專利名稱：一種可分泌纖維素酶的菌株及其纖維素酶提取方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地說是一種可分泌纖維素酶的菌株的分離方法、該菌株產(chǎn)纖維素酶及其提取方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中分布最廣泛的多糖類物質(zhì)。如能合理利用使其降解為可利用的糖類，可解決當前人類社會所面臨的糧食與能源問題。纖維素酶是水解纖維素為可發(fā)酵性糖的關(guān)鍵酶，纖維素被水解后可得到還原性糖，從而通過發(fā)酵工藝進一步轉(zhuǎn)化為生物能源等物質(zhì)。在草料中添加纖維素酶，可增加飼料的利用率，提高飼養(yǎng)動物的產(chǎn)肉率。目前纖維素酶還被廣泛用于多紡織、造紙等工業(yè)領(lǐng)域。 用于產(chǎn)纖維素酶的真菌多為里氏木霉。當前纖維素酶多由微生物發(fā)酵生產(chǎn)。但酶活產(chǎn)量低，成為纖維素酶工業(yè)化的最大阻力。尋找高效纖維素酶產(chǎn)生菌極為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種可分泌酶活高、產(chǎn)量高的纖維素酶的產(chǎn)酶菌株。本發(fā)明的另一目的還提供上述菌株的分離方法。本發(fā)明的同時還提供一種上述菌株分泌的纖維素酶的提取方法及其應(yīng)用。本發(fā)明可分泌纖維素酶的菌株為綠木霉ZY-01,保藏名稱為綠木霉(Trichodermavirens ZY-01)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No: M 2012205，保藏日期為2012年6月5日，該菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO. I所示。Trichoderma virens ZY-Ol (CCTCC No M 2012205)的具體特征如下(I)菌落形態(tài)菌絲層較厚，致密叢束狀，初期為白色，平坦，后期因產(chǎn)生孢子，而成綠色。菌落背面無色，或逐漸呈暗黃色。(2)水解圈特性在剛果紅培養(yǎng)基上有較大明顯水解圈。⑶細胞形態(tài)菌絲透明至淺綠色，壁光滑，分生孢子梗由菌絲側(cè)面生出，基部通常不育，且不分枝，向頂分枝不規(guī)則，整體像樹枝。厚垣孢子呈卵圓形，光滑，淡綠色。18s rDNA序列分析表明該菌株(Trichoderma viride ZY-OI)與模式菌株Trichoderma atroviride [Μ] 206040 和 Trichoderma virens Gv29_8 的序列同源性為 99%,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征分析，該菌有綠木霉的特性，該菌歸為木霉屬(Trichodermasp.)。上述可分泌纖維素酶的菌株的分離方法，包括下述步驟I)從秸桿作物農(nóng)田取得土壤，加水振蕩后使土壤與無菌水充分混合散開，靜置使其澄清，取上清液；土壤和無菌水的混合質(zhì)量體積比優(yōu)選為I :9。2)將上清液滴加于剛果紅選擇培養(yǎng)基上，涂布均勻，30- 40 1恒溫培養(yǎng)3- 5天；所述剛果紅選擇培養(yǎng)基成分為=KH2PO4 O. 2- I. O g, MgSO4 · 7H20 O. 2- O. 5 g，瓊脂10- 20 g, CMC Na I- 5 g，剛果紅O. 20 g，2 %去氧膽酸鈉溶液20 mL，3- 5 mL鏈霉素溶液，蒸餾水定容至1000 mL ；3)在剛果紅選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)3- 5天后，觀察水解圈情況，當菌落周圍培養(yǎng)基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近于無色時，則該水解圈指示得到可分泌纖維素酶的菌株。由于該菌株可分泌出胞外纖維素酶并水解菌落周圍培養(yǎng)基中纖維素成分，致使菌落周圍培養(yǎng)基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近于無色，由該水解圈指示即說明已得到可分泌纖維素酶的菌株綠木霉ZY-Oi。由纖維素酶的產(chǎn)酶及純化提取方法包括下述步驟 (I)發(fā)酵產(chǎn)酶將所述的菌株接種入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)酶，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成份為羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO4 7H20和K2HPO4,發(fā)酵溫度為30- 40°C，發(fā)酵時間為3- 5天，得到發(fā)酵液；(2)纖維素酶提取將發(fā)酵液離心分離得到上清液，對上清液進行乙醇￠0- 85%)沉淀，再利用葡聚糖凝膠G-75層析，得到純化后的纖維素酶。所述步驟(I)中發(fā)酵培養(yǎng)基組成比例為0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 gCMC Na, 20- 30 g NaCl, O. 3- I g K2HPO4,0. 3- I g MgSO4 7H20，蒸餾水定容至 1000mL。將菌種接入該培養(yǎng)基30- 40 °C培養(yǎng)3- 5天。本發(fā)明纖維素酶由上述提取方法得到。上述纖維素酶用于甘蔗渣、玉米秸桿及、稻草或小麥秸桿等高纖維素含量的生物質(zhì)(以下簡稱生物質(zhì))的高效降解。所述降解方法為將生物質(zhì)粉碎后用I %_ 3 % (w/v) NaOH預(yù)處理，其中固液質(zhì)量體積比為I :20，隨后每I g預(yù)處理后的生物質(zhì)中加入50-70 IU (國際酶活單位)的所述纖維素酶，加入緩沖液調(diào)節(jié)PH值到4. O- 6.0,40- 60°C恒溫酶解20-50 h0所述預(yù)處理可采用機械粉碎后NaOH溶液浸泡的方法，其目的是為了破壞纖維素和半纖維素與木質(zhì)素之間對堿不穩(wěn)定的化學(xué)鍵，溶解半纖維素和一部分木質(zhì)素，使纖維暴露易于分解。所述緩沖液可以為常用的Tirs緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液或醋酸緩沖液
坐寸ο所述酵母抽提物(如0X0ID 酵母抽提物)的提取方法為現(xiàn)有技術(shù)，不作詳述。所述甘蔗渣或、玉米秸桿粉碎后過40-80目，所述稻草、小麥秸桿粉碎至5 mm以下，優(yōu)選為不大于3mm。有益效果(I)本發(fā)明從秸桿作物農(nóng)田(如玉米、水稻或小麥作物農(nóng)田)的土壤中篩選得到一種可分泌纖維素酶的綠木霉ZY-Ol (Trichoderma viride ZY-01,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No Μ 2012205，)，該菌株的分離方法簡單、來源廣泛、可由秸桿作物農(nóng)田中的土壤中分離獲得。(2)對由綠木霉的分泌物中提取的纖維素酶酶進行酶學(xué)研究得知，該酶在45- 55°C, pH 4.6- 5. 6時酶活性最高，而其耐受范圍為30- 80 1和pH 3.6- 7，其中30- 50 V和pH 5- 6時穩(wěn)定性最高，具有酶活高，反應(yīng)適應(yīng)的條件范圍廣，易于制備的優(yōu)點。(3)本發(fā)明纖維素酶具有很高的纖維素降解活性，其中以該酶的內(nèi)切葡聚糖酶(EG)活性最為顯著。用其作為催化劑對甘蔗渣渣、玉米秸桿、稻草和小麥秸桿進行降解20-
40h，產(chǎn)糖率分別高達質(zhì)量百分數(shù)29. 2 %、23. 8 %、21. 3 %和22. 2 %，隨著反應(yīng)時間的延長，產(chǎn)糖率會進一步增加，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明綠木霉Trichoderma virens ZY-01的基因組DNA和18s rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖，其中I為marker，2為18s rDNA，3基因組DNA。 圖2為纖維素葡聚糖G-75凝膠層析圖。圖3為圖2中峰2的葡聚糖G-75凝膠層析圖。
具體實施例方式實施例中所涉及的培養(yǎng)基為[I]剛果紅選擇培養(yǎng)基=KH2PO4 O. 2- I. O g, MgSO4 7H20 O. 2_ O. 5 g，瓊脂 10-20 g, CMC Na I- 5 g，剛果紅O. 20 g，2 %去氧膽酸鈉溶液20 mL，3- 5 mL鏈霉素溶液、蒸餾水定容至1000 mL ；[2]發(fā)酵培養(yǎng)基0.5- 2 g 酵母抽提物，5- 20 g CMC Na, 20- 30 g NaCl, O. 3-
1g K2HPO4,0. 3- I g MgSO4 7H20，蒸餾水定容至 1000 mL。實施例I :菌株的篩選本發(fā)明的綠木霉(Trichoderma virens ZY-01,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No M 2012205，保藏日期為2012年6月5日)是一種屬于真菌類的菌株，該菌株從土壤中分離，經(jīng)過以底物羧甲基纖維素鈉(CMC Na)為唯一碳源從土壤樣品中富集篩選的方法獲得。篩選產(chǎn)高效纖維素酶菌株的方法為(I)稱取10 g土壤樣品(本實施例中土壤取自于玉米秸桿作物農(nóng)田)，加入90 mL無菌水，振蕩均勻呈懸浮液。靜置為上清液澄清，備用；(2)取I mL靜置后的上清液，在無菌條件下接種于剛果紅選擇培養(yǎng)基中30- 40°C°C 培養(yǎng) 3-5 d ；(3)培養(yǎng)3-5 d后，該菌株可分泌出胞外纖維素酶并水解菌落周圍培養(yǎng)基中纖維素成分，致使菌落周圍培養(yǎng)基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近于無色，由該水解圈指示得到可降解纖維素的菌株-綠木霉(Trichoderma virens ZY-01)。實施例2 :菌株鑒定(I)實施例I中所分離菌株采用CTAB法提取其基因組DNA 取10 mL菌液于離心管4 °C, 10000 r/min離心10 min，得到菌絲；菌絲加入4 mLCTAB和O. 8 mL巰基乙醇混合均勻，并分裝與I. 5 mL離心管中水浴保持30 min ;加入等體積酚/氯仿異戊醇(其中氯仿/異戊醇體積比例為24 :1)，震蕩搖勻，4 °C, 12000 r/min離心10 min;上清液中加入2 μ L RNA酶，混勻后37 1水浴保持20- 30 min ;水浴后將混合液分裝至I. 5 mL離心管中，每管約400 μ L ;再加入2倍體積無水乙醇和1/10體積NaAC溶液，沉淀；沉淀徹底后離心棄上清，75 %乙醇洗滌2- 3次；晾干加入TE緩沖液溶解，-20 V保存。(2)菌株18s rDNA序列分析對菌株18s rDNA基因克隆和序列分析；其中使用真菌18s rDNA通用引物，其上游引物為NSl GTAGTCATATGCTTGTCTC (如序列表SEQ ID NO. 2所示)，下游引物為NS8 TCCGCAGGTTCACCTACGGA (如序列表SEQ ID NO. 3所示)。PCR反應(yīng)條件為94 °C預(yù)變性5min ； 94 °C變性30 s ； 52 °C退火45 s ； 72 °C延伸90 s ；重復(fù)2- 4步30個循環(huán)，72°C保持 10 min。
以基因組為模板進行并使用通用引物對其18s rDNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖I。擴增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司測序，18s rDNA序列見SEQ IDNO. 1，并在NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)上進行比對。實施例3-5 :菌株發(fā)酵產(chǎn)酶將實施例I中得到的菌株轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產(chǎn)酶，得到粗酶液。實施例中所述菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基成分主要涉及碳源、氮源、無機鹽。其發(fā)酵培養(yǎng)基成分中碳源為羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，氮源為酵母抽提物(英國OXOID公司)，無機鹽為NaCl、MgSO4 7H20和K2HPO4。具體步驟如表I所示
權(quán)利要求
1.一種可分泌纖維素酶的菌株，保藏名稱為綠木霉ZY-Ol (Trichoderma virensZY-01)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No: M 2012205，該菌株18srDNA序列如序列表SEQ ID NO. I所示。
2.如權(quán)利要求I所述的可分泌纖維素酶的菌株的分離和鑒定方法，其特征在于 1)從秸桿作物農(nóng)田取得土壤，加水振蕩后使土壤與無菌水充分混合散開，靜置使其澄清，取上清液； 2)取上清液滴加于剛果紅選擇培養(yǎng)基上，涂布均勻，30-40 1恒溫培養(yǎng)3- 5天； 所述剛果紅選擇培養(yǎng)基成分為KH2PO4 0.2- 1.0 g，MgSO4 7H20 0.2- 0.5 g，瓊脂10- 20 g, CMC Na 1-5 g，剛果紅0. 20 g，2 %去氧膽酸鈉溶液20 mL，3- 5 mL鏈霉素溶液，蒸懼水定容至1000 mL ； 3)在剛果紅選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5天后，觀察水解圈情況，當菌落周圍培養(yǎng)基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近于無色時，則該水解圈指示得到可分泌纖維素酶的菌株。
3.一種由纖維素酶的產(chǎn)酶及純化提取方法，其特征在于，包括下述步驟 (1)發(fā)酵產(chǎn)酶 將權(quán)利要求I所述的菌株接種入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)酶，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基主要成份包括羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO4 7H20和K2HPO4,發(fā)酵溫度為30- 40 °C，發(fā)酵時間為3- 5天，得到發(fā)酵液； (2)纖維素酶純化提取 將發(fā)酵液離心分離得到上清液，對上清液采用乙醇沉淀法及葡聚糖凝膠G-75層析法純化，得到純化后的纖維素酶。
4.如權(quán)利要求3所述的由綠木霉生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述步驟(I)的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分比例為0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 g羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，20- 30 g NaCl,0. 3- I g K2HPO4,0. 3- I g MgSO4 7H20，蒸餾水定容至 1000 mL。
5.一種纖維素酶，由權(quán)利要求3或4所述的提取及純化方法得到。
6.權(quán)利要求5所述纖維素酶的應(yīng)用，所述纖維素酶用于高纖維素含量的生物質(zhì)的高效降解。
7.如權(quán)利要求6所述的纖維素酶的應(yīng)用，所述高纖維素含量的生物質(zhì)為甘蔗渣、玉米稻桿、稻草或小麥稻桿。
8.如權(quán)利要求6或7所述的纖維素酶的應(yīng)用，其特征在于，所述降解方法為將高纖維素含量的生物質(zhì)粉碎后用I %_ 3 % (w/v) NaOH預(yù)處理，其中固液質(zhì)量體積比為I :20，隨后每I g預(yù)處理后的高纖維素含量的生物質(zhì)中加入50-70 IU的權(quán)利要求5所述的纖維素酶，加入緩沖液調(diào)節(jié)pH值到4. 0- 6. 0,40- 60°C恒溫酶解20- 50 h。
9.如權(quán)利要求8所述的纖維素酶的應(yīng)用，其特征在于，所述粉碎步驟中，甘蔗渣或玉米秸桿粉碎后過40- 80目，稻草或小麥秸桿粉碎至5 mm以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可分泌纖維素酶的菌株及其纖維素酶提取方法與應(yīng)用，解決了現(xiàn)有產(chǎn)纖維素酶菌株酶活產(chǎn)量低的問題，提供一種可分泌纖維素酶的菌株，保藏名稱為綠木霉ZY-01 (Trichoderma virens ZY-01)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NoM 2012205，該菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，并描述了上述菌株的分離方法及纖維素酶的產(chǎn)酶及純化提取方法，以及用于甘蔗渣及秸稈的高效降解的應(yīng)用方法。本發(fā)明菌株具有酶活高，反應(yīng)適應(yīng)的條件范圍廣，易于制備的優(yōu)點，分泌的纖維素酶具有很高的纖維素降解活性。
文檔編號C12R1/885GK102807958SQ201210295819
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者楊忠華, 趙燕, 陳庚華, 周衛(wèi), 侯亞利 申請人:武漢科技大學(xué)