專利名稱：來(lái)自煙草的新的水楊酸誘導(dǎo)型基因和啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明致力于植物的病原體抗性領(lǐng)域，尤其是通過新的水楊酸誘導(dǎo)型基因和啟動(dòng)子賦予植物病原體抗性，和包含該可誘導(dǎo)型基因和啟動(dòng)子的載體、宿主和細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含這些基因的植物，和由此顯示對(duì)真菌病原體的易感性降低的植物。此外，本發(fā)明致力于該啟動(dòng)子作為病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)賦予植物宿主以病原體抗性的基因表達(dá)的用途。本發(fā)明還致力于該啟動(dòng)子因水楊酸(SA)或SA類似物處理(而非SA的普通誘導(dǎo))而誘導(dǎo)表型特征表達(dá)的使用。
背景技術(shù)：
當(dāng)宿主植物受到病毒、細(xì)菌、或真菌病原體攻擊時(shí)，它以許多方式做出應(yīng)答。推測(cè)大多數(shù)應(yīng)答是通過消除或限制病原體、并限制病原體引起的損害來(lái)保護(hù)植物的。在某些情況中，防衛(wèi)嘗試是不成功的，病原體進(jìn)行復(fù)制并通過植物進(jìn)行傳播，通常引起宿主受損甚至死亡。甚至在病原體成功感染的那些情況中，植物也發(fā)生防衛(wèi)應(yīng)答，但是通常太小或太慢。
植物建立針對(duì)病原體攻擊的抗性的兩種機(jī)制，即過敏反應(yīng)(HR)和全身獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)，已經(jīng)被廣泛研究。HR在自然條件下是非常特異的，而且限于特定病原體種類(pathovar)和特定植物品種之間，似乎遵循基因-基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系(Flor,Ann.Rev.Phytopathol.9:275-296,1971)。即病原體的單個(gè)顯性基因在攜帶相應(yīng)顯性抗性基因的植物上引起過敏反應(yīng)。
作為過敏反應(yīng)的結(jié)果，植物進(jìn)入防衛(wèi)能力增強(qiáng)狀態(tài)，稱為SAR(全身獲得性抗性)，并保護(hù)植物免受原本有毒性的病原體的感染。
關(guān)于過敏反應(yīng)和SAR發(fā)展涉及的信號(hào)途徑的理解是貧乏的。早期研究顯示，水楊酸(SA)在局部和全身都積累至顯著水平。還有，用水楊酸處理植物，增加了PR基因的表達(dá)水平和植物對(duì)病原體的抗性，說明SA在建立SAR中發(fā)揮至關(guān)重要的作用(見Ryals,Plant Cell8:1809-1819,1996)。
SA重要性的更確鑿證據(jù)來(lái)自攜帶惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的nahG基因的轉(zhuǎn)基因植物。nahG的基因產(chǎn)物使SA羥基化，并使之失活。由于病原體在初始感染位點(diǎn)生長(zhǎng)并傳播，所以nahG轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥植物建立有效的過敏反應(yīng)的能力受到削弱(Gaffney等人，Science 261:754-756,1993；Delaney等人，Science266:1247-1250,1994)。nahG轉(zhuǎn)基因植物在建立SAR應(yīng)答中也是有缺陷的。
然而，顯然存在誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的其它途徑，而且nahG在煙草中的過量表達(dá)并不危及對(duì)Cf9或Cf2植物用分別包含Avr9和Avr2的黃枝孢(Cladosporium fulvum)品種攻擊后發(fā)生的過敏反應(yīng)(Hammond-Kosack&Jones,Plant Cell 8:1773-1791,1996)。
關(guān)于SA在植物疾病信號(hào)傳導(dǎo)中的作用的綜述，可以參閱Durner等人，Trends Plant Sci.2,266-274,1997；Chasan,Plant Cell7:1519-1521,1995；Klessig和Malamy,Plant Mol.Biol.26:1439-1458,1994；和J.Malamy和D.A.Klessig,The Plant J.2:643-654,1992。
已顯示SAR狀態(tài)與煙草中至少16種基因的協(xié)同表達(dá)相一致(Ward等人，Plant Cell 3:1085-1094,1991)，這些基因包括編碼PR蛋白質(zhì)的那些基因(回顧見J.F.Bol和J.A.Van Kan,Microbiol.Sci.5(2):47-52,1988和D.J.Bowles,Annu.Rev.Biochem.59:873-907,1990)。
在鑒定介導(dǎo)SA應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分方面取得了一些進(jìn)展。最初認(rèn)為，鑒定為過氧化氫酶的SA結(jié)合蛋白，通過抑制過氧化氫酶的功能將SA信號(hào)轉(zhuǎn)換成過氧化氫(H2O2)的增加(Chen等人，Science262:1883-1886,1993)。由于發(fā)現(xiàn)H2O2處理可誘導(dǎo)PR基因在煙草中表達(dá)，Klessig及其工作人員提出，H2O2是誘導(dǎo)防衛(wèi)應(yīng)答途徑中的下游信號(hào)。然而，后來(lái)證明PR基因的H2O2誘導(dǎo)依賴SA積累(Bi等人，PlantJ.8:235-245,1995；Neuenschwander等人，Plant J.8:227-233,1995)。最近，又鑒定了一種SA結(jié)合蛋白，SABP2，其特征為結(jié)合親和力比過氧化氫酶高150倍(Du和Klessig,Plant Physiol.113:1319-1327,1997)。SABP2的多種特征與該蛋白質(zhì)作為SA受體的功能一致。Jupin和Chua(EMBO J.15:5679-5689,1996)鑒定了由TGAla相關(guān)的bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子組成的已知為SARP的煙草DNA結(jié)合活性。當(dāng)不存在SA時(shí)，SARP作為無(wú)活性復(fù)合物存在；但是用SA處理1hr，將導(dǎo)致其與花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子的SA誘導(dǎo)型as-1元件結(jié)合。用解離劑處理對(duì)照提取物，可以由其抑制性成分SAI釋放SARP。由于用磷酸酶處理SA誘導(dǎo)的提取物阻斷了DNA結(jié)合活性，所以SA處理后釋放SARP的天然信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑很可能涉及磷酸化。具有與該應(yīng)答一致特征的一種激酶是SIP激酶，它是在用SA處理培養(yǎng)的煙草細(xì)胞后被快速且暫時(shí)誘導(dǎo)的MAP激酶家族成員。激酶活性在5min內(nèi)由背景升高至尖峰活性，并在45min后減小(Zhang和Klessig,PlantCell 9:809-824,1997)。最后，NPR1/NIM1/SAI1蛋白是作為SA感應(yīng)或PR基因誘導(dǎo)的正調(diào)控子的ankyrin重復(fù)/類IkB蛋白(Cao等人，Cell 88:57-63,1997；Ryals等人，Plant Cell 9:425-439,1997；Shah等人，Mol.Plant-Microbe Interact.10:69-78,1997)。該功能缺陷的擬南芥植物在應(yīng)答SA處理或病原體攻擊中不能誘導(dǎo)PR基因，且對(duì)疾病更敏感。這些成分的鑒定大大幫助了對(duì)早期SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的理解?？偟膩?lái)說，它們形成了一種模型，即受體將SA升高傳達(dá)給潛在的信號(hào)成分(諸如激酶)，該信號(hào)成分再修飾靶向SA誘導(dǎo)型基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。
相反的，在鑒定SA應(yīng)答基因方面取得的進(jìn)展很少。研究最多的是用不相容病原體或直接應(yīng)用SA處理后被誘導(dǎo)至高水平的PR基因(Eyal等人，Plant Mol.Biol.19:589-599,1992；Ward等人，Plant Cell3:1085-1094,1991)。PR基因?qū)A的應(yīng)答，首先在6-8hr觀察到，并在隨后幾天穩(wěn)定上升。在誘導(dǎo)疾病抗性的時(shí)間進(jìn)度上，該應(yīng)答被認(rèn)為是快速的；然而，在對(duì)刺激的分子應(yīng)答的時(shí)間進(jìn)度上，該應(yīng)答是緩慢的。已經(jīng)證明PR基因表達(dá)在早期基因誘導(dǎo)事件中是暫時(shí)的(Qin等人，Plant Cell 6:863-874,1994；Uknes等人，Plant Cell5:159-169,1993)。
關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的相似初級(jí)基因應(yīng)答的鑒定(Almendral等人，Mol.Cell.Biol.8:2140-2148,1988；Beadling等人，Proc.NatL.Acad.Sci.USA 90:2719-2723,1993；Larner等人，J.Biol.Chem.261:453-459,1986；Lau和Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:1182-1186,1987；Zipfel等人，Mol.Cell.Biol.9:1041-1048,1989)揭示了，為過去10年在理解這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的廣泛進(jìn)展提供基礎(chǔ)的基因的評(píng)價(jià)。我們開始鑒定可能包括PR基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分的早期SA應(yīng)答基因，以更多的了解SA如何在分子水平發(fā)揮功能。這些基因的鑒定將使得鑒定誘導(dǎo)疾病抗性過程中晚期應(yīng)答建立涉及的事件成為可能。它們還將提供定性鑒定細(xì)胞對(duì)SA的初級(jí)應(yīng)答中涉及的順式元件、轉(zhuǎn)錄因子和上游信號(hào)成分的機(jī)會(huì)。轉(zhuǎn)錄因子和上游信號(hào)成分的鑒定涉及細(xì)胞對(duì)SA的初級(jí)應(yīng)答。
發(fā)明概述本發(fā)明包括當(dāng)與其天然調(diào)控序列可操作連接時(shí)用水楊酸誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)的多核苷酸，其特征為該多核苷酸包含選自基本上由SEQID NO:1-9組成之組的序列，或是編碼SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多核苷酸序列。本發(fā)明還包括包含這種核苷酸序列的嵌合DNA序列，優(yōu)選還包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，并任選包含轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。特別優(yōu)選的是其中轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的嵌合DNA，其中所述可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
這種嵌合DNA序列可以位于載體中。
本發(fā)明的另一個(gè)部分是包含這種載體的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中一旦存在該載體，即能夠維持該載體，本發(fā)明還/或包括在其基因組中穩(wěn)定摻入上述核苷酸序列的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)部分是特征為包含天然位于上述多核苷酸或多核苷酸序列5’側(cè)并能調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的核酸序列的啟動(dòng)子。優(yōu)選這種啟動(dòng)子包含SEQ ID NO:10的第1-431位核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)部分是包含本發(fā)明病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體和包含這種載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選植物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)部分是包含至少一個(gè)這樣的植物細(xì)胞或基本上由這樣的植物細(xì)胞組成的植物或植物部分。
本發(fā)明的另一個(gè)部分是使植物對(duì)病原體攻擊有抗性的方法，其特征為用包含本發(fā)明核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明的還有一個(gè)部分是在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，其特征為將本發(fā)明啟動(dòng)子與編碼要表達(dá)的蛋白質(zhì)的多核苷酸進(jìn)行可操作連接以作為調(diào)控區(qū)使用，具體地說，其中所述啟動(dòng)子可由水楊酸或其類似物誘導(dǎo)，或可由病原體感染誘導(dǎo)。
本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案是在植物中誘導(dǎo)不同于SA處理正常誘導(dǎo)的表型性狀的方法。
圖的描述

圖1．四類SA誘導(dǎo)的早期基因。對(duì)由差異顯示鑒定的基因進(jìn)行Northern分析。將經(jīng)凝膠純化的ddPCR產(chǎn)生的DNA片段，直接用于隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記和探查Northern濾膜(如C7-1、C6-1、和G9-2)，或首先進(jìn)行亞克隆并通過限制酶消化釋放。每條道含有1μg來(lái)自經(jīng)下列處理的培養(yǎng)的煙草細(xì)胞poly(A)mRNA:(1)H2O,4hr；(2)200μM SA,4hr；(3)；71μM CHX,5hr；(4)71μM CHX,5hr且1hr后加入200μM SA(總共4hr)；(5)20μM SA,2hr；(6)200μM SA,2hr；(7)200μM SA,8hr。結(jié)果一個(gè)印漬與G1-1片段發(fā)生雜交，其中β-ATPase基因作為上樣對(duì)照探針。應(yīng)答類型(Ⅰ-Ⅳ)表示于放射自顯影圖的左邊。
圖2．SA誘導(dǎo)的基因表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。用SA處理培養(yǎng)的煙草細(xì)胞指定時(shí)間(單位hr，除了2-4道為10、20、和30min)后，代表性差異顯示基因的Northern分析。每條道上樣20μg總RNA。將印漬與右邊表示的ddPCR片段或作為上樣對(duì)照探針的β-ATPase基因進(jìn)行雜交。優(yōu)化每種基因的放射自顯影的曝光時(shí)間。使用全長(zhǎng)cDNA作為探針，以增強(qiáng)C18-1的信號(hào)。左邊的標(biāo)記表示應(yīng)答類型。
圖3．CHX對(duì)SA處理后mRNA的時(shí)間依賴性積累的影響。將培養(yǎng)的煙草細(xì)胞用H2O(1-4道)、200μM SA(5-9道)、71μM CHX(10-14道)71μM CHX+200μM SA(15-19道)處理0.5、1、4、8或24hr(圖A)或0.5、1、3、5或10hr(圖B)后，代表性差異顯示基因的Northern分析。在每個(gè)時(shí)程開始前1hr開始CHX預(yù)處理，因此CHX溫育時(shí)間比表示的時(shí)間長(zhǎng)1hr。每條道上樣20μg總RNA。將印漬與右邊表示的ddPCR片段或作為上樣對(duì)照探針的β-ATPase基因進(jìn)行雜交。優(yōu)化每種基因的放射自顯影的曝光時(shí)間。左邊的標(biāo)記表示應(yīng)答類型。
圖4．SA類似物和其它信號(hào)成分的誘導(dǎo)特異性。將煙草細(xì)胞用100μM或1mM(依次為三角形的左邊和右邊)下列化學(xué)藥品處理2-2.5hr后，代表性差異顯示基因的Northern分析水楊酸(SA,4和5道)、乙酰水楊酸(ASA,6和7道)、苯甲酸(BA,8和9道)、4-氫基苯甲酸(4HBA,10和11道)、硫胺素(thia,12和13道)、茉莉酮酸甲酯(MJ,14和15道)、脫落酸(ABA,16和17道)、或2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D,18和19道)。對(duì)照處理是H2O(H,1道)、1％乙醇(E,MJ處理中的溶劑濃度，2道)、或1％DMSO(D,2,4-D處理中的溶劑濃度，3道)。將印漬與右邊表示的ddPCR片段或作為上樣對(duì)照探針的β-ATPase基因進(jìn)行雜交。優(yōu)化每種基因的放射自顯影的曝光時(shí)間。使用全長(zhǎng)cDNA作為探針，以增強(qiáng)C18-1的信號(hào)。左邊的標(biāo)記表示應(yīng)答類型。
圖5．C8-1和G8-1對(duì)一定范圍的化學(xué)藥品的劑量應(yīng)答。煙草細(xì)胞在8種濃度的SA、ASA、BA、4HBA、Thia、MJ、ABA、2,4-D、或H2O中培養(yǎng)2-2.5hr后的Northern分析。如圖所示，濃度為0.1、1、3、10、30、100、300μM或2mM。
圖6．多種SA誘導(dǎo)型基因?qū)A濃度的敏感性。曲線表示，將培養(yǎng)的煙草細(xì)胞與一定濃度范圍的SA一起溫育2-2.5hr后，G8-1(□)、C18-1(◆)和IEGT(○)的mRNA積累圖。RNA凝膠印漬由磷光成像分析定量，并相對(duì)于β-ATPase基因上樣對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(沒有顯示)。
圖7．接種了TMV的煙草植物中基因表達(dá)的誘導(dǎo)時(shí)程。接種了TMV(+)或模擬接種(m)并于接種后28、32、36、40、56、和74hr(hpi)收獲的抗性煙草植物葉片中，C18-1、IEGT、和G8-1 mRNA積累的Northern分析。在處理期的起點(diǎn)采集兩種未接種植物(-)葉片作為樣品。每條道代表單個(gè)植物。還用Prla基因和作為上樣對(duì)照的β-ATPase，探查RNA凝膠印漬。左邊的標(biāo)記表示應(yīng)答類型。
圖8．A．研究攜帶啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)導(dǎo)構(gòu)建物的植物中SA誘導(dǎo)型基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)示意圖。收獲轉(zhuǎn)基因植物的部分葉片，分離，并將一半用SA浸泡處理，另一半用水處理。然后都噴灑熒光素溶液，并測(cè)試熒光。B．使用IEGT/G1-1啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)導(dǎo)構(gòu)建物轉(zhuǎn)基因的煙草葉片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在圖上，葉片的左邊用SA浸泡，右邊用水浸泡。用較淺的顏色表示增強(qiáng)的熒光。
發(fā)明詳述我們?cè)诖嗣枋隽薙A處理后2-3hr內(nèi)誘導(dǎo)的總共15種基因。這些基因顯示多種獨(dú)特的應(yīng)答模式，包括不相容病原體相互作用過程中的誘導(dǎo)。這些基因的鑒定不僅顯著增強(qiáng)了我們關(guān)于細(xì)胞對(duì)SA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的理解，并提供了大量新的SA作用的分子標(biāo)記，而且它還提供了在無(wú)較高SA濃度誘導(dǎo)的刺激的情況下，使用這些基因引發(fā)負(fù)責(zé)產(chǎn)生病原體抗性的級(jí)聯(lián)事件的機(jī)會(huì)。推測(cè)本發(fā)明基因的過度表達(dá)引發(fā)最終導(dǎo)致PR基因誘導(dǎo)和全身獲得性抗性發(fā)展的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。進(jìn)一步推測(cè)導(dǎo)致持續(xù)的獲得性抗性狀態(tài)的基因的連續(xù)表達(dá)，將妨礙植物的自然發(fā)育。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是基因表達(dá)處于可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下、可以有目的的開關(guān)的基因表達(dá)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)將使植物能夠在全身抗性是有利的時(shí)間點(diǎn)或時(shí)機(jī)表達(dá)基因。
必須理解，編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列可以自由變化，只要產(chǎn)生的基因產(chǎn)物仍能夠觸發(fā)導(dǎo)致獲得性抗性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)即可。特別的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以通過遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性或改變密碼子使用，使之適應(yīng)將要轉(zhuǎn)化的植物的密碼子用法，產(chǎn)生核苷酸序列的變體。還有，用于轉(zhuǎn)化的多核苷酸可以進(jìn)行修飾，即可以除去使mRNA不穩(wěn)定的基元和/或隨機(jī)剪接區(qū)，使得經(jīng)這樣修飾的多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上相似的基因產(chǎn)物。本發(fā)明的其它序列可以由它們與序列表中所列序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的能力進(jìn)行鑒定。這方面的嚴(yán)謹(jǐn)條件指于60-65℃溫度下，在含0.1％SDS的0.3強(qiáng)度的檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，隨后于相同溫度用含0.1％SDS的0.3強(qiáng)度的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行漂洗。
本發(fā)明基因編碼蛋白質(zhì)?！暗鞍踪|(zhì)”指，通過肽鍵聯(lián)系的氨基酸序列。多肽或肽也被認(rèn)為是蛋白質(zhì)。本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變蛋白(mutein)指，由序列表中記錄的蛋白質(zhì)通過取代、添加和/或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的、仍然保留活性(即觸發(fā)抗性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的能力)的蛋白質(zhì)。這種突變蛋白通過體內(nèi)蛋白質(zhì)工程可以容易的制備，如改變編碼酶的開放閱讀框架，使得氨基酸序列由此受到影響。只要氨基酸序列的變化總的來(lái)說不會(huì)消除酶活性，該突變蛋白就包含于本發(fā)明。此外，應(yīng)當(dāng)這樣理解，突變應(yīng)當(dāng)能夠由序列表中記錄的蛋白質(zhì)序列或編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列衍生得到，且仍保留生物學(xué)活性，即突變蛋白質(zhì)和序列表中記錄的蛋白質(zhì)之間的所有或大部分中間物應(yīng)當(dāng)具有酶活性。“大部分”指30％或更多，優(yōu)選40％或更多，更優(yōu)選50％或更多，更優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選70％或更多，更優(yōu)選80％或更多，更優(yōu)選90％或更多，更優(yōu)選95％或更多，更優(yōu)選99％或更多中間體。特別的，序列中的取代可以在下列氨基酸組中進(jìn)行，即(a)丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸(b)谷氨酸和天冬氨酸(c)精氨酸和賴氨酸(d)異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸(e)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸本發(fā)明提供了包含本發(fā)明表達(dá)盒的嵌合DNA序列。在此說明書中，涉及DNA序列的術(shù)語(yǔ)“嵌合”包括，包含上述核苷酸的開放閱讀框架的DNA序列(其中序列通過與另一種序列融合而改變，其中另一種序列可以是植物內(nèi)源的或非內(nèi)源的)，以及通過添加、刪除、取代而改變的序列(其中該嵌合DNA是原位或以其它方式形成)。
嵌合DNA不應(yīng)當(dāng)限于在宿主中能夠復(fù)制的DNA分子，還應(yīng)當(dāng)包括能夠連接到復(fù)制子中的DNA，例如借助特定銜接頭序列的幫助，與本發(fā)明的開放閱讀框架進(jìn)行物理連接。開放閱讀框架可以與(或不與)它的天然上游和下游調(diào)控元件相連接。
開放閱讀框架可以由基因組文庫(kù)衍生得到。在后一實(shí)施方案中，它可能包含一個(gè)或多個(gè)將外顯子分開的內(nèi)含子，所述外顯子構(gòu)成編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的開放閱讀框架。開放閱讀框架還可能由一個(gè)不中斷的外顯子，或由編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA的cDNA編碼。本發(fā)明的開放閱讀框架還包含人為除去或加入一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的那些開放閱讀框架。這些變體的每一種都包含于本發(fā)明。
為了能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)，本發(fā)明的嵌合DNA通常將包含使之能夠被宿主的生化機(jī)制識(shí)別、并使開放閱讀框架能夠在宿主中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的調(diào)控元件。它通常將包含可能由在選擇的宿主細(xì)胞中能夠表達(dá)的任何基因適當(dāng)衍生得到的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以及用于核糖體識(shí)別和附著的翻譯起始區(qū)。在真核細(xì)胞中，表達(dá)盒通常額外包含位于所述開放閱讀框架下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，使轉(zhuǎn)錄能夠終止并使初級(jí)轉(zhuǎn)錄本發(fā)生多聚腺苷酸化。另外，可以改變密碼子用法，以適應(yīng)選擇的宿主的密碼子用法。此外，通常還編碼負(fù)責(zé)將基因表達(dá)產(chǎn)物靶向亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的信號(hào)序列。有關(guān)在選擇的宿主細(xì)胞中嵌合DNA構(gòu)建物表達(dá)的原則，通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，而任何種類宿主細(xì)胞(原核或真核)的可表達(dá)嵌合DNA構(gòu)建物的構(gòu)建現(xiàn)在是常規(guī)工作。
為了在宿主細(xì)胞中維持開放閱讀框架，通常將其以包含本發(fā)明所述開放閱讀框架及與之連接的可由選擇的宿主細(xì)胞識(shí)別和復(fù)制的DNA的復(fù)制子形式提供。相應(yīng)的，復(fù)制子的選擇主要由選定的宿主細(xì)胞決定。選擇的復(fù)制子要適應(yīng)特定選擇的宿主，這種原則完全屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的領(lǐng)域。
一種特殊類型的復(fù)制子是能夠?qū)⑵渥陨砘虿糠洲D(zhuǎn)移到另一種宿主細(xì)胞(諸如植物細(xì)胞)中，由此將本發(fā)明的開放閱讀框架共轉(zhuǎn)移到所述植物細(xì)胞中的復(fù)制子。具有這種能力的復(fù)制子此處稱為載體。這種載體的實(shí)例是，當(dāng)存在于合適宿主(諸如根瘤農(nóng)桿菌)中時(shí)能夠?qū)⑵渥陨淼囊徊糠?所謂的T區(qū))轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的Ti質(zhì)粒載體?，F(xiàn)在不同類型的Ti質(zhì)粒載體(參閱EP 0 116 718 B1)被常規(guī)用于將嵌合DNA序列轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞或原生質(zhì)體中，由此可以產(chǎn)生在其基因組中穩(wěn)定摻入了所述嵌合DNA的新植物。Ti質(zhì)粒載體特別優(yōu)選的形式是所謂的二元載體，其基本上如EP 0 120 516 B1和US 4,940,838中要求保護(hù)的?？梢杂糜趯⒈景l(fā)明的DNA導(dǎo)入植物宿主的其它合適的載體，可以選自病毒載體，如非整合的植物病毒載體，諸如可以由雙鏈植物病毒(如CaMV)和單鏈病毒、雙病毒等等衍生得到的載體。使用這些載體可能是有利的，當(dāng)難以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物宿主時(shí)尤其如此。在木本植物，尤其是樹和藤本植物情況下就可能如此。
表述“在其基因組中摻入了本發(fā)明嵌合DNA序列的宿主細(xì)胞”應(yīng)當(dāng)包括在其基因組中穩(wěn)定摻入了所述嵌合DNA，由此維持該嵌合DNA，且優(yōu)選通過有絲分裂或減數(shù)分裂將一個(gè)拷貝的這種嵌合DNA傳遞給子代細(xì)胞的細(xì)胞、以及包含這種細(xì)胞或基本上由這種細(xì)胞組成的多細(xì)胞生物體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，提供了基本上由基因組中摻入了一個(gè)或多個(gè)拷貝的所述嵌合DNA的細(xì)胞組成、且能夠?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)拷貝傳遞給后代(優(yōu)選通過孟德爾方式)的植物。借助本發(fā)明嵌合DNA在一些或所有植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)基因的那些細(xì)胞將顯示對(duì)病原體感染的抗性增強(qiáng)。雖然DNA在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的上述原則并不總能被理解，構(gòu)建能夠基本上以組成性方式(即基本上在大多數(shù)植物細(xì)胞類型中且基本上無(wú)嚴(yán)格的時(shí)間和/或發(fā)育限制)表達(dá)的嵌合DNA，現(xiàn)在是常規(guī)技術(shù)。為此目的常規(guī)使用的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是可以由花椰菜花葉病毒得到的啟動(dòng)子，如35S和19S RNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和所謂的根瘤農(nóng)桿菌的T-DNA啟動(dòng)子，要特別提及的是胭脂堿合酶啟動(dòng)子、章魚堿合酶啟動(dòng)子(如EP 0 122 791 B1中公開的)和甘露堿合酶啟動(dòng)子。另外可以使用基本上是組成性的植物啟動(dòng)子，諸如水稻actin基因啟動(dòng)子，或如器官特異性啟動(dòng)子，諸如根特異啟動(dòng)子。優(yōu)選的，可以使用能夠由外部因子誘導(dǎo)病原體抗性、能夠在最適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)應(yīng)用的可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。由此預(yù)防不想要的效果，諸如在導(dǎo)致抗性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中產(chǎn)生的化合物的相關(guān)毒性引起的后果?？烧T導(dǎo)型啟動(dòng)子包括能夠應(yīng)答誘導(dǎo)物而增加由給定基因產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量的任何啟動(dòng)子。若誘導(dǎo)物不存在，DNA序列將不轉(zhuǎn)錄。通常，可與可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特異結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄的因子以無(wú)活性形式存在，然后由誘導(dǎo)物直接或間接的轉(zhuǎn)變成活性形式。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)試劑，諸如蛋白質(zhì)、代謝物(糖、醇、等等)、生長(zhǎng)調(diào)控子、除草劑、或類酚化合物，或通過熱、鹽、創(chuàng)傷、有毒元素等等直接或者通過病原體或致病劑(諸如病毒)的作用間接施加的生理學(xué)壓力。包含可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的植物細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)物的細(xì)胞外部應(yīng)用(諸如通過噴、灑、加熱、或相似方法)暴露于誘導(dǎo)物?？烧T導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，而且存在多種可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，能夠令人信服的用來(lái)驅(qū)動(dòng)本發(fā)明基因的表達(dá)。適合于本發(fā)明中使用的可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括(但不限于)熱休克啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物類固醇受體系統(tǒng)和任何化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?？烧T導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括黑腹果蠅的可誘導(dǎo)型70kD熱休克蛋白啟動(dòng)子(M.Freeling等人，Ann.Rev.Genet.19:297-323，)和由乙醇誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子(R.T.Nagao等人，在B.J.Miflin(編)OxfordSurveys of Plant Molecular and Cell Biology，第3卷，第384-438頁(yè)，Oxford Univ.Press，1986)。可由單一化學(xué)藥品誘導(dǎo)的啟動(dòng)子特別有用。最后一類的實(shí)例是WO 90/08826、WO 93/21334、WO93/031294和WO 96/37609中描述的啟動(dòng)子。作為病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例，可以提到的有可由馬鈴薯得到的PRP1啟動(dòng)子(也稱為gst1啟動(dòng)子)(N.Martini等人，Mol.Gen.Genet.263:179-186，1993)、Fisl啟動(dòng)子(WO 96/34949)、Betv 1啟動(dòng)子(I.Swoboda等人，PlantCell and Env.18:865-874,1995)、Vstl啟動(dòng)子(R.Fischer,Dissertation,Univ.of Hohenheim,1994；R.Schubert等人，PlantMol.Biol.34:417-426,1997)、倍半萜烯環(huán)化酶啟動(dòng)子(S.Yin等人，Plant Physiol.115:437-451,1997)和gstAl啟動(dòng)子(F.Mauch和R.Dudler,Plant Physiol.102:1193-1201,1993)。來(lái)自長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)的ICS基因的調(diào)控區(qū)，和蛋白質(zhì)MS59和WL64的啟動(dòng)子區(qū)(WO 98/13478)也可以在這方面使用。
啟動(dòng)子的選擇并不重要，雖然必需要說可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是優(yōu)選的。還知道某些元件(所謂的增強(qiáng)子)的重復(fù)有可能顯著增強(qiáng)受其控制的DNA的表達(dá)水平(參閱例如R.Kay等人，Science 236:1299-1302,1987:CaMV 35S啟動(dòng)子的-343和-90之間的序列的重復(fù)增加了該啟動(dòng)子的活性)。本發(fā)明還包括雜合啟動(dòng)子，它們包含物理連接的不同啟動(dòng)子區(qū)元件。
關(guān)于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的必要性，通常認(rèn)為這種區(qū)域可增強(qiáng)植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的可靠性以及效率。因此，它們的使用在本發(fā)明的內(nèi)容中是非常優(yōu)選的。
關(guān)于本發(fā)明在不同植物物種中的適應(yīng)性，必需提到，雖然本發(fā)明的特定實(shí)施方案僅僅以轉(zhuǎn)基因煙草植物舉例說明，事實(shí)上實(shí)際應(yīng)用不限于這些植物物種。受到某些病原體攻擊的任何植物物種，均可以用本發(fā)明基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使之能夠表達(dá)基因產(chǎn)物以觸發(fā)在一些或所有植物細(xì)胞中導(dǎo)致抗性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
雖然本發(fā)明的一些實(shí)施方案現(xiàn)在可能行不通，如因?yàn)橐恍┲参镂锓N仍然未能基因轉(zhuǎn)化，本發(fā)明在這些植物物種中的實(shí)踐僅僅是時(shí)間問題，而非原理問題，因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)化的可適應(yīng)性與下面本發(fā)明的實(shí)施方案無(wú)關(guān)。
植物物種的轉(zhuǎn)化對(duì)于大量植物物種現(xiàn)在是常規(guī)的，包括雙子葉植物以及單子葉植物。原則上，任何轉(zhuǎn)化方法均可以用于將本發(fā)明嵌合DNA導(dǎo)入合適的原代細(xì)胞，只要細(xì)胞能夠再生成完整植株即可。合適的方法可以選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(F.A.Krens等人，Nature 296:72-74,1982；I.Negrutiu等人，Plant Mol.Biol.8:363-373,1987)、原生質(zhì)體的電穿孔(R.D.Shillito等人，Bio/Technol.3:1099-1102,1985)、向植物材料中顯微注射(A.Crossway等人，Mol.Gen.Genet.202:179-185,1986)、多種植物材料的DNA(或RNA包裹的)微粒轟擊(T.M.Klein等人，Nature327:70,1987)、用(非整合)病毒感染等等。本發(fā)明優(yōu)選的方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。尤其優(yōu)選所謂的二元載體技術(shù)的使用，如EPA 120 516和US 4,940,838中公開的。
番茄的轉(zhuǎn)化優(yōu)選基本上如Van Roekel等人描述的(Plant Cell Rep.12:644-647,1993)進(jìn)行。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化優(yōu)選基本上如Hoekema等人描述的(A.Hoekema等人，Bio/Technology 7:273-278,1989)進(jìn)行。
通常，轉(zhuǎn)化之后，選擇植物細(xì)胞或細(xì)胞組，檢測(cè)一種或多種標(biāo)記物的存在，該標(biāo)記物由與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸序列共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化材料再生成完整植株。
雖然認(rèn)為單子葉植物對(duì)基因轉(zhuǎn)化稍微較難，但是單子葉植物仍能轉(zhuǎn)化而且可以由經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、胚或其它植物材料再生成有繁殖能力的轉(zhuǎn)基因植株。目前，用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的優(yōu)選方法是胚、外植體或懸浮細(xì)胞的微彈轟擊，和直接DNA攝取或電穿孔(Shimamoto等人，Nature 338:274-276,1989)。通過微彈轟擊將編碼膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(使除草劑膦絲菌素失活)的吸濕鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因?qū)胗衩讘腋∨囵B(yǎng)物的胚發(fā)生細(xì)胞，已經(jīng)得到了轉(zhuǎn)基因玉米植物(Gordon-Kamm,Plant Cell 2:603-618,1990)。已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入其它單子葉作物(諸如小麥和大麥)的糊粉原生質(zhì)體(Lee,Plant Mol.Biol.13:21-30,1989)。通過只選擇衰老致密組織和瘤狀胚發(fā)生愈傷組織用于建立胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物，已經(jīng)由胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物再生成了小麥植株(Vasil,Bio/Technol.8:429-434,1990)。這些作物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相結(jié)合能夠?qū)⒈景l(fā)明應(yīng)用于單子葉植物。
單子葉植物，包括有商業(yè)價(jià)值的作物，諸如水稻和玉米，也能夠借助農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移(參閱WO 94/00977；EP 0 159 418 B1；J.Gould等人，Plant Physiol.95:426-434,1991)。
DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，使用Southern分析，可以對(duì)推定經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株進(jìn)行評(píng)估，以檢測(cè)本發(fā)明嵌合DNA的存在、拷貝數(shù)和/或基因組的組織。另外，使用Northern和/或Western分析等本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，可以檢測(cè)新導(dǎo)入的DNA的表達(dá)水平。最初的任選分析之后，可以對(duì)顯示新導(dǎo)入的本發(fā)明嵌合DNA的預(yù)期拷貝數(shù)和表達(dá)水平的經(jīng)轉(zhuǎn)化植株，測(cè)試針對(duì)病原體的抗性水平?；蛘?，可以將選擇的植株進(jìn)行另一輪轉(zhuǎn)化，例如用于導(dǎo)入其它基因，以增強(qiáng)抗性水平或拓寬抗性范圍。
其它評(píng)價(jià)可以包括田間條件下的病原體抗性測(cè)試、檢查繁殖力、產(chǎn)量、和其它特征。這些測(cè)試現(xiàn)在可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行。
這些評(píng)價(jià)之后，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物可以直接生長(zhǎng)，但是通常它們可能作為親本系在培育新品種或在產(chǎn)生雜種等等中使用。
為了得到能夠組成性表達(dá)多于一種嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物，可以進(jìn)行許多變化，如下A．DNA(如二元載體上的T-DNA)的使用，其中有多個(gè)嵌合基因與選擇標(biāo)記基因物理偶聯(lián)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，嵌合基因是物理偶聯(lián)的，并由此作為單個(gè)孟德爾基因座移動(dòng)。B．每個(gè)已經(jīng)能夠表達(dá)一種或多種嵌合基因(優(yōu)選與選擇標(biāo)記基因偶聯(lián))的轉(zhuǎn)基因植物，與包含偶聯(lián)了另一種選擇標(biāo)記的一種或多種嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物的花粉交叉授粉。然后，由該雜交得到的種子，可以根據(jù)兩種選擇標(biāo)記的存在，或根據(jù)嵌合基因自身的存在進(jìn)行選擇。然后由選定種子得到的植物可以用于進(jìn)一步的雜交。原則上，嵌合基因不是位于單個(gè)基因座上，而且各基因可以作為獨(dú)立基因座分離。C．許多嵌合DNA分子的使用，如每個(gè)包含一種或多種嵌合基因和選擇標(biāo)記的質(zhì)粒。如果共轉(zhuǎn)化頻率是高的，那么只根據(jù)一種標(biāo)記進(jìn)行選擇就足夠了。在其它情況中，基于多于一種標(biāo)記進(jìn)行選擇是優(yōu)選的。D．用新的嵌合DNA(任選包含選擇標(biāo)記基因)連續(xù)轉(zhuǎn)化已經(jīng)包含第一種、第二種(等等)嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物。如方法B，嵌合基因原則上不在單個(gè)基因座上，因而嵌合基因可以作為獨(dú)立基因座分離。E．上述策略的結(jié)合。
實(shí)際的策略可能取決于多種(可能容易決定的)考慮，諸如親本系的用途(直接生長(zhǎng)，用于繁殖程序，用于產(chǎn)生雜種)，但是這不是本發(fā)明的關(guān)鍵。
在本文中，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，已經(jīng)包含能夠觸發(fā)導(dǎo)致抗性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的嵌合DNA的植物，可以作為導(dǎo)入本發(fā)明其它嵌合DNA的合適遺傳背景，從而例如增加級(jí)聯(lián)反應(yīng)的速度和/或參與的細(xì)胞數(shù)目，由此增加抗性水平。能夠與嵌合DNA適當(dāng)結(jié)合使用的其它基因的克隆，和能夠相對(duì)過度表達(dá)相同嵌合DNA的轉(zhuǎn)基因植物的獲得，以及關(guān)于它們?cè)谥参镏袑?duì)病原體抗性的影響的評(píng)定，現(xiàn)在屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明具有改進(jìn)的病原體抗性的植物或其部分，包括植物品種，可以在田間、溫室、家中或其它地方生長(zhǎng)。植物或它們的可食用部分可以用于動(dòng)物飼養(yǎng)或人類消費(fèi)，或可以加工成食品、飼料或任何農(nóng)業(yè)或工業(yè)形式的其它用途。農(nóng)業(yè)將意欲包括園藝、樹木培植、花卉的培育等等?？赡苡杀景l(fā)明植物材料受益的工業(yè)包括(但不限于)藥物工業(yè)、紙張和紙漿制造業(yè)、糖制造業(yè)、飼料和食品工業(yè)、酶制造業(yè)等等。
本發(fā)明植物或其部分的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)殺蟲劑處理的需要降低，由此降低材料、勞力、和環(huán)境污染的費(fèi)用，或延長(zhǎng)這些植物的產(chǎn)品(如水果、種子等等)的儲(chǔ)存期。用于本發(fā)明用途的植物指能夠進(jìn)行光合作用、并受到某些病原體攻擊的多細(xì)胞生物體。它們將至少包括被子植物以及裸子植物、單子葉植物以及雙子葉植物。
術(shù)語(yǔ)“相對(duì)過度表達(dá)嵌合DNA構(gòu)建物的植物”將意指，包含表達(dá)轉(zhuǎn)基因編碼的基因產(chǎn)物的細(xì)胞的植物，該基因產(chǎn)物天然條件下在所述植物中不存在，或者若因編碼同一基因產(chǎn)物的內(nèi)源基因而存在時(shí)，其不以相同數(shù)量、或不在相同時(shí)間、或不在植物的相同細(xì)胞、細(xì)胞區(qū)室、組織或器官內(nèi)存在。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是與本發(fā)明多核苷酸一起天然存在、與本發(fā)明多核苷酸可操作連接、并調(diào)控本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的調(diào)控序列(或啟動(dòng)子)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含這些多核苷酸的基因的表達(dá)在應(yīng)用SA后短時(shí)間內(nèi)起始。在天然環(huán)境下，SA在病原體感染后產(chǎn)生。因此，作為SA誘導(dǎo)性的結(jié)果，可以假定這些調(diào)控序列可應(yīng)答病原體攻擊。這些調(diào)控序列由此可以用于驅(qū)動(dòng)異源基因的表達(dá)，作為對(duì)病原體感染的應(yīng)答。病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(諸如上文描述的prpl啟動(dòng)子)在生物技術(shù)抗性工程中非常有價(jià)值。
可以與本發(fā)明調(diào)控區(qū)結(jié)合使用的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括(但不限于)可以由大麥(M.Swegle等人，Plant Mol.Biol.12:403-412,1989；G.M.Balance等人，Can.J.Plant Sci 56:459-466,1976；P.B.Hoj等人，F(xiàn)EBS Lett.230:67-71,1988；P.B.Hoj等人，Plant Mol.Biol.13:31-42,1989)、扁豆(T.Boller等人，Planta 157:22-31,1983；K.E.Broglie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6820-6824,1986；U.Vgeli等人，Planta 174:364-372,1988；F.Mauch和L.A.Staehelin,Plant Cell 1:447-457,1989)；黃瓜(J.P.Metraux和T.Boller,Physiol.Mol.Plant Pathol.28:161-169,1986)；韭菜(P.Spanu等人，Planta 177:447-455,1989)；玉米(W.Nasser等人，Plant Mol.Biol.11:529-538,1988)、燕麥(W.Fink等人，PlantPhysiol.88:270-275,1988)、豌豆(F.Mauch等人，Plant Physiol.76:607-611,1984；F.Mauch等人，Plant Physiol.87:325-333,1988)、白楊(T.J.Parsons等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7895-7899,1989)、馬鈴薯(J.J.Gaynor,Nucl.Acids Res.16:5210,1988；E.Kombrink等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:782-786,1988；D.Laflamme和R.Roxby,Plant Mol.Biol.13:249-250,1989)、煙草(如M.Legrand等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6750-6754,1987；H.Shinshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:89-93,1987)、番茄(M.H.A.Joosten和P.J.G.M.De Wit,PlantPhysiol.89:945-951,1989)、小麥(J.Molano等人，J.Biol.Chem.254:4901-4907,1979)得到的β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶、馬蓋寧、凝集素、由蘇云金芽孢桿菌分離得到的毒素、由紫茉莉(Mirabilisjalapa)(EP 0 576 483)和莧屬(Amaranthus)(EP 0 593 501和US 5,514,779)分離得到的抗真菌蛋白、清蛋白類蛋白質(zhì)(諸如硫堇、napin、大麥胰蛋白酶抑制劑、谷類麥醇溶蛋白和小麥α-淀粉酶(EP 0602 098)、由蘿卜屬、蕓苔屬、歐白芥屬、擬南芥屬、大麗花屬、Cnicus屬、香豌豆屬和蝶豆屬分離得到的蛋白質(zhì)(EP 0 603 216)、草酸氧化酶(EP 0 636 181和EP 0 673 416)、糖類氧化酶(WO 98/13478)、由蔥屬植物種子分離得到的抗微生物蛋白、和來(lái)自楤木屬和鳳仙花屬植物的蛋白質(zhì)(WO 95/24485)等等。
可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的另一個(gè)用途是驅(qū)動(dòng)在基因-基因抗性相互作用中起作用的蛋白質(zhì)(如WO 91/15585中描述的)。這些蛋白質(zhì)是(例如)植物蛋白質(zhì)，諸如E.E.Karrer等人公開的(Plant Mol.Biol.36:681-690,1998),ndrl和edsl、來(lái)自西紅柿的Cf蛋白質(zhì)和Pto啟動(dòng)子、來(lái)自黃枝孢(Cladosporium fulvum)的avr引發(fā)蛋白(elicitor)、來(lái)自假單胞菌的avrPto蛋白、和來(lái)自黃單胞菌、黑麥喙孢和致病疫霉的無(wú)毒性基因。
然而，內(nèi)源形成的水楊酸誘導(dǎo)后(例如病原體感染后)，還可能通過外部應(yīng)用SA或SA類似物誘導(dǎo)調(diào)控區(qū)。這將使任何感興趣的基因能夠受控表達(dá)。在這方面，SA或SA類似物的應(yīng)用可以采用任何形式，例如對(duì)植物進(jìn)行葉面噴灑或灌溉。優(yōu)選的SA類似物是苯甲酸、乙酰水楊酸、聚丙烯酸和它們的取代衍生物，和基于苯并-1,2,3-噻二唑結(jié)構(gòu)的類似物，包括(但不限于)下列化合物苯并-1,2,3-噻二唑羧酸、苯并-1,2,3-噻二唑硫代羧酸、氰基苯并-1,2,3-噻二唑、苯并-1,2,3-噻二唑羧酸酰胺、和苯并-1,2,3-噻二唑羧酸酰肼。特別優(yōu)選的是苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸甲酯、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸正丙酯、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸苯甲酯、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸仲丁基酰肼、2,6-二氯異煙酸、或2,6-二氯異煙酸甲酯。
可以考慮本領(lǐng)域下列情形,尤其作為本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)水平的例示EP-A 392 225 A2；EP-A 440 304 A1；EP-A 460 753 A2；WO90/07001 A1；US 4,940,840。轉(zhuǎn)基因植物的評(píng)價(jià)下面評(píng)價(jià)經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中期望特性的存在和/或表達(dá)程度。第一評(píng)價(jià)可以包括新導(dǎo)入基因的表達(dá)水平、病原體相關(guān)蛋白質(zhì)或其它蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)水平、經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的病原體抗性、期望特性的穩(wěn)定遺傳性、田間試驗(yàn)等等。
第二，如果需要，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物可以與其它品種(例如具有更高商業(yè)價(jià)值的品種或已經(jīng)導(dǎo)入其它期望特性的品種)進(jìn)行雜交，或用于產(chǎn)生雜交種子，或用于另一輪轉(zhuǎn)化，等等。
本發(fā)明現(xiàn)在將由下列非限制性實(shí)施例與上述圖和下列序列進(jìn)一步描述SEQ ID NO:1-9=編碼水楊酸誘導(dǎo)時(shí)天然表達(dá)的蛋白質(zhì)的多核苷酸。SEQ ID NO:10=編碼水楊酸誘導(dǎo)時(shí)天然表達(dá)的蛋白質(zhì)的多核苷酸及其啟動(dòng)子序列。SEQ ID NO:11=SEQ ID NO:10的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO:12-14=PCR引物。SEQ ID NO:15-33=依次為AP1至AP19引物。
實(shí)施例實(shí)施例1在我們鑒定立即早期SA誘導(dǎo)型基因的努力中，我們使用了下列觀察結(jié)果。35S增強(qiáng)子中負(fù)責(zé)SA誘導(dǎo)的序列元件似乎是活化序列1(as-1)。as-1活化的獨(dú)特特征是(1)30min內(nèi)發(fā)生誘導(dǎo)，(2)mRNA水平在1-4hr內(nèi)達(dá)到峰值，然后下降，(3)當(dāng)存在放線菌酮(CHX)時(shí)發(fā)生誘導(dǎo)，(4)用CHX和SA共處理導(dǎo)致超過4hr的mRNA連續(xù)積累。誘導(dǎo)機(jī)制是典型的病毒和細(xì)胞立即早期或初級(jí)應(yīng)答基因形式(Herschman,Annu.Rev.Biochem.60:281-319,1991)，諸如動(dòng)物細(xì)胞對(duì)α-和γ-干擾素的應(yīng)答(Larner等人，J.Biol.Chem.261:453-459,1986；Lew等人，Mol.Cell.Biol.9:5404,1989)，和某些植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)型基因的誘導(dǎo)(回顧見Abel和Theologis,PlantPhys.111:9-17,1996)。
使用差異顯示技術(shù)(P.Liang和A.B.Pardee,Science257:967-971,1992)鑒定當(dāng)存在SA、CHX和兩者時(shí)激活的基因。因此，測(cè)定SA存在或不存在時(shí)，SA處理的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)、SA的2個(gè)不同濃度的誘導(dǎo)和加入CHX的影響。進(jìn)行了總共7種處理。這些處理列于下表。如Horvath和Chua所述(Plant Mol.Biol.31:1061-1072,1996)，進(jìn)行煙草BY-2懸浮細(xì)胞和葉片的處理和差異顯示PCR反應(yīng)。處理 加入的化學(xué)藥品/時(shí)間1 H2O2 200μM SA,4hr3 71μM CHX,5hr4 71μM CHX,5hr+1hr后200μM SA(因此共4hr)5 20μM SA,2hr6 200μM SA,2hr7 200μM SA,8hr使用下游引物T12MG或T12MC和上游引物AP1-19(SEQ ID NO:15-33)進(jìn)行了38個(gè)反應(yīng)。每種差異表達(dá)PCR產(chǎn)物的命名由用于擴(kuò)增的引物組合產(chǎn)生(如C6-2是使用引物T12MC和AP6的PCR產(chǎn)生的感興趣的第二條帶)。
由38組反應(yīng)，鑒定了具有感興趣的表達(dá)模式的大約60種差異顯示產(chǎn)物?；厥樟?2組，在加有每種處理細(xì)胞衍生的mRNA的poly(A)+Northern印漬上進(jìn)行測(cè)試。
大約15組在Northern印漬上顯示感興趣的mRNA表達(dá)模式，其中12組顯示于圖1。剩下的3組(C3-2、C16-1和C2-1)產(chǎn)生獨(dú)特然而微弱的信號(hào)，不再進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例2由這12種差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，將9種(SEQ ID NO:1-9)進(jìn)行亞克隆、測(cè)序、并復(fù)查表達(dá)模式。
根據(jù)不同的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，這些轉(zhuǎn)錄本可以分類成4種(見表2中的概述)。Ⅰ類應(yīng)答基因Ⅰ類基因(C3-2、C16-1(SEQ ID NO:7)、C18-1(SEQ ID NO:1)、G2-1(SEQ ID NO:6)、G3-1(SEQ ID NO:9)、G8-5(SEQ IDNO:2)、G9-2)特征為(1)于SA處理后2、4或8hr時(shí)即使有可檢測(cè)的mRNA積累也是少量的，(2)用CHX單獨(dú)處理有一些誘導(dǎo)，和(3)用CHX和SA共處理的誘導(dǎo)高許多。CHX的超誘導(dǎo)是在哺乳動(dòng)物立即早期(IE)基因中廣泛觀察到的現(xiàn)象(J.M.Almendral等人，Mol.Cell.Biol.215:403-410,1988；P.F.Zipfel等人，Mol.Cell.Biol.9:1041-1048,1989)。這說明該類蛋白質(zhì)可能在介導(dǎo)SA作用中具有早期功能。Ⅱ類應(yīng)答基因由C2-1(SEQ ID NO:4)、C6-1、C6-2(SEQ ID NO:3)、C7-1和G1-1例示，Ⅱ類基因特征為快速且暫時(shí)的SA誘導(dǎo)，其中mRNA在最早(2hr)的時(shí)間點(diǎn)積累，并在較晚的時(shí)間點(diǎn)(4和8hr)水平降低。CHX還誘導(dǎo)Ⅱ類基因的表達(dá)，且CHX/SA共處理導(dǎo)致相似或高一點(diǎn)的穩(wěn)態(tài)mRNA水平。Ⅰ類和Ⅱ類基因性質(zhì)相似，除了Ⅱ類基因的總mRNA積累較高，但是CXH/SA共處理后Ⅰ類mRNA大量積累?？赡苡邢嗨频恼T導(dǎo)機(jī)制調(diào)控Ⅰ類和Ⅱ類基因，但是Ⅰ類基因可能有另外的調(diào)控水平以維持低豐度。表2.通過差異顯示鑒定的早期SA誘導(dǎo)型基因的概述ddPCR產(chǎn)物應(yīng)答類型片段大小大致mRNA大小(bp) (nt)1C3-2 Ⅰ 190 6000/2800/850C16-1Ⅰ 203 5000/40002C18-1Ⅰ 426 1200G2-1 Ⅰ 524 520G3-1 Ⅰ 276 2000/1000/700G8-5 Ⅰ 437 1500G9-2 Ⅰ 230 4000/2000/1600C2-1 Ⅱ 382 5-6000C6-1 Ⅱ 430 2000/1300C6-2 Ⅱ 174 1300/1000C7-1 Ⅱ 430 800G1-1 Ⅱ 297 1600G8-1 Ⅲ 400 550C14-1b Ⅳ 298 1000G3-2 Ⅳ 282 50001斜線分開不同大小的多種信使2在克隆的ddPCR產(chǎn)物中檢測(cè)到的兩種轉(zhuǎn)錄本具有表達(dá)差異模式，并可能代表由不同基因編碼的相關(guān)序列。Ⅲ類應(yīng)答基因Ⅲ類由單個(gè)成員G8-1代表，顯示SA的快速mRNA誘導(dǎo)(2hr)，并持續(xù)4-8hr。CHX單獨(dú)并不誘導(dǎo)G8-1，且CHX的存在不顯著改變SA的誘導(dǎo)。Ⅳ類應(yīng)答基因與Ⅲ類類似，Ⅳ類基因(G3-2(SEQ ID NO:5)和C14-1b(SEQ ID NO:8))顯示SA處理后快速和持續(xù)的誘導(dǎo)，于2、4和8hr水平上升。CHX不僅不能誘導(dǎo)Ⅳ類基因，而且還阻斷SA的誘導(dǎo)。
總的來(lái)說，大多數(shù)基因具有可比的SA敏感性，于200μM SA有明顯誘導(dǎo)，而于20μM SA僅有很少量或無(wú)誘導(dǎo)。兩種基因G8-1和G3-2顯示更強(qiáng)的SA敏感性，于20μM產(chǎn)生的mRNA水平與那些于200μM的水平可比。圖3A和B顯示了各類代表性例子隨時(shí)間的表達(dá)模式的更詳細(xì)分析。
實(shí)施例3對(duì)可獲得片段的序列分析揭示，其中許多基因與數(shù)據(jù)庫(kù)序列沒有同源性。這些基因可能因此代表以前未認(rèn)識(shí)的基因座，或者可能PCR片段的長(zhǎng)度對(duì)于揭示編碼區(qū)同源性是不夠的。
4種序列確實(shí)有顯著的匹配。
發(fā)現(xiàn)G1-1與植物類黃酮葡糖轉(zhuǎn)移酶相似，而且以前進(jìn)行過分析(D.M.Horvath和N.-H.Chua,Plant Mol.Biol.31:1061-1072,1996)。
發(fā)現(xiàn)克隆C16-1與多種磷酸化酶激酶具有相似性，說明它可能在SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。發(fā)現(xiàn)克隆G8-5與擬南芥逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Bevan等人，EU sequencing project,1997)和玉米逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Hopscotch多聚蛋白的內(nèi)切核酸酶/整合酶區(qū)(S.E.White等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11792-11796,1994)具有強(qiáng)相似性，但是只在G8-5的負(fù)鏈發(fā)現(xiàn)有同源性。
在C18-1和以前克隆的煙草基因乙烯Reponsive元件結(jié)合蛋白-1(EREBP1)之間發(fā)現(xiàn)有完全的匹配(M.Ohme-Takagi和H.Shinshi,Plant Cell 7:173-182,1995)。
實(shí)施例4誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)通過各類代表性克隆的時(shí)程實(shí)驗(yàn)進(jìn)行詳細(xì)測(cè)試(圖2)。雖然使用ddPCR片段的poly(A)+mRNA凝膠印漬上不存在任何Ⅰ類基因的SA誘導(dǎo)信號(hào)，但將C18-1/EREBP1的全長(zhǎng)cDNA作為探針使用的增強(qiáng)條件，可以觀察到信號(hào)。事實(shí)上，SA確實(shí)誘導(dǎo)C18-1/EREPB1 mRNA水平非?？焖偾視簳r(shí)上升，在10min時(shí)首先顯現(xiàn)，在2hr時(shí)達(dá)到峰值，并在4.5hr時(shí)快速衰減至背景水平。
Ⅱ類基因C6-2顯示相似的動(dòng)力學(xué)，誘導(dǎo)在10min內(nèi)顯現(xiàn)，在大約1.5hr時(shí)達(dá)到峰值，并在4hr時(shí)降低至背景水平。以前我們已經(jīng)展示了另一種Ⅱ類基因G1-1/EGT(Horvath和Chua,1996)，該基因在20-30min稍后些誘導(dǎo)，并在3hr時(shí)得到峰值。
Ⅲ類基因G8-1首先在30-60min時(shí)檢測(cè)到，并在2-2.5hr時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，至少維持12hr。
G3-2這一Ⅳ類基因，在2hr前沒有檢測(cè)到活化，但是在2-12hr之間mRNA水平穩(wěn)定上升。另一種Ⅳ類基因C14-1b，顯示略有不同的應(yīng)答特征。誘導(dǎo)在2-2.5hr時(shí)顯現(xiàn)，但是該例的表達(dá)在5hr時(shí)達(dá)到峰值，然后顯示穩(wěn)定下降。
Ⅰ類和Ⅱ類基因的快速和暫時(shí)的應(yīng)答與哺乳動(dòng)物中鑒定的IE基因應(yīng)答最相似，然而Ⅲ類和Ⅳ類基因雖然表達(dá)早，但是似乎由不同機(jī)制調(diào)控。
實(shí)施例5通過用0.1和1mM的一系列SA類似物和植物信號(hào)成分處理煙草細(xì)胞大約2.5hr，測(cè)試SA誘導(dǎo)的特異性。圖4中的結(jié)果證明各基因應(yīng)答范圍廣泛。在SA類似物乙酰SA(ASA，乙酰水楊酸)、苯甲酸(BA)和4-羥基苯甲酸(4HBA)中，應(yīng)答通常反映類似物在其它細(xì)胞應(yīng)答中取代SA的能力(N.Yalpani等人，Plant Cell 3:809-818,1991；Y.Yang和D.F.Klessig,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14972-14977,1996)。ASA，通常如SA一般有效，將所有基因誘導(dǎo)至相似水平。BA，一種部分活性類似物，也誘導(dǎo)表達(dá)；而無(wú)活性類似物4HBA不能誘導(dǎo)除C6-2外的所有基因。在應(yīng)答中有趣的區(qū)別是，G8-1和G3-2都顯示對(duì)SA、ASA和BA有高度敏感性，顯示在0.1mM比1mM時(shí)相等或更高誘導(dǎo)；而C18-1/EREBP1和C6-2在1mM顯示更高誘導(dǎo)。C14-1b不在此時(shí)間范圍中顯示對(duì)SA或類似物的應(yīng)答。所有其它基因都顯示對(duì)活性SA類似物的誘導(dǎo)特異性，除了C6-2可能以親電子應(yīng)答性基因的特征發(fā)生應(yīng)答(T.Ulmasov等人，Plant Mol.Biol.26:1055-1064,1994)。在測(cè)試的其它成分中，PR基因的強(qiáng)誘導(dǎo)物-硫胺素(A.Asselin等人，Can.J.Bot.63:1276-1282,1985)，不引起任何測(cè)試的基因產(chǎn)生應(yīng)答。涉及創(chuàng)傷應(yīng)答的植物成分-茉莉酮酸甲酯(MJ)，能夠誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，包括C18-1/EREBP1、C14-1b和G3-2。事實(shí)上，MJ是C18-1/EREBP1和C14-1b最有效的誘導(dǎo)物。有趣的是，C14-1b是能夠被ABA(涉及創(chuàng)傷應(yīng)答、干旱和寒冷壓力的信號(hào)分子)誘導(dǎo)的唯一基因。已知多種基因，包括那些蛋白酶抑制劑和脂加氧酶的基因(T.Hildmann等人，Plant Cell 4:1157-1170,1992；M.A.Melan等人，Plant Physiol.101:441-450,1993；D.Xu等人，Plant Mol.Biol.22:573-588,1993)，受MJ和ABA雙重調(diào)控。相似調(diào)控方式可能作用于C14-1b。植物生長(zhǎng)素2,4-D誘導(dǎo)多種基因，包括C18-1/EREBP1和C6-2。因此，雖然多種ddPCR基因顯示被活性SA類似物活化的趨勢(shì)，但所有基因(除了G8-1)可由其它植物成分顯著誘導(dǎo)，說明這些基因在其它應(yīng)答途徑中有其它作用。
實(shí)施例6繪制SA的劑量-應(yīng)答曲線。因此用濃度范圍0.1μM-2mM的SA處理煙草細(xì)胞。結(jié)果顯示于圖5。
例如在C18-1/EREBP1和G8-1的敏感性之間有顯著差異。C18-1/EREBP1具有狹窄的應(yīng)答區(qū)，而G8-1表達(dá)在大范圍SA濃度內(nèi)被激活(見圖6)。
達(dá)到C18-1/EREBP1最大表達(dá)水平的一半需要的SA濃度是100-150μM，而G8-1的該值是大約1μM。G3-2似乎與G8-1一樣敏感(數(shù)據(jù)沒有顯示)。另一種SA誘導(dǎo)型基因(IEGT；Horvath和Chua,1996)的數(shù)據(jù)也顯示于該曲線圖中。
實(shí)施例7在煙草葉片的TMV誘導(dǎo)HR反應(yīng)中測(cè)試了啟動(dòng)子的病原體應(yīng)答性。結(jié)果顯示于圖7。C18-1/EREBP1(Ⅰ類)和G1-1(Ⅱ類)都在28-56hr之間在感染了TMV的煙草葉片中以高于對(duì)照植物中的水平表達(dá)。激活動(dòng)力學(xué)嚴(yán)格遵循24-36hpi開始的誘導(dǎo)SA生物合成的時(shí)刻表(J.Malamy等人，Science 250:1002-1004,1990)。然而，感染TMV 74hr后，兩類基因的mRNA水平回到與對(duì)照植物中相當(dāng)?shù)幕怠?br> 另一種SA誘導(dǎo)型基因(PR1a)的水平在較晚誘導(dǎo)且更持久。
實(shí)施例8IEGT,G8-1和C18-1/EREBP1的基因組克隆由購(gòu)自Clontech(Palo Alto,CA)的煙草基因組文庫(kù)(在λEMBL3中)分離得到。
將包含IEGT序列(經(jīng)標(biāo)記的IS5a)的2.1kb BamHⅠ-SalⅠ基因組片段(SEQ ID NO:10)克隆到載體pBSK(Stratagene,La Jolla,CA)中。分離片段由524bp的上游序列(5UTR和啟動(dòng)子序列)、1431bp的ORF(無(wú)明顯內(nèi)含子)、和編碼序列下游的220bp序列組成。
通過PCR擴(kuò)增基因組克隆的啟動(dòng)子和5’非翻譯序列區(qū)。設(shè)計(jì)的下游引物引發(fā)于1)假定的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)和2)開放閱讀框架(ORF)的起點(diǎn)，以包含5’UTR。使用的引物序列是SEQ ID NO:12、13和14。
將擴(kuò)增片段用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行消化，并亞克隆到經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ消化的、包含螢火蟲熒光素酶基因的載體VIP111/2-FFLuc(Anderson等人，Plant J.4:457-470,1994)中。該載體將啟動(dòng)子序列置于無(wú)啟動(dòng)子的FFLuc基因的緊鄰上游。pIEGT-Luc1構(gòu)建物包含較小的啟動(dòng)子片段(432bp)，缺乏5’UTR序列，而pIEGT2-Luc2由啟動(dòng)子和5’URT序列組成。
使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將兩種熒光素酶構(gòu)建物都用于轉(zhuǎn)化煙草。
實(shí)施例9測(cè)試初級(jí)轉(zhuǎn)化體或S1子代的葉片中的報(bào)導(dǎo)基因活性。具體如下將葉片對(duì)半切開、分離并用水或1mM SA浸泡4-12hr。然后向葉片上噴灑報(bào)導(dǎo)底物蟲熒光素(1mM蟲熒光素、0.1％ Triton X-100水溶液)，并用視頻成像和定量設(shè)備計(jì)算發(fā)光(示意性顯示于圖8A)。10個(gè)IEGT-Luc1品系中的6個(gè)顯示SA誘導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)，表達(dá)水平范圍為超過對(duì)照2.3-6倍(見圖8B)。無(wú)論處理與否，測(cè)試的所有10個(gè)IEGT-Luc2品系都只顯示基線活性。
通過給葉片接種煙草花葉病毒(TMV)進(jìn)行病原體攻擊。由于煙草植物攜帶N基因，所以它們對(duì)TMV感染有抗性。在TMV攻擊后，NN煙草誘導(dǎo)SA生物合成、防衛(wèi)應(yīng)答和細(xì)胞死亡。若接種后21和52hr時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，IEGT-Luc1系顯示隨時(shí)間明顯的熒光素酶的誘導(dǎo)表達(dá)。
實(shí)施例10SA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子-殺蟲蛋白嵌合構(gòu)建物的構(gòu)建將SA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如SEQ ID NO:10的啟動(dòng)子序列1-431)與殺蟲蛋白(如蘇云金芽孢桿菌衍生的Cry基因，可以使用例如美國(guó)專利號(hào)5,635,480和/或EP申請(qǐng)86300291.1中描述的基因)的編碼區(qū)進(jìn)行偶聯(lián)。為此，將殺蟲蛋白的開放閱讀框架與SA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段進(jìn)行功能性連接。理想的，使用SA應(yīng)答性基因的所有上游調(diào)控序列，直到翻譯起始密碼子，此位點(diǎn)開始為編碼殺蟲蛋白的開放閱讀框架。在殺蟲蛋白開放閱讀框架的后面加入終止子/多聚腺苷酸化序列，以增強(qiáng)基因表達(dá)。
使用常規(guī)方案，將由此制備的構(gòu)建物用于轉(zhuǎn)化植物。
在用SA或SA類似物處理植物之前和之后，使用ELISA、Western印漬分析或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，測(cè)量殺蟲蛋白的表達(dá)。
在田間條件下，測(cè)試高水平表達(dá)殺蟲蛋白的植物在用SA或SA類似物處理后對(duì)靶昆蟲的抗性是否增加。
如果需要，可以使用許多詳細(xì)描述的技術(shù)來(lái)增強(qiáng)由SA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子起始的表達(dá)。這些技術(shù)中的一種包括該啟動(dòng)子的部分轉(zhuǎn)錄活化序列多聚化，或使用SA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組合(如見EP 0729514)，或在SA調(diào)控區(qū)的上游連接強(qiáng)組成性增強(qiáng)子(增強(qiáng)病原體應(yīng)答性基因表達(dá)的相似工作見如Regina Fischer，博士論文，Universitaet Hohenheim1994)。
序列表<110>MOGEN International NV<120>新的水楊酸誘導(dǎo)型基因和啟動(dòng)子<130>MOGEN46063 PCT<140><141><150>US60/095,187<151>1998-08-03<160>33<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>708<212>DNA<213>煙草<400>1ggcacgagga aacatggggc gaattaccac taaaagtcga cgattctgaa gatatggtaa 60tttatactct cttaaaggac gctcttaacg tcggatggtc gccgtttaat ttcaccgccg 120gcgaagtaaa atcggagcta atggaggagg aaattgtggt ttctccagcg gatacaacgg 180ccgcgccggc ggctgagtta ccgaggggaa ggcattacag aggtgttaga cgacggcctt 240gggggaaatt tgcggcggag attagggatc cggcgaagaa tggagctagg gttttggctt 300ggaacatacg aaacagatga agatgctgca attgcttatg ataaagccgc ttatagaatg 360cgtggttcaa aggctcattt aaattttcca cataggatcg gtttaaatga accggaaccg 420gttcgagtta cggcgaaaag acgagcgtcg cctgaaccgg ctagttcgtc ggaaaatagt 480tcagtaaaac ggagaagaaa agctgttgca gctgagaaat ctggagctgt agaagtggag 540agtaaatcaa atgttttaca agttggatgt caagttgaac tattgacacg cggacatcaa 600ctattagtca gttaagtatg agcttacgaa gattaatatt cctttgtggt aatcttgcgc 660tccgaagttg tacagtttga ttttcatgtt aattactctt tccggtta 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權(quán)利要求
1．當(dāng)與其天然調(diào)控序列可操作連接時(shí)用水楊酸誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)的多核苷酸，其特征為該多核苷酸包含選自基本上由SEQ ID NO:1-9組成之組的序列或是編碼SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多核苷酸序列。
2．包含權(quán)利要求1的核苷酸序列的嵌合DNA序列。
3．權(quán)利要求2的嵌合DNA序列，其中還包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，并任選包含轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
4．權(quán)利要求3的嵌合DNA序列，其中轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
5．權(quán)利要求4的嵌合DNA序列，其特征為該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
6．權(quán)利要求4的嵌合DNA序列，其特征為該可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
7．權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的嵌合DNA序列，它是載體。
8．包含權(quán)利要求7的載體的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞中一旦存在該載體，即能夠維持該載體。
9．在其基因組中穩(wěn)定摻入了權(quán)利要求1的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。
10．一種啟動(dòng)子，其特征為包含天然位于權(quán)利要求1的多核苷酸或多核苷酸序列的5’并能夠調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的核酸序列。
11．一種病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其特征為包含SEQ ID NO:10的第1-431位核苷酸。
12．包含權(quán)利要求10或11的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體。
13．包含權(quán)利要求12的載體的宿主細(xì)胞。
14．權(quán)利要求8、9或13任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。
15．包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求14的植物細(xì)胞的植物或植物部分。
16．基本上由權(quán)利要求14的植物細(xì)胞組成的植物或植物部分。
17．使植物對(duì)病原體攻擊有抗性的方法，其特征為用包含權(quán)利要求1的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化該植物。
18．在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，其特征為將權(quán)利要求10或11的啟動(dòng)子與編碼要表達(dá)的蛋白質(zhì)的多核苷酸可操作連接以作為調(diào)控區(qū)使用。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述啟動(dòng)子可由水楊酸或其類似物誘導(dǎo)。
20．權(quán)利要求18的方法，其中所述啟動(dòng)子可由病原體感染誘導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明描述了在煙草中由水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)的基因的核苷酸序列。該基因可以用來(lái)賦予易感植物以病原體抗性。本發(fā)明的另一個(gè)部分涉及調(diào)控這些基因表達(dá)的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子在病原體攻擊的早期打開,而且可以作為病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子使用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1321197SQ99810746
公開日2001年11月7日 申請(qǐng)日期1999年8月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月3日
發(fā)明者M·H·司徒維爾, I·杰普森, D·M·赫瓦斯, N－H·川 申請(qǐng)人:洛克菲勒大學(xué), 辛根塔默根有限公司