kinase associated protein IA/ skpla)、M2 型丙酮酸激酶(pyruvate kinase, muscle 2，PKM2)、CD63、枸櫞酸合成酶(CS) 和凝聚素(CLU)，并且表現(xiàn)出各種各樣的功能(表2)。它們的DNA微陣列表達(dá)譜顯示與對照組相比，接受TNFa處理后7個(gè)基因當(dāng)中的5個(gè)(STEAP4、PKM2、Skpla、CD63和CLU)表達(dá)水平提高，然而2個(gè)基因(ACS1和CS)的表達(dá)水平降低(表3)。
TNF α分別對ACSl和STEAP4的mRNA水平具有下調(diào)和上調(diào)作用，這一點(diǎn)之前已有報(bào)道(Moldes et al. J Biol Chem 276 :33938-33946,2001 ；Weiner et al. J Biol Chem 266 =23525-23528,1991) ο據(jù)我們所知，尚未有關(guān)于TNF α直接調(diào)節(jié)PKM2、Skpla和CD63轉(zhuǎn)錄的報(bào)道。無論是在對照組與TNF α處理組狀態(tài)之間，還是在TNFa處理組與TNF a+ASA 與TGZ共處理組樣品(p < 0.00 之間，7個(gè)基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平均顯著不同。這些基因中的4個(gè)(STEAP4、PKM2、CD63和CLU)在對照組與TNF a +ASA與TGZ共處理組(ρ < 0.002)之間保持顯著不同，表明該胰島素敏感化藥物對TNFa的影響只產(chǎn)生部分逆轉(zhuǎn)， 然而，ASA和TGZ卻將ACS1、Skpla和CS的基因表達(dá)完全恢復(fù)到對照組的水平。每一個(gè)基因在每一條件下的基因表達(dá)變化的水平可由每次處理較小樣本數(shù)半定量實(shí)時(shí)PCR確證(表 3)。此外，所有基因在對照組與TNF α處理組之間或者在TNF α處理組與TNF α +ASA與TGZ 共處理組(P < 0. 05)之間保持顯著不同。為了鑒別新型胰島素敏化劑，使用GES對由1120個(gè)高純度、非專利保護(hù)的化合物組成的小分子庫進(jìn)行篩選。首先，將3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)于14個(gè)96孔板中，并且在TNF α 處理的最后24h加入每個(gè)化合物各10 μ M之前，先用3ng/ml TNF α培養(yǎng)處理72h。每個(gè)96 孔板中包括4個(gè)空白對照孔、4個(gè)TNF α孔及2個(gè)TNF α +ASA與TGZ處理孔作為對照。篩選的目的旨在鑒別出導(dǎo)致7個(gè)基因GES表達(dá)與胰島素再敏化細(xì)胞中觀察的表達(dá)水平極其相似的化合物，即可能表明這些細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù)了胰島素敏感性。在RNA提取和cDNA合成以后，應(yīng)用 MassARRAY Gequenom，San Diego, CA)對 7 個(gè)基因 GES 進(jìn)行基因表達(dá)分析[Cullinan and Cantor Pharmacogenomics 9 :1211_1215，2008]。數(shù)據(jù)通過 Z 值剩余系數(shù)相關(guān)法(Z-score residual coefficient correlation，Zrcc)分析；Z值在樣本-樣本變化以及每個(gè)基因?qū)?GES的預(yù)測能力的相對貢獻(xiàn)中是正常的。根據(jù)化合物的Z值將其由高到低排列，且作為概念確認(rèn)檢驗(yàn)的最初證據(jù)，對30個(gè)高排名化合物及23個(gè)隨機(jī)抽取的中等排名化合物進(jìn)行2-D0G 攝取試驗(yàn)來測定它們的潛在胰島素敏感化影響。在次極限量胰島素(0. 5nM，持續(xù)15min)存在或匱乏的條件下進(jìn)行2-D0G攝取試驗(yàn)之前，3T3-L1脂肪細(xì)胞與25 μ M的各種化合物共同培養(yǎng)。結(jié)果是，與中等程度組的13%和30%相比(ρ < 0.03)，前30名化合物的葡萄糖攝入量顯著提高(在0和0. 5ηΜ胰島素條件下)，分別為50%和63% (表4)。在10 μ M劑量條件下，與中等程度化合物相比，前30名中的大部分化合物也增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)(在0和 0. 5ηΜ胰島素條件下)，然而，未達(dá)到顯著性(表4)。總的說來，這些數(shù)據(jù)說明GES分析豐富具有胰島素敏感化屬性的化合物。依據(jù)GES排列的化合物隨后按照已知的作用機(jī)理或常規(guī)結(jié)構(gòu)特征廣泛分組并被重新描述為平均灶⑶。只有包含10個(gè)或更多元素的化合物組才被深入考慮。因此，得分最高處理組，進(jìn)而代表對胰島素最敏感的細(xì)胞，是對照組細(xì)胞，其平均&CC值為1. 76士0. 37 ； (TNF α 處理組，ρ < 0. 0001 ；TNF α +ASA 與 TGZ 共處理組，ρ < 0. 002)。與 TNF α 處理組相比(ρ < 0. 05)，前20名化合物組中的13個(gè)化合物(其中包括TNF α +ASA與TGZ共培養(yǎng)樣品)顯著提高平均值。然而，只有糖皮質(zhì)激素和β腎上腺素拮抗劑的分值明顯低于 TNFa 組樣品(ρ < 0.05)(圖 1)。隨后進(jìn)行二次篩選，對按照與胰島素再敏化TNF a +ASA與TGZ共處理樣品最接近的方式排列的8個(gè)藥物組進(jìn)行檢驗(yàn)，從而在次極限量0. 5nM胰島素存在的條件下測定其影響外源HA標(biāo)記的GLOT4向漿膜易位的能力(Govers et al. Mol Cell Biol 24 =6456-6466,2004)。選自鈉通道阻斷劑、β -內(nèi)酰胺、GABA拮抗劑、磺酰胺葉酸拮抗劑、脂氧合酶抑制劑、 多巴胺拮抗劑、碳酸酐酶抑制劑(CAIs)和抗生素的成員以10 μ M的劑量培養(yǎng)20h，且對每組元素的總體影響進(jìn)行評估和均化。除急性極限量200nM胰島素組以外，只在CAIs組和鈉通道阻斷劑組的聯(lián)合成員中發(fā)現(xiàn)在次極限量胰島素之上HA-GLUT4易位顯著提高(ρ < 0. 03) (圖加)。對包含鈉通道阻斷劑的化合物進(jìn)行深入調(diào)查發(fā)現(xiàn)它們當(dāng)中的許多會影響葡萄糖和脂肪代謝，包括奎寧酸(GES篩選中值為1. 673)、普魯卡因(&cc = 0. 312)和丙吡胺 (Zrcc = 0. 126)(Boden et al. Circulation 85 :2039-2044,1992 ；Hope—Gill et a1. Horm Metab Res 6 :457-463,1974 ；Kojima et al. Chem Pharm Bull (Tokyo)51 :1006-1008, 2003 ；Taketa and Yamamoto Acta Med Okayama 34 :289-292,1980) 因此，CAIs 組成為后續(xù)分析的焦點(diǎn)主題，且發(fā)現(xiàn)每一個(gè)CAI成員(除了美托拉宗)與ASA和TGZ處理組一樣，均在次極限量胰島素以上提高HA-GLUT4的易位(圖2b)。CAIs中的選擇物是否顯示出任何體內(nèi)胰島素敏化影響已有相關(guān)研究。飲食誘導(dǎo)性肥胖(DIO)小鼠經(jīng)每一種CAI以50mg/kg/天的劑量處理14天。CAIs中的2-氨基苯磺酰胺QABQ、氯噻酮(CTD)、呋塞米(FUR)和二氯非那胺(DCP)不影響DIO小鼠的葡萄糖處理(disposal)(圖3a)。另一方面，與對照組動(dòng)物相比(ρ < 0. 03)，醋甲唑胺(MTZ)引起葡萄糖曲線(AUC)下增量面積下降27%。當(dāng)DIO大鼠經(jīng)醋甲唑胺的N-甲基化衍生物(MMTZ) 處理時(shí)，未觀察到上述表現(xiàn)型(圖3a)。這些衍生物中用來抑制CA的一個(gè)氨基氫原子被甲基取代以防止與 CA 結(jié)合(Relman et al. J Clin Invest 39 :1551-1559,1960)并且通常顯示出100倍弱化的體內(nèi)碳酸酐酶抑制作用。在考察MTZ對循環(huán)血糖水平的影響時(shí)，與對照組小鼠相比，其體重、食物和水的攝入量或附睪脂肪量沒有明顯改變。此外，MH組和對照組間小鼠的24h排尿與肌酸分泌狀況未見明顯差異，表明上述動(dòng)物體內(nèi)觀察到的葡萄糖代謝差異不應(yīng)歸于MTZ的利尿作用。經(jīng)2ABS、CTD、FUR或DCP處理的DIO小鼠附加試驗(yàn)中對葡萄糖耐受性(濃度范圍在20-100mg/kg/天，并給藥14天)未發(fā)現(xiàn)明顯影響。與對照組小鼠(圖北中的上圖)相比，當(dāng)濃度超過20mg/kg時(shí)，MTZ處理會導(dǎo)致循環(huán)血糖水平顯著降低。降血糖作用伴隨著血漿胰島素水平的劑量依賴性下降(圖北中的下圖)。然后測定MTZ在II型糖尿病動(dòng)物模型化db/db小鼠體內(nèi)的安全性。以20或50mg/ kg/天的劑量用MTZ處理小鼠14天，小鼠空腹血糖水平顯示出劑量依賴性下降(ρ < 0. 05 ； 圖3c)。施用MTZ 3天后可觀察到上述影響且7天后達(dá)到峰值。對照組及20mg/kg MTZ處理組動(dòng)物未觀察到體重、食物或水?dāng)z入量的變化。然而，經(jīng)過50mg/kg MTZ處理7天后，觀察其體重減輕4% (對照組和MTZ處理組分別為38. 6士 1. Og和37. 0士 1. Og ;p < 0. 001) 并且食物攝入量減少27% (對照組和MTZ處理組分別為6. 3 士0. 3g/天和4. 8 士0. 5g/天； P < 0. 01)。為了研究MTZ導(dǎo)致的血糖下降是否歸因于食物攝入量減少和體重減輕，對成對飼養(yǎng)的對照組和MTZ處理組db/db小鼠進(jìn)行8天的血糖變化監(jiān)測。結(jié)果是對照組小鼠體重減輕了 8% (第 0 天為 41. 7士2. 7g，第 8 天為 38. 3士3. 2g，η = 6/組；ρ < 0. 001)。然而在處理周期結(jié)束后，只有MTZ處理組動(dòng)物的空腹血糖呈現(xiàn)明顯下降(成對飼養(yǎng)的對照組為 0. 6士 1. 9mM,MTZ處理組為6. 2士 1. 5mM ；ρ < 0. 02)。上述結(jié)果表明ΜΤΖ的降血糖作用不應(yīng)歸于食物攝入量的減少或體重的減輕。此外，MTZ在db/db小鼠體內(nèi)的抗糖尿病作用不應(yīng)歸于排尿引起的葡萄糖損失的增加。將MTZ(50mg/kg/天)處理14天的小鼠放置在代謝籠中Mh。與對照組相比(ρ < 0. 03)，MTZ處理組的尿液中葡萄糖濃度顯著降低了 18%。然而總尿中的葡萄糖排泄、尿量和水?dāng)z入量未見明顯差異。隨后檢測MTZ處理對db/db小鼠體內(nèi)HbAlc水平的影響。發(fā)現(xiàn)MTZ處理會導(dǎo)致HbAlc水平降低高達(dá)23% (ρ < 0. 003)(圖 3d)。還研究MTZ與其它已知的胰島素敏化治療藥物的聯(lián)合影響。與對照組動(dòng)物相比(ρ < 0. 05)，300mg/kg 二甲雙胍或20mg/kg MTZ處理的db/db小鼠的血糖水平8天后均顯示出顯著的更低變化(圖!Be)。與單獨(dú)施用二甲雙胍相比，聯(lián)合施用二甲雙胍和MTZ會產(chǎn)生進(jìn)一步降低血糖的效果(P < 0. 02)。實(shí)施例2 使用基于TNF α的GES表征體內(nèi)胰島素耐受群體測定基于TNF α的GES產(chǎn)生的體內(nèi)和體外生物學(xué)相關(guān)性。使用整體人源基因表達(dá)數(shù)據(jù)集來評價(jià)GES是否能夠描述人類胰島素耐受性表現(xiàn)型。該研究作為圣安東尼奧家族心臟研究(San Antonio Family Heart Study) (Blangero Nat Genetics 2007)的一部分已在淋巴細(xì)胞上開始施行，并且使用Illumina公司珠基技術(shù)(bead-based technology)為來自42個(gè)大家族血統(tǒng)的1，240個(gè)個(gè)體繪制了 47，289次轉(zhuǎn)錄表達(dá)的圖譜。在這一群體中，糖尿病的發(fā)病頻率為15.4%。受試者的特點(diǎn)如下(平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤)年齡39.3 士 16.7歲， 體重指數(shù)(BMI) 29. 3 士6. 6kg/m2，空腹血糖 100. 6 士43. 8mg/dl，空腹胰島素 16. 2 士 19. 1。該數(shù)據(jù)集還包括人體測量值(如體重指數(shù)和其他身體組成指標(biāo))、胰島素敏感性指標(biāo)(口服葡萄糖耐受性測試)和標(biāo)準(zhǔn)血液化學(xué)參數(shù)(包括血漿中葡萄糖、胰島素、脂類和細(xì)胞因子的水平)。使用該數(shù)據(jù)集，檢測到人類表達(dá)研究數(shù)據(jù)集中3T3-L1脂肪細(xì)胞鑒定出7-基因GES，并且基于改變方向的考慮計(jì)算出GES的合計(jì)值，該合計(jì)值包括所述7個(gè)基因中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)單元絕對值的總和。經(jīng)基于胰島素和葡萄糖的胰島素耐受性自穩(wěn)態(tài)模型i平估(homeostasis model of assessment for insulin resistance based on insulin and glucose, Homa-IR)發(fā)現(xiàn)，具有高GES值的受試者可測得較高水平的胰島素耐受性(Spearmans rho 0. 138 ；ρ = 0. 0000012) 0年齡和性別影響正?；院?，受試者最高和最低四分位(每個(gè)四分位的η > 400)之間可觀察到基于GES值的空腹血漿胰島素 (P = 0. 0004)、體重指數(shù)(ρ = 0. 00000044)、甘油三酯水平(p = 0. 001)和 HomaHR(p = 0. 00081 ；表幻的顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些觀察結(jié)果與用于描述本研究群體中大多數(shù)胰島素耐受性亞組特征的GES —致。表 13T3-L1脂肪細(xì)胞中TNF α誘導(dǎo)胰島素耐受性的逆轉(zhuǎn)
權(quán)利要求
1.一種用于說明II型糖尿病或其癥狀的基因表達(dá)特征(GEQ或相應(yīng)的蛋白組表達(dá)特征(PES)，所述 GES 或 PES 包含至少 2 個(gè)選自 PKM2、Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和CLU的基因或基因產(chǎn)品的表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GES或PES，其包含至少2至7個(gè)選自PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GES或PES，其包含至少3至7個(gè)選自PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GES或PES，其包含至少4至7個(gè)選自PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GES或PES，其包含至少5至7個(gè)選自PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GES或PES，其包含至少6或7個(gè)選自PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的 GES 或 PES，其包含 PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、 CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的GES或PES，其中II型糖尿病是TNFα相關(guān)II 型糖尿病。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的GES或PES，其中胰島素敏感性狀態(tài)用相對于對照組的PKM2、Skpla, CD63、STEAP4和CLU的表達(dá)降低來表示。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的GES或PES，其中胰島素敏感性狀態(tài)用相對于對照組的ACSl (FACL2)和CS的表達(dá)提高來表示。
11.一種受試者體內(nèi)II型糖尿病、其發(fā)病傾向或其相關(guān)并發(fā)癥的診斷或預(yù)后方法， 所述方法包含(a)從受試者中獲取生物樣品；(b)檢測生物樣品中基于2個(gè)或更多PKM2、 Skpla、CD63、STEAP4、ACSl、CS和/或CLU的GES或相應(yīng)的PES ； (c)比較生物樣品中的GES 和統(tǒng)計(jì)學(xué)確證的閾值，其中GES或相應(yīng)的PES有益于胰島素敏感性或耐受性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少2至7個(gè)選自PKM2、 Skpla、CD63、STEAP4、ACSl(FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少3至7個(gè)選自PKM2、 Skpla、CD63、STEAP4、ACSl(FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少4至7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少5至7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少6或7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中的GES或相應(yīng)地PES包含PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至17任一項(xiàng)所述的方法，其中的II型糖尿病是TNFa相關(guān)II型糖尿病。
19.根據(jù)權(quán)利要求11至18任一項(xiàng)所述的方法，其中胰島素敏感性狀態(tài)用相對于對照組的PKM2、Skpla, CD63、STEAP4和CLU的表達(dá)降低來表示。
20.根據(jù)權(quán)利要求11至19任一項(xiàng)所述的方法，其中胰島素敏感性狀態(tài)用相對于對照組的ACSl (FACL2)和CS的表達(dá)提高來表示。
21.一種鑒別降低細(xì)胞中胰島素耐受性水平的化合物的方法，所述方法包含接觸具有有益于胰島素耐受性(第一知識庫)的第一 GES或相應(yīng)的PES的胰島素耐受性細(xì)胞，然后篩選有益于胰島素敏感性(第二知識庫)的第二 GES或相應(yīng)的PES的化合物，其中能夠促進(jìn)第二 GES發(fā)展的化合物被選作所需化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中GES或相應(yīng)的PES包含至少2至7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少3至7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少4至7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少5至7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含至少6或7個(gè)選自PKM2、 Skpla, CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中GES或相應(yīng)地PES包含PKM2、Skpla,⑶63、 STEAP4、ACSl (FACL2)、CS和CLU的基因或基因產(chǎn)品。
28.根據(jù)權(quán)利要求21至27任一項(xiàng)所述的方法，其中胰島素耐受性與II型糖尿病相關(guān)。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中II型糖尿病是TNFα相關(guān)II型糖尿病。
30.根據(jù)權(quán)利要求21至四任一項(xiàng)所述的方法，其中胰島素敏感性狀態(tài)用相對于對照組的ΡΚΜ2、Skpla, CD63、STEAP4和CLU的表達(dá)降低來表示。
31.根據(jù)權(quán)利要求21至30任一項(xiàng)所述的方法，其中的胰島素敏感性狀態(tài)用相對于對照組的ACSl (FACL2)和CS的表達(dá)提高來表示。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的GES或PES在制備用于治療II型糖尿病的藥物中的用途。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的GES或PES在制備II型糖尿病診斷試劑中的用途。
34.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的GES或PES在制備用于降低細(xì)胞中胰島素耐受性或提高細(xì)胞中胰島素敏感性的化合物中的用途。
35.一種使受試者分組以便在治療II型糖尿病時(shí)簡化治療干預(yù)的方法，所述方法包含檢測受試者的選自PKM2、Skplal、CD63、ACSl (FACL2)、CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PES以及使用用于使受試者分組的GES或PES相同或大體相似的GES 或相應(yīng)的PES來選擇認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物。
36.一種治療具有II型糖尿病或其癥狀的受試者的方法，所述方法包含檢測受試者的選自PKM2、Skplal、OT63、ACSl (FACL2)、CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PES以及使用對上述受試者檢測到的GES或PES相同或大體相似的GES或相應(yīng)的PES施用認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物。
37.一種治療具有II型糖尿病或其癥狀的受試者的方法，所述方法包含檢測受試者的選自PKM2、Skplal、OT63、ACSl (FACL2)、CS和CLU中的至少兩種基因的表達(dá)水平的GES或相應(yīng)的PES以及使用對上述受試者檢測到的GES或PES相同或大體相似的GES或相應(yīng)的PES 施用認(rèn)作糖尿病癥狀逆轉(zhuǎn)劑的藥物并且在一定時(shí)間內(nèi)監(jiān)控GES或相應(yīng)的PES藥物并調(diào)節(jié)藥物以使藥物具有與最終檢測到的受試者GES或PES相同或大體相似的GES或相應(yīng)的PES。
38.根據(jù)權(quán)利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相應(yīng)的PES包含至少2至7 個(gè)選自 PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl(FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
39.根據(jù)權(quán)利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相應(yīng)的PES包含至少3至7 個(gè)選自 PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl(FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
40.根據(jù)權(quán)利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相應(yīng)的PES包含至少4至7 個(gè)選自 PKM2、Skpla, CD63、STEAP4、ACS1 (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
41.根據(jù)權(quán)利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相應(yīng)的PES包含至少5至7 個(gè)選自 PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl(FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
42.根據(jù)權(quán)利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相應(yīng)的PES包含至少6或7 個(gè)選自 PKM2、Skpla、CD63、STEAP4、ACSl(FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
43.根據(jù)權(quán)利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相應(yīng)的PES包含PKM2、Skpla、 CD63、STEAP4、ACSl (FACL2)、CS 和 CLU 的基因或基因產(chǎn)品。
44.根據(jù)權(quán)利要求35至43任一項(xiàng)所述的方法，其中II型糖尿病是TNFα相關(guān)II型糖尿病。
45.根據(jù)權(quán)利要求35至44任一項(xiàng)所述的方法，用于對受試者的II型糖尿病實(shí)施最優(yōu)化治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物鑒別與評價(jià)以及治療最優(yōu)化領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明提供一項(xiàng)用于鑒別能有效治療腫瘤壞死因子α(TNFα)相關(guān)糖尿病或基于基因組或蛋白組表達(dá)的特征的糖尿病相關(guān)癥狀的化合物的技術(shù)。有關(guān)糖尿病及其相關(guān)癥狀的診斷和預(yù)后的技術(shù)也屬于本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還包含治療干預(yù)的最優(yōu)化。
文檔編號C12Q1/68GK102333889SQ201080009142
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者G·R·科利耶, K·瓦爾德, N·康斯坦托普洛斯 申請人:韋爾瓦制藥有限公司