專利名稱：用于制備抗壞血酸、2－酮－l－古洛糖酸及2－酮－l－古洛糖酸酯的酶促方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備抗壞血酸、2-酮(keto)-L-古洛糖酸(KLG)和KLG的酯的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及酶催化劑在制備抗壞血酸、KLG或KLG的酯中的用途。
背景技術(shù)：
抗壞血酸、又名維生素C是一種必須存在于人類飲食中以預(yù)防壞血病并且已經(jīng)鑒定為可以提高對傳染的抗性的試劑的飲食因子。在商業(yè)方面，抗壞血酸例如用作營養(yǎng)添加物、固色劑、肉類和其它食品中的調(diào)味劑和防腐劑、面包生面團(tuán)中的氧化劑、收獲中的柑橘類水果的切除(abscission)以及分析化學(xué)中的還原劑。
一種用于制備抗壞血酸的通用方法使用了原始Reichstein-Grossner合成的改進(jìn)方法(Reichstein等，Helv.Chim.Acta,17:311(1934)；Reichstein的美國專利2,301,811；本文中所引用的所有文獻(xiàn)逐一插入本文僅供參考)。在該方法中把葡萄糖源轉(zhuǎn)化成抗壞血酸。在轉(zhuǎn)化過程中生成了KLG的雙丙酮化合物的中間體。
有幾種兩階段方法用于制備抗壞血酸。在第一階段中，通過發(fā)酵方法將葡萄糖或者轉(zhuǎn)化為分離了的KLG的中間體(Sonoyama等，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)，43:1064-1069(1982)；Anderson等，科學(xué)，230:144-149(1985)；Shinjoh等，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)，61:413-420(1995))或者轉(zhuǎn)化為Reichstein-Grossner合成的中間體、即KLG的雙丙酮化合物。
把上述兩種中間體之一轉(zhuǎn)化為抗壞血酸的第二階段是通過兩條已經(jīng)報道的路線中的一條路線進(jìn)行的。第一條路線、即Reichstein-Grossner合成的后繼步驟的改進(jìn)需要多個步驟，由此在強酸條件下使中間體與甲醇發(fā)生酯化以生成甲基-2-酮-L-古洛糖酸(MeKLG)。然后使MeKLG與堿反應(yīng)以生成金屬抗壞血酸鹽。最后，用酸化劑處理金屬抗壞血酸鹽以得到抗壞血酸。第二條路線為一步法，該方法包括如最初在Reichstein的英國專利466548中公開、隨后由Yamazaki改進(jìn)(Yamazaki，日本農(nóng)業(yè)化學(xué)協(xié)會雜志，28:890-894(1954)與化學(xué)文摘，50:5992d)并且再由Yodice改進(jìn)(WO87/00839)的酸催化KLG的成環(huán)。Yodice的方法在商業(yè)上不受歡迎，因為它使用了大量的氣態(tài)氯化氫、需要非常昂貴的加工設(shè)備并且生產(chǎn)出需要進(jìn)一步純化的抗壞血酸產(chǎn)品。
脂肪酶、即一組水解酶已經(jīng)成功地用于一些有機酸酯的合成中。具體說來，脂肪酶已經(jīng)用于其中的酯化劑為不可逆的醇的酯基轉(zhuǎn)移作用，比如當(dāng)醋酸乙烯酯用作酯化劑時(Ihiel，今日催化，517-536(1994))。Gutman等(四面體通訊，28:3861-3864(1987))描述了一種使用豬胰脂肪酶作為催化劑由γ-羥甲基酯制備簡單的5-元環(huán)內(nèi)酯的方法。但是，Gutman等(四面體通訊，28:5367-5368(1987))隨后報道了用δ-羥甲基酯代替γ-羥甲基酯并且使用同樣的催化劑僅生產(chǎn)出聚合物。在Sakashita等的EP0 515 694 A1中，抗壞血酸酯的合成(在伯羥基上進(jìn)行?；?包括在有脂肪酶存在的條件下在極性有機溶劑中使抗壞血酸與多種脂肪酸的活性酯(即脂肪酸乙烯酯)反應(yīng)。
因此，在現(xiàn)有技術(shù)中需要有生產(chǎn)下列物質(zhì)的方法(a)由KLG或KLG的酯生產(chǎn)抗壞血酸或其金屬鹽，(b)由KLG的酯生產(chǎn)KLG和(c)由KLG生產(chǎn)KLG的酯，所述方法具有高產(chǎn)率和高純度、極少或者沒有副產(chǎn)物產(chǎn)生并且在溫和的條件下進(jìn)行。因此，本發(fā)明主要的目的在于提供上述方法。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了在化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中的進(jìn)步，其中用于制備抗壞血酸的方法包括使KLG或KLG的酯與水解酶催化劑接觸。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于生產(chǎn)KLG的方法包括在水溶液中使KLG的酯與水解酶催化劑接觸。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，用于由KLG生產(chǎn)KLG酯的方法包括使KLG的醇溶液與水解酶催化劑接觸。醇溶液含有與將要制得的KLG酯的烷基部分相對應(yīng)的醇。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，用于由KLG的酯生產(chǎn)KLG的酯的方法包括使第一種KLG酯的醇溶液與水解酶催化劑接觸。該醇溶液含有與將要制得的第二種KLG酯的烷基部分相對應(yīng)的醇。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的在于出乎意料地發(fā)現(xiàn)使用水解酶作為催化劑通過誘導(dǎo)KLG或KLG酯的閉環(huán)，可以由KLG、或者更優(yōu)選地可以由KLG的酯生成抗壞血酸?？梢栽谌刍癄顟B(tài)或者在溶液中進(jìn)行用于生產(chǎn)抗壞血酸的方法。該方法也可以在體內(nèi)或在體外進(jìn)行。對體內(nèi)方法而言，水解酶催化劑可以天然存在于宿主細(xì)胞中或者可以通過重組DNA方法引入到宿主細(xì)胞或者生物體中。
本發(fā)明的目的還在于出乎意料地發(fā)現(xiàn)KLG可以在可逆反應(yīng)中通過在水溶液中使用水解酶作為催化劑使KLG的酯發(fā)生反應(yīng)來制備。此外，本發(fā)明的目的在于出乎意料地發(fā)現(xiàn)KLG的酯可以通過使用水解酶作為催化劑在醇溶液中使KLG或另一種KLG的酯發(fā)生反應(yīng)來制備。用于制備上述溶液的醇對應(yīng)于將要制得的KLG的酯的烷基部分。
在本發(fā)明的方法中用作催化劑的水解酶可以從任何來源適宜的生物體中得到或者分離出來。其中包括的實例有、但卻不限于植物、微生物以及動物，比如酵母、細(xì)菌、霉菌、真菌、鳥類、爬行動物、魚類和哺乳動物。正如在酶命名(學(xué)術(shù)出版社，1992)中規(guī)定的那樣，對本發(fā)明而言的水解酶通常被定義為E.C.3.-.-.-的酶類，并且這些酶可以通過商業(yè)途徑得到。
優(yōu)選的水解酶為那些能夠影響含有羰基或者磷酸基團(tuán)的分子水解的酶。更具體地說，優(yōu)選的水解酶為能夠影響在含有一個雜原子單鍵的羰基碳上發(fā)生水解的酶。這些含有一個雜原子單鍵的羰基碳的實例包括、但卻不限于酯、硫酯、酰胺、酸、?；u及類似物。優(yōu)選的水解酶包括E.C.3.1.-.-的酶類，它包括作用于酯鍵的水解酶、比如酯酶和脂肪酶；E.C.3.2-.-的酶類，它包括糖苷酶；E.C.3.4-.-的酶類，它包括肽的水解酶，比如蛋白酶；以及E.C.3.5.-.-的酶類，它包括作用于除肽鍵以外的鍵的酰胺酶。最優(yōu)選的水解酶包括蛋白酶、酰胺酶、脂肪酶和酯酶。
最優(yōu)選的水解酶含有活性位點的絲氨酸殘基，它能夠與KLG或KLG的酯進(jìn)行酯化或者酯基轉(zhuǎn)移作用。甚至更為優(yōu)選的為那些含有絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的催化三聯(lián)體的水解酶。
優(yōu)選的蛋白酶包括那些來源于芽胞桿菌屬或曲霉屬細(xì)菌的蛋白酶。特別優(yōu)選的蛋白酶為那些從地衣形芽胞桿菌細(xì)菌中得到的蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶為那些與枯草蛋白酶之間至少具有70％的序列同源性的蛋白酶。與枯草蛋白酶具有序列同源性的蛋白酶用于洗滌劑工業(yè)中，因此可以方便地得到。更優(yōu)選的為與枯草蛋白酶之間至少具有80％序列同源性的蛋白酶，甚至更為優(yōu)選的為與枯草蛋白酶之間至少具有90％序列同源性的蛋白酶，特別是與枯草蛋白酶之間至少具有95％序列同源性的蛋白酶。一種非常優(yōu)選的蛋白酶為枯草蛋白酶自身，它具有由Smith等在《生物化學(xué)雜志》243:2184-2191(1968)中所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)并且如下所示MMRKKSFWLGMLTAFMLVFTMAFSDSASAAQPAKNVEKDYIVGFKSGVKTASVKKDIIKESGGKVDKQFRIINAAKAKLDKEALKEVKNDPDVAYVEEDHVAHALAQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGTYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGPSGSTAMKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTSTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ.
為了方便讀者，表1提供了以上以及在本說明書其余部分中使用的氨基酸簡寫形式的一覽表。
表1氨基酸符號 三字母縮寫一字母丙氨酸Ala A精氨酸Arg R天冬酰胺 Asn N天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸Glu E甘氨酸Gly G組氨酸His H異亮氨酸 Ile I亮氨酸Leu L賴氨酸Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸Pro P絲氨酸Ser S蘇氨酸Thr T色氨酸Trp W酪氨酸Tyr Y纈氨酸Val V另外也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的為與以上所示序列的對1至6個位點具有特異性的突變體、序列添加以及序列缺失相對應(yīng)的蛋白酶。甚至更優(yōu)選的為對應(yīng)于以上所示枯草蛋白酶序列的對0至2個位點具有特異性的突變體的蛋白酶。
適用于本發(fā)明的酯酶包括那些由豬肝提取物中得到的酶。優(yōu)選的酯酶為那些與豬肝酯酶之間至少具有70％序列同源性的酯酶，所述的豬肝酯酶具有由Matsushima等在《FEBS Lett.》293:37(1991)中所述的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)并且如下所示MWLLPLVLTSLASSATWAGQPASPPVVDTAQGRVLGKYVSLEGLAFTQPVAVFLGVPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSFVKNTTSYPPMCCQDPVVEQMTSDLFTNFTGKERLTLEFSEDCLYLNIYTPADLTKRGRLPVMVWIHGGGLVLGGAPMYDGVVLAAHENFTVVVVAIQYRLGIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQENIANFGGDPGSVTIFGESFTAGGESVSVLVLSPLAKNLFHRAISESGVALTVALVRKDMKAAAKQIAVLAGCKTTTSAVFTFVHCLRQKSEDELLDLTLKMKFLTLDFHGDQRESHPFLPTVVDGVLLPKMPEEIIAEKDFTFNTVPYIVGINKQEFGWLLPTMMGFPLSEGKLDQKTATSLLWKSYPIANIPEELTPVATFTDKYLGGTDDPVKKKDLFLDLMGDVVFGVPSVTVARQHRDAGAPTYMYEFQYRPSFSSDKFTKPKTVIGDHGDEIFSVFGFPLLKGDAPEEEVSLSKTVMKFWANFARSGNPNGEGLPHWPFTMYDQEEGYLQIGVNTQAAKRLKGEEVAFWNDLLSKEAAKKPPKIKHAEL.
酯酶更優(yōu)選與以上所示的豬肝酯酶的序列之間至少具有80％的序列同源性、甚至更優(yōu)選至少有90％的序列同源性、特別優(yōu)選至少有95％的序列同源性。非常優(yōu)選的為具有以上所示序列的豬肝酯酶。
另外也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的為與以上所示序列的對1至6個位點具有特異性的突變體、序列添加以及序列缺失相對應(yīng)的酯酶。甚至更優(yōu)選的為對應(yīng)于以上所示豬肝酯酶序列的對0至2個位點具有特異性的突變體的酯酶。
優(yōu)選的脂肪酶包括那些從豬和其它哺乳動物、微生物以及植物中分離出來的酶。這包括、但卻不限于從曲霉屬、毛霉菌屬、假絲酵母屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、根霉屬、色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、地霉屬和青霉屬得到的脂肪酶。優(yōu)選的脂肪酶也包括胞外脂肪酶、比如角質(zhì)酶(cutinase)。更優(yōu)選的脂肪酶與南極洲假絲酵母(CandidaAntartica)B型脂肪酶之間至少具有70％的序列同源性、甚至更優(yōu)選至少具有80％的序列同源性、愈加更優(yōu)選至少具有90％的序列同源性、甚至更優(yōu)選至少具有95％的序列同源性。一種非常優(yōu)選的脂肪酶為南極洲假絲酵母B型脂肪酶自身，它具有由Uppenberg等在《結(jié)構(gòu)》2:293,453(1994)中所述的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)并且如下所示MKLLSLTGVAGVLATCVAATPLVKRLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVIAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLPVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP.
另外也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的為與以上所示序列的對1至6個位點具有特異性的突變體、序列添加以及序列缺失相對應(yīng)的脂肪酶。甚至更優(yōu)選的為對應(yīng)于以上所示B型南極洲假絲酵母序列的對0至2個位點具有特異性的突變體的脂肪酶。
優(yōu)選的酰胺酶包括那些從青霉菌屬的細(xì)菌中分離出來的酰胺酶。更優(yōu)選的酰胺酶與青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶之間至少具有80％的序列同源性。特別優(yōu)選的酰胺酶為青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶，它也稱作青霉素酰胺水解酶E.C.3.5.1.11(Duggleby等，自然，373:264-266(1995))。
對于在其活性位點上含有絲氨酸的水解酶來說，人們認(rèn)為在KLG或KLG酯的反應(yīng)中的第一步涉及通過由活性位點絲氨酸的KLG的酰化形成了KLG-酶酯。人們認(rèn)為分子內(nèi)的閉環(huán)生成了抗壞血酸(或其鹽)，而醇解則生成了KLG的酯、水解則生成了KLG。
本發(fā)明的方法包括將KLG或者KLG的酯與水解酶接觸以生成抗壞血酸。優(yōu)選地，該反應(yīng)是在有機溶劑系統(tǒng)、水溶劑系統(tǒng)或其混合物的條件下進(jìn)行的。有機溶劑優(yōu)選為C1-C6的醇。水溶劑系統(tǒng)或者水和有機溶劑混合的系統(tǒng)更為優(yōu)選，這是因為抗壞血酸、KLG以及KLG的酯通常更易溶于水溶劑系統(tǒng)中。對于在體外從KLG的酯生產(chǎn)抗壞血酸而言，優(yōu)選水和有機溶劑混合的系統(tǒng)或者有機溶劑系統(tǒng)以便使能夠生產(chǎn)出副產(chǎn)物KLG的競爭水解反應(yīng)降到最低的程度。當(dāng)使用完整細(xì)胞系統(tǒng)在體內(nèi)生產(chǎn)抗壞血酸時，特別優(yōu)選水溶劑系統(tǒng)。
在本發(fā)明的一個方面，抗壞血酸是由KLG或KLG的酯在有水解酶催化劑存在下，在體內(nèi)在完整細(xì)胞以及完整生物體生產(chǎn)系統(tǒng)中生成的。在一個具體實施方案中，水解酶是由宿主生物體天然產(chǎn)生的。在另一個具體實施方案中，水解酶是通過重組DNA技術(shù)由宿主生物體產(chǎn)生的。例如，將編碼水解酶的基因序列插入宿主生物體中，其中所述的宿主生物體可以是能夠表達(dá)水解酶的微生物、植物或動物。培養(yǎng)產(chǎn)生水解酶的宿主生物體、即在有KLG或KLG的酯存在的情況下提供適于生長的營養(yǎng)和合適的環(huán)境以生產(chǎn)出抗壞血酸。優(yōu)選的宿主生物體為檸檬泛菌(Pantoea Citrea)，以前在如Anderson等的美國專利5,008,193中所公開的將其稱為草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)。
另外優(yōu)選的宿主生物體為一種除了生產(chǎn)水解酶之外還生產(chǎn)KLG的生物體。具有代表性的生物體為來自泛菌屬或葡糖桿菌屬的生物體、比如Shinjoh等在《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》61:413-420(1995)中公開的生物體，以及如Sonoyama等在《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》43:1064-1069(1982)中公開的棒狀桿菌屬的生物體。
正如本文所使用的那樣，重組DNA技術(shù)包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)重組/遺傳重組，并且該技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。例如可以參閱在下列文獻(xiàn)中所述的技術(shù)Maniatis等，《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，紐約(1989)；Ausubel等，《分子生物學(xué)通用實驗方案》，Greene出版協(xié)會與WileyInterscience，紐約(1989)；Anderson等，《科學(xué)》，230:144-149(1985)；以及Estell等的美國專利5,441,882。
為了從KLG的酯制備KLG，使KLG的酯的水溶液與水解酶反應(yīng)。在制備KLG中可以使用助溶劑并且優(yōu)選C-C6的醇。
為了從KLG或者從KLG的其它酯制備KLG的酯，將起始原料溶于醇溶液中，其中的醇對應(yīng)于將要制得的KLG的酯的烷基部分。從中可以得到優(yōu)選的KLG酯的醇ROH的烷基部分R可以選自支鏈或直鏈的、飽和或不飽和的烷基、芳烷基、芳基以及取代的芳基。優(yōu)選的R基團(tuán)包括C1至C6的直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的烷基。針對烷基部分衍生的甚至更優(yōu)選的KLG的酯包括MeKLG、乙基-KLG、正丙基-KLG、異丙基-KLG、正丁基-KLG、異丁基-KLG、t-丁基-KLG以及正戊基-KLG。生成的最優(yōu)選的KLG的酯為MeKLG、這是因為它可以很方便地進(jìn)行生產(chǎn)，以及丁基-KLG、這是由于在除去水分時可以便利地使用丁醇水的共沸物。在制備KLG的酯的過程中可以使用助溶劑并且優(yōu)選水、C1-C6的醇或其混合物。
用于進(jìn)行本發(fā)明的反應(yīng)的優(yōu)選溫度為5℃至120℃。甚至更優(yōu)選的溫度為25℃至100℃，并且特別優(yōu)選的溫度為38℃至80℃。
用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選pH介于1.5和10之間，并且更優(yōu)選的pH介于3和10之間。為了從KLG的酯制備抗壞血酸鹽，特別優(yōu)選的pH范圍在6和10之間。為了制備呈游離酸形式的抗壞血酸，優(yōu)選的pH在抗壞血酸的pKa下，并且更優(yōu)選在4.2下。為了從KLG的酯制備KLG，特別優(yōu)選的pH范圍介于5和10之間，這是因為在該pH范圍內(nèi)通常能提高酶協(xié)助的水解的速率。另一方面，為了生成呈質(zhì)子化形式的KLG，介于1.5和2.5之間的pH尤其合乎要求。最后，為了從KLG制備KLG的酯，特別優(yōu)選的pH范圍介于3和6之間。
每種水解酶都具有最適溫度、最適pH以及與活性有關(guān)的pH和溫度范圍。因此對給定的水解酶而言，適宜的pH和溫度范圍為可以為水解酶的活性創(chuàng)造條件并且避免使水解酶變性或失活的條件。對于可以發(fā)生變性的條件而言、比如高溫或者使用變性溶劑(如甲醇或者類似物)，可以要求進(jìn)行最小量的測試以限定那些在一系列給定的條件下仍保持活性的水解酶。
下面的實施例是通過解釋的方式提供的，并且這些實施例不打算限制所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
實施例在質(zhì)子模式為300MHZ和碳模式為75MHZ下操作的Varian Gemini300NMR儀上記錄質(zhì)子和碳核磁共振(NMR)光譜。除非另作說明的以外，所有的NMR光譜都以0百萬分率(ppm)的四甲基硅烷(TMS)為基準(zhǔn)并且以ppm記錄峰的頻率。使用紫外(UV)檢測進(jìn)行HPLC(高效液相層析)的分析。使用Fisons VG分析有限公司的Autospec質(zhì)譜儀在FD(場解吸)模式下得到質(zhì)譜(MS)。
在本實驗中使用的KLG是根據(jù)Lazarus等、Anderson等在《科學(xué)》230:144-149(1985)中的方法通過發(fā)酵得到的，并且通過濃縮和結(jié)晶進(jìn)行純化。另外，KLG也可以根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法通過化學(xué)轉(zhuǎn)化由L-山梨糖制得(例如參見Reichstein的美國專利2,301,811)。甲基-2-酮-L-古洛糖酸的標(biāo)準(zhǔn)品可以從Aldrich化學(xué)公司(稀有和特殊化學(xué)藥品目錄)買到，另外可以通過如下所述的與用于制備丁基-KLG的方法類似的方法由KLG的酯化來制備。
水解酶樣品是從商業(yè)來源得到的，包括Sigma化學(xué)公司、AltusBiologics、重組生物催化公司、Boehringer Mannheim、NovoNordisk、Genencor國際公司、Thermogen和Fluka。實施例1本實施例描述了丁基2-酮-L-古洛糖酸的制備和純化。
在氬氣環(huán)境中將KLG水合物(51.62g)裝入一個500ml的反應(yīng)容器中。該反應(yīng)器配備有一個連接到迪安-斯達(dá)克榻分水器上的30.48cm(12”)的維格羅分餾柱。然后向反應(yīng)器中裝入正丁醇(310g)和對甲苯磺酸(2.3g)。在適度真空的條件下[大約19.95kPa(150mm Hg)]在攪拌下使反應(yīng)混合物回流(81-82℃)。持續(xù)回流共計2小時40分鐘。不再繼續(xù)加熱。使反應(yīng)冷卻并在室溫下保持大約3天。得到的晶體通過粗多孔玻璃過濾器過濾并用兩份正丁醇(139g、隨后為37g)洗滌。將得到的固體(24.4g)溶解在熱的醋酸乙酯(250m1)中，并在室溫下通過靜置過夜進(jìn)行重結(jié)晶。通過過濾分離出重結(jié)晶的丁基-KLG并在真空下
干燥至恒重(15.97g)來實現(xiàn)。
人們發(fā)現(xiàn)如此制得的丁基-KLG在水中具有至少50％重量百分?jǐn)?shù)的溶解度，因為在50％重量百分?jǐn)?shù)的情況下在所有的濃度下它都可以溶解在水中。本實施例重結(jié)晶的丁基-KLG具有令人滿意的質(zhì)子和碳NMR光譜并且通過場解吸質(zhì)譜測定給出了預(yù)測的分子量。
1H NMR(DMSO，數(shù)字式分辨率=0.1lHz，在半高度下的TMS=0.5Hz):6.49(OH,d,J=1.4Hz),4.96(OH,d,J=5.0Hz),4.84(OH,d,J=4.8Hz),4.78(OH,d,J=7.4Hz),4.17-4.0(m,2H),3.5-3.2(m，約為5H),1.64-1.5(m,2H),1.4-1.35(m,2H),0.89(CH3,t,J=7.3)。
13C NMR(DMSO，去偶的)169.4,96.3,73.8,72.8,69.8,64.5,62.8,30.0,18.4,13.5.
FDMS:M=250實施例2以下的方法用于說明在具體的pH和水溶劑組合物條件下酶的活性。
如下進(jìn)行起始酶的篩選。把酶(一般為10mg)、水性緩沖溶液(一般為860微升(ul)或550ul)、0.2M CaCl2水溶液(10ul)、甲醇(一般為90ul或400ul)和底物的水溶液(一般為90ul的丁基-KLG、其常用的濃度為110,000ppm)加入2ml聚丙烯離心管中。把得到的溶液簡短地旋轉(zhuǎn)一下并放置在300rpm、38℃下的水浴搖床中(通常處理18小時或者更長的時間)。在溫育后，將樣品在14,000G’s(14,000倍的重力)下離心20分鐘以除去酶、取樣(300ul)并用蒸餾水稀釋到1毫升。如果不在當(dāng)天用HPLC進(jìn)行分析的話，在分析前冷凍樣品。
在下面的表2中總結(jié)的是在丁基-KLG(BuKLG)與多種水解酶在水/甲醇溶液中反應(yīng)時的產(chǎn)物(以及殘留底物)的HPLC數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)是以KLG、MeKLG、抗壞血酸(ASA)和丁基-KLG的百萬分率報道的。報道值為0(零)表明存在的物質(zhì)的量低于儀器的檢測閾值。在給定的試驗中，標(biāo)記為“無酶”的樣品為對照物。這些對照物含有底物、但卻不含酶，因而可以代表實驗和HPLC的本底數(shù)據(jù)。
表2針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理41小時/38％甲醇水/0.1MES緩沖溶液)酶 測量的，KLG MeKLG ASA BuKLGpH (ppm)ESL-001-015.8 11802352 766 4603ESL-001-025.67041084 302 7736ESL-001-035.7386 527 257 8931ESL-001-045.8550 752 833 6229ESL-001-055.9456 684 469 7942ESL-001-065.6547 661 129 8896ESL-001-075.7311 755 489 6540無酶 108 32533 10177無酶 (重復(fù)) 107 303 0 9459無酶 117 32742 9878無酶 (重復(fù)) 103 269 2 8593無酶 116 322 0 9473表2說明由重組生物催化公司提供的水解酶(ESL-001-01至ESL-001-07)顯示出在用嗎啉代乙磺酸(MES)半鈉鹽緩沖的、將pH控制在5.5與6之間的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化為抗壞血酸、MeKLG和KLG。這些水解酶為通過商業(yè)途徑由重組生物催化公司銷售的重組酯酶以及來自嗜熱生物體、商品名為CloneZyme(商標(biāo))的脂肪酶。
實施例3下面的表3說明多種酰基轉(zhuǎn)移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶顯示出在用MES緩沖溶液緩沖的、pH為4.8至5.8的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。標(biāo)明為ChiroClec(商標(biāo))的酶為可以通過商業(yè)途徑從Altus Biologics購得的結(jié)晶狀的交聯(lián)酶。ChiroClec-CR為來自皺摺假絲酵母(Candida rugosa)的脂肪酶，ChiroClec-BL為枯草蛋白酶(一種蛋白酶)的結(jié)晶形式，而ChiroClec-PC為來自蔥頭假單胞菌(Pseudomonas Cepacia)的脂肪酶。南極洲假絲酵母B(Candida Antartica)(一種脂肪酶)、豬肝酯酶(一種水解酶)和芽胞桿菌屬物種的蛋白酶均顯示出特別高水平的活性。
表3針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理16小時/38％甲醇-水/0.1M MES緩沖溶液)酶 測量的 KLG MeKLG ASA BuKLGpH (ppm
實施例4下面的表4說明多種酰基轉(zhuǎn)移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶顯示出在用MES緩沖溶液緩沖的、pH為5至5.8的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。豬肝酯酶、枯草蛋白酶Carlsberg(一種蛋白酶)、芽胞桿菌屬物種的蛋白酶、ChiroClec-BL與南極洲假絲酵母B脂肪酶均顯示出特另高水平的活性。
表4針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理47.5小時/38％甲醇-水/0.1M MES緩沖溶液)酶測量的 KLG MeKLG ASABuKLGpH(ppm)<
實施例5下面的表5說明多種脂肪酶和蛋白酶顯示出在用MES緩沖溶液緩沖的、pH為5.7至6.1的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。在該表中根據(jù)與其它酶進(jìn)行比較，Prozyme 6(一種來自米曲霉的蛋白酶)、蛋白酶2A(來自米曲霉)與GC899(一種來自Genencor國際公司的商品洗滌劑蛋白酶)顯示出更高水平的活性。
表5針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理19小時/38％甲醇-水/0.1M MES緩沖溶液)
實施例6下面的表6說明多種脂肪酶和蛋白酶顯示出在用MES緩沖溶液緩沖的、pH為5.3至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。蛋白酶M(米曲霉)、Prozyme 6(一種來自米曲霉的蛋白酶)、蛋白酶N(枯草蛋白酶)與蛋白酶2A(米曲霉)均顯示出特別高水平的活性。
表6針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理19小時/8.6％甲醇-水/0.1M MES)
豬胰脂肪酶 Fluka5.88907911585284脂肪酶(Sigma-1754) 脂肪酶5.92831161486196脂肪酶(Sigma-1754) 脂肪酶 63481894158098脂肪酶(Sigma-8525) 脂肪酶 6326 93 154112脂肪酶(Sigma-1754) 脂肪酶 63001501548057脂肪酶(Sigma-3126) 脂肪酶5.8787488 998829F-15(根霉屬) 脂肪酶5.9218124 08682Lipozyme(Novo-液態(tài))脂肪酶5.8380 951017251GC899(蛋白酶) 蛋白酶5.63354 1765 2016991實施例7下面的表7說明多種?；D(zhuǎn)移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶顯示出在用MES緩沖溶液緩沖的、pH約為5至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。南極洲假絲酵母B脂肪酶、豬肝酯酶與芽胞桿菌屬物種的蛋白酶均顯示出特別高水平的活性。
表7針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理19小時/8.6％甲醇-水/0.1M MES)
實施例8下面的表8說明多種?；D(zhuǎn)移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶顯示出在用MES緩沖溶液緩沖的、pH約為5.8至6.2的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。豬肝酯酶、南極洲假絲酵母B脂肪酶、芽胞桿菌屬物種的蛋白酶和輕度交聯(lián)的結(jié)晶狀枯草蛋白酶(ChirClec-BL)均顯示出特別高水平的活性。
表8針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理21小時/8.6％甲醇-水/0.2M MES)酶 注釋pHKLGMeKLGASABuKLG(ppm)豬肝酯酶5.8 2373 4167 717 83蔥頭假單胞菌脂肪酶 5.9173169 257384豬胰脂肪酶 5.9303320 786860皺摺假絲酵母脂肪酶 5.9260112 2717351α-胰凝乳蛋白酶 5.95061239 1464 707青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶 61761172 985392黑色曲霉脂肪酶 5.9493 259 846364米赫毛霉脂肪酶 5.9243 283 547067無酶5.9198 173 27137無酶5.9216 153 07115無酶5.9223 154 17319南極洲假絲酵母‘A’脂肪酶 5.9222 1421486683解脂假絲酵母脂肪酶6721 123 256721南極洲假絲酵母‘B’脂肪酶 5.9 2708 709 20 28Humicola lanuginosa脂肪酶 5.9176 129 107215芽胞桿菌屬物種的蛋白酶 5.8 5553 603 0 33ChiroCLEC-CR(干燥的)6.1229 170 27191ChiroCLEC-BL(干燥的)5.9 42931282 61376ChiroCLEC-PC(蔥頭假單胞菌-干燥的) 6.1240 268 27539德列馬根霉脂肪酶6178 007097雪白根霉脂肪酶 6.2 178181 61 7102米根霉脂肪酶 6.1 159119 26 7611粘稠色桿菌脂肪酶 6 4151812 7275白地霉脂肪酶 6.1 1461226 6140爪哇毛霉脂肪酶 6.2 167 95 141 7422米曲霉蛋白酶 6.1 2193 1462 39 2904皺摺假絲酵母酯酶 5.8 129132 17 7164實施例9下面的表9說明對前述實施例中高活性的酶檢測其活性的統(tǒng)計再現(xiàn)性。在嚴(yán)格控制pH的條件下比較來自上述實施例的8種酶，它們均被鑒定為顯示出特別高水平的活性。在重新進(jìn)行分析的過程中，所有以前鑒定的具有高水平活性的酶均保持了高水平的活性。這些酶顯示出在用0.2M MES緩沖溶液緩沖的、pH約為5.6至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。在該比較實施例中，南極洲假絲酵母B脂肪酶、豬肝酯酶與芽胞桿菌屬物種的蛋白酶均顯示出特別高水平的活性。豬肝酯酶顯示出對酯基轉(zhuǎn)移作用以及明顯地轉(zhuǎn)化為抗壞血酸的選擇性。
表9針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理19小時/8.6％甲醇-水/0.2M MES緩沖溶液)酶 注釋PHKLGMeKLGASABuKLG(ppm)N蛋白酶 蛋白酶 6700 1166297 5435南極洲假絲酵母B 脂肪酶 5.8 43472207283 0豬肝酯酶酯酶 5.9 19474258650 0芽胞桿菌屬物種的蛋白酶 蛋白酶 5.6 5137745 55 0ChiroClec-BL(干燥的)枯草蛋白酶 5.8 34851235215 3045Prozyme-6 蛋白酶 5.8 3405151873 1624蛋白酶M 蛋白酶 6554 668 271 63292A蛋白酶蛋白酶 5.9 15851501153 3954無酶 6135 149 14 8170無酶 5.9 136 127 16 8418 無酶 6142 133 13 8570實施例10下面的表10比較了除有機溶劑的濃度更高以外其它與實施例9中相同的酶。南極洲假絲酵母B和芽胞桿菌屬物種的蛋白酶顯示出特別高水平的活性，這是因為在用0.2M MES緩沖溶液緩沖的、pH約為5.6至6.2的38％甲醇-水溶液中它們顯示出把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG。對豬肝酯酶而言，與實施例9所示的結(jié)果相比，盡管其活性仍很顯著、但卻觀察到活性有所下降。
表10針對丁基-KLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理19 小時/38％甲醇-水/0.2M MES緩沖溶液)酶注釋pH KLG MeKLG ASA BuKLG(ppm)N蛋白酶 蛋白酶 5.9176 1144 126 8153南極洲假絲酵母B 脂肪酶 5.8 1701 5710 213 199豬肝酯酶 酯酶 6203 1654 173 7030芽胞桿菌屬物種的蛋白酶 蛋白酶 5.6 3104 4032 182 213ChiroClec-BL(干燥的) 蛋白酶 5.8 1261 1693 102 5572Prozyme-6蛋白酶 6350 1268 47 7517蛋白酶M 蛋白酶 6.2141 408 199 94002A蛋白酶 蛋白酶 6.1178 62690 8666無酶6 69 221 8 9418無酶 5.9 61 189 7 8790無酶6 63 203 9 9367實施例11下面的表11比較了除將pH緩沖到大約5.2以外其它與實施例9中相同的酶。南極洲假絲酵母B和豬肝酯酶顯示出特別高水平的活性，這是因為在用0.2M吡啶/吡啶鹽酸化物緩沖溶液緩沖的、pH約為4.9至5.3的8.6％甲醇-水溶液中它們顯示出把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成MeKLG和KLG。對芽胞桿菌屬物種的蛋白酶而言，與實施例9相比，盡管其活性仍很顯著、但卻觀察到活性有所下降。
表11針對BUKLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理約19小時/8.6％甲醇-水/0.2M吡啶/吡啶鎓鹽酸化物)酶 注釋pHKLGMeKLGASA BuKLG(ppm)N蛋白酶 蛋白酶 5.2 87 237 47 8320南極洲假絲酵母B 脂肪酶 4.93460 3097 53 0豬肝酯酶酯酶5.21613 5787 37 390芽胞桿菌屬物種的蛋白酶 蛋白酶 5.11613 2473 70 3757ChiroClec-BL(干燥的)蛋白酶 5.1 987 1360 67 5603Prozyme-6 蛋白酶 5.2 700 840 7 6470蛋白酶M 蛋白酶 5.3 187 357 0 83872A蛋白酶蛋白酶 5.2 480 643 0 7523無酶5.3 970153 9750無酶5.2 730 80 9547實施例12下面的表12比較了除有機溶劑的濃度更高以外其它與實施例11中相同的酶。南極洲假絲酵母B顯示出特別高水平的活性，這是因為在用0.2M吡啶/吡啶鹽酸化物緩沖溶液緩沖的、pH約為4.7至5.1的38％甲醇-水溶液中它顯示出把丁基-KLG明顯地轉(zhuǎn)化成MeKLG和KLG。與實施例9和11相比，所有酶均顯示出活性有所下降。
表12針對BUKLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理約19小時/H4.9/38％甲醇-水)酶注釋 PH KLG MeKLG ASA BuKLGN蛋白酶 蛋白酶4.80 0 179093南極洲假絲酵母B 脂肪酶4.719536470 0 5373豬肝酯酶 酯酶 4.947 197 0 11750芽胞桿菌屬物種的蛋白酶 蛋白酶4.9333 2113 3010043ChiroClec-BL(干燥的) 蛋白酶4.997 447 7 10950Prozyme-6蛋白酶4.90 113 3 12730蛋白酶M 蛋白酶5.173 203 0 158872A蛋白酶 蛋白酶5 67 150 0 13920無酶 4.987 13 27 11753實施例13下面的表13比較了除將pH緩沖到大約2.3以外其它與實施例9和11中相同的酶。對于在用0.2M磷酸鹽緩沖溶液緩沖的、pH約為2.3-2.7的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG轉(zhuǎn)化成抗壞血酸、MeKLG和KLG而言，與實施例9和11相比，所有測試的酶均顯示出活性有所下降。
表13針對BUKLG的水解/甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理20小時/8.6％甲醇-水/pH2.3 0.2M磷酸鹽緩沖溶液)酶 注釋 PH KLG MeKLG ASA BuKLGN蛋白酶蛋白酶 2.4 203 0 38980南極洲假絲酵母B脂肪酶 2.4 397 32308463豬肝酯酶 酯酶2.4 417 93 09500芽胞桿菌屬物種的蛋白酶 蛋白酶 2.3 347 0 010987ChiroClec-BL(干燥的) 蛋白酶 2.3 387 0 010580Prozyme-6 蛋白酶 2.4 440 0 012357蛋白酶M蛋白酶 2.6 137 3330122372A蛋白酶 蛋白酶 2.7 163 347010600無酶 2.3 487 0 010417無酶 2.3 413 0 09897無酶 2.3 407 0 09873實施例14下面的表14比較了在將pH緩沖到大約6時實施例9和11的前5種酶催化KLG酯化為甲基KLG(MeKLG)的能力或其催化KLG的環(huán)閉合以生成抗壞血酸的能力。與實施例9和11相比均觀察到低水平的活性。
表14針對KLG的甲醇分解進(jìn)行酶的篩選(38℃處理19小時/8.6％甲醇-水/0.2M MES緩沖溶液)酶 注釋pH KLGMeKLG ASA BuKLGN蛋白酶 蛋白酶 6 3791 0 0 0南極洲假絲酵母B 脂肪酶 6 4258 0 0 0豬肝酯酶 酯酶 6 4393 0 0 0芽胞桿菌屬物種的蛋白酶蛋白酶 6 4099 0 0 0ChiroClec-BL(干燥的) 枯草蛋白酶 6.1 3270 0 0 0無酶 6 4340 0 0 0無酶 6 3295 0 0 0無酶 6 4029 0 0 0實施例15下面的表15說明了在pH為3-3.2的8.6％甲醇水溶液中使用南極洲假絲酵母B脂肪酶作為催化劑由KLG生產(chǎn)MeKLG。選取該緩沖溶液作為KLG及其鈉鹽的混合物(約為1/9)。前三項包括酶催化劑并且在相同的條件下一式三份。隨后的三項也一式三份，并且除沒有酶存在之外其它與前三項的條件相同。前三項顯示出在有南極洲假絲酵母B脂肪酶的情況下KLG明顯地酯化為MeKLG。隨后的三項說明在沒有南極洲假絲酵母B脂肪酶的情況下沒有進(jìn)行上述轉(zhuǎn)化。
表15針對KLG的酯化進(jìn)行酶的篩選在38℃下處理68小時/在水相中含8.6％的甲醇/緩沖溶液=KLG+NaKLG酶 注釋 pH KLGMeKLG ASA BuKLG南極洲假絲酵母B 8.6％MeOH+KLG 3.1 9227 460 0 0南極洲假絲酵母B 8.6％MeOH+KLG 3.1 9303 530 0 0南極洲假絲酵母B 8.6％MeOH+KLG 3.2 9213 413 0 0無酶 8.6％MeOH+KLG 2.9 9530 0 0 0無酶 8.6％MeOH+KLG 2.9 9477 0 0 0無酶 8.6％MeOH+KLG 2.9 9600 0 0 0實施例16本實施例說明在進(jìn)行HPLC分析的條件下抗壞血酸的緩慢分解。通過在水中溶解KLG、MeKLG、抗壞血酸(ASA)和丁基-KLG至合適的濃度來制備HPLC樣品的標(biāo)準(zhǔn)品。把這些標(biāo)準(zhǔn)品樣品放入管形瓶中、裝滿并密封，在室溫下儲存，并定期進(jìn)行分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的面積響應(yīng)來標(biāo)定HPLC，其中在標(biāo)準(zhǔn)品制備完畢之后應(yīng)盡可能快地將其注入HPLC中。下面的表16顯示出50、100和500ppm的KLG、MeKLG、抗壞血酸和丁基-KLG標(biāo)準(zhǔn)品在制備樣品后的0時(標(biāo)定時間)、在大約6.5小時以及在大約12小時時記錄的響應(yīng)。
表16制備的量 發(fā)現(xiàn)的量時間 KLGMeKLGASABuKLG(分鐘)0 50ppm標(biāo)準(zhǔn)品 51 51.453.4 50.6400 39.947.728.3 42.7715 52 43 0 38.20 100ppm 標(biāo)準(zhǔn)品 102 103 107 101400 94.3106.8 96.6100.1715 81.890.257.2 94.20 500ppm 標(biāo)準(zhǔn)品 510 514 534 506400 479 496 487 512715 493 495 473 499對于其它的標(biāo)準(zhǔn)品、尤其是針對100ppm或者更低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品而言，抗壞血酸的響應(yīng)在整個時間范圍內(nèi)是非線性的。假定在HPLC分析之前對實施例2-16的處理包括在38℃下、在水浴搖床上處理大約16小時或者更長的時間，那么由此可見生成的抗壞血酸的實際水平要高于報道值。
具體地參考本發(fā)明優(yōu)選的具體實例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但應(yīng)當(dāng)了解的是可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)實現(xiàn)變化和改進(jìn)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Hubbs,John C.
(ⅱ)發(fā)明名稱用于制備抗壞血酸、2-酮-L-古洛糖酸及2-酮-L-古洛糖酸酯的酶促方法(ⅲ)序列數(shù)3(ⅳ)通訊地址(A)收信人Eastman化學(xué)公司(B)街道郵政信箱511(C)城市Kingsport(D)州田納西(E)國家美國(F)郵政編碼37662-5075(ⅴ)計算機可讀形式(A)存儲媒體類型*(B)計算機*(C)操作系統(tǒng)*(D)軟件*(ⅵ)目前申請資料(A)申請?zhí)?(B)申請日*(C)分類*(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S60/017,879(B)申請日1996年5月17日(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名Cheryl J.Tubach(B)登記號*(C)參考/案件目錄號70432(ⅸ)電信資料(A)電話423-229-6189(B)傳真423-229-1239(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度379個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met1 5 10 15Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro20 25 30Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val35 40 45Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys50 55 60Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp65 70 75 80Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val85 90 95Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly100 105 110Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly115 120 125Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His130 135 140Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala145 150 155 160Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Tnr His Val Ala Gly Thr Val165 170 175Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val180 185 190Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr195 200 205Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp210 215 220Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys225 230 235 240Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala245 250 255Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro260 265 270Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser275 280 285Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala290 295 300Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr305 310 315 320Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala325 330 335Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn340 345 350Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly355 360 365Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln370 375(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度584個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Trp Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Leu Ala Ser Ser Ala Thr1 5 10 15Trp Ala Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly20 25 30Arg Val Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Phe Thr Gln35 40 45Pro Val Ala Val Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly50 55 60Ser Leu Arg Phe Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val65 70 75 80Lys Asn Thr Thr Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Asp Pro Val Val85 90 95Glu Gln Met Thr Ser Asp Leu Phe Thr Asn Phe Thr Gly Lys Glu Arg100 105 110Leu Thr Leu Glu Phe Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr115 120 125Pro Ala Asp Leu Thr Lys Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile130 135 140His Gly Gly Gly Leu Val Leu Gly Gly Ala Pro Met Tyr Asp Gly Val145 150 155 160Val Leu Ala Ala His Glu Asn Phe Thr Val Val Val Val Ala Ile Gln165 170 175Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly Phe Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser180 185 190Arg Gly Asn Trp Gly His Leu Asp Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val195 200 205Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe Gly Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile210 215 220Phe Gly Glu Ser Phe Thr Ala Gly Gly Glu Ser Val Ser Val Leu Val225 230 235 240Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe His Arg Ala Ile Ser Glu Ser245 250 255Gly Val Ala Leu Thr Val Ala Leu Val Arg Lys Asp Met Lys Ala Ala260 265 270Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly Cys Lys Thr Thr Thr Ser Ala275 280 285Val Phe Thr Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys Ser Glu Asp Glu Leu290 295 300Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Leu Thr Leu Asp Phe His Gly305 310 315 320Asp Gln Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Pro Thr Val Val Asp Gly Val325 330 335Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala Glu Lys Asp Phe Thr340 345 350Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys 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575Pro Lys Ile Lys His Ala Glu Leu580(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度342個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:NO:3:Met Lys Leu Leu Ser Leu Thr Gly Val Ala Gly Val Leu Ala Thr Cys1 5 10 15Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro20 25 30Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln35 40 45Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly50 55 60Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu65 70 75 80Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe85 90 95Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile100 105 110Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr115 120 125Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro130 135 140Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr145 150 155 160Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala165 170 175Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu180 185 190Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Tnr Thr Asn Leu Tyr195 200 205Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu210 215 220Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val225 230 235 240Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln245 250 255Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln260 265 270Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala275 280 285Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala290 295 300Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro305 310 315 320Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys325 330 335Ser Gly Ile Val Thr Pro340
權(quán)利要求
1．一種用于制備抗壞血酸的方法，該方法包括將選自由2-酮(keto)-L-古洛糖酸和2-酮(keto)-L-古洛糖酸酯組成的組中的化合物與水解酶催化劑接觸以生成抗壞血酸。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所說的水解酶催化劑選自由蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶組成的組中。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所說的蛋白酶由選自由芽胞桿菌屬或曲霉屬組成的組的屬中獲得。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所說的蛋白酶由地衣形芽胞桿菌細(xì)菌獲得。
5．權(quán)利要求4的方法，其中所說的蛋白酶與具有如SEQ ID NO:1所示序列的枯草蛋白酶之間至少具有70％的序列同源性。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所說的蛋白酶為具有如SEQ ID NO:1所示序列的枯草蛋白酶。
7．權(quán)利要求2的方法，其中所說的酯酶由豬肝提取物獲得。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所說的酯酶與具有如SEQ ID NO:2所示序列的豬肝酯酶之間至少具有70％的序列同源性。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所說的酯酶為具有如SEQ ID NO:2所示序列的豬肝酯酶。
10．權(quán)利要求2的方法，其中所說的脂肪酶由選自由曲霉屬、毛霉菌屬、假絲酵母屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、根霉屬、色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、地霉屬和青霉屬組成的組的屬中獲得。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所說的由假絲酵母屬得到的脂肪酶為與具有如SEQ ID NO:3所示序列的B型南極洲假絲酵母脂肪酶之間至少具有70％的序列同源性的脂肪酶。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所說的脂肪酶為具有如SEQ ID NO:3所示序列的B型南極洲假絲酵母脂肪酶。
13．權(quán)利要求2的方法，其中所說的酰胺酶由青霉屬獲得。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所說的酰胺酶與青霉素?；D(zhuǎn)移酶之間至少具有80％的序列同源性。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所說的酰胺酶為青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶。
16．權(quán)利要求1的方法，其中所說的水解酶催化劑含有一個活性位點的絲氨酸殘基。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所說的水解酶催化劑含有一個絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的催化三聯(lián)體。
18．權(quán)利要求1的方法，其中在將所說化合物與所說水解酶催化劑接觸之前，將所說化合物與溶劑一起形成溶液。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所說的溶劑選自由水、C1至C6的醇及其混合物組成的組中。
20．權(quán)利要求1的方法，其中將所說化合物與所說水解酶催化劑接觸發(fā)生在pH介于1.5和10之間的情況下。
21．權(quán)利要求1的方法，其中將所說化合物與所說水解酶催化劑接觸發(fā)生在5℃至120℃的溫度下。
22．權(quán)利要求1的方法，其中在將所說化合物與所說水解酶催化劑接觸之前，所說水解酶催化劑是由宿主生物體在體內(nèi)天然表達(dá)的。
23．權(quán)利要求1的方法，其中在將所說化合物與所說水解酶催化劑接觸之前，將編碼所說水解酶催化劑的基因序列插入宿主生物體中，并且在體內(nèi)培養(yǎng)所說的宿主生物體以表達(dá)所說的水解酶催化劑。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所說的宿主生物體為檸檬泛菌。
25．權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的方法，其中所說的宿主生物體生產(chǎn)KLG。
26．一種含有根據(jù)權(quán)利要求1的方法制得的抗壞血酸的混合物。
27．一種用于制備2-酮-L-古洛糖酸的方法，該方法包括以下步驟(a)制備2-酮-L-古洛糖酸酯的水溶液，以及(b)然后在溶液中將所說的2-酮-L-古洛糖酸酯與水解酶催化劑接觸以生成2-酮-L-古洛糖酸。
28．權(quán)利要求27的方法，其中所說的水解酶催化劑選自由蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶組成的組中。
29．權(quán)利要求27的方法，其中在制備所說的水溶液中使用助溶劑。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所說的助溶劑為C1至C6的醇。
31．一種用于制備2-酮-L-古洛糖酸酯的方法，該方法包括以下步驟(a)制備2-酮-L-古洛糖酸的醇溶液并且該醇對應(yīng)于將要生成的2-酮-L-古洛糖酸酯的烷基部分；以及(b)然后在溶液中將所說的2-酮-L-古洛糖酸與水解酶催化劑接觸以生成所說的2-酮-L-古洛糖酸酯。
32．權(quán)利要求31的方法，其中所說的水解酶催化劑選自由蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶組成的組中。
33．權(quán)利要求31的方法，其中在制備所說的醇溶液中使用助溶劑。
34．權(quán)利要求33的方法，其中所說的助溶劑選自由水、C1至C6的醇及其混合物組成的組中。
35．一種用于制備2-酮-L-古洛糖酸酯的方法，該方法包括以下步驟(a)制備第一種2-酮-L-古洛糖酸酯的醇溶液并且該醇對應(yīng)于將要生成的第二種2-酮-L-古洛糖酸酯的烷基部分；以及(b)然后在溶液中將所說的第一種2-酮-L-古洛糖酸酯與水解酶催化劑接觸以生成所說的第二種2-酮-L-古洛糖酸酯。
36．權(quán)利要求35的方法，其中所說的水解酶催化劑選自由蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶組成的組中。
37．權(quán)利要求35的方法，其中在制備所說的醇溶液中使用助溶劑。
38．權(quán)利要求37的方法，其中所說的助溶劑選自由水、C1至C6的醇及其混合物組成的組中。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于用于制備抗壞血酸、2－酮－L－古洛糖酸及2－酮－L－古洛糖酸酯的有效、高產(chǎn)的方法。該方法包括將合適的起始原料與水解酶催化劑、比如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶反應(yīng)。
文檔編號C12P17/04GK1225686SQ97196510
公開日1999年8月11日 申請日期1997年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月17日
發(fā)明者J·C·胡布斯 申請人:伊斯曼化學(xué)公司