專利名稱：發(fā)酵的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種經(jīng)D-山梨糖醇發(fā)酵轉(zhuǎn)化以高產(chǎn)率制備2-酮基-L-古洛糖酸的方法。
2-酮基-L-古洛糖酸是制備L-抗壞血酸的重要的中間體，它可按熟知的賴希斯坦方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
用發(fā)酵的方法從D-山梨糖醇或L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸是已知的。
因此，日本專利公報(bào)第40154/1976號(hào)公開了用醋酸桿菌，桿菌或假單胞菌屬的微生物從山梨糖醇生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸的方法，這些菌屬在需氧條件下具有氧化D-山梨糖醇以生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸的能力。但該已知方法的產(chǎn)率非常低，即低于6克/升。
按“中國(guó)微生物學(xué)報(bào)”21(2)，185-191(1981)公開的另一已知方法，2-酮基-L-古洛糖酸可用包括溝槽假單胞菌(Pseudomonasstriata)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)的微生物混合培養(yǎng)物從L-山梨糖制備，其產(chǎn)率當(dāng)起始L-山梨糖濃度為70克/升時(shí)為30克/升，當(dāng)起始L-山梨糖濃度為100克/升時(shí)為37克/升。
此外，歐洲專利公報(bào)第0221707號(hào)公開了一種用糖生酮假葡糖桿菌(Pseudogluconobactersaccharoketogenes)與伴生細(xì)菌一起或其自身從L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸的方法。但該已知的用糖生酮假葡糖桿菌的方法的產(chǎn)率最多為55.3-87.6克/升(轉(zhuǎn)化率34.2-54.1%)(見歐洲專利公報(bào)第0221707號(hào)第13頁(yè)，表4)。
還有，歐洲專利公報(bào)第0278447號(hào)公開了一種用微生物的混合培養(yǎng)物從L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸的方法，在微生物混合培養(yǎng)物中其一具有DSMNO.4025和菌株的分類特點(diǎn)，另一種則具有DSMNO.4026菌株(一種巨大芽孢桿菌菌株)的分類特點(diǎn))。此法產(chǎn)率為40克/升或更高。
如上所述，有各種從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2-酮基-L-古洛糖酸的微生物的試驗(yàn)方法，但由于低的產(chǎn)率使它們距離工業(yè)應(yīng)用還差很遠(yuǎn)，特別是作為從D-山梨糖醇起始的方法，本發(fā)明的方法能使產(chǎn)率最少約為60克/升，130克/升的產(chǎn)率是可達(dá)到的。
另一方面，從D-山梨糖醇發(fā)酵生產(chǎn)L-山梨糖是已知的，該法是賴希斯坦法的一部分。
已知各種醋酸桿菌(在此分類為葡糖桿菌)菌株如木質(zhì)醋酸桿菌和弱氧化醋酸桿菌能有效地從D-山梨糖醇生產(chǎn)L-山梨糖(Biotechnology、Volume6a，436-437，1984，editedbyH-J.Rehm，andG.ReedpublishedbyVerlagChemie.Weinheim，Germany)。
假如人們能建立一種有效地從如D-山梨糖醇的便宜的碳源起始而不是從L-山梨糖起始制備2-酮基-L-古洛糖酸的方法，顯然，將大大簡(jiǎn)化賴希斯坦方法。
如上所述，菌株DSMNO.4025能有效地從L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸，但從D-山梨糖醇的轉(zhuǎn)化率則很低。從D-山梨糖醇生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸的低轉(zhuǎn)化率是由于形成了如D-葡萄糖，D-葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸這些從D-山梨糖醇衍生來(lái)的副產(chǎn)物。從2-酮基-L-古洛糖酸的立體異構(gòu)體2-酮基-D-古洛糖酸中純化2-酮基-L-古洛糖酸是困難的，在菌株DSMNO.4025中D-山梨糖醇的可能的代謝途徑如下所示
為改善用菌株DSMNO.4025從D-山梨糖醇發(fā)酵制備2-酮基-L-古洛糖酸的產(chǎn)率，考慮利用某些方法盡可能多地增強(qiáng)L-山梨糖的形成途徑。
因此本發(fā)明的目的是提供一種新的以高轉(zhuǎn)化率從D-山梨糖醇制備2-酮基-L-古洛糖酸的方法，例如轉(zhuǎn)化率至少約為50mol%到約89mol%。
本發(fā)明的另一目的是提供一種操作方式，其中可防止不需要的如D-葡萄糖，D-葡萄糖酸和2-酮基-D-古洛糖酸的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
本發(fā)明是一種制備2-酮基-L-古洛糖酸或其鹽的方法，它包括在含有D-山梨糖醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種具有從D-山梨糖醇生產(chǎn)L-山梨糖能力的屬于葡糖桿菌或醋酸桿菌屬的微生物(A)和一種具有從L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸能力并具有DSMNO.4025菌株分類特點(diǎn)的微生物(B)，其功能等價(jià)物，亞培養(yǎng)物，突變體或變異體的混合培養(yǎng)物，借此進(jìn)行混合培養(yǎng)，其中所說(shuō)的兩種微生物在整個(gè)培養(yǎng)期的至少一部分時(shí)間內(nèi)是共存于培養(yǎng)基中的，并回收2-酮基-L-古洛糖酸或其鹽。
此外，按照本發(fā)明，用L-山梨糖生產(chǎn)菌株從D-山梨糖醇生產(chǎn)出的L-山梨糖可被2-酮基-L-古洛糖酸生產(chǎn)菌株所利用以形成2-酮基-L-古洛糖酸。另外，基本上沒有觀察到前面提到的副產(chǎn)物的積累。
關(guān)于這一點(diǎn)，在此使用的具有從D-山梨糖醇生產(chǎn)L-山梨糖能力的微生物(A)屬于葡糖桿菌屬或醋桿菌屬，所用的微生物(B)，其功能等價(jià)物，亞培養(yǎng)物，突變體或其變異體具有從L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸的能力并具有DSMNO.4025菌株分類特點(diǎn)。
在本方法中，得到的任何產(chǎn)物，例如通過處理微生物(A)和(B)的細(xì)胞，例如，靜止細(xì)胞，凍干細(xì)胞或固定化細(xì)胞均可被使用。
本方法可用各種方法進(jìn)行，例如，一種將兩種微生物(A)和(B)在培養(yǎng)開始時(shí)同時(shí)接種到培養(yǎng)基中的方法，一種先接種微生物(A)，在培養(yǎng)一段時(shí)間后隨后接種微生物(B)的方法，另一種方法是將兩種微生物(A)和(B)分別接種到各自的培養(yǎng)基中，然后在培養(yǎng)一定時(shí)間后將其中任一種一次全部，分成幾份或不斷加入到另一個(gè)的肉汁中，緊接著是另一種培養(yǎng)期。
對(duì)本發(fā)明的方法來(lái)說(shuō)，任何適宜的方法均可用于需培養(yǎng)的微生物，例如，根據(jù)被使用的各個(gè)微生物的特性改變其混合的方法。即，一種需被接種的微生物的量與另一種微生物的量的比率和接種的次數(shù)應(yīng)根據(jù)各個(gè)微生物的生長(zhǎng)速率及涉及到的微生物產(chǎn)生L-山梨糖的能力和將L-山梨糖轉(zhuǎn)化成2-酮基-L-古洛糖酸的能力，并以所用培養(yǎng)基的性質(zhì)為基礎(chǔ)來(lái)進(jìn)行優(yōu)選和確定。在某些情況下，處理細(xì)胞得到的產(chǎn)物還可用作任一種生長(zhǎng)著的細(xì)胞的替代物。
能被用于本發(fā)明方法中的微生物(A)，包括那些在公共保藏單位(培養(yǎng)物保藏中心)，如日本大阪發(fā)酵研究所(IFO)保存，任何人根據(jù)要求可以得到的微生物，這些微生物如下所列微生物(A)的實(shí)例弱氧化葡糖桿菌IFO3130
弱氧化葡糖桿菌IFO3255弱氧化葡糖桿菌IFO3256弱氧化葡糖桿菌IFO3257弱氧化葡糖桿菌IFO3258弱氧化葡糖桿菌IFO3289弱氧化葡糖桿菌IFO3290弱氧化葡糖桿菌IFO3291Gluconobacter gluconicusIFO3171Gluconobacter gluconicusIFO3285Gluconobacter gluconicusIFO3286赤褐色葡糖桿菌IFO3244微白色葡糖桿菌IFO3251微白色葡糖桿菌IFO3253Gluconobacter industriusIFO3261Gluconolacter cerinusIFO3262Gluconobacter cerinusIFO3263Gluconobacter cerinusIFO3265Gluconobacter cerinusIFO3266Gluconobacter cerinusIFO3267Gluconobacter cerinusIFO3270Gluconobacter diacetonicusIFO3273
Gluconobacter rosuasIFO3990醋化醋桿菌奧爾蘭亞種IFO3259醋化醋桿菌醋亞種IFO3281液化醋桿菌IFO12257液化醋桿菌IFO12258液化醋桿菌IFO12388醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO3288醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO13693醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO13772醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO13773能用于本發(fā)明方法的微生物(B)的主要分類特點(diǎn)是負(fù)氧化酶試驗(yàn)乙醇被氧化成乙酸D-葡萄糖被氧化成D-葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸;多醇的生酮作用;從甘油基本上得不到二羥基丙酮;從D-葡糖二酸產(chǎn)生2-酮基-D-葡糖二酸，但從D-葡萄糖，D-果糖，D-葡萄糖酸，D-甘露糖醇或2-酮基-D-葡萄糖酸則得不到2-酮基-D-葡糖二酸;外觀上是多形型的而不是鞭毛型的;從D-果糖產(chǎn)生褐色色素;當(dāng)在巨大芽孢桿菌或其細(xì)胞提取物存在下共培養(yǎng)時(shí)能觀察到良好的生長(zhǎng);并對(duì)鏈霉素是敏感的。
與微生物(B)相關(guān)的特定和優(yōu)選的微生物已經(jīng)按布達(dá)佩斯條約于1987年3月17日存放于theDeutscheSammlungVonMikroorganismeninGoettingen，保藏號(hào)為DSMNO.4025(該研究所現(xiàn)地址為DeuscheSammlungVonMikroorganismenandZellkulturenGmbh，MascheroderWeg1b，D-3300Braunschweig，聯(lián)邦德國(guó))。該微生物是一種氧化葡糖桿菌微生物。
進(jìn)一步優(yōu)選的微生物是前面提及的微生物的功能等價(jià)物、亞培養(yǎng)物，突變體或變異體。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，前面所說(shuō)的微生物(A)和(B)可在包含有D-山梨糖醇的培養(yǎng)基中進(jìn)行接種和培養(yǎng)，且這些微生物的細(xì)胞，例如，靜止細(xì)胞或任何處理過的從細(xì)胞得到的產(chǎn)物可被用于直接對(duì)D-山梨糖醇發(fā)生作用。任何已知的手段作為微生物培養(yǎng)技術(shù)通過使用曝氣攪拌液面下發(fā)酵器可被采用的方法均是特別優(yōu)選的，較好的結(jié)果可以通過使用液體肉汁培養(yǎng)基的培養(yǎng)來(lái)獲得。
關(guān)于培養(yǎng)微生物(A)和(B)所用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，盡管未提出特別的限制，水溶液營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基可以含有碳源和氮源?？杀晃⑸锢玫钠渌鼰o(wú)機(jī)鹽，少量其它養(yǎng)分等適于微生物的良好培養(yǎng)。培養(yǎng)基中可適當(dāng)?shù)睾心切┩ǔＳ糜谖⑸锔蒙L(zhǎng)的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
除在本發(fā)明中用作原料的D-山梨糖醇外也可加入其它碳源物質(zhì)如丙三醇，D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-果糖、D-阿糖醇等。
在本發(fā)明中各種有機(jī)或無(wú)機(jī)物也可用作氮源，如肉汁、胨、酪蛋白，玉米漿、尿素，氨基酸、硝酸鹽，銨鹽等。硫酸鎂，磷酸鉀，氯化鐵和氯化亞鐵，碳酸鈣等無(wú)機(jī)物也可被使用。
這些營(yíng)養(yǎng)成分的混合比率及每種成分的量可隨所用微生物的屬特性，原料D-山梨糖醇的量，被接種的一種微生物相應(yīng)于另一種微生物的量和接種次數(shù)而變化，并可按各種情況特點(diǎn)選擇和確定其他的培養(yǎng)條件。
培養(yǎng)基中起始物D-山梨糖醇的濃度也可隨所用微生物的屬特性等而變化。D-山梨糖醇可在培養(yǎng)開始點(diǎn)一次加入到培養(yǎng)基中，或在培養(yǎng)期間分次加入。在本發(fā)明的方法中。分次加入D-山梨糖醇將得到更可取的結(jié)果。通常采用D-山梨糖醇的總濃度約為20到250克/升，更可取的是總濃度為約50至200克/升。
培養(yǎng)條件可依所用微生物的種屬特性而變化，當(dāng)然培養(yǎng)基的組成可按不同情況的特點(diǎn)進(jìn)行選擇和確定以便最有效地產(chǎn)生所需產(chǎn)物，盡管可維持培養(yǎng)溫度約13至36℃，較可取的是約在18到33℃，培養(yǎng)基的PH值約在4.0到9.0間，較可取的是在約6.0到8.0之間。正常情況下，培養(yǎng)期在20到80小時(shí)就足夠了，在此周期內(nèi)在培養(yǎng)基內(nèi)形成的所需產(chǎn)物達(dá)到最大值。
為保持培養(yǎng)基的PH值使其最適宜酶的活性，任何適宜的酸堿試劑均可在培養(yǎng)期中的合適時(shí)間以合適的量加入到培養(yǎng)基中。這一目的還可以通過在培養(yǎng)開始時(shí)向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)木彌_劑來(lái)達(dá)到。
在培養(yǎng)基中如此制得的2-酮基-L-古洛糖酸可按已知的常規(guī)方法進(jìn)行分離和純化，且它可以鹽的形式被分離出來(lái)，例如鈉，鉀，鈣，銨鹽等，該鹽用已知的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化成游離的酸。
分離可按下列步驟的適當(dāng)結(jié)合或重復(fù)來(lái)進(jìn)行，例如，通過成鹽或利用產(chǎn)物與周圍雜質(zhì)性質(zhì)的不同，如在溶劑間溶解性，吸附性和分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。例如在離子交換樹脂上的吸附是一種方便的分離產(chǎn)物的方法，如此獲得的產(chǎn)物可以慣用的方法如重結(jié)晶或色譜法進(jìn)行進(jìn)一步純化。
因此，按該新方法收集的2-酮基-L-古洛糖酸能很容易地進(jìn)行分離，如，通過下列步驟培養(yǎng)肉汁的上清液在離心過濾后減壓下濃縮，向濃縮液中加入一種有機(jī)溶劑如乙醇，將得到的2-酮基-L-古洛糖酸結(jié)晶以鹽的形式分離出來(lái)，例如以鈉鹽或鈣鹽的形式分離。無(wú)論是使用上面的方法還是其它已知的方法，2-酮基-L-古洛糖酸總是可以很容易地進(jìn)行分離。
如此獲得的2-酮基-L-古洛糖酸或其鹽可通過酯化，然后通過烯醇化和內(nèi)酯化直接轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸。
能使用的培養(yǎng)方法包括靜置培養(yǎng)，振搖培養(yǎng)，液面下培養(yǎng)等。對(duì)于批量培養(yǎng)，使用分批，分批加料和連續(xù)操作技術(shù)的液面下培養(yǎng)是最適用的，還可使用微生物(A)和(B)的固定化細(xì)胞，固定化的方法是在如纖維素，陶瓷或玻璃珠等材料上的吸附，在如瓊脂、藻酸鈣，K-角叉膠和其它的已知的聚合物的凝膠基質(zhì)上的截留方法。這一方式使得微生物可被反復(fù)使用。
通過下列實(shí)施例可以說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1DSMNO.4025菌株代表微生物(B)，而表1中所列的微生物用作微生物(A)。種子培養(yǎng)物的制備種子培養(yǎng)物可按如下所述的兩種不同方法進(jìn)行制備。
方法1在一試管(18mm×200mm)中裝入5毫升培養(yǎng)基(SCM)D-山梨糖醇2%，酵母提取物[面包酵母(Oriental Yeast)]0.3%，牛肉提取物0.3%，玉米漿0.3%，多胨1.0%，尿素0.1%，KH2PO40.1%，MgSO4.7H2O0.02%，及CaCO30.1%(滅菌前PH7.0)并用高壓滅菌器在121℃滅菌20分鐘。將一菌環(huán)的微生物(A)和一菌環(huán)的微生物(B)接種到試管中，并在30℃下振蕩(220rpm)培育一天。
方法2將一菌環(huán)的微生物(B)和一菌環(huán)的微生物(A)接種到含有5毫升SCM的試管(18mm×200mm)中并在30℃下振蕩培養(yǎng)一天，取一滴形成的培養(yǎng)液鋪展于瓊脂培養(yǎng)基上，在SCM中含瓊脂2%，在30℃下培育4天，在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物以混合物狀態(tài)可作為接種物被直接用于下面的液體培養(yǎng)。將一菌環(huán)上述混合物接種到含有5毫升SCM的試管中并在30℃下振蕩(220rpm)培育一天。
主發(fā)酵將5毫升如上所制備形成的種子培養(yǎng)液接種到含有50毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基(PM)的500ml錐形瓶中，(PM)D-山梨糖醇8%，玉米漿1%，尿素1.5%(單獨(dú)滅菌的)，KH2PO40.1%，MgSO4.7H2O0.01%，及CaCO30.6%和消泡劑0.1%(滅菌前PH7.0)在30℃振蕩(18rpm)培育4天。表1概括了用高效液相色譜測(cè)得的培養(yǎng)的肉汁中2-酮基-L-古洛糖酸的定量測(cè)定結(jié)果。
實(shí)施例2按與實(shí)施例1中描述的方法1同樣的方式制備弱氧化葡糖桿菌IFO3255和DSMNO.4025菌株的種子培養(yǎng)液。弱氧化葡糖桿菌IFO3255和DSMNO.4025菌株的種子培養(yǎng)液的細(xì)胞濃度分別為3.7×1010細(xì)胞/毫升和5.4×108細(xì)胞/毫升。得到的每個(gè)種子培養(yǎng)液以全部接種物量的10%(V/V)接種到在500毫升錐形瓶中的50毫升PM中，其中弱氧化葡糖桿菌IFO3255和DSMNO。4025菌株的接種物比率(%，V/V)變化為0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6，∶4，7∶3，8∶2，9∶1和10∶0。將錐形瓶在30℃下培育4天。結(jié)果列于表2。當(dāng)DSMNO.4025菌株與弱氧化葡糖桿菌IFO3255間接種物比率為1∶9到4∶6時(shí)，從80克/升D-山梨糖醇而產(chǎn)生的2-酮基-L-古洛糖酸高至63.9克/升至66.6克/升(轉(zhuǎn)化率74.9到78.1mol%)不產(chǎn)生任何2-酮基-D-古洛糖酸。
備注1.弱氧化葡糖桿菌IFO32552.DSMNO.4025菌株3.2-酮基-L-古洛糖酸4.2-酮基-D-古洛糖酸實(shí)施例3弱氧化葡糖桿菌IFO3255和Gluconobacter gluconicusIFO3285用作微生物(A)，DSMNO.4025菌株用作微生物(B)。按與實(shí)施例1中描述的方法2相似的方式制備各自的種子培養(yǎng)液(200毫升)。將各自的種子培養(yǎng)液(200毫升)接種到含有約1.7升發(fā)酵培養(yǎng)基的3升發(fā)酵器中，發(fā)酵培養(yǎng)基D-山梨糖醇8%，10%或12%，酵母提取物0.5%，玉米漿2.5%，MgSO4.7H2O0.0086%，尿素0.086%(單獨(dú)滅菌的)，KH2PO40.086%和消泡劑0.15%，在121℃下滅菌20分鐘，接種后，培養(yǎng)液體積通過加入滅菌水調(diào)至2升。在30℃，攪拌速度700rpm和通氣量1升/分下進(jìn)行發(fā)酵，用4N的Na2CO3維持培養(yǎng)液PH在7.0，結(jié)果列于表3。
實(shí)施例4按與實(shí)施例3描述的同樣方式，將弱氧化葡糖桿菌IFO3255和DSMNO.4025菌株混合物的種子培養(yǎng)液(200毫升)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中含有8%D-山梨糖醇的3升發(fā)酵器中，工作體積用滅菌水調(diào)至2升。在與實(shí)施例3描述的同樣條件下開始發(fā)酵，分開地，在500毫升培養(yǎng)基瓶中裝入300毫升飼養(yǎng)培養(yǎng)基，120克D-山梨糖醇，10克酵母提取物，50克玉米漿，0.172克KH2PO4，1.72克尿素(單獨(dú)滅菌的)和2.5克消泡劑。在發(fā)酵期間，用蠕動(dòng)泵將上述飼養(yǎng)培養(yǎng)基連續(xù)輸送到發(fā)酵器中，發(fā)酵期為12到18小時(shí)，進(jìn)料速度為15毫升/小時(shí);發(fā)酵期為18到21小時(shí)，進(jìn)料速度為60毫升/小時(shí);發(fā)酵期為21到28小時(shí)，進(jìn)料速度為4.3毫升/小時(shí)。結(jié)果，經(jīng)過51小時(shí)發(fā)酵從276克D-山梨糖醇制得224克2-酮基-L-古洛糖酸，其轉(zhuǎn)化率為76.1mol%。
實(shí)施例5將一菌環(huán)弱氧化葡糖桿菌IFO3255接種到含100毫升SCM的500毫升錐形瓶中并在30℃下培育一天。將如此獲得的10毫升培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到含100毫升SCM的500毫升錐形瓶中并在30℃下培育一天，總共制得1.5升的弱氧化葡糖桿菌IFO3255種子培養(yǎng)液。另一方面，將一菌環(huán)DSMNO.4025菌株接種到裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升錐形瓶中，種子培養(yǎng)基L-山梨糖8%，丙三醇0.05%，尿素0.5%(單獨(dú)滅菌)，玉米漿1.75%，面包酵母(Oriental Yeast)5.0%，MgSO4·7H2O0.25%，CaCO31.5%和消泡劑0.1%(滅菌前PH7.0)于30℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器(180rpm)上培養(yǎng)一天，將10毫升如此制得的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到與上面同樣的培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)一天?？偣仓频肈SMNO.4025種子培養(yǎng)液1.5升。在50升發(fā)酵器中，加入25升發(fā)酵培養(yǎng)基D-山梨糖醇8%，玉米漿0.5%，MgSO4·7H2O0.01%，KH2PO40.025%及消泡劑0.17%并在121℃下滅菌30分鐘。同時(shí)接種兩種種子培養(yǎng)液(各1.5升)，總培養(yǎng)體積通過加入滅菌水調(diào)至30升。在30℃，攪拌速度400rpm及20升/分的送氣量下進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)液的PH用6.25N-NaOH保持在7.0分開地，裝有含1800克D-山梨糖醇，150克玉米漿，1.29克MgSO4·7H2O，7.5克KH2PO4和25克消泡劑的飼養(yǎng)培養(yǎng)基的5升培養(yǎng)基瓶在120℃下滅菌20分鐘，培養(yǎng)12小時(shí)后利用蠕動(dòng)泵以222毫升/小時(shí)的速度連續(xù)向發(fā)酵器中加入飼養(yǎng)培養(yǎng)基，歷時(shí)18小時(shí)，培養(yǎng)45.5小時(shí)后，得到36.8升含93.5克/升2-酮基-L-古洛糖酸的發(fā)酵肉汁，換句話說(shuō)，從4200克D-山梨糖醇中制得了3441克2-酮基-L-古洛糖酸，其轉(zhuǎn)化率為76.8mol%。
實(shí)施例6在實(shí)施例5中得到的發(fā)酵肉汁(36.8升)通過離心過濾除去細(xì)胞及其它沉積物，含有93.5克/升2-酮基-L-古洛糖酸的上清液(2升)在于45℃減壓下濃縮至約1升，在濃縮過程中可觀察到白色沉淀。然后向濃縮液中加入100毫升乙醇，隨后在10℃靜置一天。得到的沉淀用過濾法收集，用少量50%冷乙醇洗并在室溫下減壓干燥。結(jié)果得到137.6克2-酮基-L-古洛糖酸單鈉鹽一水合物，該一級(jí)產(chǎn)品的純度為99.14%。母液在減壓下濃縮至約400毫升，向其中加入約100毫升乙醇使其在10℃下靜置24小時(shí)，結(jié)果作為二級(jí)產(chǎn)品得71.9克2-酮基-L-古洛糖酸單鈉鹽-水合物(純度85.04%)。
實(shí)施例7在實(shí)施例6中獲得的上清液(0.5升)通過AmberliteIR-120(H-型)(RohmandHaasCompany)并在減壓下干燥，向干燥物(約50克)中加入400毫升甲醇和0.5毫升98%硫酸，混合物在90℃加熱2小時(shí)后，除去甲醇，剩余物用少量甲醇洗滌并干燥，然后將干燥過的剩余物懸浮于150毫升的甲醇中并在加熱下與10克甲醇鈉一起回流。濾出冷卻后得到的結(jié)晶并在減壓下干燥，結(jié)果得到35.1克L-抗壞血酸鈉鹽。
實(shí)施例8將一菌環(huán)弱氧化葡糖桿菌IFO3291接種到裝有100毫升SCM的500毫升錐形瓶中并在30℃下培育18小時(shí)。另外，將一菌環(huán)DSMNO.4025菌株接種到裝有100毫升如實(shí)施例5所述的種子培養(yǎng)基的500毫升錐形瓶中并在30℃下培養(yǎng)22小時(shí)，將如此制得的10毫升培養(yǎng)液接種到裝有100毫升與上面同樣的培養(yǎng)基的500毫升錐形瓶中并在30℃下培育18小時(shí)。
向3升發(fā)酵器中加入1.6升含有160克D-山梨糖醇，10克玉米漿，0.2克MgSO4·7H2O，0.5克KH2PO4和2克消泡劑的發(fā)酵培養(yǎng)基并在121℃下滅菌30分鐘。
同時(shí)接種如上制得的兩種種子培養(yǎng)液(各100毫升)，總培養(yǎng)體積通過加入滅菌水調(diào)至2升。分開地，裝有300毫升含180克D-山梨糖醇，10克玉米漿，0.086克MgSO4·7H2O，0.215克KH2PO4和1克消泡劑的飼養(yǎng)培養(yǎng)基的500毫升培養(yǎng)基瓶在121℃下滅菌30分鐘。在通氣速度為1.0升/分下進(jìn)行發(fā)酵并用NaOH將培養(yǎng)基PH調(diào)整到7.0，其它發(fā)酵參數(shù)列于表4，培養(yǎng)6.5小時(shí)后，飼養(yǎng)培養(yǎng)基用蠕動(dòng)泵以30毫升/小時(shí)的速度送入發(fā)酵器中持續(xù)10小時(shí)，如表4所示，從340克D-山梨糖醇總共制得2-酮基-L-古洛糖酸322.7克，其摩爾轉(zhuǎn)化率為89.0%，此時(shí)發(fā)酵在28℃和800rpm攪拌速度下進(jìn)行。
關(guān)于在實(shí)施例中所用的特定菌株和菌株混合物1992年3月30日按照布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了追加保藏，如下所示A.單一培養(yǎng)物新保藏號(hào)DSMNO.4025菌株FERMBP-3812B.混合微生物培養(yǎng)物保藏號(hào)DSMNO.4025菌株+弱氧化FERMBP-3815葡糖桿菌IFO3256DSMNO.4025菌株+弱氧化FERMBP-3813葡糖桿菌IFO3291DSMNO.4025菌株+弱氧化FERMBP-3814葡糖桿菌IFO325權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸或其鹽的方法，該方法包括在含有D-山梨糖醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有從D-山梨糖醇產(chǎn)生L-山梨糖的能力，屬于葡糖桿菌或醋酸桿菌的微生物(A)和具有從L-山梨糖產(chǎn)生2-酮基-L-古洛糖酸的能力具有DSMNo.4025菌株分類特點(diǎn)的微生物(B)，其功能等價(jià)物，亞培養(yǎng)物，突變體或變異體的混合培養(yǎng)物，借此進(jìn)行混合培養(yǎng)，其中所說(shuō)的兩種微生物在整個(gè)培養(yǎng)期的至少一部分時(shí)間內(nèi)共存于培養(yǎng)基中，并收集2-酮基-L-古洛糖酸及其鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中微生物(A)屬于由下組選出的菌種，該組包括弱氧化葡糖桿菌，gluconicus葡糖桿菌，赤褐色葡糖桿菌，微白色葡糖桿菌，industrius葡糖桿菌，cerinus葡糖桿菌，diacetonicus葡糖桿菌，roseus葡糖桿菌，醋化醋桿菌奧爾蘭亞種，液化醋桿菌或醋化醋桿菌木質(zhì)亞種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中微生物(A)是一種葡糖桿菌，最好是IFO3255，3256，3258，3267，3285，3290，3291菌株之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其特征在于使用相應(yīng)于DSM NO.4025菌株的微生物(B)，其功能等價(jià)物、亞培養(yǎng)物，突變體或變異體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的方法，其中D-山梨糖醇使用濃度為約20克/升到約250克/升，優(yōu)選的是約50克/升到約200克/升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5的任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)是在PH為約4.0到9.0之間，優(yōu)選的是約6.0到8.0之間進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)是在溫度約為13到36℃間進(jìn)行的，優(yōu)選的是在約18到33℃間進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7的任一項(xiàng)的方法，其中的2-酮基-L-古洛糖酸是用已知的方法轉(zhuǎn)化為抗壞血酸或其鹽的。
9.一種混合的微生物培養(yǎng)物，包括具有從D-山梨糖醇產(chǎn)生L-山梨糖的能力，屬于葡糖桿菌或醋酸桿菌的微生物(A)，和具有從L-山梨糖產(chǎn)生2-酮基-L-古洛糖酸的能力具有DSM NO.4025菌株分類特點(diǎn)的微生物(B)，其功能等價(jià)物，亞培養(yǎng)物，突變體或變異體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的微生物培養(yǎng)物，其中(A)是IFO3255，IFO3256或IFO3291菌株和它們的功能等價(jià)物的培養(yǎng)物，或亞培養(yǎng)物，突變體或變異體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的微生物培養(yǎng)物，其特征在于從L-山梨糖醇產(chǎn)生2-酮基-L-古洛糖酸的能力為產(chǎn)率至少為60克/升，較好的至少為120克/升，最好的至少為130克/升。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用發(fā)酵法以高產(chǎn)率轉(zhuǎn)化D-山梨糖醇而生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸的方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1067681SQ9210457
公開日1993年1月6日 申請(qǐng)日期1992年6月12日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月13日
發(fā)明者立夫星埜, 節(jié)子尾島, 昭秀杉澤 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司