專利名稱：伊立替康的敏感性判斷方法及其利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于判斷癌對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽是否具有治療反應(yīng)性而使用的敏感性判斷方法及其利用。
背景技術(shù)：
在抗癌劑中有烷基化劑、鉬制劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生物質(zhì)、抗癌性植物生物堿等種類。而在這些抗癌劑中，根據(jù)癌癥的種類有顯示效果的情況和不顯示效果的情況。還已知即使是被確認(rèn)有效種類的癌癥，隨著各個(gè)患者也有顯示效果的情況和不顯示效果的情況。將抗癌劑是否對(duì)于這樣的各個(gè)患者的癌癥顯示效果稱為抗癌劑敏感性。鹽酸伊立替康(CPT-Il)是在日本開發(fā)的具有拓?fù)洚悩?gòu)酶I (topoisomerase I)抑制作用機(jī)理的抗癌劑。在日本，CPT-11作為在非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、子宮頸癌、卵巢癌中有效的藥劑，在1994年1月獲得批準(zhǔn)，并且在1995年7月認(rèn)可對(duì)于胃癌、結(jié)腸·直腸癌、乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、惡性淋巴腫瘤的應(yīng)用。特別在大腸癌領(lǐng)域中，CPT-Il作為多劑并用療法的一線藥物(first line drug)或二線藥物(second line drug)占有世界性標(biāo)準(zhǔn)治療藥的位置，其有用性得到認(rèn)可。對(duì)晚期 轉(zhuǎn)移大腸癌的化學(xué)療法，通過(guò)并用在20世紀(jì)90年代登場(chǎng)的CPT-11、奧沙利鉬等的關(guān)鍵藥物(key drug)和以至今是大腸癌治療中心藥劑的氟尿嘧啶(5-FU)為中心的氟化嘧啶制劑，以生存率為代表的臨床表現(xiàn)被極大地改善。但是，盡管如此，現(xiàn)狀仍舊是奏效效率約為50%左右，冒著嚴(yán)重的副作用的風(fēng)險(xiǎn)投與了抗癌劑的患者一半得不到效果， 判斷各治療反應(yīng)性(應(yīng)答 無(wú)應(yīng)答)的抗癌劑敏感性預(yù)測(cè)方法的確立是當(dāng)務(wù)之急。一般而言，事實(shí)是癌癥化學(xué)療法的療程歷經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間，在邊觀察副作用的表現(xiàn)邊進(jìn)行多個(gè)療程反復(fù)治療后，判斷是得到效果還是應(yīng)該繼續(xù)投與，為此需要長(zhǎng)時(shí)間和高額醫(yī)療費(fèi)，也引起副作用出現(xiàn)。因此，對(duì)各個(gè)患者如果有能夠在治療前或治療早期預(yù)測(cè)是否得到效果的手段，就能夠減輕患者的負(fù)擔(dān)和副作用出現(xiàn)，并能夠削減醫(yī)療費(fèi)。雖然CPT-Il其自身具有抗腫瘤活性，但在體內(nèi)被羧酸酯酶(Carboxyl esterase) 活化，變換為相比于CPT-Il具有100 數(shù)千倍的強(qiáng)抗腫瘤活性的7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin) (SN-38)。可以認(rèn)為通過(guò) CPT-11 和 SN-38 同時(shí)在體內(nèi)存在而呈現(xiàn)抗腫瘤效果。SN-38在肝細(xì)胞內(nèi)，由UDP-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT UDP-glucronosyltransferase)受到葡糖醛酸共軛，成為沒(méi)有細(xì)胞毒性的SN-38葡糖醛酸共軛體(SN-38G)，主要被排泄在膽汁中向腸道移動(dòng)，此后在大便中排泄。排泄在腸道中的 SN-38G的一部分，由腸內(nèi)細(xì)菌具有的β _葡萄糖苷酸酶脫共軛，再成為活性型的SN-38，經(jīng)過(guò)腸道上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)載體再吸收，邊經(jīng)過(guò)腸肝循環(huán)、在腸上皮細(xì)胞內(nèi)的通過(guò)UGT的葡糖醛酸共軛化等步驟邊受到代謝-排泄(非專利文獻(xiàn)1)。可以認(rèn)為此時(shí)，SN-38損害腸道粘膜、誘發(fā)痢疾。另外，確認(rèn)也影響細(xì)胞分裂活躍的骨髓，引起紅血球減少-白血球減少-血小板減少。嚴(yán)重痢疾和中性粒細(xì)胞減少等副作用，表明UGTlAl基因多態(tài)性引起的SN-38體內(nèi)暴露量變化是一個(gè)原因。但是，由于從前體藥物CPT-Il向活性代謝物SN-38的變換及其解毒，進(jìn)一步在腸道循環(huán)過(guò)程中的SN-38再生成，CPT-11本身代謝與從代謝物的SN-38生成的體內(nèi)動(dòng)態(tài)的復(fù)雜性，所以關(guān)于治療效果還沒(méi)有可以通過(guò)藥物動(dòng)態(tài)預(yù)測(cè)治療效果的報(bào)道。還有報(bào)道稱外周血單個(gè)核細(xì)胞的羧酸酯酶mRNA表達(dá)量，與SN-38和SN-38G的AUC比相關(guān)但與腫瘤縮小效果無(wú)關(guān)(非專利文獻(xiàn)2)。另外，在另一方面，作為關(guān)于CPT-Il敏感性或耐性的因素，報(bào)道了 SN-38標(biāo)的的拓?fù)洚悩?gòu)酶I (topoisomerase I)變異的有無(wú)和表達(dá)量，與從CPT-11向SN-38轉(zhuǎn)換相關(guān)的羧酸酯酶活性，影響CPT-Il和SN-38的細(xì)胞內(nèi)蓄積量的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體類基因(多藥耐藥蛋白(MRP)-l、MRP-2、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)/ABCG2)、BCL2族基因(專利文獻(xiàn)1)的參與，此外，也研究了細(xì)胞增殖抗原Ki-67、癌抑制基因TP53等與對(duì)使用CPT-Il治療的反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)。在臨床研究中，最近被報(bào)道具有抗細(xì)胞凋亡作用的金屬蛋白酶組織抑制劑-KTissue inhibitor of metalloproteinase-1, ΤΙΜΡ-l)的血漿中水平，與對(duì)轉(zhuǎn)移結(jié)腸-直腸癌的CPT-11+5-FU并用療法的臨床預(yù)后有意義地相關(guān)(非專利文獻(xiàn)3)。這樣，雖然認(rèn)識(shí)到 CPT-Il敏感性預(yù)測(cè)生物標(biāo)記和敏感性判斷方法的必要性且進(jìn)行著許多研究，但也有報(bào)告稱關(guān)于標(biāo)的的拓?fù)洚悩?gòu)酶I，與認(rèn)為是5-FU敏感性預(yù)測(cè)因子的胸苷酸合成酶同樣，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與5-FU+CPT-11并用療法的治療反應(yīng)性之間的明確的關(guān)聯(lián)性等(非專利文獻(xiàn)4)，還沒(méi)有確立能夠預(yù)測(cè)治療反應(yīng)性的明確的生物標(biāo)記和敏感性判斷方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開W02005/78100號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Cancer Res 1991 ；51 :4187_4191.非專利文獻(xiàn)2 =Clin Cancer Res 2005 ；11 :6901_6907.非專利文獻(xiàn)3 =Clin Cancer Res 2007 ；13 :4117_4122.非專利文獻(xiàn)4 :Int J Cancer 2004 ；111 :252_258.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供能夠判斷各個(gè)患者治療反應(yīng)性的對(duì)伊立替康、SN-38和/ 或其鹽的敏感性判斷方法及利用其的新治療手段。用于解決課題的方法因此，本發(fā)明的發(fā)明者們使用人培養(yǎng)癌細(xì)胞，通過(guò)全面地解析添加SN-38時(shí)的基因表達(dá)和對(duì)SN-38的敏感性，確定可以認(rèn)為與敏感性相關(guān)的基因，實(shí)施由CPT-Il單獨(dú)投與的人臨床試驗(yàn)，深入研討使用該基因的敏感性判斷方法。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過(guò)在特定的計(jì)算式中代入7個(gè)該基因表達(dá)量，可以算出伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性，具體地可以算出最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)?；谶@樣的見解進(jìn)一步研討的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)測(cè)定來(lái)自癌癥患者的生物試樣中的該基因表達(dá)量，如果代入計(jì)算式， 就可以判斷該患者的癌癥對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽是否有敏感性，另外，如果把從計(jì)算式得到的數(shù)值增量作為指標(biāo)，就可能進(jìn)行敏感性增強(qiáng)劑的篩選，如果再并用該敏感性增強(qiáng)劑和為敏感性增強(qiáng)對(duì)象的伊立替康、SN-38和/或其鹽，該抗癌劑的治療效果會(huì)飛躍性提高，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷方法，其特征在于，測(cè)定檢驗(yàn)體中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf30基因、DDX54基因、PTPN2基因和 TBX3基因的表達(dá)量，由下式⑴ (3)算出最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)。最佳腫瘤縮小效果(%) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD -29. 119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)總體生存期(日)=512.78-192. 11 XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55XG......(2)無(wú)進(jìn)展生存期(日)=68.076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73 .077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)(式中，A表示AMDl基因的表達(dá)量，B表示CTSC基因的表達(dá)量，C表示EIFlAX基因的表達(dá)量，D表示C12orf30基因的表達(dá)量，E表示DDX54基因的表達(dá)量，F(xiàn)表示PTPN2基因的表達(dá)量，G表示TBX3基因的表達(dá)量。)另外，本發(fā)明提供伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷用試劑盒，其特征在于，包含㈧上述7個(gè)基因的表達(dá)量測(cè)定試劑和⑶用于通過(guò)式⑴ (3)算出最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)的使用說(shuō)明。本發(fā)明還提供測(cè)定對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性增強(qiáng)劑篩選方法，其中，測(cè)定檢驗(yàn)體中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf30基因、DDX54基因、PTPN2 基因和TBX3基因的表達(dá)量，以使用(1) (3)算出的最佳腫瘤縮小效果(％)、總體生存期 (日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)的任意1個(gè)數(shù)值的增量作為指標(biāo)。另外，本發(fā)明還提供對(duì)由上述篩選方法得到的伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性增強(qiáng)劑。本發(fā)明還提供含有上述敏感性增強(qiáng)劑，并且含有伊立替康、SN-38和/或其鹽的癌治療用組合物。發(fā)明的效果如果使用本發(fā)明的伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷方法，就能夠在抗癌劑投與前或在抗癌劑投與開始后早期，正確判斷各個(gè)患者的抗癌劑治療反應(yīng)性，其結(jié)果就可以選擇治療效果更高的抗癌劑，作為其結(jié)果，能夠防止伴隨不能期待治療效果的抗癌劑的繼續(xù)投與，癌的惡化、副作用增大，還可以期待患者的負(fù)擔(dān)減輕、醫(yī)療費(fèi)的削減。另外，如果使用該判斷方法，就可以篩選使伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性增強(qiáng)的藥劑，如果并用敏感性增強(qiáng)劑以及其對(duì)象的伊立替康、SN-38和/或其鹽，癌治療效果就會(huì)飛躍性提尚ο


圖1是表示使用5個(gè)公知基因和7個(gè)新基因表達(dá)量的體外SN-38效果預(yù)測(cè)式的圖表。圖2是表示由使用5個(gè)公知基因表達(dá)量的伊立替康單獨(dú)投與得到的最佳腫瘤縮小效果(％ )預(yù)測(cè)式及其預(yù)測(cè)性界限的圖表。
圖3是表示由使用5個(gè)公知基因表達(dá)量的伊立替康單獨(dú)投與得到的無(wú)進(jìn)展生存期 (日)預(yù)測(cè)式及其預(yù)測(cè)性界限的圖表。圖4是表示由使用5個(gè)公知基因表達(dá)量的伊立替康單獨(dú)投與得到的總體生存期 (日)預(yù)測(cè)式及其預(yù)測(cè)性界限的圖表。圖5是表示由使用7個(gè)新基因表達(dá)量的伊立替康單獨(dú)投與得到的最佳腫瘤縮小效果(％ )預(yù)測(cè)式及其預(yù)測(cè)性有用性的圖表。圖6是表示由使用7個(gè)新基因表達(dá)量的伊立替康單獨(dú)投與得到的無(wú)進(jìn)展生存期 (日)預(yù)測(cè)式及其預(yù)測(cè)性有用性的圖表。圖7是表示由使用7個(gè)新基因表達(dá)量的伊立替康單獨(dú)投與得到的總體生存期 (日)預(yù)測(cè)式及其預(yù)測(cè)性有用性的圖表。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中的伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷方法，可以通過(guò)測(cè)定檢驗(yàn)體中的上述7個(gè)基因的表達(dá)量，使用該表達(dá)量由式(1) (3)算出最佳腫瘤縮小效果
)、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)而進(jìn)行。在本發(fā)明中使用的7個(gè)基因，是被認(rèn)為在使用人培養(yǎng)癌細(xì)胞的系統(tǒng)中與SN-38敏感性相關(guān)的基因，但在實(shí)際的人臨床試驗(yàn)中的CPT-Il敏感性研究中，卻不是單獨(dú)反映CPT-Il敏感性的基因。因此，由多重回歸分析(文獻(xiàn)名禾爾 Shimokuni 等"Chemosensitivity prediction in esophageal squamous cell carcinoma :novel marker genes and efficacy-prediction formulae using their expression data. ”Int J Oncol 2006.5.)解析在臨床試驗(yàn)中得到的檢驗(yàn)體各基因的表達(dá)量，和各個(gè)患者的最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)、無(wú)進(jìn)展生存期(日)，得知代入了上述7個(gè)基因的表達(dá)量的式(1) (3)，與最佳腫瘤縮小效果(％)、總體生存期(日)、 無(wú)進(jìn)展生存期(日)具有非常高的相關(guān)性。因此，通過(guò)測(cè)定檢驗(yàn)體中的上述7個(gè)基因的表達(dá)量，代入下式(1) (3)中，就能夠判斷伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性，具體而言， 就可以預(yù)測(cè)最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)、無(wú)進(jìn)展生存期(日)。最佳腫瘤縮小效果(%) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD -29. 119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)總體生存期(日)=512.78-192. 11 XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55XG......(2)無(wú)進(jìn)展生存期(日)=68.076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011 XC+8. 9798XD+73 .077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)(式中，A表示AMDl基因的表達(dá)量，B表示CTSC基因的表達(dá)量，C表示EIFlAX基因的表達(dá)量，D表示C12orf30基因的表達(dá)量，E表示DDX54基因的表達(dá)量，F(xiàn)表示PTPN2基因的表達(dá)量，G表示TBX3基因的表達(dá)量。)在這里，所謂AMDl基因，指的是表達(dá)GenBank登錄編號(hào)(accession number) NM_001634所示的堿基序列的mRNA的基因及其同源序列，所謂CTSC基因，指的是表達(dá)GenBank登錄編號(hào)NM_148170和NM_001814所示的堿基序列的mRNA的基因及其同源序列，所謂EIFlAX基因，指的是表達(dá)GenBank登錄編號(hào)NM_001412所示的堿基序列的mRNA的基因及其同源序列，所謂C12orf30基因，指的是表達(dá)GenBank登錄編號(hào)NM_024953所示的堿基序列的 mRNA的基因及其同源序列，所謂DDX54基因，指的是表達(dá)GenBank登錄編號(hào)NM_024072所示的堿基序列的 mRNA的基因及其同源序列，所謂PTPN2基因，指的是表達(dá)GenBank登錄編號(hào)NM_002828和NM_080422所示的堿基序列的mRNA的基因及其同源序列，所謂TBX3基因，指的是表達(dá)GenBank登錄編號(hào)NM_005996和NM_016569所示的堿基序列的mRNA的基因及其同源序列。另外，所謂基因，其意思不僅包含雙鏈DNA，而且是包含構(gòu)成其的正義鏈和反義鏈的各單鏈DNA，另外，其長(zhǎng)度沒(méi)有任何限制。另外，作為核酸(多核苷酸)，可以例示RNA、DNA， DNA可以列舉cDNA、基因組DNA、合成DNA，RNA可以列舉mRNA、rRNA、siRNA。在這里，在多核苷酸中也包含由多個(gè)堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。在使用本發(fā)明的對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷方法判斷敏感性中， 可以測(cè)定檢驗(yàn)體中的上述7個(gè)基因的表達(dá)量，并帶入到式(1) (3)中。在這里，作為檢驗(yàn)體，可以列舉來(lái)自患有癌的被檢驗(yàn)者(癌癥患者)的生物試樣，例如，可以列舉血液、血清、 血漿、尿、腫瘤組織 細(xì)胞、腹水、胸水、腦脊髓液、大便、咯痰等，但特別優(yōu)選腫瘤組織。檢驗(yàn)體通過(guò)適當(dāng)公知的方法處理，也能夠作為組織提取液、組織標(biāo)本等使用。另外，作為本發(fā)明對(duì)象的癌癥，可以列舉以咽喉癌為代表的嘴唇、口腔和咽喉癌， 以食道癌、胃癌、結(jié)腸·直腸癌等為代表的消化器官癌，以肺癌為代表的呼吸器官和胸腔內(nèi)臟器官癌，骨骼和關(guān)節(jié)軟骨癌，以皮膚的惡性黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌及其它皮膚癌、中皮腫瘤為代表的中皮和軟組織癌，以乳房癌、子宮癌、卵巢癌為代表的女性性器官癌、以前列腺癌為代表的男性性器官癌，以膀胱癌為代表的尿道癌，以腦腫瘤為代表的眼、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌，甲狀腺和其它內(nèi)分泌腺癌，以非霍奇金淋巴腫瘤和淋巴性白血病為代表的淋巴組織、造血組織和相關(guān)組織癌以及以這些為原發(fā)灶的轉(zhuǎn)移組織癌等，可以優(yōu)選對(duì)于非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸 直腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、惡性淋巴癌利用，特別優(yōu)選對(duì)于結(jié)腸·直腸癌(大腸癌)利用，但特別優(yōu)選未用化學(xué)療法治療的癌?；虮磉_(dá)量的測(cè)定，使用可以檢出本發(fā)明的基因和來(lái)自基因的mRNA的探針和引物,通過(guò)DNA雜交法(southern hybridization)、DNA微陣列、實(shí)時(shí)PCR法、RT-PCR法測(cè)定標(biāo)的基因拷貝數(shù)和表達(dá)量等而進(jìn)行。另外，由該基因編碼的多肽也可作為測(cè)定對(duì)象列舉，只要是反映基因表達(dá)量的就沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選以來(lái)自該基因的mRNA作為測(cè)定對(duì)象。在這里，所謂基因表達(dá)量的測(cè)定，也包含確認(rèn)有無(wú)基因的表達(dá)。這里說(shuō)明PCR法。作為測(cè)定對(duì)象使用mRNA時(shí)，根據(jù)需要，對(duì)檢驗(yàn)體進(jìn)行了通過(guò)過(guò)濾、離心分離、色譜等公知方法的前處理后，例如，使用胍-氯化銫超速離心法、酸性胍-酚·氯仿法(AGPC法)、磁珠法、硅膠柱法等通用方法，可以從檢驗(yàn)體提取RNA。另外， 也可以使用市售的試劑盒(QIAGEN RNeasy Kit、TRIZOL等)提取RNA。mRNA的測(cè)定，例如，可以通過(guò)如下方法求出(1)使用與目的mRNA能夠特異地雜交的核酸片段和來(lái)自檢驗(yàn)體的RNA，求出PCR法的擴(kuò)增產(chǎn)物量，⑵求出與目的mRNA能夠特異地雜交的核酸片段和來(lái)自檢驗(yàn)體的RNA的雜交效率，或(3)使用其它公知方法的定量方法。
在這里，在使用PCR法時(shí)，“與目的mRNA能夠特異地雜交的核酸片段”的設(shè)計(jì)，可以通過(guò)比較目的基因具有的堿基序列和其它基因具有的堿基序列，選擇對(duì)目的基因的mRNA 特異的序列而進(jìn)行。在這里，目的基因的mRNA的堿基序列，例如，可以通過(guò)參照數(shù)據(jù)庫(kù) (GenBank等)得到。另外，使用軟件(Clustal X等)對(duì)比堿基序列，通過(guò)目測(cè)等手段，能夠發(fā)現(xiàn)特異的序列。該核酸片段的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選由5 50堿基構(gòu)成的核酸片段，更優(yōu)選由18 25個(gè)連續(xù)堿基構(gòu)成的核酸片段。作為可以與目的基因的mRNA雜交的核酸片段，不僅能夠使用這樣設(shè)計(jì)的序列，還能夠使用按照公知的技術(shù)常識(shí)能夠適當(dāng)設(shè)想的與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列，和在目的基因的mRNA測(cè)定中能夠同樣使用的同源堿基序列，例如，由a)該堿基序列中取代、添加或缺失1 10個(gè)，優(yōu)選1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列，b)與該堿基序列具有90%以上、優(yōu)選95% 以上、更優(yōu)選99%以上同源性的堿基序列，c)與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的DNA與在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列組成的核酸片段。另外，這樣的核酸片段，在其兩端或一端、優(yōu)選在5’端添加任意數(shù)、優(yōu)選100個(gè)、更優(yōu)選20個(gè)、更加優(yōu)選10個(gè)以下堿基的核酸片段。這樣設(shè)計(jì)的核酸片段，例如，能夠按照其堿基序列由DNA合成儀人工合成。作為該斷片，優(yōu)選在合成后其特異性被確認(rèn)的斷片，在這里，作為特異性的確認(rèn)，例如，在以目的 mRNA為模板時(shí)，能夠通過(guò)相比于適當(dāng)?shù)膶?duì)照，確認(rèn)可以得到特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物而進(jìn)行。作為這樣的核酸片段，例如如果是AMDl基因，可以列舉由GenBank登錄編號(hào) NM_001634堿基序列的一部分或與其互補(bǔ)的堿基序列組成的核酸片段、或由與這些同源的堿基序列組成且功能上等價(jià)的核酸片段。在這里，作為由與這些同源的堿基序列組成且功能上等價(jià)的核酸片段，例如，可以列舉以下表示的在(a) (c)中所示，在目的基因mRNA的測(cè)定中能夠使用的核酸片段。AMDl基因以外的情況也同樣。(a)在NM_001634所示的堿基序列一部分或與其互補(bǔ)的堿基序列組成的核酸片段中，缺失、取代或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的核酸片段。(b)與NM_001634所示的堿基序列一部分或與其互補(bǔ)的堿基序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、更優(yōu)選99%以上同源性的堿基序列組成的核酸片段。(c)由與由NM_001634所示的堿基序列一部分或與其互補(bǔ)的堿基序列組成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列組成的核酸片段。另外，在這里，堿基序列的同源性通過(guò)使用GENETYX 的同源性解析程序算出。另外，所謂“嚴(yán)謹(jǐn)條件”，意指在2個(gè)DNA斷片在由Sambrook J等記載的標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件下相互雜交(Expression of cloned genes in Ε. coli (Molecular Cloning A laboratory manual(1989))Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9. 47-9. 62 和 11. 45-11. 61)。使用這樣制作的核酸片段和來(lái)自檢驗(yàn)體的RNA，能夠通過(guò)進(jìn)行PCR法，優(yōu)選進(jìn)行包含制作來(lái)自mRNA的cDNA的步驟的實(shí)時(shí)RT-PCR法，測(cè)定檢驗(yàn)體的mRNA。在這里，RT-PCR 法可以使用兩步法RT-PCR(Two-M印RT-PCR)和一步法RT-PCR(0ne_St印RT-PCR)等公知的方法進(jìn)行，但特別從簡(jiǎn)便且防止交叉污染的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選One-M印RT-PCR。這樣的One-M印RT-PCR法，例如，可以使用市售的試劑盒進(jìn)行OiIAGEN One-Step RT-PCR kit 等)。作為在RT反應(yīng)中使用的具有逆轉(zhuǎn)錄活性的酶，可以使用M-MHV逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)等各種逆轉(zhuǎn)錄酶。另外，在擴(kuò)增DNA的PCR反應(yīng)中使用的DNA聚合酶優(yōu)選在90°C以上的溫度具有耐熱性的DNA聚合酶。這樣的PCR反應(yīng)通過(guò)如下進(jìn)行例如，在90 98°C進(jìn)行將雙鏈DNA變成單鏈的熱變性反應(yīng)，在37 72°C進(jìn)行引物與模板cDNA雜交的退火反應(yīng)，在50 75°C進(jìn)行DNA聚合酶作用的延伸反應(yīng)的溫度條件下，將此作為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行1 數(shù)十次這樣的循環(huán)。另外， 優(yōu)選反應(yīng)條件的1個(gè)例子為熱變性95°C · 30秒，退火60°C · 30秒，延伸反應(yīng)72°C · 40秒。 另外，PCR反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選將2種引物作為1組使用，此時(shí)，兩者必須為正義鏈和反義鏈的組合。本發(fā)明的核酸片段能夠作為探針使用，也能夠與其它公知的通用引物、寡聚核苷酸組合使用。另外，作為包含成為該RT-PCR反應(yīng)模板的mRNA的檢驗(yàn)體試樣，作為RNA總量，優(yōu)選包含Ipg 1 μ g的RNA的檢驗(yàn)體試樣，更優(yōu)選包含2ng 50ng的RNA檢驗(yàn)體試樣。在進(jìn)行適當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)時(shí)，通?！癙CR擴(kuò)增產(chǎn)物量”、“PCR循環(huán)數(shù)”和“PCR的模板量”之間具有相關(guān)關(guān)系。因此，如果參考通過(guò)這樣進(jìn)行PCR反應(yīng)而擴(kuò)增的產(chǎn)物量和PCR循環(huán)數(shù)適當(dāng)計(jì)算，就能夠求出目的基因的mRNA量，即能夠求出目的基因的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量和PCR循環(huán)數(shù)的決定沒(méi)有特別限定，可以通過(guò)所有的方法進(jìn)行，但例如，可以通過(guò)特別規(guī)定到達(dá)任意設(shè)定的一定量的DNA量時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)來(lái)進(jìn)行。這樣的特別規(guī)定，例如，能夠通過(guò)使用“合并標(biāo)記PCR產(chǎn)物的PCR法，和進(jìn)行標(biāo)記的經(jīng)時(shí)監(jiān)測(cè)的PCR 法”，特別規(guī)定到達(dá)設(shè)定的一定熒光強(qiáng)度時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)而進(jìn)行。在這里，作為標(biāo)記，例如可以列舉由熒光色素的標(biāo)記，作為標(biāo)記的測(cè)量，可以列舉熒光強(qiáng)度的測(cè)量。另外在這里，作為由熒光色素的標(biāo)記，例如，可以列舉由嵌入性熒光色素的標(biāo)記，作為嵌入性熒光色素，可以列舉STOR(R)Green I。嵌入性色素因?yàn)榫哂杏稍陔p鏈核酸中嵌入而熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的性質(zhì)， 所以發(fā)出反映擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物強(qiáng)度的熒光。另外，由熒光色素的標(biāo)記，也能夠通過(guò)由熒光色素標(biāo)記的TaqMan探針和Moleculer Beacon等的使用而進(jìn)行。TaqMan探針和Moleculer Beacon是在由PCR擴(kuò)增的區(qū)域內(nèi)部序列具有同源性的寡聚核苷酸上結(jié)合熒光色素和猝光劑的探針，在PCR反應(yīng)中共存使用。由于通過(guò)探針中結(jié)合的熒光色素和猝光劑的相互作用， 發(fā)出對(duì)應(yīng)PCR反應(yīng)的熒光，所以能夠通過(guò)測(cè)定在各PCR階段的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的經(jīng)時(shí)的觀察。另外，如上所述，在檢驗(yàn)體中的目的基因的mRNA量，例如，也能夠由在目的mRNA上可以特異雜交的核酸片段和來(lái)自檢驗(yàn)體的RNA的雜交效率的情況求出。在這里，在目的基因mRNA上可以特異地雜交的核酸片段，例如，能夠使用如上所述設(shè)計(jì)和制作的核酸片段。另外，作為這樣的核酸片段，優(yōu)選帶有標(biāo)記的核酸片段。在這里。 作為標(biāo)記，可以列舉酶、順磁性離子、生物素、熒光色素、發(fā)色團(tuán)、重金屬或放射性同位素，作為更優(yōu)選的標(biāo)記可以列舉酶，在這里，作為酶，可以列舉辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。這樣的標(biāo)記，能夠由公知的方法進(jìn)行。如果測(cè)定含有來(lái)自檢驗(yàn)體的RNA的試樣和這樣的核酸片段的雜交程度，就能夠由公知的換算方法，得知在檢驗(yàn)體中的目的基因的mRNA量。這樣的雜交程度的測(cè)量沒(méi)有特別限定，可以按照公知的方法進(jìn)行，但例如，能夠通過(guò)在核酸片段上添加的標(biāo)記的測(cè)量而進(jìn)行。即，在使用由熒光色素標(biāo)記的核酸片段時(shí)，能夠通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度進(jìn)行。另外，目的基因表達(dá)量的測(cè)定，也能夠?qū)⒃谀康幕蚣捌鋗RNA的堿基序列上能夠特異地雜交的核酸片段作為探針使用而進(jìn)行。例如，如果是AMDl基因，由上述GenBank登錄編號(hào)匪_0016；34記載的堿基序列一部分(例如GCATGTGAGTGTTCCGACTTCATCTGTTCC)或與其互補(bǔ)的堿基序列組成的核酸片段、或由與這些同源的堿基序列組成且功能上等價(jià)的核酸片段也可以作為探針使用。這些探針在任意固相中固定化，可以作為DNA芯片、基因芯片、 cDNA微陣列、寡聚DNA陣列等利用。另外，作為探針，在上述列舉物以外，也可以使用為了能夠特異檢出目的基因及其 mRNA的堿基序列，從目的基因及其mRNA的堿基序列選擇多處適當(dāng)處，并用多個(gè)在該區(qū)域上可以特異地雜交核酸片段而設(shè)計(jì)的探針。在探針的固定化中使用的固相，如果是能夠固定化多核苷酸的固相就沒(méi)有特別限制，例如，可以列舉玻璃板、尼龍膜、微球、硅芯片、毛細(xì)管等。另外，也可以標(biāo)記固相。在標(biāo)記中沒(méi)有特別限制，例如，可以列舉熒光色素、放射性同位素等。多核苷酸向固相的固定，既可以是在固相上載置預(yù)先合成的多核苷酸的方法，另外也可以是在固相上合成目的多核苷酸的方法。固定方法，例如，如果是DNA微陣列，利用市售的點(diǎn)樣儀(spotter)等，根據(jù)固定化探針的種類，可以使用適當(dāng)公知的方法(由噴墨法的多核苷酸的印記、原位合成、光刻法)。使從由上述方法制成的DNA芯片等和從培養(yǎng)細(xì)胞、組織、組織切片或血液的裂解物等檢驗(yàn)體制備的RNA為基礎(chǔ)制備的標(biāo)記DNA或RNA、或從這些檢驗(yàn)體直接制備的標(biāo)記DNA 或RNA雜交，將所形成的探針和標(biāo)記DNA或RNA的雙鏈的量作為來(lái)自于該探針標(biāo)記物的信號(hào)測(cè)定，就能夠測(cè)定目的基因的表達(dá)量。在這里，信號(hào)的檢測(cè)可以由通常方法，例如，能夠用放射線檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器等測(cè)定進(jìn)行。在上述方法以外，也能夠由微球法測(cè)定目的基因的表達(dá)量。例如，在分別施加了不同熒光標(biāo)記的微球上固定對(duì)于來(lái)自各個(gè)目的基因的mRNA的探針，使之與從培養(yǎng)細(xì)胞、組織、組織切片或血液的裂解物等檢驗(yàn)體制備的目的基因的mRNA雜交，通過(guò)檢測(cè)其熒光，識(shí)別各個(gè)目的基因，同時(shí)，對(duì)于與在微球上固定的探針雜交的來(lái)自目的基因的mRNA，雜交標(biāo)記探針，通過(guò)檢測(cè)其探針的標(biāo)記測(cè)定mRNA量，也能夠同時(shí)測(cè)定多個(gè)目的基因的表達(dá)量。使用上述的探針，還能夠使用DNA雜交法(southern hybridization)、RNA雜交法(northern hybridization)、FISH法、CGH法等公知的方法，測(cè)定目的基因的拷貝數(shù)·表達(dá)量。另外，將由目的基因編碼的多肽作為測(cè)定對(duì)象時(shí)，可以通過(guò)使用了對(duì)該多肽的特異抗體的公知的免疫染色法(ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、EIA法、RIA法、IHC法等)，測(cè)定目的基因的表達(dá)量。在判斷對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性中，測(cè)定來(lái)自抗癌劑投與前和投與中的癌癥患者的生物試樣中的基因表達(dá)量，由上式(1) ( 算出最佳腫瘤縮小效果 (% )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)，當(dāng)為確定基準(zhǔn)值以上的數(shù)值時(shí)，能夠判斷該癌癥有抗癌劑敏感性，當(dāng)為小于確定基準(zhǔn)值的數(shù)值時(shí)，能夠判斷該癌癥沒(méi)有抗癌劑敏感性。 在這里，規(guī)定的基準(zhǔn)值能夠根據(jù)對(duì)象的癌癥患者狀態(tài)和癌癥種類，根據(jù)與伊立替康、SN-38 和/或其鹽的組合使用的藥劑種類等，按照后述實(shí)施例適當(dāng)設(shè)定，例如，單獨(dú)投與伊立替康時(shí)，關(guān)于最佳腫瘤縮小效果(％ )優(yōu)選為50%，關(guān)于總體生存期(日)優(yōu)選為400日，關(guān)于無(wú)進(jìn)展生存期(日)優(yōu)選為100日。在抗癌劑投與前，由上式(1) (3)得到的數(shù)值小于規(guī)定的基準(zhǔn)值時(shí)，能夠判斷該癌癥對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽沒(méi)有敏感性，不能期待其藥效，繼續(xù)投與這樣的不能期待藥效的抗癌劑時(shí)，有癌癥惡化、副作用增大的危險(xiǎn)。這樣，本發(fā)明的敏感性判斷方法，因?yàn)椴粌H在抗癌劑治療反應(yīng)性的判斷有大的貢獻(xiàn)，而且在防止伴隨不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)投與的副作用增大中也有大的貢獻(xiàn)，所以，特別適于在抗癌劑投與前的癌癥患者利用。另外，也能夠作為用于積極地選出能夠期待治療效果的患者的判斷方法使用。另外，由于通過(guò)測(cè)定來(lái)自抗癌劑投與中的癌癥患者的生物試樣中的目的基因的表達(dá)量，在每個(gè)治療循環(huán)中測(cè)定由上式(1) C3)得到的數(shù)值，進(jìn)行監(jiān)測(cè)，能夠經(jīng)時(shí)地評(píng)價(jià)在該癌癥中的敏感性，所以也成為是否應(yīng)該繼續(xù)治療的判斷方法。在對(duì)抗癌劑不具有敏感性時(shí)，因?yàn)榭梢哉J(rèn)為不能期待該藥效，只表現(xiàn)由抗癌劑引起的副作用，所以，在本發(fā)明中的敏感性判斷方法，也能夠作為用于避免伴隨不必要的副作用表現(xiàn)或無(wú)效的繼續(xù)治療的癌惡化和副作用增大的判斷方法使用。作為判斷敏感性的參數(shù)，在最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)以外，也能夠使用表示有效性參數(shù)的總有效期(日)、穩(wěn)定期(日)、治療成功期(日)，表示副作用參數(shù)的伊立替康、SN-38及其代謝物的血中濃度及其消失半衰期、生物體內(nèi)利用率、濃度時(shí)間曲線下面積、清除率、分布容積等。本發(fā)明的方法也能夠使用用于實(shí)施這樣的方法的試劑盒，S卩，使用敏感性判斷用試劑盒進(jìn)行。在這里，作為這樣的敏感性判斷用試劑盒，含有(A)上述7個(gè)基因的表達(dá)量測(cè)定試劑，和(B)用于算出上述最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期 (日)的操作步驟。在這里，在(A)上述7個(gè)基因的表達(dá)量測(cè)定試劑中，例如，包含(Al)記載用于目的基因的表達(dá)量測(cè)定的方法的操作步驟、(A2)在用于目的基因的表達(dá)量測(cè)定的方法中使用的試劑、(A3)固定化了在目的基因的mRNA上可以特異地雜交的核酸片段的DNA芯片。另一方面，在⑶的操作步驟中，除了(Bi)用于由式⑴ (3)算出最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)的操作步驟以外，可以列舉(B2)用于判斷有無(wú)伊立替康、SN-38和/或其鹽敏感性的基準(zhǔn)值等。在該基準(zhǔn)中，包含最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)、無(wú)進(jìn)展生存期(日)的基準(zhǔn)值、影響基準(zhǔn)值的要素及其影響的程度等，這些基準(zhǔn)值可以由對(duì)象的癌癥患者的狀態(tài)和癌的種類、與伊立替康、SN-38和/或其鹽組合使用的藥劑種類等適當(dāng)設(shè)定。使用該基準(zhǔn)值，可以如上所述判斷。本發(fā)明的試劑盒不限定于這些，指的是聚集了在進(jìn)行這樣的方法的全部或一部分的步驟中必須物質(zhì)的全部或一部分。在這里，“在進(jìn)行步驟中必須的物質(zhì)”中，例如可以列舉緩沖液等。另外，如果以由上式⑴ (3)得到的最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日) 或無(wú)進(jìn)展生存期(日)的任意1個(gè)的數(shù)值增量作為指標(biāo)，就能夠篩選對(duì)伊立替康、SN-38和 /或其鹽的敏感性增強(qiáng)劑。即，在體外或體內(nèi)，使這些數(shù)值增加的物質(zhì)增強(qiáng)抗癌劑敏感性。 例如，在載癌動(dòng)物中的抗癌劑投與前后，增強(qiáng)這些數(shù)值增量的物質(zhì)是增強(qiáng)抗癌劑的敏感性的物質(zhì)(抗癌劑敏感性增強(qiáng)劑)。另外，在體外，在各種癌細(xì)胞株中，在伊立替康、SN-38和 /或其鹽的存在下，增強(qiáng)這些數(shù)值增量的物質(zhì)是增強(qiáng)抗癌劑敏感性的物質(zhì)(抗癌劑敏感性增強(qiáng)劑)。如果是抗癌劑敏感性增強(qiáng)劑，因?yàn)檫@些數(shù)值的增量比腫瘤縮小或細(xì)胞殺傷效果更早出現(xiàn)，所以能夠在更短時(shí)間的研究中判斷該物質(zhì)作為抗癌劑敏感性增強(qiáng)劑是否有用，在伴隨篩選的勞力和費(fèi)用的減少方面也可以期待大的效果。如果并用這樣得到的抗癌劑敏感性增強(qiáng)劑和敏感性增強(qiáng)對(duì)象的伊立替康、SN-38 和/或其鹽，該抗癌劑的治療效果就會(huì)飛躍性提高。本發(fā)明的組合物能夠以口服投與或非口服投與的任意1種使用，但優(yōu)選非口服投與。在投與時(shí)，將含有抗癌劑敏感性增強(qiáng)劑和敏感性增強(qiáng)對(duì)象的抗癌劑的組合物與適合于口服投與、直腸內(nèi)投與、注射等投與方法的固體或液體的醫(yī)藥用無(wú)毒性載體混合，能夠以常用的醫(yī)藥品制劑的形態(tài)投與。在這里，含有抗癌劑敏感性增強(qiáng)劑和敏感性增強(qiáng)對(duì)象的抗癌劑的組合物，既可以是包含這兩種成分的一個(gè)組合物，也可以分別是各個(gè)制劑的組合。另外，這些成分也可以分別為各個(gè)投與路徑。作為這樣的制劑，例如，可以列舉片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等固體制劑，溶液劑、 懸濁劑、乳劑等液劑，冷凍干燥劑等。這些制劑可以由制劑上常用手段制備。作為上述醫(yī)藥用無(wú)毒性載體，例如，可以列舉淀粉、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、 聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、氨基酸、明膠、白蛋白、水、生理鹽水等。另外，根據(jù)需要， 也可以適當(dāng)添加穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、粘合劑、等滲劑、賦形劑等常用的添加劑。另外，在上式(1) (3)中的第1項(xiàng)數(shù)值和各基因的系數(shù)，以由實(shí)時(shí)RT-PCR法得到的各基因的表達(dá)量為基礎(chǔ)決定，但如果由實(shí)時(shí)RT-PCR法得到的各基因的表達(dá)量和由實(shí)時(shí)RT-PCR法以外的別的方法得到的基因的表達(dá)量測(cè)定值具有一定的相關(guān)，則在上式(1) (3)的第1項(xiàng)數(shù)值和各基因的系數(shù)中，也能夠追加使用將由實(shí)時(shí)RT-PCR法和其以外的別的方法得到的測(cè)定值調(diào)整的系數(shù)，在該式中代入由實(shí)時(shí)RT-PCR法以外的別的方法得到的基因表達(dá)量即可。實(shí)施例以下，列舉實(shí)施例更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例任何制約。實(shí)施例1 (與使用癌細(xì)胞株的SN-38敏感性相關(guān)的基因鑒定)1.從人癌細(xì)胞株、人非腫瘤性培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA的制備從2種人白血病細(xì)胞株(骨髓性白血病細(xì)胞株K562及其獲得性多劑耐性細(xì)胞株K562/D0X)、9種肺癌細(xì)胞株(小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-6、其SN-38獲得耐性細(xì)胞株P(guān)C-6/ SN2-5及其CPT-Il獲得耐性細(xì)胞株P(guān)C-6/DQ2-2、肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9及其CDDP (順鉬)獲得耐性細(xì)胞株P(guān)C-9/⑶DP、肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-14及其⑶DP獲得耐性細(xì)胞株P(guān)C-14/⑶DP、肺扁平上皮細(xì)胞癌株LC-S及肺腺癌細(xì)胞株A549)、7種消化器官癌(大腸癌4株HCC-48、HCC_50、 C0L0201、C0L0320DM、胃癌2株HSC-42、MKN45、食道癌1株HEC-46)、1種口腔上皮類表皮細(xì)胞株(KB)使用RNeasy Mini kit(Qiagen公司生產(chǎn))，按照附屬的操作步驟，提取總RNA， 在-80°C保存?？?RNA 使用 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies 公司生產(chǎn))和 RNALabChip (Agilent Technologies公司生產(chǎn))，確認(rèn)18S和28S rRNA的峰鮮明且高品質(zhì)以后，供給微陣列解析。2.使用微陣列的全面基因表達(dá)解析和通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR法的定量性基因表達(dá)解析使用包含20784克隆、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的RIKEN human 21K陣列及包含19881 克隆、陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的寡聚核苷酸的CodeLink Uniset Human 20K I Bioarray (GE Healthcare公司生產(chǎn))，分析上述19種人培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株的基因表達(dá)譜。為了構(gòu)筑RIKEN human 21K 陣列而使用的標(biāo)的 DNA 是從 ResGen (Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)購(gòu)入的 cDNA克隆的甘油菌(glycerol stock)。在cDNA微陣列中，將C0L0201細(xì)胞作為參照樣品， 分別通過(guò)使用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的隨機(jī)引物的逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記樣品細(xì)胞株的聚(A)RNA，在寡聚核苷酸微陣列中，用Cy5標(biāo)記所有檢驗(yàn)體，由一色法評(píng)價(jià)。在使用RIKEN human 21K陣列的解析中，求出各點(diǎn)的lo&(Cy3/Cy5)，從其中減去陣列的全部點(diǎn)信號(hào)lo&(Cy3/Cy5)的中央值，作為各個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)表達(dá)量。在使用寡聚核苷酸微陣列的解析中，將在上述中得到的信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)使用GeneSpring GX(Agilent公司生產(chǎn))微陣列基因表達(dá)解析軟件，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)解析。即，從點(diǎn)信號(hào)減去背景信號(hào)，其值小于0. 01的作為0. 01，將除以陣列的全部點(diǎn)信號(hào)的中央值得到的值分別作為基因標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)表達(dá)量。 另夕卜，使用 TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)、ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems)定量評(píng)價(jià)基因表達(dá)量。3.對(duì)伊立替康、SN-38的敏感性評(píng)價(jià)關(guān)于全面進(jìn)行基因表達(dá)解析的19種人培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株，使用MTT (甲基噻唑基溴化四唑，methylthiazol tetrazolium bromide)法進(jìn)行對(duì)伊立替康和SN-38的敏感性評(píng)價(jià)。即，在96微孔板(Nunclon ；Nunc, Roskilde, Denmark)的各孔中，和80 μ L培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液)一起接種4X IO3個(gè)細(xì)胞，在M小時(shí)、37°C、5% CO2的條件下，在保溫箱內(nèi)培養(yǎng)，此后，更換培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液)，在各種濃度的SN-38或伊立替康和37°C、5% CO2的條件下，在保溫箱內(nèi)培養(yǎng)。在培養(yǎng)72小時(shí)后，取出培養(yǎng)液，在各孔中加入100 μ L的PBS (磷酸緩沖液)，以1500rpm離心5分鐘，抽濾除去上清。在各孔中加入IOyL的0.4% MTT試劑和IOyL的0. IM琥珀酸鈉，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)2小時(shí)，此后，加入150yL的DMS0，充分用移液槍混合(pipetting)后， 用微孑L板檢測(cè)儀(Maxline Microplate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)測(cè)定 570 650nm處的吸光度。求出從藥劑處理群各孔的吸光度只減去培養(yǎng)液吸光度平均值得到的值的平均值，再除以從對(duì)照群(藥劑未處理群)各孔的吸光度，只減去培養(yǎng)液的吸光度平均值得到的值的平均值，在其上乘100，求出增殖抑制率(％ )，在半對(duì)數(shù)圖表中對(duì)各濃度作圖，制成增殖抑制曲線，由此求出50%細(xì)胞增殖抑制濃度(IC5tl)，作為敏感性比較的指標(biāo) (表 1)。[表 1]通過(guò)MTT法的50%細(xì)胞增殖抑制濃度(IC5tl)
權(quán)利要求
1.一種伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷方法，其特征在于測(cè)定檢驗(yàn)體中的AMD 1基因、CTSC基因、EIFIAX基因、C12orf 30基因、DDX54基因、PTPN2 基因和TBX3基因的表達(dá)量，通過(guò)下式⑴ (3)算出最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期 (日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)，最佳腫瘤縮小效果(% ) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD-29.119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)總體生存期(曰)=512. 78-192. 11XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55 X G......(2)無(wú)進(jìn)展生存期(日)=68. 076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73. 077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)式(1)、⑵和(3)中，A表示AMDl基因的表達(dá)量，B表示CTSC基因的表達(dá)量，C表示 EIFlAX基因的表達(dá)量，D表示C12orf30基因的表達(dá)量，E表示DDX54基因的表達(dá)量，F(xiàn)表示 PTPN2基因的表達(dá)量，G表示TBX3基因的表達(dá)量。
2.如權(quán)利要求1所述的判斷方法，其特征在于 檢驗(yàn)體是來(lái)自患有癌的被檢驗(yàn)者的生物試樣。
3.如權(quán)利要求1或2所述的判斷方法，其特征在于 檢驗(yàn)體是來(lái)自患有大腸癌的被檢驗(yàn)者的生物試樣。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的判斷方法，其特征在于 基因的表達(dá)量是來(lái)自該基因的mRNA量。
5.一種伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷用的試劑盒，其特征在于含有(A)測(cè)定檢驗(yàn)體中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf30基因、DDX54 基因、PTPN2基因和TBX3基因表達(dá)量的試劑，與⑶用于通過(guò)下式(1) ⑶算出最佳腫瘤縮小效果(％ )、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)的使用說(shuō)明，最佳腫瘤縮小效果(% ) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD-29.119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)總體生存期(曰)=512. 78-192. 11XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55 X G......(2)無(wú)進(jìn)展生存期(日)=68. 076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73. 077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)式(1)、⑵和(3)中，A表示AMDl基因的表達(dá)量，B表示CTSC基因的表達(dá)量，C表示 EIFlAX基因的表達(dá)量，D表示C12orf30基因的表達(dá)量，E表示DDX54基因的表達(dá)量，F(xiàn)表示 PTPN2基因的表達(dá)量，G表示TBX3基因的表達(dá)量。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于 檢驗(yàn)體是來(lái)自患有癌的被檢驗(yàn)者的生物試樣。
7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于 檢驗(yàn)體是來(lái)自患有大腸癌的被檢驗(yàn)者的生物試樣。
8.一種對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性增強(qiáng)劑的篩選方法，其特征在于測(cè)定檢驗(yàn)體中的AMDl基因、CTSC基因、EIFlAX基因、C12orf 30基因、DDX54基因、PTPN2 基因和TBX3基因的表達(dá)量，以使用下式(1) (3)算出的最佳腫瘤縮小效果(％)、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)中的任意1個(gè)數(shù)值的增量作為指標(biāo)，最佳腫瘤縮小效果(% ) = 139. 49-12. 089XA-84. 477XB-12. 737XC+85. 900XD-29.119XE-6. 8630XF+20. 303 X G......(1)總體生存期(曰)=512. 78-192. 11XA-120. 78XB+134. 53XC-11. 883XD+157. 24XE+31. 962XF-386. 55 X G......(2)無(wú)進(jìn)展生存期(日)=68. 076+78. 277XA-57. 358XB-15. 011XC+8. 9798XD+73. 077XE-38. 961XF-43. 313XG......(3)式(1)、⑵和(3)中，A表示AMDl基因的表達(dá)量，B表示CTSC基因的表達(dá)量，C表示 EIFlAX基因的表達(dá)量，D表示C12orf30基因的表達(dá)量，E表示DDX54基因的表達(dá)量，F(xiàn)表示 PTPN2基因的表達(dá)量，G表示TBX3基因的表達(dá)量。
9.一種對(duì)由權(quán)利要求8所述的方法得到的伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性增強(qiáng)劑。
10.一種癌治療用組合物，其特征在于含有權(quán)利要求9所述的敏感性增強(qiáng)劑，并且含有伊立替康、SN-38和/或其鹽。
全文摘要
提供能夠判斷各患者治療反應(yīng)性的對(duì)伊立替康、SN-38和/或其鹽的敏感性判斷方法和利用其的新的癌癥治療手段。伊立替康、SN-38和/或其鹽敏感性的判斷方法，其特征在于，測(cè)定檢驗(yàn)體中的AMD1基因、CTSC基因、EIF1AX基因、C12orf30基因、DDX54基因、PTPN2基因和TBX3基因的表達(dá)量，由式(1)～(3)算出最佳腫瘤縮小效果(％)、總體生存期(日)或無(wú)進(jìn)展生存期(日)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102325905SQ201080008810
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者檜山桂子, 西山正彥, 谷本圭司 申請(qǐng)人:學(xué)校法人埼玉醫(yī)科大學(xué), 株式會(huì)社益力多本社