專利名稱：使用探針雜交和限制性通過信號擴大而檢測靶核酸的方法
使用探針雜交和限制性通過信號擴大而檢測靶核酸的方法相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2009年11月23日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/263，596的優(yōu)先權(quán)日效益，其公開內(nèi)容通過引用方式并入本文。發(fā)明領(lǐng)域和背景本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的靶核酸序列的寡核苷酸探針和方法。更具體地，本發(fā)明涉及這樣的寡核苷酸探針僅當與靶核酸序列雜交時，才被切割。探針的直接或間接切 割導致信號的產(chǎn)生和信號的擴大(通過探針的重復利用)。靶核酸序列的鑒定在生物研究和醫(yī)學診斷中具有重要意義。靶序列的檢測可用于鑒定特異性DNA或RNA分子或?qū)ζ溥M行分型，并用于掲示突變。本領(lǐng)域存在多種能夠進行靶序列的檢測和/或鑒定的方法和技術(shù)。例如，多核苷酸測序方法可用于確定靶DNA或RNA分子的核苷酸序列。用于測序的方法通常包括Sanger雙脫氧法，見例如，Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977),或 Maxam和 Gilbert 的方法，見例如 Maxam et al, Methods in Enzymology, 65:499-559 (1980)。聚合酶鏈式反應(PCR)也可用于檢測樣品中靶序列的存在。PCR利用特異性結(jié)合靶序列內(nèi)的區(qū)域的寡核苷酸引物，以擴增靶核酸序列，擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生指示著靶序列的存在。鑒定靶核酸的另ー種方法包括使寡核苷酸探針與靶核酸序列雜交，其中雜交指示著其存在。寡核苷酸探針通過在靶標與寡核苷酸之間堿基形成氫鍵而與靶核酸結(jié)合。常見的B-DNA具有常規(guī)的腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)和鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)沃森和克里克堿基配對，分別在其中形成2個和3個氫鍵。常規(guī)雜交技術(shù)是基于序列特異性DNA或RNA寡核苷酸探針通過沃森-克里克氫鍵與互補性靶核酸結(jié)合的能力。然而，也已知其它類型的核苷酸間氫鍵模式，其中與第一個核苷酸的沃森-克里克堿基配對中不涉及的原子可以與另ー個核苷酸形成氫鍵。例如，胸腺嘧啶(T)能夠通過與腺嘌呤之間的氫鍵而與AT沃森-克里克堿基對結(jié)合，從而形成T-AT堿基三元組。Hoogsteen, Acta Crystallographica12:822(1959)首次描述了存在于T-AT和C-GC堿基三元組中的交替氫鍵。更近年以來，觀察到了 G-TA堿基三元組，其中鳥嘌呤與中間的胸腺嘧啶形成氫鍵，見Griffin etal.，Science, 245:967-971(1989)。能通過沃森-克里克和非沃森-克里克氫鍵與靶核酸結(jié)合的寡核苷酸探針與靶核酸形成特別穩(wěn)定的復合物，因此，具有多種研究和診斷上的應用。例如，寡核苷酸可用作針對于固定在過濾器或膜上或存在于組織中的靶核酸的探針，例如，描述于 Sambrook et al. , Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Vols. 1-3, (1989)。然而，該文獻中描述的寡核苷酸探針具有結(jié)合穩(wěn)定性和選擇性差的局限性。另ー個實例包括溶液相檢測方法。已知有數(shù)種溶液相檢測方法，有時被稱作勻質(zhì)測定(homogeneous assay)。術(shù)語“勻質(zhì)”在本領(lǐng)域中用于指這樣的方法不將未雜交的寡核苷酸探針從探針-靶標雜交體中分離。這些方法通常依賴于下列事實寡核苷酸探針的構(gòu)象或直接的化學環(huán)境可以影響很多熒光標記物的熒光。Livak等人的美國專利號5，876，930公開了用于鑒定靶核酸序列的方法。該方法利用了寡核苷酸探針，所述探針包括熒光報告分子和能夠猝滅報告分子的熒光的猝滅劑分子。根據(jù)該方法的寡核苷酸探針被構(gòu)建為使得，當未雜交時，探針以至少ー種單鏈構(gòu)象存在其中粹滅劑分子與報告分子足夠靠近，以粹滅報告分子突光。當與祀核酸雜交時，寡核苷酸探針也以至少ー種構(gòu)象存在其中猝滅劑分子與報告分子不足以靠近使得報告分子的熒光猝滅。通過采用這些雜交和非雜交構(gòu)象，探針上的報告分子和猝滅劑分子在探針雜交和非雜交時顯示不同的熒光信號強度。因此，該方法能夠基于報告分子、猝滅分子或二者的組合的熒光強度的變化而確定特異性靶核酸序列的存在。該方法的局限性在于不能進行信號擴大，這使得不能檢測低濃度靶標。另外，該方法內(nèi)在地特征在于具有高背景信號。Tyagi等人的美國專利號5，925，517公開了用于檢測核酸祀序列的單分子和雙分子雜交探針。所述探針包括靶標互補序列、使探針在不存在靶序列的情況下處于封閉構(gòu)象的親和對，以及，當探針處于封閉構(gòu)象時相互作用的標記物對，或者，非相互作用的標記物(對于某些單分子探針)。靶標與靶標互補序列的雜交使探針轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放構(gòu)象。由于標記物對的減少的相互作用，或通過降低來自非相互作用的標記物的信號，該轉(zhuǎn)變是可以被檢出的。某些單分子探針能夠區(qū)分差別僅有一個核苷酸的靶標和非靶標序列。該方法的局限性是不能進行信號擴大，這使得不能檢測低濃度靶標。另外，該方法內(nèi)在地特征在于具有高背景信號。Nazarenko等人的美國專利號5，866，336描述了標記的核酸擴增寡核苷酸，其可以是線性的或發(fā)夾引物或封閉寡核苷酸。Nazarenko公開的寡核苷酸被分子能量轉(zhuǎn)移對的供體和/或受體部分標記。所述部分可以是熒光團，從而供體發(fā)射的熒光能量被受體吸收。受體可以是在不同于供體部分的波長發(fā)熒光的熒光團，或者可以為非熒光暗猝滅劑。這些寡核苷酸配置為供體部分和受體部分被摻入擴增產(chǎn)物中。該發(fā)明還提供了使用核酸擴增引物直接檢測擴增產(chǎn)物的方法和試劑盒。當使用標記的線性引物吋，以核酸外切酶進行的處理或者特異性溫度的使用使得無需分離未摻入的引物。這種“封閉管”形式大大降低了擴增產(chǎn)物的遺留污染(carryover contamination)的可能性,提供了樣品的高通量檢測，并且可以完全自動化。Diamond等人的美國專利號4，766，062描述了ー種診斷試劑,其包含通過嘌呤/卩密啶氫鍵與標記的多核苷酸結(jié)合的探針多核苷酸的復合物。所述探針包含能夠結(jié)合生物樣品的靶序列的靶標結(jié)合區(qū)。Diamond等人進ー步描述了ー種方法，其中與含有靶核苷酸序列的樣品的接觸引起結(jié)合，最初是靶標與探針的靶標結(jié)合區(qū)的單鏈部分的結(jié)合。然后，標記的多核苷酸從產(chǎn)生的復合物中被置換出來。對該置換的標記的多核苷酸的檢測給出ー個數(shù)值，該數(shù)值與樣品中靶核酸序列的存在和濃度成函數(shù)關(guān)系。Hogan等人的美國專利號5，451，503描述了ー種核酸雜交探針，其具有至少ー個核酸鏈，所述核酸鏈具有與靶核酸序列雜交的至少兩個分開的靶標特異性區(qū)域，以及不與靶核酸雜交但是具有能夠彼此雜交的互補區(qū)域的至少兩個不同的臂區(qū)域。這些區(qū)域設計為在合適的雜交條件下，在不存在靶核酸的情況下，互補臂區(qū)域彼此將不雜交；但是，在 存在靶核酸的情況下，探針的靶標特異性區(qū)域?qū)⑴c靶核酸退火，并且互補臂區(qū)域?qū)⒈舜送嘶?，從而形成分枝的核酸結(jié)構(gòu)，其可用于靶核酸序列的檢測。Alajem等人的美國專利號6，887，662自述為Hogan等人專利的改進，改進在于靶核酸被釋放，并且可用于隨后的擴增循環(huán)。雖然以上描述的方法相對于簡單的寡核苷酸探針檢測方法例如Sambrook等人描述的方法(其中寡核苷酸探針用于檢測固定于過濾器或膜上的靶核酸)不那么復雜，當仍然存在ー些局限性。例如，Livak等人描述的易于執(zhí)行的方法會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因為也會產(chǎn)生與非靶序列的雜交，在一些情況下是陽性結(jié)果。一般而言，上述方法的特征在于信號低、背景高。Hogan等人教導了通過模板重復利用而擴大信號以及通過適當選擇所用的寡核苷酸的臂區(qū)域的長度來減少背景。_在產(chǎn)生更精確結(jié)果的方法通常更難以執(zhí)行。致瘤性人乳頭瘤病毒(HPV)的檢測是嚴峻的挑戰(zhàn)，因為HPV基因組具有多個相關(guān)的基因型和異質(zhì)性。目前，僅有兩種FDA批準的用于高風險HPV株系的篩選測定法(Qiagen的 Hybrid Capture 2High_Risk HPV DNA Test (digene HC2);Hologic 的 Cervista HPV)。HC2測定法利用了多個基于長RNA的探針以克服靶DNA中的序列差異性并確保完全株系覆蓋。然而，該設計的本性使得Digene測定法具有特異性差的問題并顯示出與HPV的多種低風險基因型的交叉反應。基于靶核酸擴增的其他的檢測HPV的測定法比較復雜，因為需要使用簡并引物和探針以解決序列異質(zhì)性的問題。當混合在一起時，寡核苷酸的這種混合物容易發(fā)生非特異性引物相互作用，這會導致產(chǎn)生引物ニ聚體的短擴增子，這會降低靶標特異性擴增和檢測的效率。這就是為何實時的基于探針的HPV DNA的擴增和檢測無法廣泛實 施并一般局限于檢測單一基因型[見例如下列文獻中的描述Flores-Munguia, Roberto, etal, Periormance Assessment οι Eight High-Throughput PCR Assays ior Viral LoadQuantitation of Ocongenic HPV Types, journal of Molecular Diagnostics, Vol. 6,No. 2，pp. 115-124 (May2004) ;Hesselinkj A. T.，et al, ,,Comparison of Three DifferentPCR Methods for Quantifying Human Papillomavirus Type 16DNA in Cervical ScrapeSpecimens，"Journal of Clinical Microbiology, Vol. 43, No. 9, p. 4868-4871 (Sept. 2005)
;Tucker, Ruth Ann et al, ^Real-time PCR-based Fluorescent Assay for Quantiationof Human Papillomavirus Types 6，11，16，and 18, Molecular Diagnosis, Vol. 6, No. I, pp.39-47(2001)]或有限的多重測定形式、在單一反應中涉及檢測至多3種基因型[見例如下列文獻的描述 Moberg，Martin，et al.，"Real-Time PCR-Based System for SimultaneousQuantification of Human Papillomavirus Types Associated with High Risk ofCervical Cancer,, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 41, No. 7, pp. 3221-3228(July 2003) ; Peitsaroj Panu et al, ,,Integrated Human Papillomavirus Type 16Is Frequently Found in Cervical Cancer Precursors as Demonstrated by a NovelQuantitative Real-Time PCR Technique，,，Journal of Clinical Microbiology, Vol.40，No. 3，pp. 886-891 (2002)]的原因之一。已經(jīng)報道了使用插入染料“SYBR綠”實時檢測PCR擴增產(chǎn)物，但是該技術(shù)缺乏足夠的特異性以用于可靠的臨床診斷，并且通常需要熔解曲線分析以精確判讀陽性結(jié)果。該測定法描述于Lillo，F(xiàn). B.，et al, "Determinationof Human Papillomavirus (HPV) Load and Type in Hign-Grade Cervical LesionsSurgically Resected from HIV-Infected Women during Follow-up of HPV Infection,Clinical Infectious Diseases, Vol. 40，pp. 451-457(2005)和 Payan, C.，et al.，〃HumanPapillomavirus Quantification in Urine and Cervical Samples by Using theMx4000and Light Cycler General Real-Time PCR Systems, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 45，No. 3p. 897-901 (2007)。除了引物與探針之間的潛在相互作用所造成的測定法設計局限性之外，目前可用的PCR儀器只能提供不多于4至6個光學通道用于檢測多重反應。因此，特異性檢測所有14種高風險HPV基因型通常需要多個單獨的PCR，這限制了儀器的通量并對于上游樣品處理、測定法的質(zhì)控和試劑生產(chǎn)具有潛在的不良影響。
目前在尋求使用常見的光學通道在單ー的多重反應中檢測HPV的高風險株系的測定法和方法。還尋求改善的信號擴大和降低背景的方法，以便以易于高度多重化和無需使用混雜的DNA聚合酶(這會導致假陽性結(jié)果)的形式檢測中等高至高豐度的核酸靶序列(例如來自HPV高風險株系的DNA)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉使用勻質(zhì)、等溫、多重相容性信號擴大系統(tǒng)檢測靶核酸的寡核苷酸探針和方法。在一個實施方式中，靶核酸以中等高至高的濃度存在。本文描述的方法被稱作通過探針雜交和限制性擴大信號[Amplification by Probe Hybridization andRestriction (SAPHyR)]。在優(yōu)選實施方式中，該方法利用限制性核酸內(nèi)切酶的良好表征的產(chǎn)生單鏈DNA缺ロ的活性。限制性核酸內(nèi)切酶的ー個實例是BsoBI酶。將反應溫度與探針熔解溫度之間的關(guān)系選擇為使得循環(huán)產(chǎn)生切割的寡核苷酸片段。這些片段進ー步激發(fā)次級循環(huán)切割反應以產(chǎn)生信號(突光)。在一個實施方式中，該方法檢測樣品中的靶核酸的存在或不存在，所述樣品通過制備懷疑含有靶核酸的樣品而獲得。用于制備樣品(以用于檢測靶核酸是否存在的測定法)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在本文中不詳細討論。從樣品中提取核酸的ー個實例是 BD Viper System,使用位于 Franklin, Lakes New Jersey 的 Becton Dickinson (BD)的XTR 技術(shù)。從樣品提取的核酸與反應混合物混合，所述反應混合物具有第一和第二寡核苷酸探針，和序列特異性核酸內(nèi)切酶，其中所述第一和第二寡核苷酸探針各自具有第一序列和第二序列。第一和第二寡核苷酸探針的第一序列與靶核酸的非重疊序列互補。第一和第二寡核苷酸探針各自的第二序列彼此互補并形成雙鏈限制性位點，所述限制性位點被序列特異性核酸內(nèi)切酶識別。第一和第二寡核苷酸探針中的至少ー個具有位于所述限制性位點的一側(cè)的可檢測標記物和位于所述限制性位點另ー側(cè)的猝滅部分。這種相對位置允許第一和第二寡核苷酸探針的第一序列與靶核酸的非重疊序列選擇性雜交，并且第一和第二寡核苷酸探針的第二序列彼此選擇性雜交。這些探針的雜交形成雙鏈限制性位點，從而使得如果樣品中存在靶核酸，則序列特異性核酸內(nèi)切酶在該限制性位點切割該雙鏈體。按照這種方式切割探針允許檢測所述標記物。切割探針還使寡核苷酸探針的其余部分從靶核酸變性，并彼此變性。在第二實施方式中，將制備的樣品與反應混合物混合，所述反應混合物包含第一、第二和第三寡核苷酸探針，和序列特異性核酸內(nèi)切酶。所述第一和第二寡核苷酸探針各自具有第一序列和第二序列。第一和第二寡核苷酸探針的第一序列與靶核酸的非重疊序列互補。第一和第二寡核苷酸探針各自的第二序列彼此至少部分互補，并且當探針與靶標雜交時，形成雙鏈限制性位點，從而使第一和第二探針彼此靠近。優(yōu)選地，當不與靶序列雜交吋，第一和第二探針中的至少ー個具有發(fā)夾構(gòu)象，從而確保在不存在靶核酸時探針彼此不雜交。所述第一和第二寡核苷酸探針為非標記的，并且所述第二寡核苷酸探針還具有第三序列。所述第三序列的至少一部分與第二寡核苷酸探針的第二序列形成發(fā)夾，其防止當?shù)谝缓偷诙押塑账崽结槻慌c靶核酸結(jié)合時第二寡核苷酸探針與第一寡核苷酸探針雜交。所述第三序列的至少一部分與第三寡核苷酸探針雜交以形成雙鏈限制性位點。第三寡核苷酸探針為非靶標特異性寡核苷酸探針，其具有位于第一序列的ー側(cè)的可檢測標記物，所述第一序列與第二寡核苷酸探針的第三序列形成雙鏈限制性位點。第三寡核苷酸探針還具有位于第三寡核苷酸探針的第一序列的另ー側(cè)的猝滅劑部分。在該實施方式中，如果祀核酸存在于樣品中，貝1J第一和第二寡核苷酸探針的第一序列(通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)的變性)與靶核酸的非重疊序列選擇性雜交。發(fā)夾環(huán)的變性允許第一和第二寡核苷酸探針的第二序列之間發(fā)生雜交、之前在限制性位點處形成的雙鏈體被序列特異性核酸內(nèi)切酶切割，以及第三序列從第二寡核苷酸探針分離，以及第一和第二寡核苷酸探針從靶核酸分離。然后，在反應混合物中發(fā)生多個下列循環(huán)i)第二寡核苷酸探針的第三序列與第三寡核苷酸探針雜交，由此形成化學修飾的雙鏈限制性位點，ii)通過序列特異性限制性核酸內(nèi)切酶使該化學修飾的雙鏈限制性位點的單鏈產(chǎn)生缺ロ，iii)從猝滅劑釋放標記物，和iv)第三寡核苷酸探針從第二寡核苷酸探針的第三序列分離。然后使用常規(guī)技術(shù)檢測由此釋放的標記物，以檢測可檢測標記物(例如熒光團)的存在，從而信號的檢測指示樣品中靶核酸的存在。通過參考圖4A-D描述的第三實施方式，將提取的懷疑含有靶核酸的核酸與具有第一序列和第二序列的第一寡核苷酸探針(Pi)、具有第一序列和第二序列的第二寡核苷酸探針(P2)，和具有第一序列和第二序列的第三寡核苷酸探針(P3)，以及序列特異性核酸內(nèi)切酶混合。為了清楚，以圖4A-D中的示意性序列名稱描述該實施方式中的序列。這些名稱無意暗示序列組成或序列長度，而僅僅是為了提供序列描述與其示意圖之間的關(guān)聯(lián)。在該實施方式中，第一寡核苷酸探針(PD具有與靶核酸序列互補的第一序列(b’-i’)和與第二寡核苷酸探針(P2)的第一序列(a’-f')互補的第二序列(a-c’)。第一探針的第二序列(a-c’)的第一部分(d-e)是限制性位點的單鏈化學修飾部分。本文中更詳細地描述了化學修飾的限制性位點。第一寡核苷酸探針(PD的第一序列(b’-i’)的一部分和所有的第二序列(a-c’)形成次級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)。第二寡核苷酸探針(P2)是不直接與靶標雜交的探針(雖然其可以具有一些靶標特異性核苷酸，但是靶標特異性序列的 長度太短無法在反應條件下與靶標形成穩(wěn)定的雜交體)，其中第二探針(P2)的第一序列(a’-f,)的一部分(d’-e’)與第一探針(Pl)的第二序列(a-c’)的單鏈化學修飾部分(d-e)互補。第二寡核苷酸探針的第二序列(b-e’)與第三寡核苷酸探針(P3)的第一序列(b’-e)互補，其中第二探針的第二序列(b-e’)的一部分(d-e)是限制性位點的單鏈化學修飾部分。第二寡核苷酸探針的第一序列和第二序列部分重疊(e’-f,)，并且其中第二寡核苷酸探針的第一序列的至少一部分(部分b’-d’)和第ニ序列(部分b-e’)形成次級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)。第三寡核苷酸探針(P3)是不與靶標直接雜交的探針(雖然其可以具有一些靶標特異性核苷酸，但是靶標特異性序列的長度太短無法在反應條件下與靶標形成穩(wěn)定的雜交體)，其中第一序列(b’-e)包括與第二寡核苷酸探針(P2)的限制性位點的單鏈化學修飾部分(d-e)互補的部分(d’-e’)，并進一歩包括位于其上的可檢測標記物(264)或猝滅劑(266)部分，第二序列(d-k)與第一序列(b’-e)的一部分(b’-d’)形成發(fā)夾環(huán)，并具有位于其上的可檢測標記物(264)或猝滅劑(266)部分，從而猝滅劑部分阻斷來自可檢測標記物的信號(由于它們在第三寡核苷酸探針中的相對位置)。在該實施方式中，如果靶核酸存在于樣品中，則靶核酸與第一寡核苷酸探針(Pl)的第一序列(b’-i’)選擇性雜交以形成第一復合物(Ρ1:τ)。此外，在多個循環(huán)中，該方法允許i)第一寡核苷酸探針(Pl)的第二序列(a-c’)的至少一部分(a-f)與第二寡核苷酸探針(P2)的第一序列(a’-f,)選擇性雜交以形成第二復合物(P2:P1:T) ;ii)切割雙鏈限制性位點[通過形成雙鏈限制性位點的化學修飾單鏈的第一寡核苷酸探針的第二序列(a-c’)的部分(d-e)與第二探針(P2)上的互補性序列(a’-f,)的雜交而形成]的單鏈部分(d’-e’)，從而從第二寡核苷酸探針(P2)的第一序列的非重疊部分(a’-d’)分離第二寡核苷酸探針的第二序列(b-e’)；和iii)第二寡核苷酸探針從第一復合物(P1:T)分離。此外，根據(jù)該實施方式，在多個循環(huán)中，i)允許第二寡核苷酸探針(P2)的第二序列(b-e’)與第三寡核苷酸探針(P3)的第一序列(b’-e)選擇性雜交，以形成第三復合物，從而從猝滅劑分離標記物并釋放信號，ii)切割雙鏈限制性位點[通過第二寡核苷酸探針的第二序列的部分(b-e’)與第三寡核苷酸探針的第一序列的互補序列(b’-e)的雜交而形成]的單鏈(d’-e’)，iii)從猝滅劑釋放信號，并且第二寡核苷酸探針的第二序列(b-e’)從第三寡核苷酸探針(P3)的其余部分分離。在該 方法中，從標記物產(chǎn)生的信號被檢測，其指示樣品中靶核酸的存在。


圖IA和IB例示了本發(fā)明的一個實施方式，其利用了兩個靶標特異性探針以及兩個探針與靶核酸形成的復合物。圖2A-2C例示了ー種方法，其利用三個探針，其中之ー為非靶標特異性標記的報告探針，但是其中，當不與靶標結(jié)合時，探針不具有次級結(jié)構(gòu)。圖3A-3D例示了本發(fā)明的第三實施方式，其利用了三個探針，其中ー個靶標特異性探針帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以阻斷靶標-特異性探針之間的靶標非依賴性雜交。圖4A-4D例示了第四實施方式，其中僅有ー個探針是靶標特異性的。圖5例示了圖4A-4D中描述的三個探針的ー個實例。圖6例示了利用封閉探針的本發(fā)明的一個實施方式。圖7A例示了 HPV-16的靶序列。圖7B例示了 HPV-58的靶序列。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一組寡核苷酸和使用可用于檢測靶核酸序列的該組寡核苷酸的方法。具體地，本發(fā)明的方法可用于檢測特異性靶核酸序列的存在或不存在，其使用寡核苷酸探針，當所述寡核苷酸探針與模板序列退火時，在它們之間形成內(nèi)在(內(nèi)源性)切割位點。隨后，該切割位點的切割引起可檢測信號的產(chǎn)生，并且引起ー個或多個寡核苷酸從靶核酸序列分離，從而允許模板重復利用和信號擴大。通過參考附圖和隨附的說明將更好地理解根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸和方法的原理和操作。在詳細解釋本發(fā)明的至少ー個實施方式之前，應該理解本發(fā)明的應用不限于以下描述所記載的或?qū)嵤├镜募毠?jié)。本發(fā)明能夠以其它實施方式或以多種方式實施或?qū)嵭?。同樣應理解，本文使用的術(shù)語和命名是為了描述的目的，不應被理解為限制性的。 如本文使用的術(shù)語“寡核苷酸”和“探針”以及詞語“寡核苷酸探針”可相互替換地使用，是指單鏈核酸分子或單鏈核酸分子的組裝體，其能夠顯示出ー個或多個部分雙鏈的構(gòu)象。此類分子可以根據(jù)本發(fā)明用于檢測單鏈或雙鏈(在適當變性之后)靶核酸序列的存在或不存在，如本文進ー步描述。如通篇使用的術(shù)語“模板”或詞語“靶核酸序列”是指核酸模板，其天然是單鏈形式，例如信使RNA，或者被變性成為單鏈形式，例如DNA。根據(jù)本發(fā)明的靶核酸序列可以是粗制的、部分純化的，或純化的形式，并且可以具有不同程度的復雜性，這取決于其來源。如本文使用的特異性靶核酸序列可以與另ー特異性靶核酸序列僅有單一核苷酸的差別，例如，點突變，或多個核苷酸的差別。如本文使用的術(shù)語“互補或?qū)嵸|(zhì)上互補”是指在預先確定的溫度和離子強度的雜交條件下和/或模板的存在下可以堿基配對的序列。具體地，“互補或?qū)嵸|(zhì)上互補”是指至少70%互補，優(yōu)選至少80%互補，有利地90%-100%互補?！巴耆パa”是指100%互補。如本文使用，術(shù)語“發(fā)夾”用于描述單鏈DNA或RNA中的莖環(huán)分子內(nèi)堿基配對。發(fā)夾或發(fā)夾環(huán)是由同一探針的至少實質(zhì)上彼此互補的兩個區(qū)域形成的。在核苷酸序列中，互補序列堿基配對以形成雙螺旋“莖”，其終止于非配對的環(huán)。如本文使用的詞語“嗜熱限制性酶”是識別并切割特異性核酸序列的限制性核酸內(nèi)切酶。嗜熱限制性酶較不易受熱的影響。此類酶具有大約50°C或更高的反應溫度。合適的嗜熱限制性核酸內(nèi)切酶的ー個實例是BsoBl限制性核酸內(nèi)切酶。這些酶切割限制性核酸內(nèi)切酶限制性位點(RERS)。此類限制性位點描述于美國專利號6，743，582、美國專利號5，846，726和美國專利號5，919，630，這些文獻全部通過引用方式并入本文。BsoBl將切割具有一定程度簡并性(即差異性)的序列。BsoBl切割的簡并序列是熟知的，包括ctcgag, cccgag, cccggg和ctcggg。當處于單鏈形式時,這些RERS序列不被酶切割。然而，當RERS序列與其互補物雜交時，能被限制性核酸內(nèi)切酶切割。所需的互補程度將根據(jù)特異性RERS而有一定的變化。然而，一般而言，對于6個堿基對的限制性位點，優(yōu)選地，在位點內(nèi)沒有錯配(雖然，例如，BsoBI，可以具有錯配，只要不是位于1，3，4或6位)。在可切割的RERS序列之一被化學修飾的情況下，僅有未被化學修飾的RERS序列被存在的酶切割。BsoBI是能夠識別半修飾的RERS的限制性酶的實例，其能夠切割未被修飾的鏈，雖然也已知其它的具有這些性質(zhì)的酶，包括但不限于Hinc II1Ava I，Nci I和Fnu 4H?？紤]到修飾的限制性位點探針用于本發(fā)明。通過在雜交的探針的一條鏈的識別位點引入修飾，可以阻止被修飾的鏈的酶促切割。此類修飾的ー個實例是在互補于被限制性核酸內(nèi)切酶切割的RERS序列的探針序列中引入的硫代修飾。由于該修飾，僅有限制性位點的一條鏈被切割。在本發(fā)明的情況下(其中探針在多個循環(huán)中被使用)，這具有重要意義。該方法由于整個溫育過程中反應物的較高濃度而獲益，因此，產(chǎn)生較高的產(chǎn)物形成效率。技術(shù)人員知曉很多化學修飾的限制性位點，因此在本文中未詳細描述。技術(shù)人員理解不是所有的限制性位點都易于被化學修飾而產(chǎn)生單鏈缺ロ。因此，只有某些酶的RERS序列可以被化學修飾以實現(xiàn)本文描述的單鏈缺ロ。在本發(fā)明的一些實施方式中，化學修飾的限制性位點是回收再利用的探針的一部分。某些實施方式涉及回收探針以進ー步擴大從靶序列檢測所產(chǎn)生的信號。一旦靶標/探針復合物變性，則未被切割的探針被回收用于再利用。類似于首次產(chǎn)生配對的探針，只有當雙數(shù)目的配對探針雜交以形成雙鏈限制性位點時，限制性核酸內(nèi)切酶才識別并切割完整限制性位點(5’——3’)。然而，僅有雜交的探針對的未經(jīng)修飾的鏈被切割。將探針的熔解溫度(在所選的反應溫度)選擇為使得當未被化學修飾的探針被切割時，至少切割的探針從其復合物變性。在其它實施方式中，單鏈未被化學修飾的限制性位點的缺ロ引起所有探針從其靶標變性。
在一些實施方式中，為了能夠檢測，本發(fā)明的寡核苷酸探針組裝體優(yōu)選經(jīng)檢測部分標記。然而將認識到，并且如下文進ー步詳述，根據(jù)本發(fā)明的檢測也可以在不向結(jié)合于靶標的寡核苷酸摻入此類檢測部分的情況下進行。而是，與靶標的結(jié)合產(chǎn)生探針片段，該探針片段結(jié)合非靶標特異性報告分子探針，并且該報告分子探針與該探針片段雜交。如本文詳述，使用任何常規(guī)的檢測機制進行探針及其限制性產(chǎn)物的檢測。例如，可以使用側(cè)翼于同一鏈的限制性位點的熒光報告染料和猝滅基團。猝滅劑能夠捕獲熒光基團發(fā)射的能量，因此，只要兩個基團彼此足夠靠近，則當熒光基團被激發(fā)時不會發(fā)射熒光。技術(shù)人員對于配置具有猝滅和信號部分的探針(其中，當與猝滅部分處于一定的靠近時，來自信號部分的信號被猝滅；當間距增加時發(fā)射信號)或具有兩個信號部分的探針(其中，當距離增加時信號減少或消失)的考慮是完全清楚的。為了保持猝滅部分與信號部分之間的足夠的靠近，可以將探針配置為發(fā)夾。在該結(jié)構(gòu)中，序列的折疊部分使猝滅部分與信號部分的靠近程度相對于序列不折疊時更近。在這樣的配置下，當發(fā)夾變性時，信號部分能夠發(fā)射信號，因此使猝滅部分與信號部分分離。如果探針具有RERS序列，則限制性核酸內(nèi)切酶切割RERS，使具有猝滅部分的探針的部分從具有信號部分的探針的部分釋放。這進ー步使猝滅部分與信號部分分離，從而允許更多信號從信號部分發(fā)射。技術(shù)人員對于實現(xiàn)信號猝滅和信號發(fā)射所需的分離的量是知曉的。如果要配置RERS序列，則通常在熒光報告染料與猝滅基團之間需要4-18個堿基的間隔，這取決于所使用的限制性酶。在酶促切割之后，熒光報告染料與猝滅基團彼此分離并在溶液中變得分散。因此，不存在從熒光基團向猝滅劑的能量轉(zhuǎn)移，熒光可以被檢測到。由于可以隨著反應進行而檢測熒光，所以可以進行擴增的實時測定。熒光的強度和速率的増加可以允許評估存在于混合物中的靶分子的數(shù)目和擴增速率。如上所述，本發(fā)明的探針可以使用多種熒光/猝滅劑或供體/受體組合。本領(lǐng)域普遍使用這樣的組合其中供體來自染料的夾氧雜蒽(xanthene)基團，包括熒光素，猝滅齊U來自染料(例如6-FAM和TAMRA)的若丹明基團。Cy5和ROX是可以使用的另ー對染料。當利用兩個信號部分例如熒光素/若丹明配對時，熒光素供體被激發(fā)并將能量轉(zhuǎn)移至若丹明受體，其在特定波長發(fā)射熒光，從而使得能夠進行檢測。如果熒光素和若丹明之間的距離増加，則檢測到減少的信號或無信號。也可以使用非熒光猝滅劑，例如DABCYL和QSF-7 ;這些猝滅劑允許在選擇熒光染料時的高度靈活性。染料對的選擇需要當二者靠近時，猝滅劑將吸收熒光染料的能量。優(yōu)選地，在染料分離之后熒光的増加要盡可能大(對于多種能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)報告了 3-20倍的熒光増加)。當僅使用一種熒光染料時，應該選擇具有最高的熒光強度的染料(通常具有寬發(fā)射譜)。如果設計攜帯相同的熒光/猝滅基團的兩個探針用于檢測同一靶標的兩個不同區(qū)域，則可以増加測定的靈敏性。或者，可以使用兩個或更多個靶向不同靶標的探針，條件是使用熒光/猝滅染料的不同組合。然而，在使用兩個或更多個熒光染料的情況下，測定的靈敏性可能被削弱，以區(qū)分多種染料的熒光。這可以通過檢測更窄的發(fā)射譜來進行，其中多種染料的熒光將不會重疊。以下段落描述了現(xiàn)有技術(shù)中教導的但用于本發(fā)明的寡核苷酸探針，具有某些限制性，如下文所強調(diào)，這些限制性引起靶核酸的更優(yōu)越的檢測，這是由于信號的擴大和/或背景信號的降低。圖IA例示了第一實施方式，其使用靶標特異性探針10和20，其中成像部分特異于靶標。在圖IA中，(a)和(e)代表的序列特異于靶序列(a)和(e，)。選擇序列(c)和(c’)以提供用于嗜熱限制性酶的限制性位點。嗜熱限制性酶的ー個實例是BsoBI。圖IB例示了由圖IA圖示例示的探針10和20形成的復合物。探針10和20與它們各自的靶序列(a’)和(e’)雜交，反應溫度(THyb)小于偶聯(lián)于靶標21的探針10的熔解溫度(T1J或偶聯(lián)于靶標的探針20的熔解溫度(TmB)。由于THyb大于Tim或TmB至少之一，所以探針10和/或20隨著探針靶標復合物的形成在靶標上循環(huán)依附和脫離，并且探針10或20中的至少ー個被切割，引起探針從靶標21或靶標/探針復合物變性。在一些實施方式中，這種探針循環(huán)通過溫度循環(huán)實現(xiàn)和/或伴隨溫度循環(huán)。這種探針循環(huán)通過允許更多的探針與靶標結(jié)合而促進信號的擴大。技術(shù)人員知曉熔解/雜交溫度是序列長度和組成的函數(shù)。技術(shù)人員可以選擇適合于在給定的Thyb使用的序列長度和序列組成。在該實施方式中，復合物的三個雜交部分的熔解溫育與雜交溫度之間的熱力學關(guān)系是TmC<[TmA或TmB]〈THyb (其中Tmc是探針10和20的區(qū)域(b C d)和(b，C，d’)之間形成的雜交體的熔解溫度)。該關(guān)系阻止了在不存在靶標核酸序列的情況下在溶液中形成探針10 :探針20的復合物。在優(yōu)選實施方式中,選擇序列以提供具有堿基堆積(base stacking)的復合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉堿基堆積促成圖IB中例示的復合物的穩(wěn)定性的方式。(a)和(e)與它們各自的靶標的雜交使得互補區(qū)域(b)和(b，)，(c)和(C，)以及(d)和(d’)靠近，増加了它們的局部濃度，從而發(fā)生雜交以形成三重復合物其具有雙鏈限制性位點60。然后，該新形成的限制性位點60被適當?shù)拿?例如BsoBl)切割以從猝滅劑80分離熒光團70，這會以靶標依賴性方式產(chǎn)生熒光。在優(yōu)選實施方式中，(a) : (a’)或(e) : (e，)的熔解溫度！ 高于(b，c, d) : (b’，c’，d’)的熔解溫度。反應在升高的溫度THyb進行，以阻止(b, c, d) : (b’，c’，d’)雙鏈體的靶標非依賴性形成。在該實施方式中，限制性酶也是嗜熱的以確保在反應過程中維持酶活性。 雜交區(qū)域(a) : (a’ )和(e) : (e’ )中的配對堿基的堆積也可以增強三重探針革巴標復合物的穩(wěn)定性。配對堿基的堆積描述于Lane, M, et al, "The thermodynamicadvantage of DNA oligonucleotide' stacking hybridization' reactions:energetics of a DNA nick,〃 Nucleic Acids Research Vol. 25, No. 3(1997);Yakovchuk etal.,^Base-stacking and base-pairing contributes into thermal stability of theDNA double helix,〃 Nucleic Acids Research, Vol. 34, pp. 564-574(2006);Zhu, L. ,et al, "Development of a base stacking hybridization-based microarray methodfor rapid identification of clinical isolates,〃 Diagnostic Microbiology 和Infectious Disease, Vol. 59, pp. 149-156 (2007)，這些文獻全部通過引用方式并入本文?？蛇x地，在多重反應中，區(qū)域(b-d)和(b’-d’)的序列特異于每個探針對以減少多重反應中多組探針之間的探針10和20的靶標非依賴性雜交的潛在可能。探針20和標記的探針10之一或二者可以配置為具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其將防止兩個探針進行靶標非依賴性雜交。然而，鑒于通過該實施方式可以實現(xiàn)的信號擴大的緩慢動力學(如下文更詳細地討論)，配置探針使其具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)將更加限制其應用。
圖IA-B例示的實施方式的一個缺點是探針10和20在靶標上依附和脫離的速率。在該實施方式中，熒光的積累依賴于切割的探針從靶標的分離以及探針10和20與靶標雜交以形成另外的復合物。將該實施方式與鏈置換擴增(SDA)進行比較，在SDA 中，加倍時間是大約 30 秒(見 Spargo, et al. , "detection of M. tuberculosisDNA using thermophilic strand displacement amplification, " MoI. CellularProbes, Vol. 10, pp. 247-256 (1996))，并且在基于實時熒光的系統(tǒng)中擴增的靶標的檢測需要累積大約IO8個切割的探針分子。因此，從IO3個靶標分子的輸入水平，需要IO5倍的擴增(假設每個拷貝的靶標都產(chǎn)生I個探針分子的切割)，大約log IO5循環(huán)(加倍)除以log2或大約16. 6x 30秒=8. 5分鐘。與此相反，在圖IA-B例示的實施方式中，假設循環(huán)時間是大約3秒(即，SDA的1/10)，則從IO3個拷貝的靶標產(chǎn)生IO8個切割的探針所需的時間為IO8+IO3X 3秒=300，000秒=83. 3小時，這對于多數(shù)應用是不可接受的時間長度。在優(yōu)選的實施方式中，次級的、自我持續(xù)的探針切割方式增加了切割的探針的積累速率。這些實施方式提供了激發(fā)探針切割的機制。在這些實施方式中，靶標被連續(xù)回收再利用，并且在一些實施方式中，一個或多個探針被連續(xù)回收再利用。在一些實施方式中，回收的組分誘導另外的探針切割輪次，無需另外的分析物特異性雜交事件。在圖2A-2C中例示了自我持續(xù)的探針切割。在該實施方式中有3個探針探針10、探針20和探針22。探針10具有第一序列(a)，其為靶核酸上的序列(a’)的互補物。探針10還具有序列(b, c和d)，其將與探針20上的序列b’，C，和d’雜交。在圖2A中，探針10或探針20上都不提供報告分子(如圖IA和IB中例示的熒光團70和猝滅劑80)。相反，探針20上提供序列(e’)，其將與非特異性標記的報告探針22上的互補序列(e)雜交。圖2A-C例示了被修飾以包含具有兩個BsoBI限制性位點的5’尾巴的探針20，所述限制性位點之一是硫代的以防止被切割。為了使探針10和20與它們的互補序列((b, c, d) : (b’，c’，d’))的靶標非依賴性雜交最小化，在高溫度THyb進行反應，其等于或高于靶標特異性探針區(qū)域(a)和(g’)的熔解溫度Tm。探針10中的(a)與探針20中的(g’)與靶標中的它們的互補靶序列(a’和g)的雜交使探針10的區(qū)域(b，c, d)和探針20的(b’，c’，d’)靠近，這繼而導致它們的雜交并形成雙鏈限制性位點60。該限制性位點60被BsoBI酶切割以從探針20釋放單鏈片段23 (d’，e’，f ’)，其在探針10中不具有互補物。探針20的片段23 (d’，e’，f ’)互補于標記的報告探針22的序列(d，e, f)。片段(d’，e’，f’)與報告探針22的雜交引起形成半硫代的BsoBI限制性位點90，如圖2B所示。該雙鏈體的未經(jīng)修飾(標記)的鏈被BsoBI酶產(chǎn)生缺口，以產(chǎn)生片段24 (d)和25 (e, f)，如圖2C所示，它們從它們的互補序列分離，從而使熒光團70與猝滅劑80分離并以靶標依賴性方式產(chǎn)生熒光。該實施方式的重要方面是硫代的DNA鏈(f’，d’，e’)進行另外的探針雜交輪次和單鏈產(chǎn)生缺口的能力，從而引起熒光的累積，這與進一步的分析物特異性探針雜交無關(guān)。對于多重應用(其中檢測多于一種靶標分析物)，報告探針22可以包含互補于多個分析物特異性探針20序列的5’尾巴的通用序列。即，多個不同的靶標特異性探 針20將在它們的5’尾巴具有相同的序列(f'，e’，d’)。雖然圖2A-2C中描述的機制可用作學究式的工具以描述本發(fā)明的概念，但是該機制提供了靶標非依賴性信號的可能性，這是由于在不存在互補于區(qū)域(a)和(g’)的序列的情況下(即不存在靶標)溶液中的(b，c, d)與(b’，c’，d’)的雜交。一旦形成該復合物，限制性位點60被切割，這會產(chǎn)生片段(d’，e’，f’)，與靶標的存在無關(guān)；產(chǎn)生假陽性。第二種實施方式減少了靶標非依賴性信號的潛在可能并在圖3A-D中例示。在該實施方式中，探針20被配置為具有穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)100。當兩個探針在溶液中游離時，發(fā)夾100阻斷與探針10的3’尾巴的雜交。注意發(fā)夾結(jié)構(gòu)具有兩個RERS序列60和90。由于這些RERS序列至少部分位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)內(nèi)，并優(yōu)選配置為針對同一限制性核酸內(nèi)切酶的簡并識別序列，所以它們不形成易于被限制性酶切割的雙鏈限制性位點。當兩個探針10、20通過它們各自的區(qū)域(a)和(g’)與它們各自的靶序列(a’)和(g)雜交而在一起時，條件為使得所述雙鏈發(fā)夾變性。見圖3B，當探針10和20與特異性靶標雜交時，探針10和20的兩個互補尾巴序列(分別為序列13，(3，(1和序列13’，(3’，(1’)的局部濃度足夠高，使得發(fā)生(b, c, d) : (b’，c’，d’)的分子間雜交。注意在圖3A例示的配置中，探針10和20 二者都具有序列b。序列b的互補物是探針22中的(b’)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)100使探針20 (在溶液中游離并且不與靶標雜交)不與通用的標記的報告探針22結(jié)合。探針10和探針22具有各自的互補序列(b，c，d和b’，c’，d’)，但是被配置為當都在溶液中游離時，不雜交。在替代性實施方式中，探針10也具有發(fā)夾。一旦探針10和20由于與靶標結(jié)合而靠近，則探針10中的(b，c, d)與探針20中的(b’，c’，d’)發(fā)生雜交。這例示于圖3B。雜交產(chǎn)生雙鏈識別位點60，其被限制性酶(BsoBl)切割以產(chǎn)生片段23 (d’，e’，b)，該片段互補于標記的報告探針22中的(b’，e)。探針20的片段23 (d’，e’，b)與探針22的雜交產(chǎn)生雙鏈的半硫代的限制性位點90，其被限制性酶在對應于探針22的鏈上產(chǎn)生缺口。見圖3D，一個具有缺口的片段110具有序列(b’)和猝滅劑部分80。猝滅劑部分80的一個實例是Dabcyl。然而，這僅是一個實例，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉之前說明的很多合適的猝滅劑部分。報告探針22的另一個有缺口的片段120攜帶熒光部分70 (例如熒光團)。報告探針22的有缺口的片段110、120從探針20的它們的互補片段23 (b，e’，d’)的分離以及彼此的分離導致產(chǎn)生熒光和再生單鏈探針B片段23(b，e’，d')。然后，DNA的經(jīng)保護的(例如硫代的)單鏈片段23經(jīng)歷進一步的自我再生探針雜交和單鏈切割輪次，產(chǎn)生突光信號的積累(和擴大)。見圖4A-4D，未經(jīng)標記的發(fā)夾探針200用作產(chǎn)生靶標特異性熒光的中間體。探針200具有第一序列(b’ -i’)，其是靶序列201的部分的互補物(b-i)。探針200具有第二序列(a_c ’)，其具有部分(d-e)，該部分是限制性位點205的單鏈硫代部分。注意第一寡核苷酸探針200的第一序列的一部分(b’-i’)和所有的第二序列(a-c’)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。由于發(fā)夾包括與靶標結(jié)合序列結(jié)合的探針200序列的一部分，所以探針200與靶標201的雜交引起探針200的發(fā)夾變性(即變?yōu)槲措s交的)。單鏈的硫代的限制性位點不被限制性核酸內(nèi)切酶消化(即產(chǎn)生缺口)。探針200與互補性靶標雜交并形成熱力學上更穩(wěn)定的異雙鏈復合物210。見圖4B，復合物210與發(fā)夾探針230雜交。發(fā)夾探針230具有第一序列(a’ -f')，其與復合物210的序列(a-f)雜交。探針230具有第二序列(b-e’)，其與第三寡核苷酸探針260上的第一序列(b’-e)互補并雜交(圖4D)。所有的第一序列和部分的第二序列形成第二寡核苷酸探針230上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(b-b’)。探針230的第一序列(a’ -f,)的部分255 (d’，e’)與探針200的第二序列(c’ -a)的部分205 (d，e)在復合物240中形成限制性位點。探針230的第二序列(b-e’)的部分250 (d-e)與探針序列260的第一序列(b’ -e)的部分262 (d’ _e’)形成半硫代限制性位點(圖4D)。探針230的雜交形成熱力學上有利的三重結(jié)構(gòu)240 (探針230:探針200:靶標201)。探針230具有經(jīng)保護的(例如硫代的)限制性位點250和未經(jīng)保護的(例如非硫代的)限制性位點255。見圖4C，限制性位點的未經(jīng)保護的鏈255的缺口導致形成從探針200 分離的亞片段242 (d，-a’)和244 (b_e，)。片段244(b_e’)互補于標記的發(fā)夾報告探針的第一序列(b’ _e)，如圖4D所示。由于它們的互補序列的長度，244與探針260的雜交相對于維持探針260的發(fā)夾結(jié)構(gòu)而言在熱力學上是有利的。因此，探針260的分子內(nèi)堿基配對被破壞，這導致形成復合物270 (探針260:亞片段244)。探針260還具有信號部分264 (例如熒光團)和猝滅部分266。探針260中的分子內(nèi)堿基配對的破壞使信號部分264從猝滅部分266分離，并導致信號增加。然后，未經(jīng)保護的限制性位點262 (d’ -e’)被限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生缺口，這進一步使熒光團264與猝滅劑266分離，這導致熒光的進一步增加。片段244(b-e’)從探針260的切割的部分變性，并且自由結(jié)合另一個探針260，其中重復下列循環(huán)i)雜交以形成復合物270 ；ii)半硫代的雙鏈限制性位點的未經(jīng)保護的鏈(d’ -e’)的切割；和探針230從片段244的釋放。圖5是用于圖4A-D所示的實施方式中使用的探針200、230和260的具體SEQ ID的一個實施方式。探針200是58-mer，特異于HPV 16靶標。探針200見SEQ ID NO: I。HPV16靶標見SEQ ID N0:2。HPV-16的靶序列示于圖7A。HPV 16序列(以粗斜體著重顯示)互補于探針200的3’末端的27個核苷酸并與之雜交(圖5 ；SEQ ID NO: I)?？紤]到探針200也將與HPV-58靶標雜交。HPV-58靶標示于圖7B。圖7B中的SEQID N0:3。HPV-58序列中的著重顯示的序列包含與200 (圖5)具有互補性的區(qū)域(通過大寫字母核苷酸標示)，其中散布著5個錯配的核苷酸(以小寫字母標示)。基于3-態(tài)平衡模型(Bonnet et al Proc. Natl. Acad. Sci. 96:6171-6176 (1999))的計算(其考慮到在形成P1靶標復合物過程中解折疊200發(fā)夾消耗的自由能)表明在通常的反應溫度Γ50° C)與200雜交的匹配的靶標(HPV-16)的分數(shù)將是雜交的錯配靶標(HPV-58)的分數(shù)的大約10，OOO倍。因此，該模型預測相對于匹配的(HPV-16)靶標，錯配的(HPV-58)靶標的信號低得多。探針200中的核苷酸1-18互補于探針200中的核苷酸31_48，并形成探針200中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。探針200中的硫代的RERS序列205是核苷酸19-24，序列為ctcggg，其是易于被BsoBI切割的序列之一。然而，由于其化學修飾，當其與探針230中的255形成雙鏈限制性位點時，RERS序列205不被切割。如上所述，當探針200被置于靠近靶序列時，熱力學平衡有利于發(fā)夾的變性，這會促進探針200與靶序列形成復合物。探針200具有等于大約-13. 086kcal/mole的dG值。本文報告的dG值是根據(jù)Markham, N. R.，和Zuker, M.，"DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction,〃 Nucl.Acid Res. Vol. 33, pp. w577-w581 (2005), Markham, N. R. &Zuker, M. "UNAFold: softwarefor nucleic acid folding and hybridization, Bioinformatics,^Vol. II: Structure, Functions 和 Applications, No. 453 (Keith, J. M.，ed.，2008);Methods inMolecular Biology, Ch. I, pp. 3-31 (Humana Press, Totowa, NJ 2008)計算的。該值是探針的次級結(jié)構(gòu)的自由能，并表示給定條件組(鹽濃度、溫度、DNA濃度等)下的發(fā)夾的相對穩(wěn)定性。該值越高(更負性)，變性發(fā)夾所需的能量越大。技術(shù)人員知曉在設計探針時(特別是等溫過程)考慮的很多因素。具體地，限制性核酸內(nèi)切酶具有確定的其具有最佳活性的溫度范圍。因此，基于等溫過程的溫度選擇限制性核酸內(nèi)切酶。同樣，探針穩(wěn)定性與溫度相關(guān)。相對于較短的探針(即具有較少的互補核苷酸的探針)，較長的探針(即具有更多的與靶序列的互補核苷酸的探針)將在較高的溫度雜交。探針組成(即構(gòu)成序列的特定核苷酸)將影響探針的熔解溫度和雜交溫度。很多其它因素也影響探針設計，這些因素是技術(shù)人員熟知的。在圖5所示的實施方式中，等溫過程的溫度是大約55° C至大約60° C。探針230是45-mer，如SEQ ID NO: 4所示。在探針230中，核苷酸17_45是互補的并特異于探針200的核苷酸2-30。核苷酸1-14和25-37構(gòu)成探針230的發(fā)夾。探針230的核苷酸10-15是保護的RERS序列250，核苷酸23-28是未經(jīng)保護的RERS序列255。未經(jīng)保護的限制性位點255是探針200上的經(jīng)保護的限制性位點205的互補物。如之前所述，RERS序列250是RERS序列255的簡并序列。如上所述，當探針230被置于靠近復合物210 (探針200:靶序列201)時，熱力學平衡有利于發(fā)夾的變性，有利于形成復合物240與復合物210。在此，探針230的dG值是-10. 79kcal/mole。探針260(無信號和猝滅部分)的核苷酸序列是40-mer，見SEQ IDN0:5。核苷酸1-17互補于探針230上的片段244的核苷酸7_23并與其結(jié)合(在探針230被限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生缺口以形成從復合物240變性的片段242和244之后)。探針260具有-12. 059kcal/mole的dG值。熱力學為探針260與來自探針230的片段244的靠近引起探針260的發(fā)夾(由核苷酸11-24及其互補序列核苷酸28-40形成)變性，使發(fā)夾解折疊。探針260在核苷酸9-14具有未經(jīng)保護的RERS序列262。其與片段244的硫代的RERS序列250 (核苷酸10-15)互補并對齊。得到的雙鏈限制性位點被限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生缺口，產(chǎn)生探針260的兩個片段。第一片段為核苷酸1-9,具有信號部分264 (例如突光團)。第二片段是核苷酸10-40，具有猝滅劑部分266。圖6例示了另一個實施方式，其中封閉探針用于增強探針雜交的特異性。封閉探針320與探針300競爭與靶序列310的一部分的雜交。封閉探針320被探針300的置換取決于競爭性雜交體序列(a，b) : (a’，b’)和(b，c) : (b’，c’ )的相對熱力學穩(wěn)定性。為了使特異性最大化，將探針300設計為只有靶標310中的序列(b，c)和(b’，c’)之間的完美互補才導致封閉探針320的置換。此類封閉技術(shù)的原理適用于本文描述的所有實施方式。使用封閉探針320所提供的一個優(yōu)點是，在用于檢測單核苷酸多態(tài)性的實施方式中(其中完美匹配與錯配的靶序列之間的探針Tm的差異小)。此類封閉探針可以被設計為與靶序列部分互補，如圖6所示，或者與一個或多個靶標特異性探針部分互補。在后者的情況下，探針與其特異性靶標的雜交相對于探針與封閉寡核苷酸的雜交在熱力學上是有利的，從而促進在存在靶標特異性探針的情況下，封閉探針從靶標的置換。
一般地，如本文使用的命名法是分子、生物化學、微生物學和重組DNA技術(shù)中常規(guī)使用的。此類技術(shù)在文獻中有詳細的解釋。見，例如"Molecular Cloning:Alaboratory Manual" Sandbrook et al.，(1989);"Current Protocols in MolecularBiology" Volumes I-III Ausubel, R. M. , et ed. (1994);Cell Biology:A LaboratoryHandbook^Volumes I-III Cellis, J. E. , ed. (1994);"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J. E. , ed. (1994) ; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J. , ed. (1984) ; "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D.,和 Higgins S. J. , eds.(1985);"Transcription and Translation" Hames, B. D. , and Higgins S.J.,eds.(1984);"Animal Cell Culture" Freshney, R. I.，ed. (1986);"Immobilized Cellsand Enzymes" IRL Press, (1986);〃A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal, B. , (1984)and "Methods in Enzymology^ Vol. l-317Academic Press。雖然已經(jīng)通過具體實施方式
描述了本發(fā)明，但是明顯的是，很多替代、修飾和變異對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，意在包括落在隨附的權(quán)利要求的精神和寬范圍內(nèi)的所有此類替代、修飾和變異。本說明書中提及的所有公開物、專利和專利申請都通過引用方式全文并入本說明書，達到如同各篇公開物、專利或?qū)＠暾埗继貏e且單獨地被指明通過引用方式并入本文一樣的程度。另外，本申請中引用或提及任何參考文獻都不應被解釋為承認此類文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。序列表<110>BECT0N DICKINSON<120>使用探針雜交和限制性通過信號擴大而檢測靶核酸的方法<130>Becton 329〈160〉序列個數(shù)5<170>PatentIn version 3. 5<210>SEQ ID NO I〈211〉長度58〈212〉類型DNA〈213〉來源人工序列〈223〉合成的探針〈400〉序列Iccaaaattcc agtcctctct cgggtttttt agaggactgg aattttggtc tacaacct
<210>SEQ ID NO 2〈211〉長度50〈212〉類型DNA〈213〉來源人乳頭瘤病毒；類型16〈400〉序列2GTGTGCCTCC TGGGGGAGGT TGTAGACCAA AATTCCAGTC CTCCAAAATA<210>SEQ ID NO 3〈211〉長度50〈212〉類型DNA〈213〉來源人乳頭瘤病毒；類型58〈220〉〈400〉序列3AACTGGCAGA CGGAGGAGGT gtTAaACCAA AtTgCCAGTC CTCCAAAATA<210>SEQ ID NO 4〈211〉長度45〈212〉類型DNA〈213〉來源人工序列〈220〉〈223〉合成的探針〈400〉序列4cactcctctc tcgagaaaaa aacccgagag aggagtggaa ttttg<210>SEQ ID NO 5〈211>長度40〈212〉類型DNA
〈213〉來源人工序列〈220〉〈223〉合成的探針〈400〉序列5gtttttttct cgagagagga ctgttttcag tcctctctcg
權(quán)利要求
1.檢測樣品中靶核酸的存在或不存在的方法，包括 a)制備懷疑含有靶核酸的樣品； b)制備反應混合物，所述反應混合物包含樣品，第一和第二寡核苷酸探針，和序列特異性核酸內(nèi)切酶，其中所述第一和第二寡核苷酸探針各自包含第一序列和第二序列，其中第一和第二寡核苷酸探針的第一序列與靶核酸的非重疊序列互補，并且其中第一和第二寡核苷酸探針各自的第二序列彼此互補，由此形成雙鏈限制性位點，所述限制性位點被序列特異性核酸內(nèi)切酶識別，并且其中第一和第二寡核苷酸探針中的至少一個包含位于所述限制性位點的一側(cè)的可檢測標記物和位于所述限制性位點另一側(cè)的猝滅部分，由此允許第一和第二寡核苷酸探針的第一序列與靶核酸的非重疊序列選擇性雜交，并且第一和第二寡核苷酸探針的第二序列彼此選擇性雜交，從而形成雙鏈限制性位點，從而使得如果樣品中存在靶核酸，則序列特異性核酸內(nèi)切酶在該限制性位點切割雙鏈體，允許檢測所述標記物，并使寡核苷酸探針的其余部分從靶生物的核酸變性，以及從彼此變性。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述序列特異性核酸內(nèi)切酶是選自BsoBI，HincII，AvaI, Nci I 和 Fnu 4H 的酶。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述序列特異性核酸內(nèi)切酶是BsoBI。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述反應混合物經(jīng)歷熱循環(huán)以使切割的寡核苷酸從靶核酸變性。
5.權(quán)利要求4的方法，其中參考熔解曲線選擇熱循環(huán)溫度。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述反應混合物維持在大于下列溫度的雜交溫度i)偶聯(lián)于靶核酸的第一寡核苷酸探針的熔解溫度；ii)偶聯(lián)于靶核酸的第二寡核苷酸探針的熔解溫度；和iii)第一寡核苷酸探針與第二寡核苷酸探針形成的雜交體的熔解溫度。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述可檢測標記物是熒光團。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述熒光團是夾氧雜蒽染料。
9.權(quán)利要求7的方法，其中猝滅劑是若丹明染料。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述反應混合物還包含封閉探針。
11.檢測樣品中靶核酸的存在或不存在的方法，包括 a)制備懷疑含有靶核酸的樣品； b)制備反應混合物，所述反應混合物包含樣品，第一、第二和第三寡核苷酸探針，和序列特異性核酸內(nèi)切酶，其中所述第一和第二寡核苷酸探針各自包含第一序列和第二序列，其中第一和第二寡核苷酸探針的第一序列與靶核酸的非重疊序列互補，并且其中第一和第二寡核苷酸探針各自的第二序列彼此互補，由此形成雙鏈限制性位點，并且其中第一和第二寡核苷酸探針是未標記的，并且所述第二寡核苷酸探針還包含第三序列，所述第三序列的至少一部分與第二寡核苷酸探針的第二序列形成發(fā)夾，其防止當?shù)谝缓偷诙押塑账崽结槻慌c靶核酸結(jié)合時第二寡核苷酸探針與第一寡核苷酸探針雜交，其中所述第三序列的一部分與第三寡核苷酸探針雜交以形成雙鏈限制性位點；其中第三寡核苷酸探針為非靶標特異性寡核苷酸探針，其包含位于第一序列的一側(cè)的可檢測標記物，所述第一序列與第二寡核苷酸探針的第三序列雜交以形成雙鏈限制性位點；和位于第三寡核苷酸探針的第一序列的另一側(cè)的猝滅部分； 如果靶核酸存在于樣品中，則第一和第二寡核苷酸探針的第一序列與靶核酸的非重疊序列選擇性雜交； 由此允許發(fā)夾環(huán)的變性以及第一和第二寡核苷酸探針的第二序列之間發(fā)生雜交，之前在限制性位點處形成的雙鏈體被序列特異性核酸內(nèi)切酶切割，以及第三序列從第二寡核苷酸探針分離，以及第一和第二寡核苷酸探針從靶核酸分離，以及多個下列循環(huán)i)第二寡核苷酸探針的第三序列與第三寡核苷酸探針雜交，由此形成化學修飾的雙鏈限制性位點，ii)通過序列特異性限制性核酸內(nèi)切酶使該化學修飾的雙鏈限制性位點的單鏈產(chǎn)生缺口，iii)從猝滅劑釋放標記物，和iv)第三寡核苷酸探針從第二寡核苷酸探針的第三序列分離；和 檢測從標記物產(chǎn)生的信號，其指示樣品中靶核酸的存在或不存在。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述序列特異性核酸內(nèi)切酶是選自BsoBI，HincII，AvaI, Nci I 和 Fnu 4H 的酶。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述序列特異性核酸內(nèi)切酶是BsoBI。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述反應混合物經(jīng)歷熱循環(huán)以使切割的寡核苷酸從靶核酸變性。
15.權(quán)利要求14的方法，其中參考熔解曲線選擇熱循環(huán)溫度。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述反應混合物維持在大于下列溫度的雜交溫度i)偶聯(lián)于靶核酸的第一寡核苷酸探針的熔解溫度；ii)偶聯(lián)于靶核酸的第二寡核苷酸探針的熔解溫度；和iii)第一寡核苷酸探針與第二寡核苷酸探針形成的雜交體的熔解溫度。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述可檢測標記物是熒光團。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述熒光團是夾氧雜蒽染料。
19.權(quán)利要求17的方法，其中猝滅劑是若丹明染料。
20.權(quán)利要求10的方法，其中所述化學修飾的反應位點是半修飾的。
21.權(quán)利要求10的方法，其中所述反應混合物還包含封閉探針。
22.檢測樣品中靶核酸的存在或不存在的方法，包括 a)制備懷疑含有靶核酸的樣品； b)制備反應混合物，所述反應混合物包含 i)樣品； ii)具有第一序列和第二序列的第一寡核苷酸探針、具有第一序列和第二序列的第二寡核苷酸探針，和具有第一序列和第二序列的第三寡核苷酸探針；和 iii)序列特異性核酸內(nèi)切酶；其中 第一寡核苷酸探針具有與靶核酸序列互補的第一序列和與第二寡核苷酸探針的第一序列互補的第二序列，其中第二序列的第一部分是限制性位點的單鏈化學修飾部分，其中第一寡核苷酸探針的第一序列的一部分和第二序列形成次級結(jié)構(gòu)； 第二寡核苷酸探針是不直接與靶標雜交的探針，其中第二探針的第一序列的一部分與第一探針的第二序列的單鏈化學修飾部分互補，第二寡核苷酸探針的第二序列與第三寡核苷酸探針的第一序列互補，其中第二探針的第二序列的一部分是限制性位點的單鏈化學修飾部分，第二寡核苷酸探針的第一序列和第二序列部分重疊，并且其中第二寡核苷酸探針的第一序列的至少一部分和第二序列形成次級結(jié)構(gòu)； 第三寡核苷酸探針是不與靶標直接雜交的探針，其中第一序列包括與第二寡核苷酸探針的限制性位點的單鏈化學修飾部分互補的部分，并進一步包括位于其上的可檢測標記物或猝滅劑部分，并且第二序列與第一序列的一部分形成發(fā)夾環(huán)，并具有位于其上的可檢測標記物或猝滅劑部分，從而，由于它們在第三寡核苷酸探針上的相對位置，猝滅劑部分阻斷來自可檢測標記物的信號； 并且，如果靶核酸存在于樣品中，則靶核酸與第一寡核苷酸探針的第一序列選擇性雜交以形成第一復合物，在多個循環(huán)中，i)允許第一寡核苷酸探針的第二序列的至少一部分與第二寡核苷酸探針的第一序列選擇性雜交以形成第二復合物；ii)切割雙鏈限制性位點的單鏈部分，所述雙鏈限制性位點是通過形成雙鏈限制性位點的化學修飾單鏈的第一寡核苷酸探針的第二序列的部分與第二探針上的互補性序列雜交而形成的，從而從第二寡核苷酸探針的第一序列的非重疊部分分離第二寡核苷酸探針的第二序列；和iii)第二寡核苷酸探針從第一復合物分離； 并且，在多個循環(huán)中，i)允許第二寡核苷酸探針的第二序列與第三寡核苷酸探針的第一序列選擇性雜交，以形成第三復合物，從而從猝滅劑分離標記物并釋放信號，ii)切割雙鏈限制性位點的單鏈，所述雙鏈限制性位點是通過第二寡核苷酸探針的第二序列的部分與第三寡核苷酸探針的第一序列上的互補序列的雜交而形成的，iii)從猝滅劑釋放標記物，和iv)使第二寡核苷酸探針的第二序列從第三寡核苷酸探針分離； 和檢測從標記物產(chǎn)生的信號，其表示樣品中靶核酸的存在。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述次級結(jié)構(gòu)是發(fā)夾。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述序列特異性核酸內(nèi)切酶是選自BsoBI，HincII1AvaI,Nci I 和 Fnu 4H 的酶。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述序列特異性核酸內(nèi)切酶是BsoBI。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述可檢測標記物是熒光團。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述熒光團是夾氧雜蒽染料。
28.權(quán)利要求26的方法，其中猝滅劑是若丹明染料。
29.權(quán)利要求22的方法，其中所述核酸靶序列是人乳頭瘤病毒核酸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述人乳頭瘤病毒核酸選自人乳頭瘤病毒類型16和人乳頭瘤病毒類型58。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述靶核酸選自SEQID N0:2和SEQ ID N0:3。
32.權(quán)利要求22的方法，其中所述第一寡核苷酸探針是SEQIDN0:1，所述第二寡核苷酸探針是SEQ ID NO:2，并且所述第三寡核苷酸探針是SEQ ID N0:3。
33.權(quán)利要求22的方法，其中所述化學修飾的限制性位點是半修飾的。
34.權(quán)利要求22的方法，其中所述反應混合物還包含封閉探針。
全文摘要
用于檢測樣品中的核酸的寡核苷酸，其通過重復利用探針和探針片段而提供擴大的信號。
文檔編號G01N33/52GK102686747SQ201080060646
公開日2012年9月19日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者J·納德烏, T·赫雷爾 申請人:貝克頓·迪金森公司