專利名稱：乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種乙型肝炎病毒基因分型檢測的基因芯片和試劑盒及其方法，可用于人乙型肝炎病毒(HBV)基因型(B、C、D)三型感染的輔助診斷。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒Q^patitis B virus, HBV)是嚴(yán)重危害人類健康的肝炎病毒之一， 是主要的肝臟疾病致病因子。世界上有20億人感染過HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3. 8億，其中慢性HBV攜帶者75%分布在東南亞和次撒哈拉地區(qū)，而我國就占了 1.5 億，其中有2000萬人為慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人已近50萬。估計(jì)全球每年有 100-200萬人直接死于HBV持續(xù)感染。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是一種DNA病毒，其基因組由長3. 2kb的部分雙鏈DNA 組成，共有四個(gè)開放讀碼框(Open Readin Frame, ORF) :S、C、P、X，他們編碼至少8個(gè)不同蛋白表面抗原蛋白，DNA多聚酶蛋白，核心抗原蛋白，X蛋白等。HBV具有病毒復(fù)制產(chǎn)量高 (1012-13病毒粒/天)和突變率高(1010-11個(gè)點(diǎn)突變/天)的特征，高突變是由于高復(fù)制，尤其是由于基因組復(fù)制，需先轉(zhuǎn)錄為RNA中間體，但聚合酶缺乏校正功能所致。根據(jù)HBV 全基因核苷酸序列異源性大于8 %或S基因區(qū)核苷酸序列異源性大于4. 1 %，可將HBV分為 A、B、C、D、E、F、G、H，8 個(gè)基因型。HBV基因型呈一定的地域性分布在世界不同地區(qū)基因型分布不同，A型為全世界分布，B型、C型主要分布在亞洲，D型分布在南歐、美、澳大利亞和中東，E型分布在非洲，F(xiàn) 型分布在美洲土著人和波利尼西亞，G型分布在美洲、歐洲，H型在美國發(fā)現(xiàn)。目前我國乙型肝炎患者的HBV基因型主要是B、C和D這三型，并以C型最多，其中在北方城市以C型為主，由北方至南方，B型感染率逐漸增高，在香港、廣州等南部地區(qū)有少部分D型分布，另外， 華北、新疆地區(qū)有A型存在。眾多的研究證實(shí)，不同基因型的乙肝病毒具有不同的致病性，人類感染乙肝病毒后的臨床病情輕重、肝臟病變程度以及治療效應(yīng)與乙肝病毒的基因型存在著十分密切的關(guān)系。A型乙肝病毒的抗原性可能較弱，故免疫清除能力較弱，不過有報(bào)道指出A型乙肝病毒對標(biāo)準(zhǔn)干擾素治療的應(yīng)答率較其他基因型高；B型乙肝病毒則與慢性攜帶有關(guān)，并且年輕患者容易發(fā)展成肝細(xì)胞癌癥；由于較容易發(fā)生CP變異和在遷延性感染時(shí)免疫清除期較長， C型乙肝病毒導(dǎo)致的肝臟炎癥損害和纖維化較其他基因型嚴(yán)重；而D型乙肝病毒多見于重度肝炎。因此，對乙肝患者進(jìn)行乙肝病毒分型測定，有助于患者早期治療和指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定針對性的治療方案以及預(yù)后判斷。目前多采用基因型特異性引物PCR法、限制性片段長度多態(tài)性分析法(RFLP)和基因序列測定法對HBV進(jìn)行基因分型檢測?；蛐吞禺愋砸颬CR法通常需要借助凝膠電泳判讀結(jié)果，這種受到很多不可確定性因素制約的結(jié)果判讀方法一直避免應(yīng)用于臨床檢測，所以此法目前多限于科學(xué)研究領(lǐng)域。RFLP操作繁瑣而且重復(fù)性差，對檢測人員技術(shù)要求較高，使得其無法在臨床上得到廣泛應(yīng)用?；蛐蛄袦y定法是最準(zhǔn)確可靠的方法，但是測序需要的設(shè)備和技術(shù)門檻使得測序只能局限在某些具有一定實(shí)力的單位進(jìn)行，國家相關(guān)機(jī)構(gòu)也無法對不同檢測對象的測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，再加上測序費(fèi)用較高，使得基因測序根本無法應(yīng)用于臨床檢測。目前，市場上僅有的兩種乙肝病毒基因分型檢測試劑盒都是采用PCR熒光法，但由于熒光染料和檢測儀器的局限性，這兩種分型試劑盒僅能對B型和C型進(jìn)行分型。1989年由&iiki等提出了反向斑點(diǎn)雜交(reverse dot blot，RDB)技術(shù)，該技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一個(gè)實(shí)用性的改進(jìn)。Saiki及其同事在檢測HLA時(shí)提出了一個(gè)有效的改進(jìn)，該方法是將靶基因在PCR過程用放射性元素標(biāo)記，然后與尼龍膜雜交，從而檢測靶基因的突變情況。這一方法可將多個(gè)靶基因在同一條件下進(jìn)行檢測從而大大提高了檢測的效率。隨后，其它科學(xué)家證實(shí)了該方法可以區(qū)分單個(gè)堿基的突變，利用共價(jià)鍵的探針固定方法代替紫外交聯(lián)以及使用非放射性的生物素標(biāo)記引物的方法，RDB技術(shù)的穩(wěn)定性有了明顯的提高。目前Oogenetics的LiPA系列產(chǎn)品(通過CE認(rèn)證)均是基于上述的原理。從技術(shù)原理來說，RDB在本質(zhì)上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的一種，但它不同于一般所說的玻璃DNA芯片，其信號特異性強(qiáng)，簡便易行，技術(shù)要求低，儀器設(shè)備投入小，檢測結(jié)果用肉眼就可直接判斷，而無需購買昂貴的激光掃描儀，更符合中國目前的國情也更利于在基層醫(yī)院推廣。然而，目前RDB技術(shù)整個(gè)雜交過程的操作步驟比較多，操作時(shí)間也相對較長，成為大規(guī)模推廣應(yīng)用的阻力?；诖诵枨螅m然已經(jīng)有相應(yīng)的自動化雜交儀出現(xiàn)，但自動化雜交儀的價(jià)格昂貴，并非普通的基層醫(yī)院可接受。而且，繁多的操作步驟，也對自動化儀器運(yùn)行的穩(wěn)定性提出了挑戰(zhàn)。目前，市場上尚無利用PCR-RDB法對乙肝病毒進(jìn)行分型的診斷試劑盒。因此，研發(fā)乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和可觀經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用PCR-RDB方法，在具備了 PCR高靈敏度高特異性等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對HBV基因型的高通量多通道分析，這不僅有助于臨床病情評估，治療藥物的選擇和預(yù)后判斷，還為追蹤大范圍乙肝暴發(fā)時(shí)的傳染源提供了可行性。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，包括尼龍膜， 所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為可分別與乙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸雜交的核苷酸，所述探針序列如下所示探針Bl :5，-AGTTGGCTTTGAATGCA-3，；探針B2 :5，-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3，；探針B3 :5，-GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3，；探針P :5，-TGMGGGCTCCACCCCAA-3，；探針PC :5，-TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3，；
探針 CC 5，-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3，。
優(yōu)選的，上述基因芯片所述各探針5’進(jìn)行氨基標(biāo)記，探針CC的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括擴(kuò)增乙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示上游引物H-I :5，-GAGTTCCACTGCATGGCC-3，；下游引物H-2 5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，。所述上游引物H-I的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。優(yōu)選的，上述試劑盒所述PCR反應(yīng)液還包括內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒，所述內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒的擴(kuò)增引物為上游引物H-3 :5，-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3，；下游引物H-4 :5，-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3，；所述上游引物H-3的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。優(yōu)選的，上述試劑盒所述PCR反應(yīng)液還包括純水、10XPCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。優(yōu)選的，上述試劑盒的還包括雜交液，所述雜交液包括A液貯存液、B液貯存液、C 液貯存液、D液貯存液、E液貯存液、F液貯存液。本發(fā)明的又一技術(shù)方案為乙型肝炎病毒基因分型的方法，該方法包括下述具體步驟a、以乙型肝炎病毒基因組野生B、C、D型樣本序列為主設(shè)計(jì)合成分型引物與分型探針，所述探針序列為Bl :5，-AGTTGGCTTTGAATGCA-3，；B2 5' -GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3，；B3 :5’ -GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3’ ；P:5， -TGMGGGCTCCACCCCAA-3，；PC :5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3’ ；CC :5，-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3，；所述CC探針3’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；所述引物序列為上游引物H-I :5，-GAGTTCCACTGCATGGCC-3，；下游引物H-2 :5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，；b、用活性氨基標(biāo)記步驟a所述探針，并將其依次固定在尼龍膜上，制成檢測膜條；C、對步驟a所述上游引物H-I的5，端進(jìn)行生物素標(biāo)記，進(jìn)行HBVDNA擴(kuò)增；d、將擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測膜條雜交，以過氧化物酶與四甲基聯(lián)苯胺顯色；e、判斷基因分型結(jié)果。本發(fā)明試劑盒具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn)，一次雜交反應(yīng)可以檢測多種靶序列，取材方便，無需特殊設(shè)備，儀器投入低，具有快速簡便、敏感度高和特異性強(qiáng)的特
點(diǎn)ο


圖1為膜條點(diǎn)陣基本尺寸；
圖2為膜條探針排列順序；
圖3:PCR擴(kuò)增調(diào)節(jié)示意圖4HBV-DNA 陽性，HBV B 型;
圖5HBV-DNA 陽性，HBV D 型;
圖6=HBV-DNA陽性，HBV BC混合型
圖7=HBV-DNA 陰性。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。本發(fā)明是將高靈敏度的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因及基因突變檢測技術(shù)。是將特異的探針分別固定到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再將經(jīng)PCR 特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物(在PCR引物5’端預(yù)先進(jìn)行生物素標(biāo)記，使擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)標(biāo)記有生物素)與之雜交，這樣待檢樣本就會與具有同源序列的探針結(jié)合，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣本，由于待測的DNA樣本具有生物素類的標(biāo)記物，結(jié)合了待測DNA的探針點(diǎn)上就帶有生物素類的標(biāo)記物，再經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)就能顯出雜交信號。生物素(Biotin)本發(fā)明生物素標(biāo)記，優(yōu)選地高辛標(biāo)記。以尼龍膜為載體的DNA芯片技術(shù)，采用的是微量點(diǎn)樣DNA微陣列技術(shù)。其主要的基本原理如下DNA探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標(biāo)記。經(jīng)活化處理的尼龍膜帶有負(fù)電荷基團(tuán)，可以與氨基形成共價(jià)結(jié)合。利用這種方法可將DNA探針按一定的排列規(guī)律永久的固定在尼龍膜的表面。其主要優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，技術(shù)要求低，并且探針不受探針分子大小種類的限制，能根據(jù)使用者的要求簡便地制出符合目的的芯片。在此基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)對微量待測樣品進(jìn)行大量快速擴(kuò)增，擴(kuò)增后含有相應(yīng)標(biāo)記物的待測樣品與芯片上的探針進(jìn)行特異性雜交，此后對雜交信號強(qiáng)弱和有無進(jìn)行分析，即可判斷樣品中靶分子的數(shù)量和性質(zhì)。實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的組成膜條生產(chǎn)工藝將尼龍膜經(jīng)EDC. HCl (1_ (3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)預(yù)處理30 分鐘后激活表面羧基；同時(shí)，將5’端帶有氨基標(biāo)記的探針用緩沖液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋搓嚵许樞螯c(diǎn)加于尼龍膜相應(yīng)位置上，氨基與活化的羧基發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的“-C0-NH-”共價(jià)鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面，最后用0. IN的NaOH處理尼龍膜，封閉未結(jié)合探針的表面羧基，膜條制作完成，具體流程如下1、將將膜條裁成適當(dāng)大小，用激光打印機(jī)打上1X6的格子，每格大小為 4. 5X5. Omm ；2、配探針稀釋液(0. 5mol/L NaHC03, ρΗ8· 4)；3、將所有6條探針分別用探針稀釋液稀釋至5 μ mol/L ；4、配32%的EDC溶液等比例混合EDC和探針稀釋液；
7
5、用八通道連續(xù)移液器取0. 6μ L稀釋好的探針點(diǎn)于尼龍膜相應(yīng)的格子上膜條自然晾干30min ；6、配制 0. lmol/L NaOH, 二次泡膜 5 分鐘；7、純水洗膜3次；8、膜條烘干 30min;9、二次裁剪備用。請參閱圖1，圖2，圖1為膜條點(diǎn)陣基本尺寸(單位毫米)，1的長度為4. 5士0. 25， 2的長度為5. 0 士 0. 25，3的長度為36. 5 士 0. 254的長度為7. 5 士 0. 25，圖2為膜條探針排列順序。上述探針的名稱及序列如表1(M = A+C)。表 權(quán)利要求
1.乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，其特征在于，包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為可分別與乙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸雜交的核苷酸，所述探針序列如下所示探針 Bl :5’ -AGTTGGCTTTGAATGCA-3’ ；探針 B2 :5，-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3，；探針 B3 :5’ -GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3’ ；探針 P :5，-TGMGGGCTCCACCCCAA-3，；探針 PC :5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3’ ；探針 CC :5’ -CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3，；所述各探針5’進(jìn)行氨基標(biāo)記，所述探針CC的3’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
2.乙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片，還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括擴(kuò)增乙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示上游引物 H-I :5’ -GAGTTCCACTGCATGGCC-3，； 下游引物 H-2 :5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，； 所述上游引物H-I的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液還包括內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒，所述內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒的擴(kuò)增引物為上游引物 H-3 :5’ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3’ ； 下游引物 H-4 :5，-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3，； 所述上游引物H-3的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
4.如權(quán)利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述探針CC的 3’端進(jìn)行地高辛標(biāo)記，所述上游引物H-I的5’端進(jìn)行地高辛標(biāo)記，所述上游引物H-3的5’ 端進(jìn)行地高辛標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液還包括純水、10 X PCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。
6.如權(quán)利要求2所述的乙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括雜交液，所述雜交液包括A液貯存液、B液貯存液、C液貯存液、D液貯存液、E液貯存液、 F液貯存液。
7.乙型肝炎病毒基因分型的的方法，其特征在于，該方法包括下述具體步驟a、以乙型肝炎病毒基因組野生B、C、D型樣本序列為主設(shè)計(jì)合成分型引物與分型探針， 所述探針序列為Bl 5' -AGTTGGCTTTGAATGCA-3‘； B2 :5’ -GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3’ ； B3 5' -GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3‘； P 5' -TGMGGGCTCCACCCCAA-3‘； PC :5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3’ ； CC :5’ -CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’ ；所述CC探針3’端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 所述引物序列為上游引物 H-I :5’ -GAGTTCCACTGCATGGCC-3，； 下游引物 H-2 :5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，；b、用活性氨基標(biāo)記步驟a所述探針，并將其依次固定在尼龍膜上，制成檢測膜條； C、對步驟a所述上游引物H-I的5，端進(jìn)行生物素標(biāo)記，進(jìn)行HBVDNA擴(kuò)增；d、將擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測膜條雜交，以過氧化物酶與四甲基聯(lián)苯胺顯色；e、判斷基因分型結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明目的是利用高靈敏度的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因檢測技術(shù)，快速準(zhǔn)確的區(qū)分乙型肝炎病毒基因型的方法。本發(fā)明技術(shù)方案為提供一種用于乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和試劑盒及其方法。所述試劑盒包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為可分別與乙型肝炎病毒各亞型的核酸雜交的核苷酸。本發(fā)明試劑盒具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn)，一次雜交反應(yīng)可以檢測多種靶序列，取材方便，無需特殊設(shè)備，儀器投入低，具有快速簡便、敏感度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/70GK102559933SQ20121001622
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者周曉強(qiáng), 姚銘鋒, 林希瑾, 秦偉, 胡守旺, 謝佐福 申請人:泰普生物科學(xué)(中國)有限公司